Name: Prosta metoda prowadzącej do badań ksenoprzeszczepu wewnątrzczaszkowego u myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: Poznaj prostą metodę ksenoprzeszczepu wewnątrzczaszkowego u myszy do badania nowych terapii przeciwnowotworowych. Technika wykorzystuje śrubę prowadzącą do wstrzyknięcia komórek U 87 mg, oferując bezpieczniejszą alternatywę dla stereotaksji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Verlene Henry oraz Lindsay Holmes za pomoc w opracowaniu tego modelu. Praca ta była częściowo finansowana przez James S. McDonnell Foundation (#220020173).

1. Linie komórkowe
<ol>
	<li>Komórki glejaka U87MG hoduje się w dużych kolbach do hodowli tkanek w pożywce DMEM-F12 uzupełnionej o 5% płodowej surowicy bydlęcej (FBS).</li>
	<li>Komórki zbiera się poprzez dwukrotne przemycie kolb ciepłym solfizjologicznym roztworem buforowanym fosforanowo (PBS) i inkubowanie ich w 37°C przez 5 minut z użyciem 10 ml buforu PBS zawierającego 0,25% trypsyny i 0,05% EDTA. Po odklejeniu komórek przenosi się je do probówki o pojemności 50 ml zawierającej 10 ml pożywki hodowlanej i wiruje (30 x g przez 4 min).</li>
	<li>Po przemyciu komórki resuspenduje się do stężenia 10 x 106/ml w pożywce hodowlanej, co pozwoliło na inokulację 50 00 komórek/5 μl.</li>
	<li>Komórki przechowywa się w lodzie do momentu wstrzyknięcia dojamownego.</li>
</ol>
2. Intrakranialna stabilizacja za pomocą śrub prowadzących
Tę procedurę można przeprowadzić na kilka dni przed wstrzyknięciem komórek. Wszystkie opisane tutaj procedury były wykonywane w rygorystycznych warunkach sterylnych.
<ol>
	<li>Myszy (samice BALB/c nu/nu; 5-6 tygodni; około 18g) są numerowane w celu identyfikacji, ważone i znieczulone poprzez wstrzyknięcie do jam brzusznej (IP) mieszaniny ketaminy (10 mg/kg) i ksylazyny (5 mg/kg).</li>
	<li>Skórę przecier się roztworem jodu, a następnie wykonuje niewielkie nacięcie (2-3 mm) wzdłuż prawej strony linii środkowej, przed linią międzyuszną. Odsłania to szwy wieńcowe i strzałkowe czaszki. Bregma znajduje się w miejscu połączenia tych dwóch szwów.</li>
	<li>Punkt wejścia śruby prowadzącej jest następnie zaznaczany w odległości 2,5 mm bocznie i 1 mm przed bregmą. Punkt ten znajduje się bezpośrednio nad jądrem ogonowym1.</li>
	<li>Za pomocą sterylnego ręcznego wiertła skręcanego wierci się otwór o wymiarach 1 x 1 mm przez czaszkę aż do opony twardej.</li>
	<li>Następnie w otwór wkręca się śrubokrętem sterylną śrubę prowadzącą, która będzie wystawać 1,6 mm poniżej powierzchni czaszki w głąb opony twardej, aż do wyrównania z powierzchnią czaszki (Rycina 1A).</li>
	<li>Do centralnego otworu śruby prowadzącej wprowadza się sterylny stilet lub zaślepkę śruby, aby zamknąć otwór (Rycina 1B).</li>
	<li>Ranę zamyka się klejem tkankowym Vetbond (n-butyl cyjanoakrylan), a myszom podaje się dożylnie zastrzyk z reversine (dla małych zwierząt) (0,1 ml/kg) oraz karprofenu (5 mg/kg/10 μl) w celu przeciwbólowym. Następnie myszy pozostawia się do wybudzenia na macie grzewczej (36°C), co może potrwać do 20 minut. W czasie wybudzania myszy są często monitorowane i obserwowane, aż do pełnego odzyskania przytomności.</li>
</ol>
3. Wewnątrzczaszkowe wszczepienie komórek
<ol>
	<li>Przygotowuje się sterylną strzykawkę Hamiltona z ogranicznikiem, nakładając mały plastikowy pierścień na końcówkę igły w taki sposób, aby tylko 2 mm igły wystawało poniżej wylotu śruby prowadzącej (Ryc. 1B). Ostateczny punkt inokulacji znajduje się zatem 3,5 mm poniżej powierzchni czaszki.</li>
	<li>Cztery dni po operacji wszczepienia śruby prowadzącej myszy ponownie znieczula się w opisany wcześniej sposób (2.1) i wykonuje niewielkie nacięcie nad śrubą prowadzącą, aby usunąć stylit.</li>
	<li>Strzykawkę Hamiltona z ogranicznikiem napełnia się 5 μl dobrze wymieszanych komórek, dbając o to, aby nie powstały ani nie zostały zassać pęcherzyki powietrza.</li>
	<li>Strzykawkę mocuje się do pompy perfuzyjnej, a igłę wprowadza do śruby prowadzącej (Ryc. 1C). Następnie komórki infunduje się z prędkością 30 μl na godzinę.</li>
	<li>Zautomatyzowane urządzenie (Ryc. 1D) umożliwiło jednoczesne wstrzyknięcie preparatu do 10 zwierząt przy stałej prędkości przepływu. Komórki można również wstrzykiwać ręcznie, używając strzykawki Hamiltona z ogranicznikiem lub alternatywnie zastosować ogranicznik w postaci końcówki pipety o pojemności 20 μl, przyciętą o 3 mm, aby końcówka igły wystawała poza śrubę prowadzącą o 2 mm. W takim przypadku wstrzykiwanie musi być wykonywane we właściwym, stałym tempie.</li>
	<li>Po zakończeniu infuzji ostrożnie usuwa się strzykawkę i ponownie wprowadza stylit do śruby prowadzącej. Ranę zamyka się za pomocą kleju, a myszom podaje się leki wspomagające rekonwalescencję jak wcześniej (2.7) i pozostawia do wybudzenia na macie grzewczej.</li>
</ol>
4. Wyzwanie terapeutyczne
<ol>
	<li>Cztery dni po inokulacji komórek U87MG myszy są ważone i losowo dzielone na grupę kontrolną oraz grupę badawczą.</li>
	<li>Grupa kontrolna otrzymuje dożylnie do jamy otrzewnej (IP) wtrysk PBS (100 μl), natomiast grupa badawcza otrzymuje wtrysk IP AMG102 (10 μg w 10 μl PBS).</li>
	<li>Wtryski są powtarzane co drugi dzień przez 14 dni, łącznie wykonuje się 6 wtrysków (Rycina 2).</li>
	<li>Po ostatnim wtrysku myszy są monitorowane codziennie i ważone co drugi dzień.</li>
	<li>W momencie gdy u myszy zaczęły pojawiać się znaczne dysfunkcje neurologiczne (zaburzenia równowagi, paraliż), odwodnienie, utrata masy ciała powyżej 10% lub stan agonii, poddawano je humanitarnej eutanazji. Dni osiągnięcia tych humanitarnych punktów końcowych zapisywano następnie na krzywej przeżycia Kaplana-Meiera.</li>
</ol>
5. Ocena skuteczności terapeutycznej
<ol>
	<li>Krzywa przeżycia Kaplana-Meiera została wygenerowana przy użyciu programu GraphPad Prism 4.03 dla systemu Windows; GraphPad Software, San Diego California USA, <a href="http://www.graphpad.com">www.graphpad.com</a>3. Zgony lub eutanazje zaznaczono jako zdarzenia końcowe i oceniono jako 1. Zwierzęta, które przeżyły do końca eksperymentu, zapisano jako zdarzenia nieistniejące i oceniono jako 0.</li>
</ol>
6. Reprezentatywne wyniki:
Zwierzęta z grupy kontrolnej zaczęły wykazywać oznaki zaburzeń neurologicznych i utraty masy ciała 23 dni po wstępnej inokulacji komórek. W grupie leczonej AMG102 proces ten uległ znacznemu opóźnieniu do 35 dnia. Rzeczywiście, do 35 dnia uśpiono 7% (n = 7/9) zwierząt z grupy kontrolnej. Krzywa przeżycia Kaplana-Meiera wyraźnie pokazuje znaczący wzrost przeżywalności w odpowiedzi na leczenie AMG102 (Rysunek 3). Do 70 dnia uśpiono 88% myszy kontrolnych (n = 8/9) w porównaniu do 37% (n = 3/8) w grupie leczonej AMG102. Analiza histologiczna mózgów potwierdziła, że u wszystkich 9 zwierząt w grupie kontrolnej rozwinęły się guzy, podczas gdy w grupie leczonej AMG102 stało się tak tylko u 3 z 8 myszy (Rysunek 4).
<img alt="Procedura implantacji kranialnej u myszy; konfiguracja aparatury i pomiary; eksperyment w badaniach neuronaukowych." src="/files/ftp_upload/3157/3157fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Zdjęcie (A) przedstawia wewnątrzczaszczowy śrubowy prowadnik umieszczony w obszarze znajdującym się bezpośrednio nad jądrem ogoniastym. Następnie do prowadnika wprowadza się strzykawkę Hamiltona z mankietem (wcześniej napełnioną komórkami) w taki sposób, aby 2 mm igły wystawało poza prowadnik, co pozwala na wstrzyknięcie komórek na głębokość 3,5 mm wewnątrz jądra ogoniastego. Strzykawka zostaje następnie usunięta i zastąpiona stiletem (B). Automatyczne urządzenie do infuzji (C) może wstrzykiwać substancję do 10 zwierząt jednocześnie. Przedstawiono tutaj pięć jednoczesnych iniekcji (D).
<img alt="Schemat harmonogramu wewnątrzczaszkowej próby terapeutycznej; komórki U87MG, leczenie AMG102 w ciągu 70 dni." src="/files/ftp_upload/3157/3157fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rycina 2: Schemat protokołu badania. Komórki wstrzyknięto w dniu 0, a leczenie rozpoczęto w dniu 4. Zwierzęta z grupy kontrolnej otrzymały wstrzyknięcie PBS (100 μl) domięśniowo, podczas gdy grupa leczona otrzymała zastrzyk z AMG102 (100 μg/100 μl) d.o. Iniekcje te podawano co drugi dzień przez 10 dni. Podano łącznie 6 iniekcji. Następnie zwierzęta monitorowano przez 70 dni pod kątem objawów zaburzeń neurologicznych i fizycznych.
<img alt="Analiza przeżycia – wykres Kaplana-Meiera porównujący wyniki w grupie kontrolnej i grupie leczonej AMG102, p=0,005." src="/files/ftp_upload/3157/3157fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> 
Rysunek 3: Krzywa przeżycia Kaplana-Meiera porównująca myszy z grupy kontrolnej i myszy leczonych AMG102. Po zastosowaniu leczenia AMG102 uzyskano istotne statystycznie przeżycie (p=0,05).
<img alt="Porównanie przekrojów histologicznych mózgu, barwiona tkanka, obraz mikroskopowy, analiza różnic strukturalnych." src="/files/ftp_upload/3157/3157fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 4"> 
Rysunek 4: Mikrofotografie koronalnych przekrojów mózgu wykazujące rozwój guza u zwierząt z grupy kontrolnej (A) oraz brak rozwoju guza mózgu u zwierząt leczonych AMG102 (B). Pasek skali oznacza 1 mm.

<ol><li>Lal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+implantable+guide-screw+system+for+brain+tumor+studies+in+small+animals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosurg%22%5BJournal%5D)">An implantable guide-screw system for brain tumor studies in small animals.</a> J Neurosurg. 92, 326-333 (2000).</li>
<li>Jun, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMG+102%2C+a+fully+human+anti-hepatocyte+growth+factor%2Fscatter+factor+neutralizing+antibody%2C+enhances+the+efficacy+of+temozolomide+or+docetaxel+in+U-87+MG+cells+and+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">AMG 102, a fully human anti-hepatocyte growth factor/scatter factor neutralizing antibody, enhances the efficacy of temozolomide or docetaxel in U-87 MG cells and xenografts.</a> Clin Cancer Res. 13, 6735-6742 (2007).</li>
<li>Pillay, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+plasticity+of+oncogene+addiction%3A+implications+for+targeted+therapies+directed+to+receptor+tyrosine+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">The plasticity of oncogene addiction: implications for targeted therapies directed to receptor tyrosine kinases.</a> Neoplasia. 11, 448-458 (2009).</li>
<li>Buchanan, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiosensitization+of+glioma+cells+by+modulation+of+Met+signaling+with+the+hepatocyte+growth+factor+neutralizing+antibody.+AMG102%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Radiosensitization of glioma cells by modulation of Met signaling with the hepatocyte growth factor neutralizing antibody. AMG102.</a> J Cell Mol Med. 15, 1999-2006 (2011).</li>
<li>Wen, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phase+II+study+evaluating+the+efficacy+and+safety+of+AMG+102+%28rilotumumab%29+in+patients+with+recurrent+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro+Oncol%22%5BJournal%5D)">A phase II study evaluating the efficacy and safety of AMG 102 (rilotumumab) in patients with recurrent glioblastoma.</a> Neuro Oncol. 13, 437-446 (2011).</li>
<li>Caretti, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+of+Tumor+Growth+and+Post-Irradiation+Recurrence+in+a+Diffuse+Intrinsic+Pontine+Glioma+Mouse+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Pathol%22%5BJournal%5D)">Monitoring of Tumor Growth and Post-Irradiation Recurrence in a Diffuse Intrinsic Pontine Glioma Mouse Model.</a> Brain Pathol. 4, 441-451 (2011).</li>
<li>Jallo, G. I., Volkov, A., Wong, C., Carson, B. S., Penno, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+brainstem+tumor+model%3A+functional+and+histopathological+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Childs+Nerv.+Syst%22%5BJournal%5D)">A novel brainstem tumor model: functional and histopathological characterization.</a> Childs Nerv. Syst. 22, 1519-1525 (2006).</li>
<li>Johns, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+efficacy+of+epidermal+growth+factor+receptor-specific+antibodies+against+gliomaxenografts+is+influenced+by+receptor+levels%2C+activation+status%2C+and+heterodimerization%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">The efficacy of epidermal growth factor receptor-specific antibodies against gliomaxenografts is influenced by receptor levels, activation status, and heterodimerization.</a> Clin Cancer Res. 13, 1911-1925 (2007).</li>
<li>Scott, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phase+I+clinical+trial+with+monoclonal+antibody+ch806+targeting+transitional+state+and+mutant+epidermal+growth+factor+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">A phase I clinical trial with monoclonal antibody ch806 targeting transitional state and mutant epidermal growth factor receptors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 4071-4076 (2007).</li>
<li>Niyazi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+options+for+recurrent+malignant+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Radiother.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Therapeutic options for recurrent malignant glioma.</a> Radiother. Oncol. 98, 1-14 (2011).</li>
</ol>

Praca ta była wspierana przez grant badawczy z firmy Amgen Inc.

Przedstawiona tutaj metoda z wykorzystaniem wkrętu prowadzącego do czaszki umożliwia szybkie i powtarzalne tworzenie ksenoprzeszczepów wewnątrzczaszkowych, a w rękach przeszkolonego technika weterynaryjnego procedura ta jest bardzo łatwa do wykonania bez konieczności użycia urządzenia stereotaktycznego. Nasza metoda łączy zastosowanie wkręta prowadzącego, służącego do precyzyjnego zlokalizowania obszaru mózgu najodpowiedniejszego do rozwoju guza in vivo, oraz automatycznej pompy infuzyjnej, która pozwala na jednoczesną inokulację do 10 zwierząt. Procedura aplikacji wkręta prowadzącego trwa mniej niż 5 minut. Automatyczna infuzja komórek z prędkością 30 μl/godzinę zajmuje zaledwie 10 minut dla objętości 5 μl. Zapewnia to dokładne dawkowanie przy stałym przepływie i zmniejsza ryzyko wypchnięcia komórek do obszaru poza czaszką w wyniku wzrostu ciśnienia wewnątrzczaszkowego. Przeprowadziliśmy tę procedurę również z użyciem objętości 10 μl i nie zaobserwowaliśmy wzrostu guza poza czaszką wynikającego z refluksu komórek. Ponieważ automatyczna pompa infuzyjna umożliwia jednoczesną inokulację kilku zwierząt, możemy iniekować do 60 zwierząt na godzinę, w porównaniu do procedury stereotaktycznej, która jest ograniczona do około 15 zwierząt na godzinę.
Kluczowym etapem tej procedury jest lokalizacja śruby prowadzącej w czaszce, ponieważ jej położenie determinuje ostateczną lokalizację masy guza. Jeśli śruba prowadząca zostanie umieszczona zbyt centralnie, komórki zostaną wstrzyknięte w obszar między dwiema półkulami mózgu, natomiast jeśli zostanie umieszczona zbyt daleko z przodu, komórki w ogóle nie trafią do mózgu. Niezbędne jest zatem zachowanie jak największej precyzji podczas lokalizacji prowadnika 2,5 mm bocznie i 1 mm przednio względem bregma1. W niniejszym badaniu zastosowano stalową śrubę prowadzącą, choć dostępne są również plastikowe śruby prowadzące do badań wymagających obrazowania mózgu, takich jak MRI lub PET6. Nawet jeśli automatyczna pompa infuzyjna jest zbyt kosztowna dla niektórych grup, komórki można wciąż wstrzykiwać ręcznie, co jest szybsze niż podejścia stereotaktyczne. Ogólnie rzecz biorąc, ta szybka, dokładna i powtarzalna metoda może być stosowana do badania glejaków, medulloblastoma oraz guzów pnia mózgu7. Procedura ta została wykonana na ponad 500 myszach w naszych dwóch laboratoriach, a zgony wynikające z nieoczekiwanych reakcji na znieczulenie wyniosły (&lt;1%). Myszy, u których zamocowano śrubę prowadzącą, a następnie przeprowadzono infuzję komórek, nie zginęły ani nie doznały żadnych powikłań neurologicznych w wyniku zabiegu. Zwierzęta przeżyły ponad 100 dni bez żadnych powikłań. Choć preferowaliśmy użycie myszy bezwłosej, mysz z niedoborem odporności z włosem, taka jak SCID, byłaby równie odpowiednia, pod warunkiem usunięcia włosa z czaszki przed operacją, aby utrzymać czystość miejsca zabiegu i zapobiec zakłóceniom w osadzaniu śruby prowadzącej.
Obecnie opracowywanych jest kilka nowych metod terapeutycznych do leczenia glejaka8-10. Niedawno wykazaliśmy, że podskórne ksenoprzeszczepy glejaka U87MG mogą być hamowane poprzez leczenie AMG1023; humanizowane przeciwciało skierowane przeciwko HGF, które jest obecnie poddawane ocenie klinicznej w leczeniu glejaka5. Wykorzystaliśmy opisaną tutaj metodę do wytworzenia wewnątrzczaszkowych guzów U87MG w mózgach myszy nude. Nasze badanie wyraźnie pokazuje użyteczność tej metody i dowodzi, że AMG102 znacząco hamuje wzrost ortotopowych ksenoprzeszczepów U87MG. Będziemy kontynuować wykorzystywanie tego modelu, aby ustalić, jakie inne środki terapeutyczne można zastosować w połączeniu z AMG102 w celu uzyskania bardziej efektywnego hamowania wzrostu guza.

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12</td><td>Invitrogen</td><td>12634010</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Bovogen</td><td>SFBS</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna</td><td>Invitrogen</td><td>15050065</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>Myszy Balb/c nu/nu</td><td>ARC Perth</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt do śruby</td><td>Plastics One</td><td>SD-1</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt do wiertła</td><td>Plastics One</td><td>DH-1</td><td></td></tr><tr><td>Wiertło</td><td>Plastics One</td><td>D#60</td><td></td></tr><tr><td>Prowadnica śruby (metalowa)</td><td>Plastics One</td><td>C212SG</td><td></td></tr><tr><td>Atrapa śruby (rylec)</td><td>Plastics One</td><td>C212SD</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka Hamiltona (10 &amp;mu;l, igła cementowana 26g)</td><td>Grace Division Discovery Science</td><td>80075</td><td></td></tr><tr><td>Pompa infuzyjna PHD 22/2000</td><td>Harvard Apparatus</td><td>70-2003</td><td>Opcjonalnie</td></tr><tr><td>Vetbond</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>Mata grzewcza</td><td>Harvard Apparatus</td><td>340390</td><td></td></tr></tbody></table>

prosta metoda prowadnicy śrubowej do badań ksenoprzeszczepów wewnątrzczaszkowych u myszy

A Simple Guide Screw Method for Intracranial Xenograft Studies in Mice

Przeszczepianie ludzkich komórek nowotworowych do mózgu myszy z immunosupresją jest ugruntowaną metodą badania nowotworów mózgu, w tym glejaka wielopostaciowego (glejaka) i medulloblastoma. Powszechnie stosowane podejście stereotaktyczne pozwala na iniekcję tylko jednego zwierzęcia naraz, jest pracochłonne i wymaga wysoko specjalistycznego sprzętu. Metoda śruby prowadzącej, opracowana pierwotnie przez Lal et al.,1 została stworzona w celu wyeliminowania uciążliwych procedur stereotaktycznych. Opisujemy obecnie zmodyfikowane podejście z użyciem śruby prowadzącej, które jest szybkie i wyjątkowo bezpieczne; oba te aspekty są krytycznymi rozważaniami etycznymi. Co istotne, nasza procedura obejmuje teraz pompę infuzyjną, która umożliwia jednoczesną iniekcję komórek nowotworowych u maksymalnie 10 zwierząt.
Aby zademonstrować użyteczność tej procedury, utworzyliśmy wewnątrzczaszkowe ksenoprzeszczepy ludzkich komórek glejaka U87MG u myszy, które następnie leczono AMG102; w pełni ludzkim przeciwciałem skierowanym przeciwko HGF/czynnikowi rozproszenia, będącym obecnie w fazie oceny klinicznej2-5. Systemowe wstrzyknięcie AMG102 znacząco przedłużyło przeżycie wszystkich myszy z wewnątrzczaszkowymi ksenoprzeszczepami U87MG i doprowadziło do licznych całkowitych wyleczeń.
Niniejsze badanie wykazuje, że metoda wkrętu prowadzącego jest niedrogim i wysoce powtarzalnym podejściem do tworzenia wewnątrzczaszkowych ksenoprzeszczepów. Co więcej, dostarcza ona odpowiedniego modelu fizjologicznego do walidacji nowych strategii terapeutycznych w leczeniu nowotworów mózgu.

Aby ocenić nowe paradygmaty terapeutyczne w leczeniu glejaka, niezbędne są modele istotne fizjologicznie. Wykorzystujemy procedurę z implantowalną śrubą prowadzącą do tworzenia ksenograftów wewnątrzczaszkowych, która jest szybsza i bezpieczniejsza niż podejścia stereotaktyczne.

Prosta metoda prowadnicy śrubowej do badań ksenoprzeszczepów wewnątrzczaszkowych u myszy

Przeszczepianie ludzkich komórek nowotworowych do mózgu myszy z immunosupresją jest uznaną metodą badania nowotworów mózgu, w tym glejaka wielopostaciowego...

Celem niniejszej procedury jest wytworzenie wewnątrzczaszkowego przeszczepu raka mózgu w celu oceny skuteczności nowego środka terapeutycznego. Osiąga się to poprzez najpierw wkręcenie śruby prowadzącej w czaszkę, a następnie wprowadzenie komórek do mózgu za pomocą tej śruby. Następnym krokiem jest rozpoczęcie terapii ukierunkowanej na komórki nowotworowe, które zadomowiły się w mózgu.Następnie zwierzęta są monitorowane pod kątem odpowiedzi terapeutycznej poprzez ocenę przeżywalności. W efekcie środki terapeutyczne mogą wpływać na wzrost guza oraz przeżywalność w grupach leczonych w porównaniu z grupami kontrolnymi. Tę procedurę można przeprowadzić na kilka dni przed iniekcją komórek.Należy rozpocząć od zważenia myszy i podania im w zastrzyku doszpikowym mieszaniny ketaminy i ksylazyny w celu znieczulenia. Gdy myszy przestaną reagować na uciśnięcie palca, należy przygotować skórę głowy za pomocą jodyny, a następnie wykonać nacięcie o długości od dwóch do trzech milimetrów wzdłuż prawej strony linii środkowej i przed linią międzyoczną. Nacięcie to odsłania szwy czołowy i strzałkowy czaszki.BGMA znajduje się na styku tych dwóch szwów. Zaznacz miejsce wprowadzenia wkrętu prowadzącego 0,2–0,5 milimetra bocznie od BGMA i jeden milimetr przed BGMA. Punkt ten znajduje się bezpośrednio nad jądrem CAU 8.W miejscu oznaczenia, za pomocą ręcznego wiertła spiralnego, wykonaj otwór o głębokości jednego milimetra w śrubie mocującej oponę twardą. Wprowadź sterylną śrubę prowadzącą do otworu, aż zostanie ona zlicowana z powierzchnią czaszki. Należy zaprzestać wkręcania śruby natychmiast po zetknięciu się z powierzchnią czaszki.Jeśli śruba wgłębi się w czaszkę, może dojść do jej pęknięcia. Śruba prowadząca podtrzymuje igłę o rozmiarze 26 G i długości 1,6 milimetra. Aby zamknąć otwór śruby prowadzącej, należy włożyć do niej wkładkę lub śrubę zastępczą.Następnie przykręcić śrubę. Zamknąć ranę, zbliżając brzegi naciętej skóry za pomocą pęsety i sklejając je kroplą kleju Vet Bond; rozprowadzić klej wzdłuż krawędzi cięcia i przytrzymać skórę przez kilka sekund, aż do związania. Na koniec podać przeciwciało odwracające oraz karprofen przeciwbólowo drogą domięśniową i pozostawić myszy do wybudzenia na macie grzewczej.Proces regeneracji może potrwać do 20 minut. W przypadku eksperymentu przykładowego komórki glejaka U 87 mg hodowano w dużych kolbach do hodowli tkanek w pożywce D-M-E-M-F 12 uzupełnionej o 5% płodowej surowicy bydlęcej. W tej sekcji opisano sposób przygotowania tych komórek do iniekcji w dniu zabiegu.Zabierz komórki, najpierw dwukrotnie płucząc kolbę ciepłym PBS. Następnie dodaj 10 ml PBS zawierającego 0,25% trypsyny i 0,05% EDTA i inkubuj komórki w temperaturze 37 °C przez pięć minut lub do momentu ich odklejenia. Następnie zbierz komórki do 10 ml pożywki.Umieść komórki w komorze liczbowej (hemocytometrze) i policz je pod mikroskopem zgodnie z instrukcją. Probówkę stożkową o pojemności 50 mililitrów, zawierającą 10 mililitrów pożywki i komórek, wiruj przy 300 ×g przez cztery minuty. Po wirowaniu resuspenderuj komórki w pożywce hodowlanej do stężenia 10 milionów komórek na mililitr. Przy tym stężeniu każde 5 µL zawiesiny komórkowej będzie zawierać 50 000 komórek, co jest wykorzystywane do każdego wstrzyknięcia do jam czaszkowych.Przechowywać zawiesinę komórkową do iniekcji na lodzie. W tym przypadku wymagana jest pojedyncza objętość komórek w zawiesinie, ponieważ objętości rzędu pięciu mikrolitrów łatwo odparowują, co doprowadziłoby do zniszczenia komórek. Należy rozpocząć od przygotowania strzykawki Hamiltona z końcówką.Przymocuj mały plastikowy pierścień do końcówki igły w taki sposób, aby poniżej otworu śruby prowadzącej wystawały tylko dwa milimetry igły. Zapewnia to głębokość punktu inokulacji wynoszącą 3,5 milimetra. Znieczul wcześniej poddaną augmentacji mysz i wykonaj niewielkie nacięcie nad śrubą prowadzącą. Wkręć śrubę i usuń stilet.Następnie napełnij strzykawkę 5 µL dobrze wymieszanych komórek przechowywanych w lodzie. Należy uważać, aby w strzykawce nie powstały pęcherzyki powietrza, ponieważ mogą one spowodować zator lub cofnięcie komórek z miejsca wstrzyknięcia. Przymocuj strzykawkę do pompy perfuzyjnej, a następnie wprowadź igłę do prowadnicy.Rozpocznij infuzję komórkową z prędkością 30 µL/h. Przy użyciu urządzenia zautomatyzowanego można jednocześnie podać preparat do 10 zwierząt przy stałym tempie przepływu. Możliwa jest również iniekcja manualna, pod warunkiem zachowania stałego, równomiernego tempa.Po zakończeniu infuzji ostrożnie wyjmij strzykawkę, a następnie ponownie wprowadź stilet do śruby prowadzącej, tak jak wcześniej. Zamknij ranę za pomocą kleju wet bond, podaj leki przeciwbólowe i pozwól myszom dojść do siebie. Powrót do pełnej sprawności może potrwać do 20 minut.Cztery dni po inokulacji komórek U 87 mg myszy zważono i losowo podzielono na grupę kontrolną i grupę badawczą. Grupie kontrolnej wstrzyknięto 100 µL PBS doprzewnowiskowo, a grupie badawczej wstrzyknięto 100 µg na 100 µL MG 1 0 2 ip. Iniekcję powtarzano co drugi dzień przez 14 dni, co łącznie dało sześć wstrzyknięć.Po ostatnim wstrzyknięciu myszy monitorowano codziennie i ważono co drugi dzień. Punktem końcowym dla zwierzęcia określono wystąpienie istotnych dysfunkcji neurologicznych, takich jak zaburzenia równowagi lub paraliż, odwodnienie, utrata masy ciała przekraczająca 10% lub śmierć. Dni osiągnięcia punktu końcowego zapisano w formie krzywych przeżycia Kaplana-Meiera.Zgony lub wezwania uznano za punkty końcowe, zdarzenia i oceniono jako jeden. Zwierzęta, które przeżyły do końca eksperymentu, odnotowano jako brak zdarzeń i oceniono jako zero kontrolne. Zwierzęta zaczęły wykazywać objawy zaburzeń neurologicznych i utratę masy ciała 23 dni po wstępnej inokulacji komórek.Zjawisko to było znacznie opóźnione w grupie traktowanej A MG 1 0 2. Do 35. dnia uśpiono 7 z dziewięciu zwierząt kontrolnych. Do 78. dnia uśpiono dziewięć zwierząt kontrolnych w porównaniu z zaledwie trzema z 8:00 AM g 1 0 2 traktowanych zwierząt.Analiza histologiczna mózgów potwierdziła, że u wszystkich dziewięciu zwierząt w grupie kontrolnej rozwinęły się guzy, w porównaniu do tylko trzech myszy traktowanych g 1 0 2 o godzinie 8:00.

a-simple-guide-screw-method-for-intracranial-xenograft-studies-in-mice

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Prosty przewodnik Metoda śrubowa do badań nad przeszczepami międzygatunkowymi w mózgu myszy

Ksenoprzeszczepy ludzkich guzów mózgu zmodyfikowane lucyferazą mogą być tworzone wewnątrzczaszkowo u myszy atymicznych, z późniejszym monitorowaniem wzrostu guza i odpowiedzi na terapię za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego. W połączeniu z analizą przeżywalności, monitorowanie bioluminescencyjne stanowi niezbędne narzędzie badawcze w badaniach przedklinicznych terapii rozważanych w leczeniu guzów mózgu.

Tworzenie wewnątrzczaszkowych ksenograftów guzów mózgu z późniejszą analizą wzrostu guza i odpowiedzi na terapię z wykorzystaniem obrazowania bioluminescencyjnego

Opisujemy zintegrowaną metodę precyzyjnej implantacji stereotaktycznej ludzkich komórek wielopostaciowego glejaka do mózgów myszy nago oraz następującego po niej seryjnego obrazowania in vivo w celu monitorowania wzrostu i odpowiedzi na leczenie powstałych ksenograftów.

Stereotaktyczna implantacja wewnątrzczaszkowa i obrazowanie bioluminescencyjne in vivo ksenoprzeszczepów guzów w mysim modelu glioblastoma multiforme

Źródło: Liou, C. et al. Domózgowo-komorowe dostarczanie metabolitów mikrobiologicznych pochodzących z jelit u swobodnie poruszających się myszy. J. Vis. Exp. (2022).Ten film pokazuje wewnątrzczaszkowe wstrzyknięcie krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych (SCFA) swobodnie poruszającej się myszy w celu zbadania ich wpływu na zachowanie za pośrednictwem mózgu. Kaniula iniektorowa jest wprowadzana do kaniuli prowadzącej wszczepionej do mózgu myszy. Po wyzdrowieniu mysz aklimatyzuje się w nowej...

Wewnątrzczaszkowe wstrzyknięcie metabolitów mikrobiologicznych pochodzących z jelit w modelu mysim

Opisujemy nowatorską technikę obrazowania in vivo, która łączy fluorescencyjne chimeryczne myszy z oknami wewnątrzczaszkowymi i mikroskopią 2-fotonową o wysokiej rozdzielczości. Ta platforma obrazowania wspomaga badania dynamicznych zmian w tkance mózgowej i mikrokrążeniu na poziomie pojedynczej komórki, po patologicznych urazach i jest przystosowana do oceny wewnątrzczaszkowego dostarczania i dystrybucji leków.

Nowatorska technika obrazowania in vivo o wysokiej rozdzielczości do badania dynamicznej odpowiedzi struktur wewnątrzczaszkowych na wzrost guza i terapie

Złośliwe glejaki stanowią niejednorodną grupę wysoce naciekających nowotworów glejowych o wyraźnych cechach klinicznych i molekularnych. Pierwszorzędowe ksenoprzeszczepy ortotopowe podsumowują histopopatologiczne i molekularne cechy podtypów glejaka złośliwego w przedklinicznych modelach zwierzęcych.

Pierwotne ksenoprzeszczepy glejaka ortotopowego podsumowują wzrost naciekowy i mutację dehydrogenazy izocytrynianowej I

Fenotypowo dzikie astrocyty i nerwowe komórki macierzyste pobrane od myszy zmodyfikowanych za pomocą floksowanych, warunkowo onkogennych alleli i przekształconych za pomocą wirusowej rekombinacji za pośrednictwem Cre mogą być używane do modelowania patogenezy gwiaździaka in vitro i in vivo poprzez ortotopowe wstrzykiwanie przekształconych komórek do mózgów syngenetycznych, immunologicznie kompetentnych rodzeństwa z miotu.

Modelowanie patogenezy gwiaździaka in vitro i in vivo przy użyciu astrocytów korowych lub nerwowych komórek macierzystych od warunkowych, genetycznie zmodyfikowanych myszy

Mózg to unikalne miejsce o cechach, które nie są dobrze reprezentowane przez analizy in vitro lub ektopowe. Ortotopowe modele myszy z powtarzalną lokalizacją i charakterystyką wzrostu można niezawodnie tworzyć za pomocą wstrzyknięć wewnątrzczaszkowych przy użyciu stereotaktycznego przyrządu do fiksacji i niskociśnieniowej pompy strzykawkowej.

Tworzenie anatomicznie dokładnych i odtwarzalnych ksenoprzeszczepów wewnątrzczaszkowych ludzkich guzów mózgu

Komórki macierzyste są obiecującymi nośnikami terapeutycznymi w leczeniu guzów mózgu ze względu na ich wewnętrzny tropizm nowotworowy. Nieinwazyjne donosowe podawanie komórek macierzystych omija barierę krew-mózg i wykazuje duży potencjał w zakresie translacji klinicznej. W artykule podsumowano podstawowe zasady podawania donosowych komórek macierzystych w mysim modelu glejaka.

Donosowe podawanie terapeutycznych komórek macierzystych do glejaka w modelu mysim

Guzy ośrodkowego układu nerwowego (OUN) są główną przyczyną zgonów związanych z rakiem u dzieci, a lokoregionalne terapie immunologiczne są coraz częściej testowane dla pacjentów w badaniach klinicznych. Protokół ten opisuje metody lokoregionalnej implantacji kaniuli u myszy w celu przedklinicznej oceny infuzji immunoterapeutycznych ukierunkowanych na guzy OUN.

Implantacja kaniuli wewnątrzczaszkowej do seryjnych infuzji limfocytów T lokoregionalnego receptora chimerycznego antygenu (CAR) u myszy

Opracowanie ortotopowych modeli guzów mózgu u dzieci wymaga skrupulatnej precyzji, przy użyciu urządzenia stereotaktycznego do precyzyjnego wszczepiania komórek nowotworowych. Przedstawiona tutaj metodologia przedstawia etapy związane z przygotowaniem komórek guza mózgu, wykonywaniem iniekcji wewnątrzczaszkowych i wdrażaniem systemu monitorowania pooperacyjnego w celu oceny wszczepienia guza mózgu.

Opracowanie ortotopowych modeli ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów dla guzów mózgu przy użyciu urządzenia stereotaktycznego

Celem tego protokołu jest dostarczenie badaczom wysoce powtarzalnej techniki implantacji czaszkowych.

Steryotatyczna wewnątrzczaszkowa implantacja linii komórek xenotransplantatu pochodzenia pacjenckiego z glioblastomu u myszy

Poznaj prostą metodę ksenoprzeszczepu wewnątrzczaszkowego u myszy do badania nowych terapii przeciwnowotworowych. Technika wykorzystuje śrubę prowadzącą do wstrzyknięcia komórek U 87 mg, oferując bezpieczniejszą alternatywę dla stereotaksji.

Prosta metoda prowadnicy śrubowej do badań ksenoprzeszczepów wewnątrzczaszkowych u myszy

Przeglądaj więcej filmów