Pakowanie konstruktów ekspresji wektora lentiwektorowego opartych na HIV lub FIV i transdukcja pseudotypowanych cząstek wirusa VSV-G

Ogólnym celem tej procedury jest poznanie opakowań lentiwirusowych. Pięciodniowy protokół. Pierwszego dnia, 2 9 3, ogniwa producenta TN są powlekane z obliczoną gęstością.

Drugiego dnia komórki są transfekowane wybranym konstruktem wektora lenti, zawierającym interesujący nas gen i mieszankę plazmidów do pakowania wirusa. Czwartego dnia sacie wirusa jest zbierane i zagęszczane przez dodanie roztworu wytrącającego wirusa PEG. Końcowym etapem procedury jest pobranie skoncentrowanego wirusa PEG, podwielokrotnienie wirusa i zakażenie komórek skoncentrowanym wirusem w celu wywołania wirusa.

Ostatecznie, ilościowy PCR stabilnie zintegrowanych genów służy do obliczenia liczby stabilnych zintegrowanych konstruktów. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak transfekcja osocza lub transdukcja retrowirusowa, jest to, że zoptymalizowany protokół pakowania lentiwirusa FBI wytwarza funkcjonalnie aktywnego wirusa o wysokim mianie, co umożliwia skuteczne dostarczanie do prawie każdej komórki ssaków, w tym trudnych do transfekcji komórek, takich jak komórki macierzyste i niedzielące się komórki pierwotne. Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej metodzie będą miały trudności, ponieważ nie są zaznajomione z drobnymi szczegółami protokołu, które są niezbędne do pomyślnej produkcji wirusa o wysokim mianie.

Wizualna demonstracja tej metody jest przydatna, ponieważ gęstość komórek wizualizowana przez mikroskop podczas transfekcji określa skuteczność pakowania wirusa, który określa końcowe miano wirusa. W przypadkach, w których ma to zastosowanie, ekspresja fluorescencyjnego reportera decyduje o skuteczności transfekcji, która ma znaczący wpływ na końcowe miano wirusa. Dodatkowo, wizualna demonstracja tej metody jest pomocna dla badaczy w zapoznaniu się z subtelnymi, ale ważnymi częściami protokołu, takimi jak najlepsze praktyki utrzymania sterylności podczas całego procesu oraz jak uniknąć włączania resztek komórkowych do pobranego wirusa.

Skuteczne pakowanie lentiwirusów opiera się na trzech komponentach. Po pierwsze, lentiwirusowy wektor ekspresyjny musi zawierać niektóre elementy wymagane do pakowania wirusa i stabilnej integracji, a także elementy do ekspresji genu będącego przedmiotem zainteresowania. Krótka spinka do włosów, RNA, mikro RNA lub kaseta reporterska.

Po drugie, plazmidy pakujące lentiwirusa muszą dostarczać białka niezbędne do upakowania kopii RNA konstruktu ekspresyjnego w rekombinowane cząstki pseudowirusa, a następnie odwrotnej transkrypcji i integracji wirusa po zakażeniu. Po trzecie, 2 9 3 komórki produkcyjne TN muszą być przejściowo przecięte przez wektory ekspresji i pakowania. Komórki te wytwarzają cząstki pseudowirusa o wysokim mianie, które są zbierane z pożywki hodowlanej.

Ostatecznie, udana transdukcja komórek docelowych zależy głównie od liczby cząstek wirusa w komórce dla danego typu komórki. Innymi słowy, mnogość infekcji zaczyna się od dorastania 2 9 3 komórek TN. W 15-centymetrowych płytkach do hodowli komórkowych przez 18 do 24 godzin, aby uzyskać płynność od 60 do 80%.

W momencie transfekcji każda płytka da około 14 milionów komórek, aby zwiększyć wydajność wirusa. Więcej niż jedną płytkę można użyć następnego dnia, gdy 2 9 3 komórki TN są w 60 do 80% zlewne, są gotowe do transfekcji. Na każdą płytkę komórek dodaj 1,6 mililitra, wolnego od surowicy DMEM do 15-mililitrowej probówki sokoła.

Następnie dodaj 22,5 mikrograma ppac H one lub Ppac F1 i 4,5 mikrograma konstruktu wektorowego lenti do DMEM i mieszaj, pipetując w górę iw dół. Następnie dodaj 55 mikrolitrów czystego uczucia do tej samej probówki i wiruj przez 10 sekund, a następnie wykonaj 15-minutową inkubację w temperaturze pokojowej. Po 15 minutach dodaj jedną rurkę do każdej płytki hodowlanej.

Kroplami, następnie delikatnie zakręć płytką, a następnie inkubuj komórki przez 48 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla po 48 godzinach. Jeśli konstrukt wektora lenti wyraża gen fluorescencyjny, taki jak GFP, sprawdź komórki pod mikroskopem, udana transfekcja da od 50 do ponad 90% zielonych komórek fluorescencyjnych, teraz zbieraj supernatant hodowli komórkowej do 50-mililitrowej stożkowej probówki. Supernatant zawiera zakaźne cząstki pseudowirusowe.

Wszelkie komórki oderwane od płytki nie wpłyną negatywnie na produkcję wirusa. Aby usunąć zanieczyszczenia, odwirować supernatant wirusa w ilości 1500 G przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Następnie, nie naruszając osadu, zbierz supernatant wirusa, upewniając się, że pozostawiłeś bufor około 500 mikrolitrów supernatantu i przejdź do następnego etapu, którym jest zagęszczenie cząstek wirusa 72 godziny po transfekcji.

Opcjonalne drugie pobranie supernatu wirusa może być wykonane przy użyciu tej samej techniki po pobraniu satu wirusowego. Skoncentrowany przez dodanie jednej objętości lodowatego roztworu wytrącającego wirusa peg do każdych czterech objętości supernatantu w 50-mililitrowej polipropylenowej probówce wirówkowej. Odwróć roztwór, aby go wymieszać.

Nigdy nie używaj wiru, a następnie przechowuj roztwór bez mieszania w temperaturze czterech stopni Celsjusza do 96 godzin. Po minimum 12 godzinach chłodzenia odwirować mieszaninę o stężeniu 1500 G przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po odwirowaniu wytrącone przez peggo cząstki lentiwirusa pojawią się jako beżowe lub białe granulki na dnie probówki.

Teraz usuń wszelkie ślady płynu przez ostrożne zasysanie, nie naruszając wytrąconych cząstek lentiwirusa w granulce. Alternatywnie, usunąć większość supra natin i ponownie zawiesić osad w pozostałym supinacie. Następnie przenieś zawiesinę do sterylnej dwumililitrowej probówki einor i odwiruj probówkę w zimnej mikro fuge przez dwie minuty.

Przy prędkości 14 000 obr./min odpipetuj pozostały supernatant i ponownie zawieś osad cząstek lentiwirusa w lodowatym, zimnym, sterylnym buforze w ilości od jednej dziesiątej do jednej setnej. Pierwotna objętość ostrożnie odpipetuj osad do roztworu, nie tworząc żadnych pęcherzyków, utrzymując go w chłodzie przez cały czas. Upewnij się, że pelety są całkowicie zawieszone.

Na koniec przygotuj od 15 do 25 mikrolitrów podwielokrotności atramentu, sterylne fiolki kriogeniczne na lodzie i przechowuj fiolki w temperaturze ujemnej 70 stopni Celsjusza. Udana seria pakowania przyniesie od 10 milionów do 1000 milionów IFU na mililitr do transdukcji wirusa na 24-dołkowej płytce hodowlanej, 50 000 komórek na dołek i hodowania ich przez noc w określonych warunkach hodowli. Komórki powinny być w od 50 do 70% zlewające się do transdukcji w celu titteringu.

Komórki HT 10 80 mogą być używane jako łatwa do transdukcji kontrolna linia komórkowa następnego dnia do odessania pożywki z komórek. Następnie połącz pożywkę hodowlaną ze skoncentrowanym roztworem kaczki. Tak więc końcowe stężenie kaczek trans wynosi jeden x, dodaj pół mililitra transdukowanego do każdej studzienki z komórkami docelowymi o prawidłowej gęstości 50 do 70% płynności Co dodaj wirusa do każdej studzienki w następujących rozcieńczeniach, jeden do 100, jeden do 10 i proste rozcieńczenie jeden do jednego.

Wirus może pozostawać w kontakcie z komórkami docelowymi do 72 godzin bez zmiany pożywki. Po 72 godzinach prowirus stabilnie zintegruje się z genomem gospodarza i zacznie wyrażać interesujący go gen. Jeśli obecna ekspresja markera fluorescencyjnego może być wykorzystana do oszacowania skuteczności transdukcji przy różnych rozcieńczeniach wirusa, wówczas liczbę jednostek zakaźnych można określić ilościowo za pomocą QPCR.

Gdy miano wirusa jest już znane, należy obliczyć odpowiednią objętość wirusa, aby osiągnąć pożądaną wielokrotność infekcji dla innych komórek docelowych. Pomiar miana i kontrolowanie MOI zapewnia spójność między eksperymentami i różnymi preparatami wirusowymi. Wirus jest teraz gotowy do użycia w dodatkowych eksperymentach.

Gęstość wyjściowa 2 9 3 komórek TN miała kluczowe znaczenie dla pomyślnego pakowania wirusa w dniu transfekcji. Te 2, 9, 3 komórki TN były od 60 do 80% zlewane. 24 godziny po udanej transfekcji wektorem lenti wykazującym ekspresję GFP stwierdzono, że co najmniej 90% z 2 9 3 komórek TN wykazywało zieloną fluorescencję.

72 godziny po transdukcji GFP kontynuował ekspresję w komórkach gospodarza HT 10 80. Wskazuje to, że konstrukt lentiwirusowy stabilnie zintegrowany z genomem gospodarza, transdukujący te same komórki gospodarza w dziesięciokrotnym rozcieńczeniu, proporcjonalnie zmniejszał ekspresję GFP. Ponieważ związek między mianem wirusa a ekspresją genów za pośrednictwem lentiwirusa jest wprost proporcjonalny.

Po opanowaniu tej techniki można ją wykonywać w ciągu pięciu dni przez około jedną do dwóch godzin dziennie, jeśli jest wykonywana prawidłowo. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak skutecznie i bezpiecznie pakować funkcjonalnie zakaźne cząsteczki wirusa oraz skutecznie transdukować komórki z wirusem. Nie zapominaj, że praca z lentiwirusem może być niebezpieczna i należy zachować środki ostrożności, takie jak praca w kapturze do hodowli tkankowej BSL.

Podczas wykonywania tej procedury należy zawsze nosić fartuch laboratoryjny i rękawice.