Identyfikacja podtypów komórek zwojowych siatkówki myszy za pomocą śledzenia fluorescencyjnego

Umieść tkankę siatkówki wyizolowaną od transgenicznej myszy z fluorescencyjnie znakowanymi komórkami zwojowymi siatkówki lub RGC w komorze rejestracyjnej.

Informacja wzrokowa jest przekazywana do RGC, których aksony przekazują ją do mózgu przez nerw wzrokowy.

Podtypy RGC różnią się rozgałęzionymi wzorami ich dendrytów, które rozwarstwiają się na podwarstwy w wewnętrznej warstwie siatkówki.

Spłaszcz tkankę siatkówki i zabezpiecz ją za pomocą kotwicy tkankowej.

Przenieś komorę na stolik mikroskopu i perfaktoruj natleniony roztwór, aby utrzymać żywotność RGC.

Korzystając z oświetlenia w podczerwieni, zidentyfikuj fluorescencyjne RGC.

Umieścić pipetę zawierającą znacznik fluorescencyjny na RGC.

Zastosuj nadciśnienie, aby zapobiec zatkaniu.

Przełącz na podciśnienie, wciągając membranę do pipety, aby utworzyć uszczelnienie.

Zastosuj ssanie, aby rozerwać membranę, ustanawiając konfigurację całej komórki, która ułatwia dyfuzję znacznika do dendrytów.

Obserwuj morfologię i stratyfikację dendrytyczną, aby zidentyfikować podtypy RGC.

Umyj siatkówkę w natlenionym roztworze zewnątrzkomórkowym i przenieś ją do komory rejestracyjnej ze szklanym dnem za pomocą plastikowej pipety do przenoszenia. Następnie za pomocą kleszczy ostrożnie spłaszcz tkankę z warstwą fotoreceptorów skierowaną w dół. Usuń nadmiar płynu za pomocą pipety. I zakotwicz tkankę za pomocą platynowego pierścienia z nylonową siatką. Następnie napełnij komorę natlenionym roztworem zewnątrzkomórkowym i zamontuj go na stoliku mikroskopowym. Perfuzjuj tkankę natlenionym roztworem zewnątrzkomórkowym z prędkością od 2 do 4 mililitrów na minutę.

Aby przygotować się do tej procedury, należy pobrać szklane mikropipety do zapisów elektrofizjologicznych za pomocą ściągacza do mikropipet. Obserwuj warstwę komórek zwojowych za pomocą optyki IR-DIC. Następnie zidentyfikuj GFP plus komórki zwojowe za pomocą epifluorescencji na około 480 nanometrach. Następnie zlokalizuj pipetę wypełnioną roztworem wewnątrzkomórkowym w DIC. Zastosuj lekkie nadciśnienie i wyzeruj wszelkie przesunięcia napięcia na amplifier.

Następnie opuść szklaną mikropipetę na ogniwo GFP z dodatnim wynikiem GFP i zastosuj kroki poleceń napięcia testowego, aby monitorować rezystancję uszczelnienia. Podciśnienie powinno tworzyć uszczelnienie gigaomowe między pipetą a błoną komórkową. Po utworzeniu stabilnego uszczelnienia rozerwij membranę, stosując krótkie impulsy podciśnienia, aby uzyskać dostęp do całej komórki. Odczekaj jedną do dwóch minut, aż dendryty komórki wypełnią się fluorescencyjnym znacznikiem.