Name: Rozpoznawanie transglutaminazy naskórkowej za pomocą przeciwciał IgA i tkankowej transglutaminazy 2 w rzadkim przypadku rezusowego zapalenia skóry (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-15T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: Poznaj metodę wizualizacji reakcji autoimmunologicznej w skórze makaków rhesus z zapaleniem skóry przy użyciu przeciwciał IgA i transglutaminazy naskórkowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Amandzie Tardo, dr. Mostafie Bouljihadowi, Stephanie Feely, Carol Coyne, dr Erin Ribka, dr. Pete’owi Didierowi oraz Dorothy Kuebler za pomoc techniczną. Praca ta była wspierana przez granty NIH R01-DK076653 oraz 3R01-DK076653-02S1 przyznane K.S. oraz podstawowy grant operacyjny TNPRC RR000164.

1. Pobieranie próbek biopsji skóry
<ol>
	<li>Przed przystąpieniem do procedury biopsji skóry, podaj zwierzętom domięśniowo 2,5 mg/kg mieszaniny chlorowodorku tiletaminy i chlorowodorku zolazepamu (Telazol; Fort Dodge Animal Health, Fort Dodge, IA). Monitoruj zwierzęta od momentu podania środka znieczulającego aż do utraty przytomności, a następnie wyjmij je z klatki.</li>
	<li>Usuń owłosienie z obszaru skóry zainteresowania, używając weterynaryjnej maszynki do strzyżenia Oster Golden A5 Single Speed z ostrzem nr 40 (Oster Professional Products, McMinnville, TN), a następnie przygotuj pole aseptycznie, naprzemiennie stosując betadynę i alkohol. Załóż sterylną draperię z otworem nad wybranym miejscem biopsji.</li>
	<li>Stosując technikę sterylną, przyłóż do skóry instrument do biopsji skóry Miltex Punch o średnicy 4,0 mm (Miltex, York, PA), obracając narzędzie o 180 stopni zgodnie i przeciwnie do ruchu wskazówek zegara z lekkim naciskiem, aż do momentu, gdy treasures przebiją warstwy skóry i dotrą do tkanki podskórnej. Wyjmij próbkę do biopsji, chwyć wyciętą część skóry pęsetą i oddziel ją od tkanki podskórnej.</li>
	<li>Zamknij defekt skóry, używając nici nylonowej 3-0 z igłą tnącą 3/8 koła (Ethilon, Ethicon, Johnson &amp; Johnson Medical Limited, Berkshire, UK), wykonując szew w kształcie krzyża. Wszystkim zwierzętom podaj domięśniowo 0,01 mg/kg chlorowodorku buprenorfiny (Hospira, Lake Forest, IL) w celu zapewnienia pooperacyjnego leczenia przeciwbólowego.</li>
</ol>
2. Obróbka próbek
<ol>
	<li>Należy pracować z próbkami biopsji skóry pobranymi od makaków rezus z przewlekłym zapaleniem skóry oraz od zdrowych osobników kontrolnych. Z każdego zwierzęcia należy pobrać od dwóch do trzech próbek biopsji (o średnicy 4 mm).</li>
	<li>Pierwszą próbkę utrwalono w formalinie cynkowej (Z-fix, Anatech Ltd., Battle Creek, MI) przez 24 godziny, przemyto w wodzie przez 30 min, krótko przemyto w 70% etanolu, a następnie umieszczono w procesorze tkanek ASP300 Leica (Leica Microsystems Inc., Buffalo Grove, KS), gdzie tkankę odwodniono w rosnących stężeniach etanolu: 70%, 80%, 95% i 100% przez 48 min każdy (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA), a następnie dwukrotnie wymieniono ksylen (Fisher).</li>
	<li>Próbki zatopiono w parafinie (Fisher) do długoterminowego przechowywania w temperaturze pokojowej. Przed skrawaniem schłodzono do -20oC na 20 min. Przygotowano skrawki o grubości 6 μm za pomocą mikrotomu obrotowego (HM325, Microm International, Waldorf, Germany). Skrawki umieszczono na szkiełkach ładunekowych (Fisher) i suszono na powietrzu w 60oC przez noc. Przeprowadzono barwienie hematoksyliną i eozyną (H&amp;E) standardową metodą (opisaną poniżej).</li>
	<li>Drugą próbkę utrwalono w 2% paraformaldehydzie (USB Corp, Cleveland, OH) przez 30 min w temperaturze pokojowej, przemyto trzykrotnie w buforze fosforanowym (PBS, Gibco-Invitrogen, Carlsbad, CA), pozostawiono w 30% sacharozie (Fisher) na 4 godziny, a następnie zatopiono w medium mrożącym OCT (Sakura Finetek, Torrence, CA). Przed skrawaniem przechowywano w -80oC przez 20 min. Przygotowano skrawki o grubości 15 μm za pomocą kriotomu (HM560, Thermo Scientific, Kalamazoo, MI).</li>
</ol>
3. Barwienie H&amp;E
<ol>
	<li>Usunąć parafinę z zatopionych przekrojów poprzez trzykrotne płukanie w ksylenach (Fisher), a następnie nawodnić w szeregu stężeń etanolu: trzykrotne płukanie w 100%, dwukrotne w 95%, jednokrotne w 80% oraz w wodzie destylowanej, po 2 min każdego etapu.</li>
	<li>Barwić hematoksyliną (Richard-Allan Scientific, Kalamazoo, MI) przez jedną minutę, a następnie krótko płukać pod bieżącą wodą z kranu.</li>
	<li>Barwić kontrastowo eozyną (Sigma) przez 6 min.</li>
	<li>Odwodnić zabarwione tkanki w etanolu 95% i absolutnym, dwa razy po 2 min, a następnie odbarwić w trzech zmianach ksylenów, po 3 min każda.</li>
	<li>Przymocować szkiełko coverglass przy użyciu medium montażowego Cytoseal Mounting Medium (Richard-Allan Scientific) na przekrojach tkanek zabarwionych metodą H&amp;E.</li>
</ol>
4. Ocena histopatologiczna
Przezbadaj barwione H&amp;E skrawki biopsji skóry pod mikroskopem świetlnym, stosując powiększenia od 4 do 40x oraz mikroskop Leica z cyfrową kamerą SPOT Insight (Digital Instruments Inc., Michigan, USA).
5. Barwienie immunofluorescencyjne
<ol>
	<li>Do barwienia immunofluorescencyjnego należy wykorzystać skrawki skóry zatopione w OCT. Przed barwieniem namoczyć je przez 20 min w PBS zawierającym 0,2% żelatyny ze skóry rybiej (FSG, Sigma) z dodatkiem 0,1% Triton X-100 (Sigma), aby usunąć OCT i przeprowadzić permeabilizację tkanki.</li>
	<li>Po wypłukaniu preparatów inkubować je z 10% normalnym surowicą kozią (NGS, Sigma), rozcieńczoną w PBS-FSG, przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w wilgotnej komorze do preparatów.</li>
	<li>W celu wizualizacji złogów przeciwciał IgA i tTG2 inkubować preparaty z przeciwciałami pierwszorzędowymi anty-rhesus IgA oraz anty-tTG2, rozcieńczonymi w 10% NGS-PBS-FSG, przez 1 godzinę.</li>
	<li>Przemyć PBS–FSG–Triton X-100 (Sigma) przez 10 min, a następnie PBS-FSG przez 10 min.</li>
	<li>Inkubować z wtórnymi, izotypowo specyficznymi przeciwciałami znakowanymi fluorochromami Alexa Fluor 488 (zielony), 568 (czerwony) lub 633 (niebieski) (Molecular Probes-Invitrogen) w rozcieńczeniu 1:1 000. Do wizualizacji DNA jądrowego użyć barwnika ToPro-3. Jako rozcieńczalnik przeciwciał zastosować 10% NGS-PBS-FSG.</li>
	<li>Do montowania zbarwionych skrawków tkanki użyć roztworu anty-quenching (Sigma).</li>
</ol>
6. Obrazowanie konfokalne
Obrazowanie należy przeprowadzić przy użyciu konfokalnego skaningowego mikroskopu laserowego Leica TCS SP2 True Confocal Laser Scanning Microscope (Leica, Wetzlar, Niemcy) wyposażonego w trzy lasery (dostępnych sześć linii wzbudzenia): laser argonowo-kryptonowy o długości fali 488 nm (zielony), laser kryptonowy o długości fali 568 nm (czerwony) oraz laser helowo-neonowy o długości fali 633 nm (niebieski), które obejmują zakres od widzialnego do dalekoczerwonego obszaru widma. Należy zarejestrować obrazy w kontraście interferencyjnym różnicowym (DIC) w celu oceny architektury tkanki nieoznakowanej.
7. Reprezentatywne wyniki
Przykład pozytywnego rozpoznania eTG zarówno przez tTG2, jak i przeciwciała IgA przedstawiono na ryc. 3A. Zgodnie z sytuacją u pacjentów ludzkich oraz ze względu na znacznie niższą częstość występowania zapalenia skóry typu DH niż nadwrażliwości na gluten typu CD również u makaków rezus, oczekuje się, że większość próbek biopsji skóry wykaże reakcję pozytywną z przeciwciałami tTG2, ale bez obecności komórek podwójnie pozytywnych tTG2+IgA+ (ryc. 4). Przypadki niezwiązane z DH, w tym przypadki zapalenia skóry o pochodzeniu mikrobiologicznym, wykażą niektóre pojedynczo pozytywne komórki IgA+ rozproszone pod nabłonkiem, ale bez nakładania się widm markerów znakowanych tTG2 i IgA (ryc. 3B i 4). Dlatego ważne jest zachowanie kolejności sugerowanych procedur testowych, zaczynając od badania klinicznego (ryc. 1), a następnie oceny histopatologicznej (ryc. 2); dopiero w przypadku, gdy nie można zidentyfikować innych, częstszych czynników wywołujących zapalenie skóry, uzasadnione jest badanie biopsji skóry barwionych na tTG2 i IgA za pomocą mikroskopii konfokalnej. Same oceny kliniczne i/lub histopatologiczne nie są wystarczające do postawienia pozytywnej diagnozy tego stanu. W przypadkach, gdy w obszarze brodawek skórnych zidentyfikowane zostaną komórki podwójnie pozytywne (tTG2+IgA+), można postawić diagnozę zapalenia skóry typu DH. W takich sytuacjach zaleca się odstawienie glutenu z diety i wprowadzenie diety bezglutenowej w celu złagodzenia objawów zapalenia skóry.
<img alt="Porównanie podrażnień skóry; obrazy obok siebie pokazują różne stopnie nasilenia, badanie dermatologiczne." src="/files/ftp_upload/3154/3154fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Region pachwinowy makaka EM96 przed (A) i po (B) 5-tygodniowym odstawieniu glutenu z diety. Ponowne wprowadzenie glutenu do diety zbiegło się w czasie z ponownym pojawieniem się zapalenia skóry (C).
<img alt="Analiza preparatu histologicznego, histopatologia tkanki skóry, porównanie struktury komórkowej, obraz mikroskopowy." src="/files/ftp_upload/3154/3154fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Barwienie HE biopsji skóry makaka EM96 pobranych przed (A) i po (B) 9-tygodniowym odstawieniu glutenu z diety. A: Nabłonek jest pogrubiony (7-15 warstw komórek nabłonkowych) z grubą, powierzchowną strupem z hiperkeratycznych komórek naciekniętych degenerującymi neutrofilami. Neutrofile występują również wewnątrz nabłonka i mieszają się z umiarkowaną liczbą limfocytów, plazmocytów i histiocytów wokół przydatków w górnej części skóry właściwej. B: Nadal występuje pewna hiperkeratoza, grubość nabłonka jest znormalizowana (4-7 warstw) przy minimalnym nacieku limfoplasmacytowym w górnej części skóry właściwej. C: Dla porównania dołączono normalną skórę brzucha makaka FR56, bez nacieku limfoplasmacytowego. Powiększenie 20x.
<img alt="Mikroskopia immunofluorescencyjna tkanki skóry wykazująca barwienie dla IgA, TG2 oraz jąder komórkowych; schemat." src="/files/ftp_upload/3154/3154fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Obrazy z mikroskopii konfokalnej biopsji skóry makaka EM96 pobranych przed (A) i po (B) 9-tygodniowym odstawieniu glutenu z diety. A: barwienie IgA (zielony), tTG2 (czerwony) i marker DNA jądrowego ToPro-3 (niebieski). Kolokalizacja IgA i tTG2 widoczna jest w kolorze żółtym wokół obszaru brodawek skóry właściwej. B: próbka skóry pobrana po 9 tygodniach diety bezglutenowej nie wykazuje obecności IgA w obrębie nabłonka, podczas gdy w obszarze podnabłonkowym wciąż obecne jest IgA (zielony), tTG2 (czerwony) i marker DNA jądrowego ToPro-3 (niebieski).
<img alt="Przekrój histologiczny, obraz mikroskopii fluorescencyjnej struktury tkanki, analiza rozmieszczenia komórek." src="/files/ftp_upload/3154/3154fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4. Obrazy z mikroskopii konfokalnej biopsji skóry małpy rhesus GI24 pobranych w czasie, gdy zwierzę przejawiało objawy przewlekłego zapalenia skóry (niezwiązanego z DH). Barwienie IgA jest zielone, tTG2 czerwone, a marker DNA jądrowego ToPro-3 jest niebieski. Komórki tTG2+ znajdują się w obrębie nabłonka, kilka komórek IgA+ pod nabłonkiem, przy czym nie obserwuje się rozległego nakładania się widm markerów czerwonego i zielonego.
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Znakowanie zwierząt</td>
			<td>Płeć 
			[M/K]</td>
			<td>Wiek 
			[Lata]</td>
			<td>Objawy kliniczne</td>
			<td>tTG2 w osoczu 
			przeciwciała</td>
			<td>Dieta 
			[1,2]*</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HJ71</td>
			<td>F</td>
			<td>1.3</td>
			<td>Zdrowy</td>
			<td>-</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HD13</td>
			<td>M</td>
			<td>1.4</td>
			<td>Zdrowa, sporadyczna biegunka</td>
			<td>+</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FR56</td>
			<td>M</td>
			<td>5.4</td>
			<td>Przewlekła idiopatyczna biegunka</td>
			<td>-</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EM96</td>
			<td>F</td>
			<td>5.0</td>
			<td>Przewlekłe zapalenie skóry</td>
			<td>+/- (wynik graniczny)</td>
			<td>1 i 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GI24</td>
			<td>F</td>
			<td>4.6</td>
			<td>Przewlekłe zapalenie skóry</td>
			<td>-</td>
			<td>1</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1. Małpy z gatunku rhesus macaque z TNPRC wykorzystane do pobrania biopsji skóry
* Dieta 1 – zwykła karma dla małp (zawierająca gluten); Dieta 2 – dieta bezglutenowa

<ol><li>Diosdado, B., Wijmenga, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+the+adaptive%2C+innate+and+regulatory+immune+responses+in+the+intestinal+mucosa+of+celiac+disease+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Expert.+Rev.+Mol.+Diagn%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of the adaptive, innate and regulatory immune responses in the intestinal mucosa of celiac disease patients.</a> Expert. Rev. Mol. Diagn. 5 (5), 681-700 (2005).</li>
<li>Schuppan, D., Dennis, M. D., Kelly, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Celiac+disease%3A+epidemiology%2C+pathogenesis%2C+diagnosis%2C+and+nutritional+management%5BTitle%5D)+AND+%22Nutr.+Clin.+Care%22%5BJournal%5D)">Celiac disease: epidemiology, pathogenesis, diagnosis, and nutritional management.</a> Nutr. Clin. Care. 8 (2), 54-69 (2005).</li>
<li>Sardy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+transglutaminase+%28TGase+3%29+is+the+autoantigen+of+dermatitis+herpetiformis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Epidermal transglutaminase (TGase 3) is the autoantigen of dermatitis herpetiformis.</a> J. Exp. Med. 195 (6), 747-757 (2002).</li>
<li>Rose, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoantibodies+against+epidermal+transglutaminase+are+a+sensitive+diagnostic+marker+in+patients+with+dermatitis+herpetiformis+on+a+normal+or+gluten-free+diet%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Acad.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Autoantibodies against epidermal transglutaminase are a sensitive diagnostic marker in patients with dermatitis herpetiformis on a normal or gluten-free diet.</a> J. Am. Acad. Dermatol. 61 (1), 39-43 (2009).</li>
<li>Bethune, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transepithelial+transport+and+enzymatic+detoxification+of+gluten+in+gluten-sensitive+rhesus+macaques%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Transepithelial transport and enzymatic detoxification of gluten in gluten-sensitive rhesus macaques.</a> PLoS ONE. 3 (3), e1857-e1857 (2008).</li>
<li>Mazumdar, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+transepithelial+passage+of+the+immunogenic+33-residue+peptide+from+%CE%B1-2+gliadin+in+gluten-sensitive+macaques%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Visualization of transepithelial passage of the immunogenic 33-residue peptide from α-2 gliadin in gluten-sensitive macaques.</a> PLoS ONE. 5 (4), e10228-e10228 (2010).</li>
<li>Schuppan, D., Junker, Y., Barisani, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Celiac+disease%3A+from+pathogenesis+to+novel+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Celiac disease: from pathogenesis to novel therapies.</a> Gastroenterol. 137 (6), 1912-1933 (2009).</li>
<li>Hunt, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Newly+identified+genetic+risk+variants+for+celiac+disease+related+to+the+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genet%22%5BJournal%5D)">Newly identified genetic risk variants for celiac disease related to the immune response.</a> Nature Genet. 40 (4), 395-402 (2008).</li>
<li>Abadie, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+genetic+and+immunological+insights+into+a+model+of+celiac+disease+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Integration of genetic and immunological insights into a model of celiac disease pathogenesis.</a> Annu. Rev. Immunol. 29, 493-525 (2011).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Nasz nowo opracowany model nadwrażliwości na gluten u naczelnych niedzkości został niedawno wykorzystany do zbadania zmian przepuszczalności jelitowej wywołanych glutenem w diecie 5,6. U niektórych makaków z nadwrażliwością na gluten wykryto przeciwciała tTG2 w osoczu oraz złogi tTG2+IgA+ w jelitach. Ponieważ w ostatnim czasie zidentyfikowano rzadkie przypadki idiopatycznego zapalenia skóry u makaków rezus w kolonii, dla których nie udało się ustalić typowej etiologii (zakaźnej/metabolicznej), celem niniejszeg...

<table><tbody><tr><td>Przeciwciało przeciw ludzkiej IgA-FITC *</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F-5259</td><td>roztwór roboczy 1:100</td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciw ludzkiej tTG2</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>MS-300-P1ABX</td><td>roztwór roboczy 1:100</td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciw mysiej IgG1 **</td><td>Invitrogen</td><td>A-21124</td><td>roztwór roboczy 1:1,000</td></tr><tr><td>Sonda DNA ToPro-3 ***</td><td>Invitrogen</td><td>T-3605</td><td>roztwór roboczy 1:1,000</td></tr><tr><td>Formalina cynkowa (Z-fix)</td><td>Anatech Ltd., Battle Creek, MI</td><td>171</td><td></td></tr><tr><td>Medium do zamrażania OCT</td><td>Sakura Finetek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Medium montażowe Cytoseal</td><td>Richard-Allan Scientific</td><td>8312-4</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór przeciw wygaszaniu (Anti-Quenching)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P 3130</td><td></td></tr><tr><td>Ethilon (szew nylonowy)</td><td>Ethicon Inc.</td><td>663G</td><td></td></tr><tr><td>Przyrząd do dermalnej biopsji punch Miltex</td><td>Miltex Inc.</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Jednobiegowa maszynka weterynaryjna Oster Golden A5 z głowicą nr 40</td><td>Oster Professional Products</td><td>78005-050</td><td></td></tr><tr><td>Procesor tkankowy Leica</td><td>Leica Microsystems</td><td>ASP300</td><td></td></tr><tr><td>Mikrotom obrotowy</td><td>Microm International</td><td>HM325</td><td></td></tr><tr><td>Kriostat</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>HM560</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny</td><td>Leica, Wetzlar</td><td>TCS SP2</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">* Izotiocyjanian fluoresceiny&lt;br/&gt; ** Przeciwciało wtórne (skoniugowane z Alexa Fluor 568) stosowane po przeciwciałach pierwszorzędowych przeciw tTG2&lt;br/&gt; *** Barwnik</td></tr></tbody></table>

rozpoznanie transglutaminazy epidermalnej przez przeciwciała iga i przeciwciała przeciwko tkankowej transglutaminazie 2 w rzadkim przypadku zapalenia skóry u rhesus

Recognition of Epidermal Transglutaminase by IgA and Tissue Transglutaminase 2 Antibodies in a Rare Case of Rhesus Dermatitis

Tkankowa transglutaminaza 2 (tTG2) jest jelitowym enzymem trawiennym, któryy deamiduje częściowo strawione już białka glutenu z pożywienia, np. peptydy gliadyny. U osób predysponowanych genetycznie tTG2 wywołuje odpowiedzi autoimmunologiczne charakteryzujące się produkcją przeciwciał przeciwko tTG2 i ich bezpośrednim osadzaniem się w ścianie jelita cienkiego 1,2. Obecność takich przeciwciał stanowi jedną z głównych cech charakterystycznych celiakii (CD). Epidermalna transglutaminaza (eTG) to kolejny członek rodziny transglutaminaz, który u niewielkiej mniejszości pacjentów z CD może również pełnić rolę autoantygenu. W tych stosunkowo rzadkich przypadkach eTG wywołuje reakcję autoimmunologiczną (wysypkę skórną) znaną klinicznie jako opryszczkowa choroba skóry (DH). Choć dokładny mechanizm patogenezy CD i DH nie jest w pełni poznany, wiadomo, że tTG2 i eTG dzielą epitopy antygenowe, które mogą być rozpoznawane przez przeciwciała w surowicy pacjentów zarówno z CD, jak i z DH 3,4.
W niniejszym badaniu wykorzystano badanie mikroskopowe konfokalne próbek biopsyjnych z zmian skórnych u dwóch makaków rezus (Macaca mulatta) z zapaleniem skóry (Tabela 1, Rys. 1 i 2) w celu analizy zajętych tkanek. U jednego zwierzęcia (EM96) wykazano nakładanie się widm przeciwciał IgA i tTG2 (Rys. 3). Obecność komórek podwójnie dodatnich tTG2+IgA+ koncentrowała się w głębokiej warstwie naskórka, wokół brodawek skóry właściwej. Jest to zgodne ze zmianami opisywanymi u pacjentów z DH 3. Po wprowadzeniu zwierzęcia EM96 na dietę bezglutenową zapalenie skóry, jak i złogi tTG2+IgA+, zniknęły i nie były już wykrywalne (Rys. 1-3). Zapalenie skóry pojawiło się jednak ponownie po ponownym wprowadzeniu glutenu do diety EM96 (nie pokazano). U innych makaków, w tym u zwierzęcia z niezwiązanym zapaleniem skóry, nie wykryto złogów tTG2+IgA+. Remisja zapalenia skóry u EM96 zależna od diety bezglutenowej, wraz z obecnością komórek tTG2+IgA+ w skórze, sugeruje autoimmunologiczny mechanizm rozwoju tego stanu, podobny do DH. Jest to pierwszy raport na temat zapalenia skóry przypominającego DH u naczelnych innych niż człowiek.

Opryszczkowe zapalenie skóry (DH) jest przewlekłym stanem zapalnym charakteryzującym się reakcją autoimmunologiczną między IgA a transglutaminazą epidermalną (eTG). DH rozwija się u niewielkiej części pacjentów z nadwrażliwością na gluten i/lub celiakią. Wyniki niniejszego badania wskazują, że DH może rozwijać się również u małpy z gatunku makaka rezusa z objawami idiopatycznego zapalenia skóry.

Rozpoznanie transglutaminazy epidermalnej przez przeciwciała IgA i przeciwciała przeciwko tkankowej transglutaminazie 2 w rzadkim przypadku zapalenia skóry u Rhesus

Transglutaminaza tkankowa 2 (tTG2) jest jelitowym enzymem trawiennym, który odamiduje częściowo strawione peptydy glutenu z diety, np. gliadyny. W...

Niniejszy artykuł wideo demonstruje metodę wizualizacji reakcji autoimmunologicznej w skórze rezunów Maccas wykazujących nadwrażliwość na gluten z postacią zapalenia skóry opuszkowego (dermatitis herpetiformis). Osiąga się to poprzez wstępną identyfikację zwierząt z zapaleniem skóry, którego nie można powiązać z innymi, częściej diagnozowanymi przyczynami zapalenia skóry, wybierając te przypadki idiopatyczne oraz zdrowe zwierzęta kontrolne w tym samym wieku. Próbki skóry pobierane są z obszaru dotkniętego zmianami w celu oceny architektury tkanki, stanu zapalnego oraz obecności transglutaminazy epidermalnej.Próbki pobrane w celu wykrycia autoprzeciwciał utrwala się w formalinie cynkowej oraz 2% paraldehydzie, a następnie barwi hematoksyliną i eozyną (H&amp;E). Barwienie to przeprowadza się w celu oceny stopnia stanu zapalnego i histopatologii, natomiast barwienie immunofluorescencyjne stosuje się do oceny depozycji autoprzeciwciał przeciwko transglutaminazie epidermalnej w głębokich warstwach naskórka. Zapalenie skórykleszczowe (DH) jest przewlekłym stanem zapalnym charakteryzującym się reakcją autoimmunologiczną między IgA a transglutaminazą epidermalną; rozwija się ono u niewielkiej części pacjentów z celiakią wrażliwych na gluten. Wyniki niniejszego badania wskazują, że DH może rozwijać się również u niewielkiej grupy małp z gatunku rhesus wrażliwych na gluten.Nasze wyniki potwierdzają trafność niedawno opracowanego modelu wrażliwości na gluten Resus Meac w przedstawionej formie. Wyniki wskazują, że objawy kliniczne tego stanu nie ograniczają się wyłącznie do jelita cienkiego. Typowy protokół obejmuje jedno zwierzę z idiopatycznym zapaleniem skóry oraz jedną zdrową grupę kontrolną w tym samym wieku.Po zastosowaniu odpowiedniej anestezji i przygotowaniu miejsca zabiegu zgodnie z techniką sterylną, należy przyłożyć instrument do biopsji skóry Miltex o średnicy 4,0 mm do skóry zwierzęcia, wywierając lekki nacisk. Należy obracać instrument o 180 stopni zgodnie i przeciwnie z ruchem wskazówek zegara, aż punch do biopsji przetnie warstwy skóry właściwej i dotrze do tkanki podskórnej. Procedurę należy powtórzyć w celu pobrania drugiej próbki do biopsji, używając pęsety.Chwyć przeciętą część skóry i oddziel ją od tkanki podskórnej. Umieść pierwszą próbkę, która zostanie poddana barwieniu H&E, w formalinie cynkowej. Następnie umieść drugą próbkę, która zostanie oceniona za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej, w 2% paraformaldehydzie, używając okrężnej igły tnącej o rozmiarze 3/8 z nicią nylonową 3-0.Zamknij defekt skóry w wzór krzyżowy. Powtórz ten proces, aby pobrać od dwóch do trzech próbek do biopsji od każdego zwierzęcia. Podaj przeciwbólowe leki pooperacyjne zgodnie ze szczegółowym opisem w protokole pisemnym dotyczącym badania obecności i lokalizacji IGA oraz TTG two.Próbki umieszczone w 2% formaldehydzie należy inkubować przez cztery godziny w temperaturze pokojowej w celu ich utrwalenia. Po utrwaleniu należy usunąć paraformaldehyd i przemyć próbki w PBS przez 30 do 60 minut na platformie kołyszącej. Czynność tę należy powtórzyć dwukrotnie, tak aby łącznie przeprowadzić trzy płukania, a następnie usunąć PBS i zastąpić go 30% sacharozą na co najmniej cztery godziny, maksymalnie do dwóch tygodni.Następnie umieść próbkę w medium mrożącym OCT i zanurz ją w kąpieli z 2-metylopentanu i suchego lodu, aż przejrzyste OCT stanie się białe i stałe, co wskazuje na całkowite zamrożenie. Następnie umieść bloki w temperaturze -80 °C na co najmniej 20 minut. Zapewnia to całkowite zamrożenie tkanki, dzięki czemu ostrze przetnie ją bez miażdżenia.Tkankę można przechowywać długoterminowo w OCT w temperaturze -80°C. Po wykonaniu skrawków i ich naniesieniu na szkiełka, należy usunąć OCT w celu przepuszczania tkanki. Szkiełka należy zanurzyć w słoju Copelanda zawierającym PBS z 0,2% żelatyną z rybiej skóry i 0,1% Triton X 100.Następnie umieść słoik na wytrząsarku na 20 minut. Po upływie 20 minut myj preparaty przez 10 minut w PBS z 0,2% żelatyny ze skóry ryb, a następnie inkubuj przez 40 minut w temperaturze pokojowej w wilgotnej komorze do preparatów z 10% normalnym surowicą kozią rozcieńczoną w PBS z 0,2% żelatyny ze skóry ryb. Inkubuj preparaty z przeciwciałami pierwotnymi przeciwko resus IGA oraz TTG, osobno dla każdego z nich, przez jedną godzinę. Następnie, trzymając preparat za krawędzie, delikatnie opłucz go roztworem P-B-S-F-S-G Triton X 100 za pomocą pipety transferowej.Następnie należy umieścić go w naczyniu typu Copeland zawierającym ten sam bufor. Potem naczynie należy umieścić na wytrząsarce oscylacyjnej na 10 minut. Procedurę płukania należy powtórzyć raz.Następnie przeprowadź płukanie w P-B-S-F-S-G przez 10 minut. Po inkubacji inkubuj z izotypowo specyficznymi przeciwciałami wtórnymi znakowanymi fluorochromem Alexa przez 40 minut. Przepłucz preparat w ten sam sposób co wcześniej.Następnie należy dodać barwnik do DNA jądrowego do medium montażowego przeciwko wygaszaniu (anti-quenching) w rozcieńczeniu 1:2000. Nanieś kroplę medium bezpośrednio na każdy preparat. Następnie nałóż szkiełko nakrywowe na tkankę i uszczelnij krawędzie lakierem do paznokci.Umieść preparat w ciemności i pozostaw do wyschnięcia. Aby zwizualizować podwójne barwienie IGA i TTG, wykonaj obrazowanie za pomocą konfokalnego mikroskopu skaningowego wyposażonego w lasery odpowiednie dla przeciwciał wtórnych użytych do oceny nieoznaczonej tkanki. Wykonaj obrazy w kontraście różnicowym DIC.DIC to kanał w mikroskopie, który obrazuje tkankę w skali szarości. Pozwala to na lepsze określenie architektury komórkowej w celu wykonania barwienia HNE. Próbka umieszczona w formie cynkowej jest najpierw blokowana w parafinie, a następnie wycinana na szkiełka.Następnie preparaty poddaje się suszeniu w temperaturze 60 °C przez noc i umieszcza w automatycznym barwiarzu, który barwi preparaty HNE, a następnie kończy proces barwienia. Przebarwione sekcje biopsji ogląda się pod mikroskopem świetlnym wyposażonym w kamerę cyfrową, używając Forex i powiększenia 40 x. Dla każdego powiększenia należy zarejestrować od trzech do czterech obrazów. W celu zbadania wpływu wyeliminowania glutenu z diety na zapalenie skóry, pobrano i zbarwiono – zgodnie z opisem w tym filmie – próbki biopsji z zmian skórnych małp z gatunku Reuss Maca.Przedstawiono okolicę pachwinową jednej małpy przed odstawieniem glutenu z diety. Po wprowadzeniu u tego zwierzęcia diety bezglutenowej zapalenie skóry ustąpiło i nie było już wykrywalne, co widać tutaj. Zapalenie skóry pojawiło się ponownie po ponownym wprowadzeniu glutenu do diety w celu oceny architektury tkanki.Barwienie H&amp;E przeprowadzono przed odstawieniem glutenu. Nabłonek był pogrubiony, z siedmioma do 15 warstwami komórek nabłonkowych oraz grubą, powierzchniową warstwą komórek hiperkeratotycznych naciekniętych przez degenerujące neutrofile. Neutrofile pojawiły się również wewnątrz nabłonka i mieszały się z umiarkowaną liczbą limfocytów, komórek plazmatycznych i histiocytów wokół przydatków w górnej skórze właściwej po dziewięciu tygodniach odstawienia glutenu z diety.Nadal występowała pewna hiperkeratoza i pogrubienie nabłonka, jednak w porównaniu do tego jedynie z minimalną infiltracją limfoplazmocytarną w górnej skórze właściwej. Przedstawiono tutaj prawidłową skórę brzucha bez pogrubienia nabłonka i bez infiltracji limfoplazmocytarnej górnej skóry właściwej. Obrazy z mikroskopii konfokalnej tych samych biopsji skóry makaków pobranych przed wycofaniem glutenu z diety; kolokalizacja IGA (kolor zielony) i ttg two (kolor czerwony) widoczna jest jako kolor żółty wokół obszaru brodawek skóry właściwej, co wskazuje na obecność autoprzeciwciał przeciwko transglutaminazie epidermalnej.Marker jądrowego DNA to pro three pokazano na niebiesko po dziewięciu tygodniach diety bezglutenowej. W obrębie nabłonka nie obserwowano już IgA, co wskazuje na brak autoprzeciwciał przeciwko transglutaminazie epidermalnej, które byłyby widoczne na żółto. Wciąż obecne było niektóre podnabłonkowe IgA, pokazane na zielono; marker jądrowego DNA to pro three pokazano na niebiesko u innych zwierząt, w tym u osobnika z niepowiązanym idiopatycznym zapaleniem skóry.Nie wykryto autoprzeciwciał. Barwienie IGA jest w kolorze zielonym, ttg two w czerwonym, a marker jądrowego DNA to pro three w kolorze niebieskim. Komórki ttg two dodatnie znajdują się w obrębie nabłonka.Kilka komórek dodatnich pod kątem IGA poniżej nabłonka. Brak rozległego nakładania się widm markerów czerwonego i zielonego wskazuje na brak autoprzeciwciał przeciwko transglutaminazie epidermalnej. W niniejszym badaniu wykorzystujemy mikroskopię konfokalną do wizualizacji obecności autoprzeciwciał IGA przeciwko transglutaminazie epidermalnej.Podczas wykonywania procedury należy pamiętać, że większość przypadków zapalenia skóry nie jest spowodowana nadwrażliwością na gluten. Dlatego przed przeprowadzeniem badania należy zastosować inne metody, w tym oznaczanie w surowicy przeciwciał antygladynowych i anty-transglutaminazie tkankowej oraz przeprowadzić dokładną ocenę kliniczną. Mimo to rozpowszechnienie zapalenia skóry Opposite herpetiformis jest niższe niż rozpowszechnienie przedstawionej enteropatii związanej z nadwrażliwością na gluten.Wyniki stanowią podstawę dla przyszłych badań, przy założeniu, że zostanie zidentyfikowanych więcej zwierząt z tym schorzeniem.

recognition-epidermal-transglutaminase-iga-tissue-transglutaminase-2

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Rozpoznanie enzymu transglutaminazy naskórkowej przez przeciwciała IgA i tkankowego enzymu 2 transglutaminazy w rzadkim przypadku Dermatitis Rhesus

W modelu zwierzęcym opisanym w niniejszej pracy, oczyszczone przeciwciała IgG przeciwko fragmentowi 200 aminokwasów (aa 757-967) kolagenu VII są wielokrotnie wstrzykiwane myszom, co pozwala na odtworzenie fenotypu pęcherzowego oraz cech histopatologicznych i immunopatologicznych charakterystycznych dla ludzkiego nabytego prątka pęcherzowego (EBA)1.

Granulocytozależne pęcherzowanie skóry indukowane autoprzeciwciałami

Tutaj opisujemy dwa testy do pomiaru aktywacji dopełniacza indukowanej przez przeciwciała przeciwko czerwonym krwinkom. Główną przewagą nad obecnymi testami jest ich ilościowy i łatwy w interpretacji charakter.

Metody ilościowego wykrywania indukowanej przez przeciwciała aktywacji dopełniacza na krwinkach czerwonych

Protokół wykrywania samoreaktywnych limfocytów T CD4 w mózgu i sercu poprzez bezpośrednie barwienie głównymi dekstramerami klasy II kompleksu zgodności tkankowej został opisany w tym raporcie. Do kompleksowej analizy opracowano również wiarygodną metodę wyliczania częstości występowania limfocytów T CD4+ specyficznych dla antygenu in situ.

In Situ Wykrywanie autoreaktywnych limfocytów T CD4 w mózgu i sercu przy użyciu dekstramerów klasy II o głównym kompleksie zgodności tkankowej

Tutaj przedstawiliśmy metody wykrywania autoprzeciwciał ludzkich wysp trzustkowych za pomocą testów elektrochemiluminescencyjnych (ECL). Protokół, stosowany do przewidywania cukrzycy typu 1, może być rozszerzony o wykrywanie autoprzeciwciał przeciwko innym chorobom autoimmunologicznym.

Testy elektrochemiluminescencyjne dla autoprzeciwciał ludzkich wysp trzustkowych

W tym artykule opisujemy protokół charakteryzujący odpowiedzi immunoglobuliny (Ig) zależnej od T i niezależnej od T u myszy za pomocą testu ELISA. Ta metoda stosowana samodzielnie lub w połączeniu z cytometrią przepływową pozwoli naukowcom zidentyfikować różnice w odpowiedziach izotypu Ig za pośrednictwem komórek B u myszy po immunizacji antygenu T zależnej i niezależnej od T.

Charakterystyka odpowiedzi izotypu immunoglobuliny zależnej i niezależnej od grasicy u myszy przy użyciu testu immunoenzymatycznego

Ten artykuł przedstawia protokół wykrywania specyficznej dla surowicy immunoglobuliny E za pomocą mikroprzepływowego systemu chemiluminescencji opartego na kartridżu oraz ocenę jego przydatności w diagnostyce alergii.

Zastosowanie technologii mikroprzepływowej Biochip do wykrywania immunoglobuliny E (sIgE) swoistej dla alergenu w surowicy

Prezentowany tutaj jest protokół oddzielania naskórka od skóry właściwej w celu oceny produkcji mediatorów stanu zapalnego. Po zapaleniu naskórek tylnej łapy szczura jest oddzielany od skóry właściwej za pomocą termolizyny w temperaturze 4 °C. Naskórek jest następnie wykorzystywany do analizy mRNA metodą RT-PCR oraz oceny białka metodą western blot i immunohistochemii.

Oddzielenie naskórka i skóry właściwej szczura za pomocą termolizyny w celu wykrycia mRNA i białka zapalnego specyficznego dla miejsca

Ten protokół wykorzystuje mieszane peptydy G6PI do konstruowania modeli reumatoidalnego zapalenia stawów, które są bliższe modelom ludzkiego reumatoidalnego zapalenia stawów w limfocytach T CD4+ i cytokinach. Niezmienne limfocyty T NK o wysokiej czystości (głównie iNKT2) o określonych fenotypach i funkcjach uzyskano przez indukcję in vivo i oczyszczanie in vitro do immunoterapii adoptywnej.

Immunoterapia adoptywna komórek iNKT u myszy RZS indukowanych izomerazą glukozo-6-fosforanową (G6PI)

Modelujemy prosty multipleksowany test ECL, który łączy ze sobą 7 testów autoprzeciwciał. Test jest w stanie przeprowadzić badania przesiewowe w kierunku cukrzycy typu 1 i wielu innych chorób autoimmunologicznych jednocześnie, w tym celiakii, autoimmunologicznej choroby tarczycy i autoimmunologicznego zespołu wielogruczołowego 1.

Wysokoprzepustowy test elektrochemiluminescencyjny 7-plex do jednoczesnego badania przesiewowego w kierunku cukrzycy typu 1 i wielu chorób autoimmunologicznych

Ten protokół opisuje prostą metodę hodowli trójwymiarowego, zrekonstruowanego ludzkiego naskórka w powtarzalny i solidny sposób. Dodatkowo scharakteryzowano zależność struktura-funkcja modelu bariery naskórkowej. Przedstawiono również reakcje biologiczne zrekonstruowanego naskórka ludzkiego na bodźce prozapalne.

Hodowla trójwymiarowego zrekonstruowanego ludzkiego naskórka na dużą skalę

Zmiany skórne są powszechnymi i ważnymi cechami w wielu chorobach reumatycznych, a biopsja z analizą patologiczną odgrywa kluczową rolę w diagnostyce. Niniejszy artykuł zawiera szczegółowy przegląd standaryzowanej procedury biopsji skóry i, na przykładzie tocznia rumieniowatego krążkowego, podkreśla istotną rolę dermatopatologii w diagnozowaniu chorób reumatycznych.

Biopsja skóry w celu rozpoznania tocznia rumieniowatego krążkowego

Poznaj metodę wizualizacji reakcji autoimmunologicznej w skórze makaków rhesus z zapaleniem skóry przy użyciu przeciwciał IgA i transglutaminazy naskórkowej.

Rozpoznawanie transglutaminazy naskórkowej za pomocą przeciwciał IgA i tkankowej transglutaminazy 2 w rzadkim przypadku rezusowego zapalenia skóry (Wideo) | JoVE Journal

Rozpoznanie transglutaminazy epidermalnej przez przeciwciała IgA i przeciwciała przeciwko tkankowej transglutaminazie 2 w rzadkim przypadku zapalenia skóry u Rhesus

Przeglądaj więcej filmów