Prosta metoda prowadzącej do badań ksenoprzeszczepu wewnątrzczaszkowego u myszy
September 26th, 2011
Aby ocenić nowe paradygmaty terapeutyczne w leczeniu glejaka, niezbędne są modele fizjologiczne. Wykorzystujemy metodę wszczepialnej prowadzącej do tworzenia modeli ksenoprzeszczepu wewnątrzczaszkowego, która jest szybsza i bezpieczniejsza niż podejścia stereotaktyczne.
Celem tej procedury jest wygenerowanie wewnątrzczaszkowego przeszczepu raka mózgu w celu oceny skuteczności nowego środka terapeutycznego. Osiąga się to poprzez najpierw przykręcenie prowadzącej na miejsce na czaszce, a następnie wprowadzenie komórek do mózgu przez prowadzącą. Kolejnym krokiem jest rozpoczęcie wyzwania terapeutycznego ukierunkowanego na komórki nowotworowe, które zagnieździły się w mózgu.
Zwierzęta są następnie monitorowane pod kątem reakcji terapeutycznych poprzez ocenę wyników przeżycia. Ostatecznie środki terapeutyczne mogą wpływać na wzrost guza i przeżycie w grupach leczonych w porównaniu z grupą kontrolną. Zabieg ten można przeprowadzić na kilka dni przed wstrzyknięciem komórki.
Zacznij od zważenia myszy i znieczulenia ich mieszaniną ketaminy i ksylazyny we wstrzyknięciu dootrzewnowym. Gdy myszy nie zareagują na uszczypnięcie palca u nogi, przygotuj skórę głowy jodem, a następnie wykonaj nacięcie o długości od dwóch do trzech milimetrów wzdłuż prawej strony linii środkowej i przed linią międzyustną. To nacięcie odsłania szwy koronalne i strzałkowe czaszki.
Bgma jest umieszczona na styku tych dwóch szwów. Zaznacz wejście prowadzącej 0,2 0,5 milimetra w bok od bgma i jeden milimetr przed bgma. Punkt ten znajduje się bezpośrednio nad jądrem CAU ósemkowym.
Teraz na miejscu użyj ręcznego wiertła krętego i wykonaj otwór o głębokości jednego milimetra w twardej. Wysterylizowaną prowadnicę wkręć w otwór, aż zrówna się z powierzchnią czaszki. Pamiętaj, aby przestać przesuwać, gdy tylko dotknie powierzchni czaszki.
Jeśli śruba wgnieci się w czaszkę, czaszka może pęknąć. Śruba prowadząca obsługuje igłę o długości 1,6 milimetra o rozmiarze 26. Aby zamknąć otwór prowadzącej, włóż ją lub wkręć atrapę do prowadnicy.
teraz. Zamknij ranę, przytrzymując przeciętą skórę razem kleszczami i sklejając skórę kroplą wiązania weterynaryjnego i rozprowadź wzdłuż przeciętej krawędzi skóry, przytrzymaj skórę przez kilka sekund, aż przylgnie. Na koniec podaj przeciwbólowe przeciwbólowe odwracające i karprofen przez wstrzyknięcie dootrzewnowe i pozwól myszom dojść do siebie na macie rozgrzewającej.
Odzyskiwanie może potrwać do 20 minut. W przykładowym eksperymencie komórki glejaka U 87 mg hodowano w dużych kolbach do hodowli tkanek z D-M-E-M-F 12 uzupełnionymi 5% płodową surowicą bydlęcą. W tej części opisano, jak przygotować te komórki do wstrzyknięcia w dniu wstrzyknięcia.
Zebrać komórki, najpierw dwukrotnie przemywając kolbę ciepłym PBS. Następnie dodaj 10 mililitrów PBS zawierających 0,25% trypsyny i 0,05% EDTA i inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut lub do momentu, gdy się usuną. Następnie zbierz komórki w 10 mililitrach pożywki.
Umieść komórki na hemocytometrze i policz komórki pod mikroskopem podążającym za komórką. Policz 50-mililitrową stożkową probówkę zawierającą 10 mililitrów kultury, pożywki i komórek, odwirowuje się pod ciśnieniem 300 razy G przez cztery minuty. Po wirowaniu ponownie zawieś komórki w pożywce hodowlanej w stężeniu 10 milionów komórek na mililitr Przy tym stężeniu każde pięć mikrolitrów zawiesiny komórkowej będzie zawierało 50 000 komórek, które są używane do każdego wstrzyknięcia wewnątrzczaszkowego.
Zawiesinę komórek do wstrzykiwań przechowywać na lodzie. Wymagana jest tutaj pojedyncza objętość komórek w zawiesinie, ponieważ pięć mikrolitrów łatwo odparowuje, a tym samym niszczy komórki. Zacznij od przygotowania strzykawki Hamiltona z mankietem.
Przymocuj mały plastikowy pierścień do końcówki igły tak, aby tylko dwa milimetry igły mogły wystawać poniżej wylotu prowadzącej. Gwarantuje to, że punkt inokulacji ma głębokość 3,5 milimetra, znieczulij wcześniej wzmocnioną mysz i wykonaj małe nacięcie nad prowadnicą. Przykręcić i zdjąć spól.
Następnie napełnij strzykawkę pięcioma mikrolitrami dobrze wymieszanych komórek przechowywanych na lodzie. Należy uważać, aby uniknąć pęcherzyków powietrza w strzykawce, ponieważ mogą one spowodować zator lub płukanie wsteczne komórek z miejsca wstrzyknięcia. Przymocować strzykawkę do pompy perfuzyjnej, a następnie wprowadzić igłę do prowadnicy.
Zakręć rozpocząć infuzję komórek w ilości 30 mikrolitrów na godzinę. Za pomocą zautomatyzowanego aparatu można wstrzyknąć do 10 zwierząt jednocześnie przy stałym natężeniu przepływu. Ręczne wstrzykiwanie jest również wykonalne, jeśli jest wykonywane w stałym, stałym tempie.
Po zakończeniu infuzji ostrożnie wyjąć strzykawkę, a następnie umieścić trzpień w prowadzącej, tak jak poprzednio. Zamknij ranę wiązaniem weterynaryjnym, zapewnij środki przeciwbólowe i pozwól myszom dojść do siebie. Odzyskiwanie może potrwać do 20 minut.
Cztery dni po inokulacji komórek U 87 mg myszy zważono i losowo podzielono na grupy kontrolne i leczone. Grupie kontrolnej wstrzyknięto 100 mikrolitrów PBS dootrzewnowo, a grupie leczonej wstrzyknięto 100 mikrogramów na 100 mikrolitrów MG 1 0 2 ip. Wstrzyknięcie powtarzano co drugi dzień przez 14 dni, w sumie sześć wstrzyknięć.
Po ostatnim wstrzyknięciu myszy były monitorowane codziennie i ważone co drugi dzień. Punkt końcowy zwierzęcia zdefiniowano jako wystąpienie istotnych dysfunkcji neurologicznych, takich jak równowaga, zaburzenia lub paraliż, odwodnienie, utrata masy ciała o więcej niż 10% obfitszy charakter lub śmierć. Dni końcowe rejestrowano jako krzywe przeżycia Kaplana-Meiera.
Zgony lub połączenia były oznaczane jako punkty końcowe, zdarzenia i oceniane jako jedno. Zwierzęta, które pozostały przy życiu pod koniec eksperymentu, zostały zarejestrowane jako nie-zdarzenia i ocenione jako zerowa kontrola. Zwierzęta zaczęły wykazywać oznaki zaburzeń neurologicznych i utraty masy ciała 23 dni po początkowym zaszczepieniu komórek.
Było to znacznie opóźnione w grupie leczonej A MG 1 0 2. Do 35 dnia 7 z dziewięciu zwierząt kontrolnych zostało poddanych eutanazji. Do dnia 78 z dziewięciu zwierząt kontrolnych zostało poddanych eutanazji, w porównaniu do tylko trzech z leczonych zwierząt o godzinie 8:00 rano g 1 0 2.
Analiza histologiczna mózgów potwierdziła, że u wszystkich dziewięciu zwierząt w grupie kontrolnej rozwinęły się guzy w porównaniu z tylko trzema myszami leczonymi o 8:00 rano g 1 0 2.
Przegląd
Ten artykuł opisuje procedurę ustanawiania śródczaszkowych modeliksenogreftów gliomi dla oceny nowych środków terapeutycznych. Metoda polega na użyciu implantowanej śruby przewodowej do infuzji komórek, zapewniając bezpieczniejszą i bardziej efektywną alternatywę dla tradycyjnych technik stereotaktycznych.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Neurologia
- Onkologia
- Terapeutika
Tło
- Gliomy są agresywnymi nowotworami mózgu, które wymagają skutecznych strategii leczenia.
- Obecne modele badania terapii gleja często obejmują złożone i czasochłonne procedury.
- Śródczaszkowe modeleksenogreftów mogą dostarczyć wglądu w skuteczność terapeutyczną.
- Szybkie i bezpieczne metody są niezbędne do rozwoju badań nad glejami.
Cel badania
- Ustanowienie wiarygodnego modelu do testowania nowych terapii gleja.
- Ocena reakcji terapeutycznych komórek gleja in vivo.
- Porównanie wpływu środków terapeutycznych na wzrost guza i przeżycie.
Stosowane metody
- Implantacja śruby przewodowej do czaszki w celu infuzji komórek.
- Śródczaszkowe wstrzyknięcie komórek gleja U 87 mg.
- Monitorowanie reakcji terapeutycznych poprzez wyniki przeżycia.
- Analiza histologiczna w celu oceny rozwoju guza.
Główne wyniki
- Zwierzęta kontrolne wykazywały znaczne zaburzenia neurologiczne i utratę masy ciała.
- Leczenie AMG 102 opóźniło pojawienie się objawów w porównaniu z kontrolą.
- Analiza histologiczna potwierdziła obecność guza u zwierząt kontrolnych.
- Współczynniki przeżycia były znacznie lepsze w grupach leczonych.
Wnioski
- Metoda śruby przewodowej jest skuteczna w ustanawianiu modeli gleja.
- AMG 102 wykazuje potencjał jako środek terapeutyczny dla gleja.
- Ten model może ułatwić dalsze badania nad leczeniem gleja.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
The guide screw method enables rapid, reproducible establishment of intracranial xenograft models for evaluating novel glioma therapeutics. By supporting simultaneous infusion in up to 10 animals, it increases throughput while reducing procedural variability and animal handling stress. This approach strengthens preclinical confidence in target validation and therapeutic efficacy assessment for brain cancer drug discovery programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional interrogation of therapeutic targets in physiologically relevant intracranial tumor models.
- Operational Value: Supports consistent xenograft establishment across cohorts, reducing biological noise in target validation studies.
- Predictive Value: Facilitates mechanistic de-risking by linking target modulation to survival outcomes in vivo.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized intracranial tumor models suitable for compound screening and dose-response evaluation.
- Operational Value: Compatible with perfusion pump automation, enabling standardized, high-reproducibility cell delivery across multiple animals.
- Assay Readiness: Provides a quantifiable engraftment platform for monitoring therapeutic response via survival and histological endpoints.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Uses human U87MG glioma cells to model patient-relevant tumor biology in immunocompromised hosts.
- Preclinical Validation: Enables longitudinal monitoring of therapeutic effects on tumor growth and survival, supporting go/no-go decisions.
- Risk-Adjusted Advancement: Histological confirmation of tumor reduction in treated groups provides mechanistic evidence for therapeutic efficacy.
Pipeline & Workflow Integration
The guide screw method integrates into the discovery workflow from early target validation through preclinical efficacy testing, enabling consistent model generation for downstream therapeutic assessment.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling intracranial delivery of tumor cells to evaluate target-dependent tumor growth.
- Screening: Enables reproducible xenograft formation, a prerequisite for reliable compound screening in brain cancer models.
- Analytics: Generates survival and histological readouts that quantify therapeutic response and support comparative analysis across treatment groups.
- Translational Research: Uses human-derived glioma cells to maintain relevance to clinical pathophysiology, supporting biomarker-aligned efficacy evaluation.
- Enterprise Reuse: The method is adaptable across glioma models and therapeutic modalities, serving as a reusable platform for oncology discovery teams.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence in target validation by reducing variability in tumor engraftment.
- Operational Value: Increases procedural standardization and throughput via perfusion pump compatibility.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling parallel animal processing and reducing reliance on specialized stereotactic equipment.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization through reproducible survival and histological endpoints that inform advancement decisions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in rodent stereotaxy, aseptic surgery, and postoperative care.
- Dependent on access to precision drills, guide screws, perfusion pumps, and Hamilton syringes.
- Necessitates standardization across teams for screw placement depth, infusion rates, and postoperative monitoring.
- Adaptation considerations include variations in tumor cell line inoculum volume and target brain coordinates across models.
- Practical limitations include the need for aseptic technique to prevent infection and ensure graft viability.
