Name: Test ilościowy dla progenitorów tworzących kolonie z ekspresją insuliny (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 39 s
Description: Poznaj metodę ilościowego testu kolonii dla progenitorów trzustkowych z ekspresją insuliny. Technika wykorzystuje półstałe podłoże z Matrigel i czynniki wzrostu do badania biologii komórek macierzystych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować dr. Klausowi Kaestnerowi za przekazanie mysiej linii komórek macierzystych zarodkowych Ngn3-EGFP, pani Lucy Brown oraz Analytical Cytometry Core za pomoc w sortowaniu komórek. Praca ta była częściowo finansowana z grantów NIH R21DK069997 i R01DK081587 przyznanych H.T.K. oraz z grantów szkoleniowych California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) przyznanych M.W. i L.S.

<ol><li>Ku, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Committing+embryonic+stem+cells+to+early+endocrine+pancreas+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cells%22%5BJournal%5D)">Committing embryonic stem cells to early endocrine pancreas in vitro.</a> Stem cells. 22, 1205-1217 (2004).</li>
<li>Ku, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin-expressing+colonies+developed+from+murine+embryonic+stem+cell-derived+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Insulin-expressing colonies developed from murine embryonic stem cell-derived progenitors.</a> Diabetes. 56, 921-929 (2007).</li>
<li>Chen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+an+in+vitro+differentiation+assay+for+pancreatic-like+cell+development+from+murine+embryonic+stem+cells%3A+detailed+gene+expression+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Assay.+Drug.+Dev.+Technol%22%5BJournal%5D)">Characterization of an in vitro differentiation assay for pancreatic-like cell development from murine embryonic stem cells: detailed gene expression analysis.</a> Assay. Drug. Dev. Technol. 9, 403-419 (2011).</li>
<li>Lee, C. S., Perreault, N., Brestelli, J. E., Kaestner, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenin+3+is+essential+for+the+proper+specification+of+gastric+enteroendocrine+cells+and+the+maintenance+of+gastric+epithelial+cell+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%22%5BJournal%5D)">Neurogenin 3 is essential for the proper specification of gastric enteroendocrine cells and the maintenance of gastric epithelial cell identity.</a> Genes. 16, 1488-1497 (2002).</li>
<li>Gu, G., Dubauskaite, J., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+evidence+for+the+pancreatic+lineage%3A+NGN3%2B+cells+are+islet+progenitors+and+are+distinct+from+duct+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Direct evidence for the pancreatic lineage: NGN3+ cells are islet progenitors and are distinct from duct progenitors.</a> Development. 129, 2447-2457 (2002).</li>
<li>Ogawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+and+proliferation+of+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Differentiation and proliferation of hematopoietic stem cells.</a> Blood. 81, 2844-2853 (1993).</li>
<li>Gittes, G. K., Galante, P. E., Hanahan, D., Rutter, W. J., Debase, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage-specific+morphogenesis+in+the+developing+pancreas%3A+role+of+mesenchymal+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Lineage-specific morphogenesis in the developing pancreas: role of mesenchymal factors.</a> Development. 122, 439-447 (1996).</li>
<li>Miralles, F., Battelino, T., Czernichow, P., Scharfmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta+plays+a+key+role+in+morphogenesis+of+the+pancreatic+islets+of+Langerhans+by+controlling+the+activity+of+the+matrix+metalloproteinase+MMP-2%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">TGF-beta plays a key role in morphogenesis of the pancreatic islets of Langerhans by controlling the activity of the matrix metalloproteinase MMP-2.</a> J. Cell. Biol. 143, 827-836 (1998).</li>
<li>Bonner-Weir, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+cultivation+of+human+islets+from+expanded+ductal+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">In vitro cultivation of human islets from expanded ductal tissue.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97, 7999-8004 (2000).</li>
<li>Gao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+endocrine+progenitor+cells+and+critical+factors+for+their+differentiation+in+human+adult+pancreatic+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Characterization of endocrine progenitor cells and critical factors for their differentiation in human adult pancreatic cell culture.</a> Diabetes. 52, 2007-2015 (2003).</li>
<li>Gao, R., Ustinov, J., Korsgren, O., Otonkoski, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+neogenesis+of+human+islets+reflects+the+plasticity+of+differentiated+human+pancreatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">In vitro neogenesis of human islets reflects the plasticity of differentiated human pancreatic cells.</a> Diabetologia. 48, 2296-2304 (2005).</li>
<li>Suarez-Pinzon, W. L., Lakey, J. R., Brand, S. J., Rabinovitch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+therapy+with+epidermal+growth+factor+and+gastrin+induces+neogenesis+of+human+islet+beta-cells+from+pancreatic+duct+cells+and+an+increase+in+functional+beta-cell+mass%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Endocrinol.+Metab%22%5BJournal%5D)">Combination therapy with epidermal growth factor and gastrin induces neogenesis of human islet beta-cells from pancreatic duct cells and an increase in functional beta-cell mass.</a> J. Clin. Endocrinol. Metab. 90, 3401-3409 (2005).</li>
<li>Hao, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta-cell+differentiation+from+nonendocrine+epithelial+cells+of+the+adult+human+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Beta-cell differentiation from nonendocrine epithelial cells of the adult human pancreas.</a> Nature Medicine. 12, 310-316 (2006).</li>
<li>Ku, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minireview%3A+pancreatic+progenitor+cells--recent+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Minireview: pancreatic progenitor cells--recent studies.</a> Endocrinology. 149, 4312-4316 (2008).</li>
<li>Seaberg, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+identification+of+multipotent+precursors+from+adult+mouse+pancreas+that+generate+neural+and+pancreatic+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Clonal identification of multipotent precursors from adult mouse pancreas that generate neural and pancreatic lineages.</a> Nature Biotechnology. 22, 1115-1124 (2004).</li>
<li>Rovira, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+centroacinar%2Fterminal+ductal+progenitor+cells+in+adult+mouse+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of centroacinar/terminal ductal progenitor cells in adult mouse pancreas.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 75-80 (2010).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

Dotychczas liczba testów kolonnych umożliwiających ilościową i funkcjonalną ocenę pojedynczych progenitorów trzustki była ograniczona, co znacznie utrudniało postępy w badaniach nad biologią komórek macierzystych i progenitorowych trzustki. Istotą testu kolonnego jest pomiar wewnętrznej zdolności komórek progenitorowych, a nie tylko ich fenotypu, co pozwala na obserwację funkcjonalności i potencjału linii komórkowych tych komórek. Jest to również narzędzie ilościowe, które pozwala określić liczbę progenitorów w danej populacji. W dziedzinie hematopoetycznych komórek macierzystych testy kolonne odegrały istotną rolę w ich identyfikacji, a także w rozszyfrowywaniu wymagań dotyczących czynników wzrostu, interakcji i mechanizmów sterujących różnicowaniem tych komórek w konkretne linie.6 W biologii komórek progenitorowych trzustki opracowano metody hodowli organoidów trzustki7,8 lub hodowle zbiorcze9-13, jednak testy te nie pozwalają na rozstrzygnięcie kwestii biologicznych na poziomie pojedynczej komórki. Bez analizy pojedynczych komórek nie można jednoznacznie udowodnić istnienia wielopotencjalnych komórek macierzystych/progenitorowych trzustki.14
W niniejszej pracy wykazujemy, że progenitorów tworzących kolonie i wykazujących ekspresję insuliny można analizować przy użyciu trójwymiarowego, półstałego systemu hodowlanego zawierającego Matrigel. Chociaż opracowano system hodowli w zawiesinie15,16, który pozwala pojedynczym dorosłym progenitorom trzustki na proliferację i różnicowanie w „pankreatosfery”, nasz test tworzenia kolonii zapewnia dodatkowe korzyści. Po pierwsze, nasz system półstałych mediów hodowlanych umożliwia wysiew do 25 000 posortowanych komórek na 500 μL medium w jednej studience płytki 24-dołkowej, przy jednoczesnym utrzymaniu tworzenia kolonii w zakresie liniowym.2 W przeciwieństwie do tego, test pankreatosfer w zawiesinie wymaga zastosowania metody depozycji pojedynczych komórek z sortera komórkowego w celu umożliwienia analizy pojedynczych komórek, co wiąże się z koniecznością użycia większej objętości medium oraz większej przestrzeni w inkubatorze. W związku z tym nasz test tworzenia kolonii jest stosunkowo łatwy i kosztowo efektywny do przeprowadzenia w sytuacjach, gdy konieczne jest jednoczesne porównanie aktywności progenitorowej dla dużej liczby różnych komórek. Po drugie, nasze półstałe medium zapewnia równomierny rozkład składników macierzy zewnątrzkomórkowej i czynników wzrostu, co pozwala na zachodzenie zarówno proliferacji, jak i różnicowania w tej samej studience. W przeciwieństwie do tego, trudniej jest zapewnić takie środowisko, a zwłaszcza macierz, komórkom w hodowli w zawiesinie. Mamy świadomość, że w przypadku naszej metody nie można jednoznacznie udowodnić, iż każda kolonia pochodzi z jednej komórki, ponieważ dwa progenitory mogą zostać przypadkowo rozmieszczone blisko siebie i utworzyć jedną kolonię. Problem ten można jednak rozwiązać poprzez analizę wtórną z wykorzystaniem manipulacji pojedynczymi komórkami. Bezpośrednie ręczne wyselekcjonowanie posortowanych pojedynczych komórek mogłoby jednoznacznie wykazać pochodzenie każdej kolonii z jednej komórki.
Podsumowując, opisana w niniejszym opracowaniu zdolność progenitorów do tworzenia kolonii wykazujących ekspresję insuliny w podłożach półstałych stwarza wyjątkowe możliwości prowadzenia badań mechanistycznych nad progenitorami trzustki na poziomie pojedynczych komórek. Na przykład w poprzednim raporcie stwierdziliśmy, że do powstania kolonii wykazujących ekspresję insuliny z komórek Ngn3-EGFP+ niezbędny jest dodatek do pożywki Matrigel, będący surową mieszaniną białek macierzy pozakomórkowej,2 co sugeruje, że macierz pozakomórkowa jest istotna dla tych progenitorów. Dzięki zastosowaniu tego testu koloniogennego możliwe będzie teraz dalsze analizowanie i określanie specyficznych wymagań dotyczących macierzy dla takiej aktywności. Oprócz badania progenitorów pochodzących z embrionalnych komórek macierzystych myszy, obecnie badamy, czy ten system testowy in vitro wspiera również tworzenie innych charakterystycznych kolonii pochodzących z trzustki i wątroby myszy okołoporodowych i dorosłych, a także z ludzkiej pośmiertnej tkanki trzustki pozbawionej wysepek.

<table><tbody><tr><td>1X DMEM/ F-12 (1:1)</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>15-090-CV</td><td></td></tr><tr><td>Płytkowa surowica bydlęca</td><td>Tissue Culture Biologicals</td><td>201</td><td>Patrz sekcja 1.1</td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>1X PBS Dulbecco&amp;rsquo;s</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Albuminy surowicy bydlęcej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8412</td><td>7.5 %</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>356231</td><td>Z obniżoną zawartością czynników wzrostu</td></tr><tr><td>Metyloceluloza</td><td>Sinetsu Chemical</td><td></td><td>1,500 centipoise (wysoka lepkość)</td></tr><tr><td>Nikotynamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowana ludzka aktywina &amp;#946;B</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>659-AB-025</td><td></td></tr><tr><td>Exendin-4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7144</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki VEGF-A</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>293-VE-010</td><td></td></tr><tr><td>Płytki 24-dołkowe</td><td>Costar</td><td>3473</td><td>Ultra-niska&lt;br/&gt; adhezja</td></tr><tr><td>Szalka Petriego 60mm z siatką</td><td>Nalge Nunc international</td><td>169558</td><td></td></tr></tbody></table>

ilościowe oznaczenie progenitorów tworzących kolonie wykazujących ekspresję insuliny

A Quantitative Assay for Insulin-expressing Colony-forming Progenitors

Dziedzina biologii komórek macierzystych i progenitorowych trzustki była ograniczana przez brak funkcjonalnych i ilościowych testów in vitro, które umożliwiałyby analizę pojedynczych komórek. Analizy pojedynczych progenitorów mają krytyczne znaczenie, ponieważ stanowią one rozstrzygający sposób na jednoznaczne wykazanie potencjału linii komórkowej poszczególnych progenitorów. Choć opracowano metody generowania „pankreatosfer” w kulturze zawiesinowej z pojedynczych komórek, istnieje kilka ograniczeń. Po pierwsze, osadzanie pojedynczych komórek dla dużej ich liczby jest czasochłonne, co z kolei wymaga dużych objętości pożywek hodowlanych i przestrzeni. Po drugie, liczenie powstałych pankreatosfer jest pracochłonne, zwłaszcza gdy częstotliwość występowania progenitorów inicjujących tworzenie pankreatosfer jest niska. Po trzecie, test pankreatosfer nie jest wydajną metodą pozwalającą na jednoczesną proliferację i różnicowanie progenitorów trzustki w tym samym dołku hodowlanym, co ogranicza użyteczność tego badania.
Aby przezwyciężyć te ograniczenia, opracowano i zaprezentowano w niniejszym raporcie test kolonijny dla progenitorów trzustki oparty na podłożu półstałym. Metoda ta wykorzystuje istniejącą koncepcję testu kolonijnego dla komórek krwiotwórczych, w której metyloceluloza służy do nadania lepkości podłożu, co pozwala komórkom progenitorowym pozostać w przestrzeni trójwymiarowej podczas proliferacji oraz różnicowania. Aby wzbogacić populację progenitorów tworzących kolonie wykazujących ekspresję insuliny z heterogenicznej populacji komórek, wykorzystano komórki wykazujące ekspresję neurogeniny (Ngn) 3, która jest markerem komórek progenitorowych endokrynnych trzustki. Komórki wykazujące ekspresję Ngn3 pochodzące z mysich embrionalnych komórek macierzystych (ES), znakowane reporterem wzmocnionego zielonego białka fluorescencyjnego, zostały posortowane, a następnie do studni płytek hodowlanych o niskim stopniu przylegania (24-dołkowych) wysiano do 25 000 komórek na studnię. Każda studnia zawierała 500 μL podłoża półstałego z następującymi głównymi składnikami: metylocelulozą, Matrigelem, nikotynamidem, eksendyną-4, aktywinią βB oraz pożywką warunkowaną pobraną z komórek trzustkopodobnych pochodzących z mysich komórek ES. Po 8 do 12 dniach hodowli utworzyły się kolonie wykazujące ekspresję insuliny o charakterystycznej morfologii, które można było poddać dalszej analizie pod kątem ekspresji genów trzustki za pomocą ilościowej RT-PCR oraz barwienia immunofluorescencyjnego w celu określenia składu linii każdej kolonii.
Podsumowując, opracowany przez nas test kolonogenny umożliwia łatwą detekcję i kwantyfikację funkcjonalnych komórek progenitorowych w heterogenicznej populacji komórek. Ponadto format półstałych podłoży zapewnia równomierne dostarczanie komponentów macierzy zewnątrzkomórkowej oraz czynników wzrostu do komórek, co pozwala progenitorom na proliferację i różnicowanie in vitro. Test kolonogenny ten stwarza wyjątkowe możliwości prowadzenia badań mechanistycznych nad komórkami progenitorowymi trzustki na poziomie pojedynczej komórki.

Opisano trójwymiarowy test kolonogenny, który pozwala progenitorom o fenotypie trzustkowym na różnicowanie się w kolonie wykazujące ekspresję insuliny. Metoda ta wykorzystuje półstałe podłoża zawierające metylocelulozę, Matrigel oraz czynniki wzrostu, w których pojedyncze komórki progenitorowe proliferują i różnicują się in vitro, co umożliwia ilościowe określenie liczby funkcjonalnych progenitorów w populacji.

Ilościowe oznaczenie progenitorów tworzących kolonie wykazujących ekspresję insuliny

Dziedzina biologii komórek macierzystych i progenitorowych trzustki była ograniczona przez brak funkcjonalnych i ilościowych testów in vitro, które umożliwiają...

W tym filmie zaprezentowano procedurę tworzenia trójwymiarowych hodowli, które umożliwiają różnicowanie się prekursorów przypominających komórki trzustkowe w kolonie wykazujące ekspresję insuliny. Najpierw zdiferencjowane komórki pochodzące z linii murzych embrionalnych komórek macierzystych z knock-in EGFP są dysocjowane i sortowane pod kątem ekspresji EGFP w celu wzbogacenia populacji o prekursory przypominające komórki endokrynne. Posortowane pojedyncze komórki wykazujące ekspresję EGFP są wysiewane na półstałe podłoże zawierające matrigel oraz czynniki wzrostu.Ogranicza to ruchomość poszczególnych komórek progenitorowych, umożliwiając jednocześnie ich przeżycie, proliferację i różnicowanie in vitro. Następnie pod mikroskopem policzono i oceniono liczbę powstałych kolonii o charakterystycznej morfologii, aby obliczyć częstotliwość występowania progenitorów tworzących kolonie w danej posortowanej populacji. Analiza poszczególnych kolonii za pomocą czasu rzeczywistego PCR oraz mikroskopii immunofluorescencyjnej ujawniła ekspresję insuliny w koloniach pochodzących z komórek ngn three pozytywnych, natomiast nie zaobserwowano jej w koloniach z komórek NGN three negatywnych.Główną zaletą stosowania tej techniki w porównaniu do istniejących metod, takich jak hodowla sfer pancreatycznych w zawiesinie, jest możliwość jednoczesnego zbadania większej liczby komórek pod kątem ich wewnętrznej zdolności do tworzenia kolonii progenitorowych. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na pytania dotyczące biologii komórek macierzystych i progenitorowych trzustki, takie jak to, jakie markery wykazują komórki progenitorowe oraz jakie czynniki wewnętrzne lub zewnętrzne są istotne dla utrzymania, samoodnowy i różnicowania tych komórek. Zastosowanie tej techniki może mieć znaczenie dla terapii cukrzycy typu 1, ponieważ jeśli komórki progenitorowe trzustki zostaną zidentyfikowane i poddane różnicowaniu w kierunku komórek podobnych do beta, komórki te mogą zostać wykorzystane do zastąpienia uszkodzonych komórek beta u pacjentów w końcowym stadium cukrzycy typu 1.Metodę tę można również zastosować w innych układach, takich jak badanie komórek progenitorowych tworzących kolonie w trzustce postnatalnej i dorosłej, szpiku kostnym, wątrobie i śledzionie. Zazwyczaj osoby początkujące w tej technice napotykają trudności, ponieważ dysocjacja komórek do postaci zawiesiny jednokomórkowej oraz praca z matrigelem i metylocelulozą podczas przygotowania do dozowania mogą być wymagające. Pomysł na tę metodę pojawił się, gdy zdałem sobie sprawę, że brakuje testu klonogennego pozwalającego zbadać relacje linii rozwojowych między komórkami progenitorowymi a ich zróżnicowanym potomstwem w trzustce.Taki test kolonibiogenny był w przeszłości niezwykle pomocny w badaniach nad hematopoetycznymi komórkami macierzystymi i progenitorowymi. Dostrzegam potrzebę zastosowania takiego testu do badania biologii komórek macierzystych trzustki. Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ półstały komponent podłoża jest z natury lepki, a etapy przygotowania i dozowania są trudne do opanowania.Procedury zaprezentują pan Michael Winkler, student studiów magisterskich, pani Nancy, technik, oraz dr Lang Jing, stażysta podoktorski z laboratorium, w celu przygotowania pożywki warunkowanej do testu kolonogennego, który zostanie przeprowadzony w późniejszym etapie. Neurony z komórek ES są różnicowane in vitro w komórki przypominające komórki trzustkowe. Rozpocznij tę procedurę od zbadania sześciodniowych ciał embrionalnych pod mikroskopem świetlnym.Przynajmniej 30 do 40% z nich powinno mieć średnicę co najmniej 150 mikronów. Większe ciała embrionów powinny zawierać ciemne plamki sugerujące zwiększoną różnicowanie. Przenieś od 80 do 100 ciał embrionów do każdej studni sześcio-studnijkowej płyty do hodowli adhezyjnej, a następnie delikatnie zakręć płytą, aby zebrać ciała embrionów w centrach studni w celu zwiększenia kontaktów międzykomórkowych.Kontakty te prowadzą do lepszego rozwoju komórek przypominających komórki trzustkowe z ciał embrionalnych. Ostrożnie umieść płytki z powrotem w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% carbon dioxide w kulturze. A 13.Wymień medium na świeże medium do hodowli przylegających, zawierające nikotynamid w stężeniu czterokrotnym oraz ludzki rekombinowany aktywny beta B, aby indukować różnicowanie komórek endokrynnych. Następnie wprowadź hodowle z powrotem do inkubatora. W 16. dniu zbierz medium i przefiltruj je przez membranę z polietersulfonu o rozmiarze porów 0,2 mikrona, aby usunąć wszelkie szczątki komórkowe.Od tego momentu zebrane medium będzie określane jako medium warunkowane. Należy podzielić media warunkowane do 15 mililitrowych stożkowatych probówek polipropylenowych i przechowywać je w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do momentu użycia. Neurogenin 3 jest czynnikiem transkrypcyjnym wykazującym ekspresję w progenitorach endokrynnych trzustki podczas rozwoju. Prekursory endokrynne wykazujące ekspresję neurogeniny 3 różnicują się ostatecznie w komórki wykazujące ekspresję glukagonu (alfa), insuliny (beta), somatostatyny (delta), ghreliny (epsilon) oraz polipeptydu trzustkowego. Aby ułatwić identyfikację komórek wykazujących ekspresję NGN3, jeden allel locus NGN3 został zastąpiony genem reporterowym EGFP w linii komórek ES myszy typu knock-in. Powstała linia komórkowa została oznaczona jako NGN3-EGFP. W celu uzyskania zróżnicowanych komórek NGN3-EGFP pozytywnych oraz NGN3-EGFP negatywnych.W 16. dniu komórki są najpierw odrywane od płytek hodowlanych za pomocą trypsyny w celu przygotowania zawiesiny pojedynczych komórek. Agregaty komórkowe inkubuje się z kolagenazą B oraz DNazą I, a następnie przepuszcza przez sito o oczkach 40 lub 70 mikronów. Następnie dodaje się DPI, a komórki są sortowane za pomocą sortera komórkowego na podstawie rozproszenia światła w przód (forward scatter) oraz pod kątem (side scatter), które są odpowiednio wskaźnikami wielkości i ziarnistości komórek i są nanoszone na wykres.Następnie wyznacza się bramkę w celu wyeliminowania zanieczyszczeń niekomórkowych. Do rozróżnienia martwych komórek, które wykazują barwienie dodatnie, stosuje się DPI. Przy pobudzeniu w zakresie 405–413 nm i detekcji emisji za pomocą filtra 454/40, bramkowanie szerokości impulsu (width of the electronic forward scatter pulse) pozwala na wykrycie dubletów, które należy wyeliminować przed przekazaniem do sortera komórek aktywowanych fluorescencją; następnie wykonuje się bramkowanie kanału EGFP FL1 w stosunku do autofluorescencji.Użycie komórek z 16. dnia z kontrolnej rodzicielskiej linii komórkowej, takiej jak TL pokazana na lewym panelu, pozwala wyeliminować autofluorescencję, dzięki czemu populacja komórek dodatnich pod kątem NGN3 EGFP może być wizualizowana, jak pokazano na prawym panelu. Brama sortowania komórek dodatnich dla NGN3 EGFP zostaje celowo przesunięta w prawo, jak wskazano tutaj strzałką, aby ograniczyć zanieczyszczenie komórkami ujemnymi dla NGN3 EGFP podczas sortowania. Po ustaleniu bram komórki dodatnie dla NGN3 EGFP oraz komórki ujemne dla NGN3 EGFP są sortowane i przechowywane w lodzie do czasu użycia w ramach przygotowań do wysiewania.Umieść Matrigel na lodzie w temperaturze 4°C w noc poprzedzającą eksperyment. W dniu eksperymentu następujące odczynniki lub roztwory należy trzymać na lodzie: DMEM/F12, metyloceluloza, medium kondycjonowane, FCS, nikotynamid, XTEND w 4x, VEGF A oraz rekombinowana ludzka aktywna beta B. Umieść sterylne pudełko z końcówkami do pipety o pojemności 200 µL w temperaturze -20°C co najmniej na pół godziny przed użyciem. W ramach przygotowania do wysiewu posortowanych komórek, składniki medium półstałego należy najpierw dodać do polistyrenowej probówki o pojemności 5 mL. Najpierw, używając igły o rozmiarze 16,5 G, pobierz niewielką ilość 3,3% roztworu metylocelulozy do strzykawki.Następnie niezwłocznie wypchnij roztwór, aby usunąć powietrze. Pozwoli to wypełnić przestrzeń martwą w strzykawce roztworem i ułatwi prawidłowy pomiar objętości półstałego roztworu. Następnie, unikając powstawania pęcherzyków powietrza, pobierz i odmierz zamierzoną objętość roztworu metylocelulozy do probówki o pojemności pięciu mililitrów.Dodać medium warunkowane zawierające FCS, nikotynamid oraz czynniki VEGF A i D-M-E-M-F 12. Następnie, używając schłodzonych końcówek do pipety, dodać Matrigel. Na koniec do probówki o pojemności 5 ml dodać pożądaną ilość posortowanych komórek.Komórki należy dodawać zawsze na samym końcu, aby uniknąć ich przedwczesnej stymulacji. Następnie szczelnie zamknąć probówkę i energicznie oraz dokładnie wstrząsnąć nią ręcznie. Ponieważ wstrząsanie powoduje powstawanie pęcherzyków powietrza, probówki należy umieścić na lodzie na pięć minut lub do czasu wypłynięcia małych pęcherzyków powietrza na powierzchnię.Używając strzykawki o pojemności 1 ml z igłą o rozmiarze 18,5 G, pobierz niewielką ilość mieszaniny komórek w medium półstałym i natychmiast usuń powietrze ze strzykawki. Następnie powoli nanieś 500 µL mieszaniny komórek w medium półstałym bezpośrednio do centrum każdego dołka płytki 24-dołkowej o niskim przywieraniu. Każda próbka powinna zostać wysiana w czterech powtórzeniach; do hodowli należy wykorzystać tylko cztery środkowe kolumny poziomo zorientowanej płytki 24-dołkowej.Pozostałe dołki wypełnij sterylną wodą, aby wspomóc nawilżanie hodowli komórkowej. Bezpośrednio po wysiewaniu obejrzy komórki pod mikroskopem świetlnym.Pojedyncze komórki są rozłożone losowo i równomiernie w obrębie studzienek. Inkubować komórki w temperaturze 37°C w atmosferze 5% carbon dioxide przez 8 do 12 dni. Po 8–12 dniach inkubacji ponownie poddać komórki obserwacji pod mikroskopem.To jest dobry przykład równomiernie rozprowadzonego matrigelu w kulturze. Tutaj przedstawiono przykład nierównomiernie rozprowadzonego matrigelu, co skutkuje powstaniem struktur typu „Apache”. Kolonie nie rosną w miejscach, w których brakuje matrigelu.Jest to przykład tła studzienki, w której do półstałej mieszaniny pożywek nie dodano Matrigelu. Aby przeliczyć powstałe kolonie, należy przymocować siatkę pod płytką. Następnie, używając obiektywu 10x, należy obserwować i liczyć kolonie; ze względu na trójwymiarowy charakter podłoża kolonie będą znajdować się w różnych płaszczyznach ostrości.W związku z tym podczas obserwacji pod mikroskopem świetlnym może być wymagana regulacja ostrości dla każdej kolonii; tutaj przedstawiono reprezentatywne mikrografie kolonii wykazujących ekspresję insuliny w kulturze półstałej po 8 do 12 dniach; kolonie wskazane strzałkami są rozproszone przypadkowo i pojawiają się jako małe, ciemne, niewykorzystujące odbicia światła skupiska o średnicy od około 60 do 100 mikronów. Następująca mikrofluidyczna analiza R-T-P-C-R poszczególnych, ręcznie wyselekcjonowanych kolonii wykazała ekspresję insuliny 2 oraz glukagonu, co jest zgodne z naszym poprzednim raportem. Wyniki te demonstrują zdolność pojedynczych komórek NGN3 EGFP-dodatnich do różnicowania się w kolonie zawierające jednocześnie dwa hormony wyspowe, przypominające prymitywne komórki endokrynne pierwszej fali; ekspresja białka eptide, markera nowo powstającej produkcji insuliny, została potwierdzona za pomocą fluorescencyjnego barwienia całego preparatu.Podsumowując, gdy test jednostek tworzących kolonie wykazujące ekspresję insuliny jest przeprowadzany zgodnie z ilustracją w niniejszym raporcie, liczba poszczególnych progenitorów zdolnych do tworzenia kolonii może zostać łatwo określona; jak wykazano tutaj oraz w naszym poprzednim raporcie, jednostki tworzące kolonie wykazujące ekspresję insuliny mogą być wzbogacane poprzez sortowanie komórek pochodnych z linii ES myszy in vitro, które są pozytywne pod kątem NGN EGFP, ale nie negatywne pod kątem ngn three EEG FP. Po opanowaniu ta technika może być wykonana w czasie od jednej do trzech godzin po sortowaniu. Podczas próby przeprowadzenia tej procedury ważne jest, aby pamiętać o całkowitym zdysocjowaniu komórek do zawiesiny pojedynczych komórek oraz utrzymywaniu wszystkich komponentów hodowlanych w lodzie, aby uniknąć krzepnięcia matrigelu, a komórki należy dodawać do probówek na samym końcu, aby uniknąć przedwczesnej stymulacji komórek po wykonaniu tej procedury. Można zastosować inne metody, takie jak manipulacja pojedynczymi komórkami, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, na przykład czy jedna komórka jest wystarczająca do zainicjowania tworzenia kolonii po jej rozwoju.Technika ta utoruje drogę badaczom w dziedzinie biologii macierzystych oraz progenitorowych komórek trzustki. Pozwala im ona badać zdolność do samoodnowy oraz potencjał różnicowania w stronę komórek beta-podobnych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć pełną wiedzę na temat przeprowadzania ilościowego testu kolonogennego dla progenitorów tworzących kolonie wykazujących ekspresję insuliny.

a-quantitative-assay-for-insulin-expressing-colony-forming-progenitors

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ilościowa ocena pochodnych komórek macierzystych tworzących kolonie wytwarzających insulinę

Niniejszy protokół opisuje szybką technikę ilościowego oznaczania translokacji GLUT4 z cytoplazmy do błony plazmatycznej komórek za pomocą cytometrii przepływowej.

Ilościowy pomiar translokacji GLUT4 do błony komórkowej przy użyciu cytometrii przepływowej

Testy kolonii in vitro do wykrywania samoodnawiania i różnicowania komórek progenitorowych wyizolowanych z dorosłej trzustki mysiej zostały opracowane. W tych testach komórki progenitorowe trzustki powodują powstawanie kolonii komórkowych w przestrzeni trójwymiarowej w półstałym podłożu zawierającym metylocelulozę. Opisano protokoły postępowania z pojedynczymi komórkami i charakterystyki poszczególnych kolonii.

In vitro Testy kolonijne do charakteryzowania trójpotencjałowych komórek progenitorowych wyizolowanych z dorosłej mysiej trzustki

Kluczowe wyzwania dla dziedziny badań nad cukrzycą to zrozumienie mechanizmów molekularnych regulujących replikację komórek β wysp trzustkowych oraz opracowanie metod stymulowania regeneracji komórek β. W niniejszym artykule przedstawiono metodę badań przesiewowych o wysokiej zawartości w celu identyfikacji i oceny aktywności małych cząsteczek wspomagającej replikację komórek β.

Platforma odkrywania replikacji β komórek wysp trzustkowych o wysokiej zawartości in vitro

Tutaj prezentujemy metodologię generowania i podawania mikrosfer z poli(kwasu mlekowo-ko-glikolowego) (PLGA) do nienaruszonych mysich wysp trzustkowych w hodowli, a następnie analizy immunofluorescencyjnej proliferacji komórek β. Metoda ta jest odpowiednia do określania skuteczności kandydujących mitogenów β-komórkowych.

Trwałe podawanie mitogenów z komórek β do nienaruszonych wysepek myszy ex vivo przy użyciu biodegradowalnych mikrosfer poli(kwasu mlekowo-ko-glikolowego)

Tutaj prezentujemy jednorodny FRET (HTRF) jako skuteczną metodę szybkiego wykrywania insuliny wydzielanej przez komórki.

Jednorodny, rozdzielczy w czasie test rezonansowy oparty na transferze energii Förstera do wykrywania wydzielania insuliny

Prezentowany tutaj jest protokół pomiaru proliferacji limfocytów T CD4+ w odpowiedzi na antygenowe białka lub peptydy za pomocą rozcieńczenia barwnika. Test ten jest szczególnie czuły w przypadku rzadkich limfocytów T specyficznych dla antygenu i może być modyfikowany w celu ułatwienia klonowania komórek specyficznych dla antygenu.

Kwantyfikacja proliferujących ludzkich limfocytów T CD4 + specyficznych dla antygenu przy użyciu estru sukcynimidylu karboksyfluoresceiny

Ten protokół opisuje, jak przeprowadzić szybkie, tanie testy lucyferazy przy średniej przepustowości przy użyciu lucyferazy Gaussia połączonej z insuliną jako wskaźnika wydzielania insuliny z komórek beta. Test można wykonać za pomocą większości czytników płytek luminescencyjnych i pipet wielokanałowych.

Pomiar względnego wydzielania insuliny za pomocą współwydzielanego surogatu lucyferazy

Różnicowanie komórek macierzystych w komórki wysp trzustkowych stanowi alternatywne rozwiązanie dla konwencjonalnego leczenia cukrzycy i modelowania chorób. Opisujemy szczegółowy protokół hodowli komórek macierzystych, który łączy komercyjny zestaw różnicujący z wcześniej zwalidowaną metodą, aby pomóc w wytwarzaniu wysp trzustkowych wydzielających insulinę pochodzących z komórek macierzystych w naczyniu.

Różnicowanie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w klastry wysp trzustkowych wytwarzających insulinę

Ten artykuł przedstawia protokół ukierunkowanego różnicowania i analizy funkcjonalnej komórek podobnych do komórek β. Opisujemy optymalne warunki hodowli i pasażki dla ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych przed wytworzeniem komórek trzustki produkujących insulinę. Sześcioetapowe różnicowanie postępuje od ostatecznego tworzenia endodermy do funkcjonalnych komórek podobnych do komórek β wydzielających insulinę w odpowiedzi na glukozę.

Zoptymalizowany protokół generowania funkcjonalnych komórek wydzielających insulinę trzustkową z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Opracowaliśmy test hybrydyzacji Duplex in situ do mapowania izoform receptora insuliny IR-A i IR-B w mysim splocie naczyniówkowym, pokonując ograniczenia tradycyjnych metod. To podejście o wysokiej rozdzielczości ujawnia ekspresję specyficzną dla izoformy, oferując nowe informacje na temat sygnalizacji insuliny w mózgu i potencjalnych terapii ukierunkowanych na izoformy w zaburzeniach neurologicznych.

Precyzyjna wizualizacja receptorów insuliny A i B w mózgu myszy za pomocą testu hybrydyzacji RNA in situ

Badanie to opracowało uproszczoną metodę efektywnego wyodrębniania funkcjonalnych wysetek pierwotnych i komórek acynarnych z trzustki myszy, co stanowi cenne narzędzie do badania komunikacji międzykomórkowej w patogenezie ostrej cukrzycy indukowanej zapaleniem trzustki.

Prosta i szybka metoda jednoczesnej izolacji pierwotnych wysp i pierwotnych komórek acinowych trzustki od myszy

Poznaj metodę ilościowego testu kolonii dla progenitorów trzustkowych z ekspresją insuliny. Technika wykorzystuje półstałe podłoże z Matrigel i czynniki wzrostu do badania biologii komórek macierzystych.

Ilościowe oznaczenie progenitorów tworzących kolonie wykazujących ekspresję insuliny

Przeglądaj więcej filmów