Ilościowe oznaczenie progenitorów tworzących kolonie wykazujących ekspresję insuliny

W tym filmie zaprezentowano procedurę tworzenia trójwymiarowych hodowli, które umożliwiają różnicowanie się prekursorów przypominających komórki trzustkowe w kolonie wykazujące ekspresję insuliny. Najpierw zdiferencjowane komórki pochodzące z linii murzych embrionalnych komórek macierzystych z knock-in EGFP są dysocjowane i sortowane pod kątem ekspresji EGFP w celu wzbogacenia populacji o prekursory przypominające komórki endokrynne. Posortowane pojedyncze komórki wykazujące ekspresję EGFP są wysiewane na półstałe podłoże zawierające matrigel oraz czynniki wzrostu.

Ogranicza to ruchomość poszczególnych komórek progenitorowych, umożliwiając jednocześnie ich przeżycie, proliferację i różnicowanie in vitro. Następnie pod mikroskopem policzono i oceniono liczbę powstałych kolonii o charakterystycznej morfologii, aby obliczyć częstotliwość występowania progenitorów tworzących kolonie w danej posortowanej populacji. Analiza poszczególnych kolonii za pomocą czasu rzeczywistego PCR oraz mikroskopii immunofluorescencyjnej ujawniła ekspresję insuliny w koloniach pochodzących z komórek ngn three pozytywnych, natomiast nie zaobserwowano jej w koloniach z komórek NGN three negatywnych.

Główną zaletą stosowania tej techniki w porównaniu do istniejących metod, takich jak hodowla sfer pancreatycznych w zawiesinie, jest możliwość jednoczesnego zbadania większej liczby komórek pod kątem ich wewnętrznej zdolności do tworzenia kolonii progenitorowych. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na pytania dotyczące biologii komórek macierzystych i progenitorowych trzustki, takie jak to, jakie markery wykazują komórki progenitorowe oraz jakie czynniki wewnętrzne lub zewnętrzne są istotne dla utrzymania, samoodnowy i różnicowania tych komórek. Zastosowanie tej techniki może mieć znaczenie dla terapii cukrzycy typu 1, ponieważ jeśli komórki progenitorowe trzustki zostaną zidentyfikowane i poddane różnicowaniu w kierunku komórek podobnych do beta, komórki te mogą zostać wykorzystane do zastąpienia uszkodzonych komórek beta u pacjentów w końcowym stadium cukrzycy typu 1.

Metodę tę można również zastosować w innych układach, takich jak badanie komórek progenitorowych tworzących kolonie w trzustce postnatalnej i dorosłej, szpiku kostnym, wątrobie i śledzionie. Zazwyczaj osoby początkujące w tej technice napotykają trudności, ponieważ dysocjacja komórek do postaci zawiesiny jednokomórkowej oraz praca z matrigelem i metylocelulozą podczas przygotowania do dozowania mogą być wymagające. Pomysł na tę metodę pojawił się, gdy zdałem sobie sprawę, że brakuje testu klonogennego pozwalającego zbadać relacje linii rozwojowych między komórkami progenitorowymi a ich zróżnicowanym potomstwem w trzustce.

Taki test kolonibiogenny był w przeszłości niezwykle pomocny w badaniach nad hematopoetycznymi komórkami macierzystymi i progenitorowymi. Dostrzegam potrzebę zastosowania takiego testu do badania biologii komórek macierzystych trzustki. Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ półstały komponent podłoża jest z natury lepki, a etapy przygotowania i dozowania są trudne do opanowania.

Procedury zaprezentują pan Michael Winkler, student studiów magisterskich, pani Nancy, technik, oraz dr Lang Jing, stażysta podoktorski z laboratorium, w celu przygotowania pożywki warunkowanej do testu kolonogennego, który zostanie przeprowadzony w późniejszym etapie. Neurony z komórek ES są różnicowane in vitro w komórki przypominające komórki trzustkowe. Rozpocznij tę procedurę od zbadania sześciodniowych ciał embrionalnych pod mikroskopem świetlnym.

Przynajmniej 30 do 40% z nich powinno mieć średnicę co najmniej 150 mikronów. Większe ciała embrionów powinny zawierać ciemne plamki sugerujące zwiększoną różnicowanie. Przenieś od 80 do 100 ciał embrionów do każdej studni sześcio-studnijkowej płyty do hodowli adhezyjnej, a następnie delikatnie zakręć płytą, aby zebrać ciała embrionów w centrach studni w celu zwiększenia kontaktów międzykomórkowych.

Kontakty te prowadzą do lepszego rozwoju komórek przypominających komórki trzustkowe z ciał embrionalnych. Ostrożnie umieść płytki z powrotem w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% carbon dioxide w kulturze. A 13.

Wymień medium na świeże medium do hodowli przylegających, zawierające nikotynamid w stężeniu czterokrotnym oraz ludzki rekombinowany aktywny beta B, aby indukować różnicowanie komórek endokrynnych. Następnie wprowadź hodowle z powrotem do inkubatora. W 16. dniu zbierz medium i przefiltruj je przez membranę z polietersulfonu o rozmiarze porów 0,2 mikrona, aby usunąć wszelkie szczątki komórkowe.

Od tego momentu zebrane medium będzie określane jako medium warunkowane. Należy podzielić media warunkowane do 15 mililitrowych stożkowatych probówek polipropylenowych i przechowywać je w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do momentu użycia. Neurogenin 3 jest czynnikiem transkrypcyjnym wykazującym ekspresję w progenitorach endokrynnych trzustki podczas rozwoju. Prekursory endokrynne wykazujące ekspresję neurogeniny 3 różnicują się ostatecznie w komórki wykazujące ekspresję glukagonu (alfa), insuliny (beta), somatostatyny (delta), ghreliny (epsilon) oraz polipeptydu trzustkowego. Aby ułatwić identyfikację komórek wykazujących ekspresję NGN3, jeden allel locus NGN3 został zastąpiony genem reporterowym EGFP w linii komórek ES myszy typu knock-in. Powstała linia komórkowa została oznaczona jako NGN3-EGFP. W celu uzyskania zróżnicowanych komórek NGN3-EGFP pozytywnych oraz NGN3-EGFP negatywnych.

W 16. dniu komórki są najpierw odrywane od płytek hodowlanych za pomocą trypsyny w celu przygotowania zawiesiny pojedynczych komórek. Agregaty komórkowe inkubuje się z kolagenazą B oraz DNazą I, a następnie przepuszcza przez sito o oczkach 40 lub 70 mikronów. Następnie dodaje się DPI, a komórki są sortowane za pomocą sortera komórkowego na podstawie rozproszenia światła w przód (forward scatter) oraz pod kątem (side scatter), które są odpowiednio wskaźnikami wielkości i ziarnistości komórek i są nanoszone na wykres.

Następnie wyznacza się bramkę w celu wyeliminowania zanieczyszczeń niekomórkowych. Do rozróżnienia martwych komórek, które wykazują barwienie dodatnie, stosuje się DPI. Przy pobudzeniu w zakresie 405–413 nm i detekcji emisji za pomocą filtra 454/40, bramkowanie szerokości impulsu (width of the electronic forward scatter pulse) pozwala na wykrycie dubletów, które należy wyeliminować przed przekazaniem do sortera komórek aktywowanych fluorescencją; następnie wykonuje się bramkowanie kanału EGFP FL1 w stosunku do autofluorescencji.

Użycie komórek z 16. dnia z kontrolnej rodzicielskiej linii komórkowej, takiej jak TL pokazana na lewym panelu, pozwala wyeliminować autofluorescencję, dzięki czemu populacja komórek dodatnich pod kątem NGN3 EGFP może być wizualizowana, jak pokazano na prawym panelu. Brama sortowania komórek dodatnich dla NGN3 EGFP zostaje celowo przesunięta w prawo, jak wskazano tutaj strzałką, aby ograniczyć zanieczyszczenie komórkami ujemnymi dla NGN3 EGFP podczas sortowania. Po ustaleniu bram komórki dodatnie dla NGN3 EGFP oraz komórki ujemne dla NGN3 EGFP są sortowane i przechowywane w lodzie do czasu użycia w ramach przygotowań do wysiewania.

Umieść Matrigel na lodzie w temperaturze 4°C w noc poprzedzającą eksperyment. W dniu eksperymentu następujące odczynniki lub roztwory należy trzymać na lodzie: DMEM/F12, metyloceluloza, medium kondycjonowane, FCS, nikotynamid, XTEND w 4x, VEGF A oraz rekombinowana ludzka aktywna beta B. Umieść sterylne pudełko z końcówkami do pipety o pojemności 200 µL w temperaturze -20°C co najmniej na pół godziny przed użyciem. W ramach przygotowania do wysiewu posortowanych komórek, składniki medium półstałego należy najpierw dodać do polistyrenowej probówki o pojemności 5 mL. Najpierw, używając igły o rozmiarze 16,5 G, pobierz niewielką ilość 3,3% roztworu metylocelulozy do strzykawki.

Następnie niezwłocznie wypchnij roztwór, aby usunąć powietrze. Pozwoli to wypełnić przestrzeń martwą w strzykawce roztworem i ułatwi prawidłowy pomiar objętości półstałego roztworu. Następnie, unikając powstawania pęcherzyków powietrza, pobierz i odmierz zamierzoną objętość roztworu metylocelulozy do probówki o pojemności pięciu mililitrów.

Dodać medium warunkowane zawierające FCS, nikotynamid oraz czynniki VEGF A i D-M-E-M-F 12. Następnie, używając schłodzonych końcówek do pipety, dodać Matrigel. Na koniec do probówki o pojemności 5 ml dodać pożądaną ilość posortowanych komórek.

Komórki należy dodawać zawsze na samym końcu, aby uniknąć ich przedwczesnej stymulacji. Następnie szczelnie zamknąć probówkę i energicznie oraz dokładnie wstrząsnąć nią ręcznie. Ponieważ wstrząsanie powoduje powstawanie pęcherzyków powietrza, probówki należy umieścić na lodzie na pięć minut lub do czasu wypłynięcia małych pęcherzyków powietrza na powierzchnię.

Używając strzykawki o pojemności 1 ml z igłą o rozmiarze 18,5 G, pobierz niewielką ilość mieszaniny komórek w medium półstałym i natychmiast usuń powietrze ze strzykawki. Następnie powoli nanieś 500 µL mieszaniny komórek w medium półstałym bezpośrednio do centrum każdego dołka płytki 24-dołkowej o niskim przywieraniu. Każda próbka powinna zostać wysiana w czterech powtórzeniach; do hodowli należy wykorzystać tylko cztery środkowe kolumny poziomo zorientowanej płytki 24-dołkowej.

Pozostałe dołki wypełnij sterylną wodą, aby wspomóc nawilżanie hodowli komórkowej. Bezpośrednio po wysiewaniu obejrzy komórki pod mikroskopem świetlnym.

Pojedyncze komórki są rozłożone losowo i równomiernie w obrębie studzienek. Inkubować komórki w temperaturze 37°C w atmosferze 5% carbon dioxide przez 8 do 12 dni. Po 8–12 dniach inkubacji ponownie poddać komórki obserwacji pod mikroskopem.

To jest dobry przykład równomiernie rozprowadzonego matrigelu w kulturze. Tutaj przedstawiono przykład nierównomiernie rozprowadzonego matrigelu, co skutkuje powstaniem struktur typu „Apache”. Kolonie nie rosną w miejscach, w których brakuje matrigelu.

Jest to przykład tła studzienki, w której do półstałej mieszaniny pożywek nie dodano Matrigelu. Aby przeliczyć powstałe kolonie, należy przymocować siatkę pod płytką. Następnie, używając obiektywu 10x, należy obserwować i liczyć kolonie; ze względu na trójwymiarowy charakter podłoża kolonie będą znajdować się w różnych płaszczyznach ostrości.

W związku z tym podczas obserwacji pod mikroskopem świetlnym może być wymagana regulacja ostrości dla każdej kolonii; tutaj przedstawiono reprezentatywne mikrografie kolonii wykazujących ekspresję insuliny w kulturze półstałej po 8 do 12 dniach; kolonie wskazane strzałkami są rozproszone przypadkowo i pojawiają się jako małe, ciemne, niewykorzystujące odbicia światła skupiska o średnicy od około 60 do 100 mikronów. Następująca mikrofluidyczna analiza R-T-P-C-R poszczególnych, ręcznie wyselekcjonowanych kolonii wykazała ekspresję insuliny 2 oraz glukagonu, co jest zgodne z naszym poprzednim raportem. Wyniki te demonstrują zdolność pojedynczych komórek NGN3 EGFP-dodatnich do różnicowania się w kolonie zawierające jednocześnie dwa hormony wyspowe, przypominające prymitywne komórki endokrynne pierwszej fali; ekspresja białka eptide, markera nowo powstającej produkcji insuliny, została potwierdzona za pomocą fluorescencyjnego barwienia całego preparatu.

Podsumowując, gdy test jednostek tworzących kolonie wykazujące ekspresję insuliny jest przeprowadzany zgodnie z ilustracją w niniejszym raporcie, liczba poszczególnych progenitorów zdolnych do tworzenia kolonii może zostać łatwo określona; jak wykazano tutaj oraz w naszym poprzednim raporcie, jednostki tworzące kolonie wykazujące ekspresję insuliny mogą być wzbogacane poprzez sortowanie komórek pochodnych z linii ES myszy in vitro, które są pozytywne pod kątem NGN EGFP, ale nie negatywne pod kątem ngn three EEG FP. Po opanowaniu ta technika może być wykonana w czasie od jednej do trzech godzin po sortowaniu. Podczas próby przeprowadzenia tej procedury ważne jest, aby pamiętać o całkowitym zdysocjowaniu komórek do zawiesiny pojedynczych komórek oraz utrzymywaniu wszystkich komponentów hodowlanych w lodzie, aby uniknąć krzepnięcia matrigelu, a komórki należy dodawać do probówek na samym końcu, aby uniknąć przedwczesnej stymulacji komórek po wykonaniu tej procedury. Można zastosować inne metody, takie jak manipulacja pojedynczymi komórkami, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, na przykład czy jedna komórka jest wystarczająca do zainicjowania tworzenia kolonii po jej rozwoju.

Technika ta utoruje drogę badaczom w dziedzinie biologii macierzystych oraz progenitorowych komórek trzustki. Pozwala im ona badać zdolność do samoodnowy oraz potencjał różnicowania w stronę komórek beta-podobnych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć pełną wiedzę na temat przeprowadzania ilościowego testu kolonogennego dla progenitorów tworzących kolonie wykazujących ekspresję insuliny.