Wychwytywanie limfocytów T CD4+ za pomocą jednorazowego chipa mikroprzepływowego dla HIV

Cześć, nazywam się Richard Lin i jestem badaczem w grupie profesora TI Mercy na Wydziale Nauk o Zdrowiu i Technologii Harvard MIT. Projekt, nad którym pracuję, polega na ilościowym określeniu i wychwyceniu limfocytów T CD czterech dodatnich i C3-dodatnich. U pacjenta krew ma być używana w warunkach ograniczonych zasobów.

Tuż przede mną mamy urządzenie do mikronapełniania, które składa się z PDMS, czyli polifetylu sloane. Urządzenie, sam kanał, wysoki ma wysokość 50 mikrometrów, a całkowita objętość w urządzeniu to 10 mikrolitrów. Jest to więc niezwykle precyzyjne urządzenie, którego użyjemy do wychwytywania limfocytów T pomocniczych.

Zasadniczo jest to diagnostyczny punkt odniesienia dla pacjentów z HIV. Tak więc powierzchnia urządzenia mikroprzepływowego została już przygotowana z białkiem i przeciwciałami CD four dodatnimi w strzykawce. W tej chwili mamy tylko bufor biologiczny PBS o pH 7,4 i teraz wprowadzimy go do kanału, aby wypłukać dodatkowe przeciwciało CD 4 dodatnie.

Na tym etapie stawka nie musi być kontrolowana, ponieważ po prostu staramy się wypłukać dodatkowe rzeczy i tak naprawdę nie ma znaczenia, jaka jest nasza stawka. To jest miejsce, w którym będą wloty urządzenia, a to będą wyloty do naszego, po mojej lewej i po twojej prawej stronie. Więc teraz wypłuczę dodatkowy roztwór przeciwciał i jeśli zauważysz z wylotu, że wypływa płyn, wiesz, że jest to bardzo mała ilość, ale jeśli przyjrzysz się uważnie, zobaczysz, że płyn powietrzny wydostaje się z kanału przez rurkę.

Tak więc teraz, gdy wypłukaliśmy dodatkowy roztwór przeciwciał, możemy teraz przygotować się do wstrzyknięcia krwi. Więc teraz odłączę rurkę od wlotu. Więc teraz otworzymy nową strzykawkę do krwi, krwi ludzkiej, krwi pełnej.

Nie jest to więc próbka od pacjenta, ale od zdrowej próbki, od zdrowego pacjenta, podczas gdy my przygotowujemy się do wstrzyknięcia krwi do urządzenia mikroprzepływowego. Więc przymocujemy strzykawkę do pompy strzykawkowej. Teraz włączymy i zobaczysz natężenie przepływu strzykawki i ustawiliśmy je na pięć mikrolitrów na minutę.

A teraz w zasadzie przygotujemy się do wstrzyknięcia krwi. Umieścimy pompkę strzykawkową pionowo, ponieważ, jak wiemy, komórki krwi tworzą osady i będziemy chcieli, aby komórki przepływały do kanału. Więc raczej mieć osad komórkowy na dnie, który znajduje się tuż obok naszej rurki.

Więc teraz wszystko jest gotowe do pracy. Objętość mojego urządzenia wynosi 10 mikrolitrów na 10 mikrolitrów. A objętość, którą chcemy wpłynąć do ściany kanału, to również 10 mikrolitrów.

Więc mogę stwierdzić, czy płynę w wystarczającej ilości krwi, patrząc tylko na kolor kanału, jeśli jest cały czerwony, cały wypełniony, to wiem, że płynę w 10 mikrolitrach i powinienem zatrzymać zderzak strzykawki. Więc teraz naciskam przycisk start i czasami się uruchamia, czasami zajmuje to trochę czasu, zanim krew faktycznie dostanie się do kanału. A to w dużej mierze wynika z presji.

Na przykład, kiedy umieściliśmy tam strzykawkę, czasami, no wiecie, pobieraliśmy lub wstrzykiwaliśmy płyn odpowiednio, aby dostosować krew w rurce. Więc może to coś potrwać, może to trochę potrwać, ale gdy zacznie pompować do kanału, natężenie przepływu jest ustawione na ly na minutę, czyli to, czego chcemy. Możemy więc być trochę cierpliwi i czekać, czasami trzeba czekać jakieś dwie, trzy minuty, zanim krew zacznie płynąć do kanału.

Właściwie widzicie teraz, że krew zaczyna płynąć do kanału. Więc możesz teraz powiedzieć, że urządzenie jest prawie całkowicie wypełnione. Okej, więc teraz przełączymy rurkę z powrotem na PBS, aby wypłukać krew znajdującą się w kanale.

Aby to zrobić, powtórzymy to, co już zrobiliśmy, aby usunąć rurkę. Ponieważ nadal musimy kontrolować szybkość przepływu PBS, nadal potrzebujemy pompki strzykawkowej. Ponieważ jednak nie płynie już krew, nie musimy pozostawiać pompki strzykawkowej w pozycji pionowej, ponieważ w PBS nie ma komórek.

Więc teraz wszystko jest gotowe i teraz wypłuczemy krew z urządzenia, a ja ponownie nacisnę ostry przycisk tutaj. Jak więc widać, urządzenie zaczyna się oczyszczać. Na brzegach jest jeszcze trochę krwi, ale powoli znika.

Więc gdy cała krew zniknie, zwiększymy szybkość z pięciu mikrolitrów na minutę do 20 mikrolitrów na minutę. Powodem tej zmiany jest to, że we krwi są dwa typy komórek, które mają antygeny C, cztery, dodatnie. Jednym z nich jest to, czego szukaliśmy, limfocyty T pomocnicze.

Drugi to to, co nazywamy monocytami. Chcemy mieć pewność, że nasze urządzenie wychwytuje tylko limfocyty pomocnicze T, a nie oba limfocyty pomocnicze T i monocyty. Metoda, którą stosujemy, polega na zwiększeniu natężenia przepływu, ponieważ wiemy, że monocyty są większe niż limfocyty T pomocnicze.

Tak więc, zwiększając natężenie przepływu, większe monocyty będą odczuwać większe ciśnienie, aby opuścić powierzchnię niż CD cztery dodatnie limfocyty T pomocnicze. Więc teraz jest to w przybliżeniu 20 minut. Więc w mojej ręce w tej chwili jest to rozwiązanie.

Nazywa się to rozwiązaniem do licencjonowania faksów. Celem tego jest kłamstwo czerwonych krwinek. Tak więc wszędzie tam, gdzie w kanale pozostaną czerwone krwinki, ten roztwór będzie leżał.

To jest rozcieńczane 10, 10 razy od roztworu podstawowego. Więc teraz zamierzamy zatrzymać pompę strzykawkową, usunąć rurkę i zasadniczo zastąpić roztwór roztworem z tej strzykawki. Więc teraz zatrzymuję maszynę, wyjmuję rurkę, zdejmuję to, biorę to z tą strzykawką, wymieniam na nową.

Okej, więc teraz, gdy wszystko mam skonfigurowane, zmniejszymy szybkość z powrotem do pięciu mikrolitrów na minutę. Więc klikniemy stawkę z 20, zmniejszymy ją do pięciu, a teraz będziemy korzystać z rozwiązania z licencją faksu przez 20 minut. A teraz naciśniemy start.

Tak więc w tej chwili przed nami znajduje się optyczny obraz urządzenia wykonany w 10-krotnym powiększeniu. Więc możesz sam odróżnić te wszystkie białe kropki tutaj. Jak więc możemy się upewnić, że te komórki są tymi, których szukamy?

Używamy więc kilku różnych barwników, aby upewnić się, że pierwsza plama, której używamy, jest tym, co nazywamy dpi, wszystko to plami w plamach DPI w jądrze. Więc w zasadzie wszystkie komórki z jądrem, takie jak białe krwinki z wszystkimi plamami, podczas gdy powiedzmy, czerwone krwinki, które nie mają jądra, nie byłyby zabarwione i można powiedzieć, że jest to na całym obrazie. To wszystkie te niebieskie kropki i każda z nich z niebieskim.

jest komórką. Następnym krokiem jest sprawdzenie, czy komórki mają to, co nazywamy antygenem C-4-dodatnim. Jest to niezwykle ważne, ponieważ głównym celem naszego urządzenia jest wychwycenie komórek C czterech dodatnich.

Następne, fluorescencyjne przeciwciało, którego używamy, jest oczywiście specyficzne dla C-czterech. I przejdź do następnego slajdu. Na tym zdjęciu komórki są znacznie ciemniejsze, ponieważ przeciwciało fluorescencyjne, którego używamy, zwykle odpowiada za fakty.

Tak więc rozcieńczenie jest znacznie wyższe. Ale jeśli przyjrzysz się dość uważnie, nadal możesz stwierdzić, że nadal są kropki, które zaśmiecają ten widok pola. Są dość ciemne.

Ale po bliższym przyjrzeniu się możemy stwierdzić, że te komórki są w DC dla dodatniego, co jest dobre, ponieważ to jest dokładnie to, czego chcemy. Następnym testem jest, jak wspomniałem wcześniej, istnieją dwa różne typy komórek C-4 dodatnich. Jednym z nich są limfocyty pomocnicze T, a drugim nazywamy monocytami.

Więc znowu potrzebujemy kolejnego przeciwciała fluorescencyjnego, aby rozróżnić te dwie komórki. Wiemy więc, że w limfocytach T pomocniczych mają na sobie to, co nazywamy CD trzema dodatnimi antygenami. Podczas gdy w przypadku monocytów nie.

Następnym przeciwciałem, którego używamy, jest specyficzne dla CD 3, które zobaczymy na tym obrazku. Więc znowu możesz powiedzieć, że ich kropki zaśmiecają się wokół urządzenia, one, kropki wyglądają na większe, ponieważ czasami niektóre komórki po prostu świecą jaśniej, inne nie. Mam na myśli to, że w tym przypadku wiele rzeczy jest przypadkowych, ale w większości przypadków te kropki w jaskrawoczerwonych kropkach to wszystkie komórki.

Więc po prostu, znowu, to, czego chcemy, ponieważ po pierwsze, upewniamy się, że nasze komórki są CD 4 dodatnie i CD 3 dodatnie. Więc w tym przypadku możesz powiedzieć, że wiele naszych komórek jest w d CD trzy dodatnie, co jest dobre. Daje nam to konkretność w naszym ujęciu.

Duże dos, to mogą być śmieci, ale często zdarza się, że komórka po prostu zbiera więcej płyt CD trzy spłukania, CD trzy na siebie. Na tym zdjęciu jest to jedna z danych, które zebraliśmy dla tego urządzenia do mikropłynów i jest to w zasadzie profesjonalista w przechwytywaniu komórek. Więc w poprzednim, wiecie, slajdy, tak dalej, można powiedzieć, że było dużo, no wiecie, obrazków z komórkami na nich.

Ale do czego tak naprawdę się one kumulują? Otóż kumulują się one do profilu przechwytywania komórek, w takim przypadku możemy wykreślić na osi X mamy odległość od wlotu, a na osi Y mamy dysk komórki przechwytującej. I możecie to stwierdzić w całym urządzeniu, wiecie, wasza gęstość początkowo jest bardzo wysoka, a potem powoli maleje, czego byśmy się spodziewali, ponieważ wychwytujemy komórki C cztery dodatnie i trzy po, C3 dodatnie z krwiobiegu, a oni będą zmniejszać stężenie tych komórek w próbce krwi.

I tak w zasadzie zazwyczaj prezentowane są nasze dane.