Pakowanie konstruktów ekspresyjnych lentiwektorów opartych na HIV lub FIV oraz transdukcja pseudotypowanych cząsteczek wirusowych VSV-G

Ogólnym celem tej procedury jest zapoznanie się z procesem pakowania lentiwirusów. Protokół trwa pięć dni. Pierwszego dnia komórki producenta 2 9 3, TN są wysiewane z obliczoną gęstością.

Drugiego dnia komórki poddaje się transfekcji wybranym konstruktem wektora lenti zawierającym gen zainteresowania oraz mieszanką plazmidów do pakowania wirusów. Czwartego dnia zbiera się nadpływ wirusowy i koncentruje go poprzez dodanie roztworu do wytrącania wirusów PEG. Ostatnie etapy procedury obejmują odzyskanie wirusa skoncentrowanego za pomocą PEG, rozdzielenie wirusa na aliquoty oraz zakażenie komórek skoncentrowanym wirusem w celu wyznaczenia miana wirusa.

W końcowym etapie ilościowe PCR stabilnie zintegrowanych genów jest wykorzystywane do obliczenia liczby stabilnie zintegrowanych konstruktów. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak transfekcja plazmidowa czy transdukcja retrowirusowa, jest to, że zoptymalizowany protokół pakowania lentiwirusów FBI pozwala na uzyskanie wirusa o wysokim mianie i aktywności funkcjonalnej, co umożliwia efektywną dostawę do niemal każdej komórki ssaków, w tym do komórek trudnych do transfekcji, takich jak komórki macierzyste i niepodzielące się komórki pierwotne. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności ze względu na brak znajomości drobnych szczegółów protokołu, które są niezbędne do pomyślnej produkcji wirusa o wysokim mianie.

Wizualna demonstracja tej metody jest pomocna, ponieważ gęstość komórek obserwowana pod mikroskopem podczas transfekcji determinuje wydajność pakowania wirusów, co z kolei wpływa na końcowy miano wirusa. W przypadkach, gdy jest to możliwe, ekspresja fluorescencyjnego reportera pozwala określić wydajność transfekcji, co ma istotny wpływ na ostateczne miano wirusa. Ponadto wizualna prezentacja tej metody pomaga badaczom zapoznać się z subtelnymi, lecz ważnymi elementami protokołu, takimi jak najlepsze praktyki zachowania sterylności w całym procesie oraz sposób unikania zanieczyszczenia zebranego wirusa debris komórkowym.

Efektywne pakowanie lentiwirusowe opiera się na trzech komponentach. Po pierwsze, lentiwirusowy wektor ekspresyjny musi zawierać niektóre elementy niezbędne do pakowania wirusa i stabilnej integracji, a także elementy do ekspresji genu zainteresowania. Krótka spinka RNA (shRNA), mikroRNA lub kaseta reporterowa.

Po drugie, plazmidy pakujące lentiwirusowe muszą dostarczać białka niezbędne do zapakowania kopii RNA konstruktu ekspresyjnego do rekombinowanych cząsteczek pseudowirusowych oraz do późniejszej odwrotnej transkrypcji i integracji wirusa po infekcji. Po trzecie, komórki producenta 2 9 3 TN muszą zostać przejściowo współtransfekowane wektorem ekspresyjnym oraz wektorami pakującymi. Komórki te produkują pseudowirusowe cząstki o wysokich mianach, które należy zebrać z pożywki hodowlanej.

Ostatecznie skuteczna transdukcja komórek docelowych zależy głównie od liczby cząsteczek wirusowych na komórkę dla danego typu komórek. Innymi słowy, od wielokrotności infekcji; należy rozpocząć od hodowli komórek 2 9 3 TN w 15-centymetrowych płytkach hodowli komórkowych przez 18 do 24 godzin, aby uzyskać 60 do 80% konfluencji.

W momencie transfekcji każda płytka dostarczy około 14 milionów komórek w celu zwiększenia wydajności wirusa. Następnego dnia można użyć więcej niż jednej płytki; gdy komórki 2 9 3 TN osiągną 60 do 80% konfluencji, są gotowe do transfekcji. Dla każdej płytki z komórkami dodaj 1,6 mililitrów DMEM bez surowicy do probówki Falcon o pojemności 15 mililitrów.

Następnie dodaj 22,5 µg ppac H one lub Ppac F1 oraz 4,5 µg konstruktu wektora lenti do DMEM i wymieszaj, pipetując ciecz w górę i w dół. Następnie dodaj 55 µL czystego affection do tej samej probówki i wortexuj przez 10 s, a następnie inkubuj przez 15 min w temperaturze pokojowej. Po 15 min przelej zawartość jednej probówki do każdej płytki hodowlanej.

Dodawać kroplami, a następnie delikatnie zakręcić płytką, po czym inkubować komórki przez 48 godzin w temperaturze 37 °C przy 5% CO2. Jeśli konstrukt wektora lentiwirusowego wykazuje ekspresję genu fluorescencyjnego, takiego jak GFP, należy sprawdzić komórki pod mikroskopem; pomyślna transfekcja powinna dać od 50 do ponad 90% zielonych fluorescencyjnych komórek. Następnie zebrać nadsącz z hodowli komórkowej do probówki stożkowej o pojemności 50 ml. Nadsącz zawiera zakaźne pseudowirusowe cząstki wirusowe.

Ewentualne komórki oderwane od płytki nie wpłyną negatywnie na produkcję wirusa. Aby usunąć resztki, odwirować nadsącz wirusowy przy 1500 G przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Następnie, nie naruszając osadu, zebrać nadsącz wirusowy, pamiętając o pozostawieniu bufora w ilości około 500 µl nadsączu, i przejść do kolejnego kroku, którym jest zagęszczanie cząstek wirusowych 72 godziny po transfekcji.

Opcjonalne drugie pobranie supernatu wirusowego można przeprowadzić przy użyciu tej samej techniki po zebraniu stanu wirusowego. Koncentrację wykonuje się poprzez dodanie jednej objętości lodowatego roztworu do wytrącania wirusów PEG na każde cztery objętości supernatu w 50 mililitrowej polipropylenowej probówce do wirowania. Odwróć probówkę, aby wymieszać roztwór.

Nigdy nie używaj wirówki typu vortex, a następnie przechowuj roztwór bez mieszania w temperaturze 4°C przez maksymalnie 96 godzin. Po minimum 12 godzinach chłodzenia odwiruj mieszaninę przy 1500 G przez 30 minut w temperaturze 4°C. Po wirowaniu wytrącone cząsteczki lentiwirusowe peggo pojawią się w postaci beżowego lub białego osadu na dnie probówki.

Następnie ostrożnie usuń resztki cieczy poprzez aspirację, uważając, aby nie zakłócić osadu z wytrąconych cząsteczek lentiwirusowych. Alternatywnie można usunąć większość nadnadzawki i resuspender osad w pozostałym nadnadzawku. Następnie przenieś zawiesinę do sterylnej probówki typu Eppendorf o pojemności 2 ml i wiruj ją w chłodnej mikrowirówce przez 2 minuty.

Przy 14 000 RPM odpipetuj pozostały supernatant, a osad cząsteczek lentiwirusowych resuspenduj w lodowatym, sterylnym buforze w rozcieńczeniu od 1/10 do 1/100 objętości pierwotnej. Ostrożnie przenieś osad pipetą do roztworu, unikając tworzenia pęcherzyków powietrza i przez cały czas utrzymując niską temperaturę. Upewnij się, że osad został całkowicie zresuspendowany.

Na koniec przygotować alikwoty po 15 do 25 µL w sterylnych probówkach kriogenicznych na lodzie i przechowywać je w temperaturze -70 °C. Pomyślny proces pakowania pozwoli uzyskać od 10 milionów do 1000 milionów IFU na mL dla transdukcji wirusowej w 24-dołkowej płytce hodowlanej, przy 50 000 komórek na dołek; następnie inkubować je przez noc w określonych warunkach hodowli. Do celów miareczkowania komórki powinny osiągnąć od 50 do 70% konfluencji przed transdukcją.

Komórki HT 1080 można wykorzystać jako linię kontrolną, którą łatwo poddać transdukcji. Następnego dnia należy odessać pożywkę z komórek. Następnie połączyć pożywkę hodowlaną ze stężonym roztworem transduktorów, tak aby końcowe stężenie transduktorów wynosiło 1x. Do każdej studni z komórkami docelowymi o odpowiedniej konfluencji od 50 do 70% dodać 0,5 mL roztworu po transdukcji. Wirusa należy dodać do każdej studni w następujących rozcieńczeniach: 1:100, 1:10 oraz w rozcieńczeniu bezpośrednim 1:1.

Wirus może pozostawać w kontakcie z komórkami docelowymi do 72 godzin bez zmiany medium. Po 72 godzinach prowirus zostanie stabilnie zintegrowany z genomem gospodarza i zacznie ekspresować badany gen. Jeśli obecna jest ekspresja markera fluorescencyjnego, można ją wykorzystać do oszacowania wydajności transdukcji przy różnych rozcieńczeniach wirusa, a następnie określić liczbę jednostek zakaźnych za pomocą qPCR.

Po ustaleniu miana wirusa należy obliczyć odpowiednią objętość wirusa, aby uzyskać pożądaną wielokrotność infekcji (MOI) dla innych komórek docelowych. Pomiar miana i kontrola MOI zapewniają powtarzalność między eksperymentami oraz różnymi preparatami wirusa. Wirus jest teraz gotowy do wykorzystania w dalszych badaniach.

Początkowa gęstość komórek 2 9 3 TN była kluczowa dla skutecznego pakowania wirusów w dniu transfekcji. Komórki 2 9 3 TN te wykazywały konfluencję na poziomie od 60 do 80%. Stwierdzono, że 24 godziny po udanej transfekcji wektorem lenti ekspresującym GFP co najmniej 90% komórek 2 9 3 TN wykazywało zieloną fluorescencję.

72 godziny po transdukcji w komórkach gospodarza HT 10 80 nadal występowała ekspresja GFP. Wskazuje to, że konstrukt lentiwirusowy stabilnie zintegrował się z genomem gospodarza; transdukcja tych samych komórek gospodarza przy dziesięciokrotnym rozcieńczeniu spowodowała proporcjonalny spadek ekspresji GFP. Wynika to z faktu, że zależność między mianem wirusa a lentiwirusową ekspresją genów jest bezpośrednio proporcjonalna.

Po opanowaniu tej techniki, przy prawidłowym wykonaniu, procedurę można przeprowadzić w ciągu pięciu dni, poświęcając na to około jedną do dwóch godzin dziennie. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak efektywnie i bezpiecznie pakować funkcjonalnie zakaźne cząsteczki wirusowe oraz jak skutecznie transdukować komórki za pomocą wirusa. Pamiętaj, że praca z lentiwirusem może być niebezpieczna i wymaga zachowania środków ostrożności, takich jak praca w komorze do kultur tkankowych o poziomie bezpieczeństwa biologicznego BSL 2.

Podczas wykonywania tej procedury należy zawsze nosić fartuch laboratoryjny i rękawiczki.