Bezsoczewkowa mikroskopia fluorescencyjna na chipie
17 sierpnia 2011
Bezsoczewkowa platforma mikroskopii fluorescencyjnej na chipie jest demonstrowana, która może obrazować obiekty fluorescencyjne w ultraszerokim polu widzenia, np. >0,6-8 cm2 z rozdzielczością <4μm, używając algorytmu dekodowania opartego na kompresyjnym próbkowaniu. Tak kompaktowa i szerokokątna metoda obrazowania fluorescencyjnego na chipie może być cenna dla wysokoprzepustowej cytometrii, badań nad rzadkimi komórkami i analizy mikromacierzy.
Ogólnym celem tej procedury jest zademonstrowanie wbudowanej w soczewkę platformy mikroskopii fluorescencyjnej do obrazowania obiektów fluorescencyjnych w ultraszerokim polu widzenia. Aby to osiągnąć, cienki filtr absorpcyjny i światłowodowa płyta czołowa są delikatnie umieszczane na wierzchu matrycy czujników optoelektrycznych lub mchu CCDC, a następnie chip mikroprzepływowy jest umieszczany na górze płyty czołowej. Następnie pryzmat jest montowany z mikroczipem za pomocą oleju dopasowującego indeks.
Cytowanie fluorescencyjne uzyskuje się przez boczną fasetę romboidalnego pryzmatu, a oświetlenie holograficzne odbywa się przez górną fasetę tego samego pryzmatu. Ostatecznie, obrazy mikroskopowe o wysokiej rozdzielczości można uzyskać z uzyskanych obrazów fluorescencyjnych poprzez dekodowanie surowych obrazów za pomocą algorytmów cyfrowych. W razie potrzeby zdekodowane obiekty fluorescencyjne mogą być automatycznie zliczane za pomocą specjalnie opracowanego interfejsu.
Na soczewce chipowej. Ogólnie rzecz biorąc, obrazowanie ma na celu zastąpienie nieporęcznych mikroskopów optycznych opartych na soczewkach prostszymi i bardziej kompaktowymi konstrukcjami. Ta powstająca platforma technologiczna ma potencjał, aby wyeliminować potrzebę stosowania nieporęcznych i kosztownych komponentów atrakcyjnych dzięki pomocy nowatorskich teorii i algorytmów rekonstrukcji cyfrowej.
Lista soczewek na wbudowanej platformie obrazowania składa się z kilku elementów optycznych, w tym matrycy czujników cyfrowych, niespójnego źródła oświetlenia, pryzmatu, filtra absorpcyjnego i światłowodowej płyty czołowej lub stożka światłowodowego. Na tej platformie można stosować różne typy matryc czujników do wykrywania sygnału fluorescencyjnego z docelowych mikroobiektów. Na potrzeby tego filmu zostanie użyte urządzenie sprzężone z ładunkiem, niespójne źródło światła, takie jak prosta dioda elektroluminescencyjna, służy do wzbudzenia fluorescencyjnego.
Dwie różne metody filtrowania wzbudzenia są używane równolegle w celu utworzenia wymaganego tła ciemnego pola, jak pokazano na tym schemacie. Po pierwsze, szklany pryzmat lub szklana półkula jest używana do wytworzenia całkowitego wewnętrznego odbicia lub TIR na dolnej powierzchni chipa mikroprzepływowego, w którym znajdują się interesujące nas próbki. Równolegle stosuje się niedrogi filtr absorpcyjny do usuwania tygodniowych rozproszonych świateł wzbudzenia, które nie są zgodne z procesem TIR.
Po pomyślnym odrzuceniu wzbudzenia za pomocą tych dwóch mechanizmów, w płaszczyźnie detektora uzyskuje się tylko emisję fluorescencyjną próbek. Pomimo tak dużej apertury numerycznej detekcji, surowe plamki fluorescencyjne na matrycy czujników stają się dość szerokie, aby zaprojektować i lepiej kontrolować przestrzenne rozprzestrzenianie się tego sygnału fluorescencyjnego. Światłowodowa płyta czołowa zostanie umieszczona między obiektem a płaszczyznami czujnika jako alternatywa dla zwykłej płyty czołowej.
Stożkowa światłowodowa płyta czołowa, która ma znacznie większą gęstość światłowodowych na górnej ścianie w porównaniu z dolną, może być używana do obrazowania o wyższej rozdzielczości poprzez powiększenie. Chipy mikroprzepływowe, które są używane w tej platformie, są wytwarzane przy użyciu ścianek z polidimetylu Sloane'a umieszczonych na szklanych szkiełkach w celu stworzenia mikrokanałów, które są potrzebne do obrazowania na chipie, aby rozpocząć montaż bezlądowej platformy obrazowania na chipie. Najpierw zdejmij szkiełko nakrywkowe optoelektronicznego układu czujników za pomocą pióra próżniowego, delikatnie umieść cienki filtr absorpcyjny na górze aktywnego obszaru detektora.
Umieść światłowodową płytę czołową na górze tego filtra absorpcyjnego. Następnie umieść wyprodukowany chip mikroprzepływowy bezpośrednio na górze układu światłowodowego. Następnie szklany pryzmat jest montowany nad chipem mikroprzepływowym, który dopasowuje wskaźnik dopasowania do oleju, tak aby współczynnik załamania światła interfejsu był dopasowany do współczynnika załamania światła szkła.
Podłącz źródła światła do światłowodowych za pomocą złącz FC. Jednym z najtrudniejszych aspektów tej procedury jest wyrównanie komponentów. Ostrożnie wyrównaj odległości między komponentami, położenie i kąt oświetlenia.
Na koniec przesuń włókno oświetlenia bocznego bliżej pryzmatu i dostosuj jego kąt, aby zapewnić całkowite odbicie wewnętrzne na szklanym interfejsie powietrza odpowiadającym chipom mikroprzepływowym. Dolny substrat, różne komórki lub modele małych zwierząt mogą być obrazowane za pomocą tej platformy na chipie, ale białe krwinki zostaną zobrazowane na potrzeby tej demonstracji. Aby oznaczyć białe krwinki barwnikiem fluorescencyjnym, najpierw wymieszaj około 100 mikrolitrów krwi pełnej z około jednym mililitrem buforu do wzrostu czerwonych krwinek, inkubuj przez około trzy minuty w temperaturze pokojowej, a następnie odwiruj roztwór krwi.
Po usunięciu górnej warstwy za pomocą mikropipety, ponownie zawieś warstwę osadu w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanem, aby oznaczyć kwas nukleinowy komórek barwnikiem fluorescencyjnym, dodaj SYTO 16 do zawiesiny resus, a następnie inkubuj próbkę przez około 30 minut w ciemności w temperaturze pokojowej. Po 30 minutach odwirować oznakowaną próbkę. Usuń supinat, aby zmniejszyć szum tła spowodowany emisją fluorescencyjną z niezwiązanych barwników.
Reese zgiął warstwę osadów białych krwinek w około pięciu mililitrach PBS. Próbka jest teraz gotowa do załadowania do chipa mikroprzepływowego w celu obrazowania fluorescencyjnego bez soczewek na chipie. Przed obrazowaniem białych krwinek platforma obrazowania musi zostać skalibrowana przy użyciu mikrogranulek fluorescencyjnych.
Przygotować rozcieńczoną próbkę mikrogranulek, używając wody dejonizowanej i roztworu surowych kulek. Za pomocą ostrej strzykawki z igłą. Wstrzyknąć tę początkową próbkę do chipa mikroprzepływowego od strony ścianek PDMS.
Po zmontowaniu komponentów w celu uzyskania wbudowanego obrazowania fluorescencyjnego, uzyskaj surowe obrazy koralików fluorescencyjnych za pomocą niestandardowo opracowanego interfejsu widoku laboratoryjnego za pomocą komputera. Upewnij się, że w całym polu widzenia znajduje się co najmniej 20 izolowanych obrazów koralików fluorescencyjnych. Zapisz dane kalibracyjne, które zostaną później wykorzystane do kalibracji i wyodrębnienia funkcji rozproszenia punktowego platformy mikroskopii fluorescencyjnej bez soczewek.
Wyjmij chip mikroprzepływowy zawierający próbkę kulki fluorescencyjnej i odłącz pryzmat od tego chipa. Strzyknąć wcześniej przygotowaną próbkę białych krwinek do innego nieużywanego chipa mikroprzepływowego od strony ścianek PDMS. A ponownie zmontować komponenty w tych samych warunkach eksperymentalnych, zwłaszcza w odniesieniu do odległości i mocy wzbudzenia.
Uzyskaj surowe obrazy białych krwinek za pomocą niestandardowego widoku laboratoryjnego z tymi samymi parametrami oprogramowania, które są używane dla mikrogranulek fluorescencyjnych. Dane kalibracyjne i surowe obrazy białych krwinek są następnie wykorzystywane do tworzenia obrazów o wyższej rozdzielczości w MATLAB poprzez przetwarzanie cyfrowe. Reprezentatywne wyniki obrazowania fluorescencyjnego na chipie z soczewką szerokokątną mieszaniny zawierającej cztery mikrony i 10 mikronów zielonych cząstek fluorescencyjnych są pokazane tutaj w celach porównawczych, mikroskop 10 x.
Dostarczane są również obiektywne obrazy, które dobrze zgadzają się z pokazanymi obrazami mniej fluorescencyjnymi obiektywu. Następnie, wyniki soczewki szerokokątnej, mniej fluorescencyjne obrazowanie mieszaniny zawierającej 10 mikronów zielonych i 10 mikronów czerwonych cząstek fluorescencyjnych. Obrazy bezfluorescencyjne zapewniają przyzwoite dopasowanie do 10-krotnych obrazów obiektywów mikroskopowych tych samych próbek.
Rysunek ten przedstawia porównanie wydajności dekonwolucji Lucy Richardson i próbkowania kompresyjnego w oparciu o algorytmy dekodowania do obrazowania różnych par kulek o średnicy 10 mikronów. Górny rząd ilustruje obiektyw mniej surowymi obrazami fluorescencyjnymi, w których obrazy wstawkowe pokazują porównania mikroskopowe tych samych cząstek, które są wymagane przy użyciu soczewki obiektywowej 10x. Środkowy rząd przedstawia wyniki dekodowania kompresyjnego, podczas gdy dolny rząd ilustruje wyniki dekonwolucji Lucy Richardson, DDCS i DLR odnoszą się odpowiednio do odległości od środka do środka i obrazów mikroskopowych, obrazów obiektywów dekodowanych CS i obrazów bez soczewek skrętnych LR de.
Następnie zilustrowano cyfrową obróbkę obiektywu, mniej fluorescencyjne surowe obrazy. Algorytm oparty na próbkowaniu kompresyjnym służy do osiągnięcia rozdzielczości przestrzennej mniejszej niż cztery mikrony poprzez rozwiązanie ciasno upakowanych par kulek o średnicy dwóch mikronów. Wstawki pokazują 40-krotne porównania obiektywów mikroskopowych, które bardzo dobrze zgadzają się z dekodowanymi obrazami fluorescencyjnymi.
Tutaj D odnosi się do odległości od środka do środka na obrazach mikroskopowych. Podczas gdy DCS odnosi się do odległości od środka do środka w dekodowanej soczewce CS, mniej obrazów fluorescencyjnych. Ten rysunek przedstawia wyniki bezsoczewkowego obrazowania białych krwinek znakowanych fluorescencyjnie.
Surowe obrazy bez soczewek są szybko dekodowane za pomocą dekodera opartego na CS, który bardzo dobrze zgadza się z konwencjonalnym obrazem mikroskopowym tej samej próbki, który jest uzyskiwany za pomocą soczewki obiektywowej 10x. Oprócz obrazowania w razie potrzeby, zdekodowane obiekty fluorescencyjne mogą być również automatycznie zliczane za pomocą specjalnie opracowanego interfejsu do zastosowań cytometrii na chipie. Pokazano tutaj specjalnie zaprojektowany, zautomatyzowany interfejs zliczania obiektów fluorescencyjnych w matlabie. Właśnie zademonstrowaliśmy procedurę bezlądowej mikroskopii fluorescencyjnej znakowanych komórek i mikrodudnień w polu widzenia o powierzchni ośmiu centymetrów kwadratowych.
Tak porównywała platformę obrazowania statków z szybkim dekoderem kompresyjnym z tyłu. Będzie dość zmienny w przypadku cytometrii o wysokiej przepustowości, analizy mikrorzadkich i zastosowań do badań nad prawdziwymi komórkami.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten artykuł prezentuje bezobiektywową platformę mikroskopową na chipie zdolną do obrazowania fluorescencyjnych obiektów na ultraszerokim polu widzenia. System osiąga rozdzielczość mniejszą niż 4μm przy użyciu algorytmu dekodowania opartego na próbkowaniowym kompresji, co sprawia, że jest on odpowiedni do zastosowań o wysokiej wydajności.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Mikroskopia fluorescencyjna
- Techniki obrazowania
- Mikrofluidyka
Tło
- Tradycyjna mikroskopia często wymaga dużych obiektywów.
- Systemy bezobiektywowe mogą oferować kompaktowe rozwiązania do obrazowania.
- Cytometria o wysokiej wydajności i badania rzadkich komórek korzystają z obrazowania szerokiego pola.
- Algorytmy cyfrowe poprawiają rozdzielczość obrazu z danych surowych.
Cel badania
- Opracowanie kompaktowego bezobiektyowego systemu obrazowania.
- Osiągnięcie wysokiej rozdzielczości obrazowania na dużej powierzchni.
- Ułatwienie automatycznego liczenia fluorescencyjnych obiektów.
Zastosowane metody
- Umieszczenie cienkiej filtry absorpcyjnego i płyty czołowej światłowodowej na tablicy czujników.
- Umieszczenie mikroczipa mikrofluidycznego do obsługi próbek.
- Zastosowanie pryzmatu romboidalnego do wzbudzania fluorescencji i iluminacji holograficznej.
- Zastosowanie algorytmów cyfrowych do dekodowania i analizy obrazu.
Główne wyniki
- Sukces w obrazowaniu fluorescencyjnych obiektów na powierzchni większej niż 0,6-8 cm².
- Osiągnięta rozdzielczość mniejsza niż 4μm.
- Wykazane potencjał dla zastosowań o wysokiej wydajności.
- Możliwość automatycznego liczenia fluorescencyjnych obiektów poprzez niestandardowy interfejs.
Wnioski
- Bezobiektywowa platforma mikroskopowa na chipie jest skuteczna do obrazowania szerokiego pola.
- Oferuje kompaktową alternatywę dla tradycyjnych metod mikroskopicznych.
- Ta technologia może znacząco zaawansować cytometrię i analizę mikrotablicach.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Lensless on-chip fluorescent microscopy addresses the need for compact, high-throughput imaging in early discovery workflows by eliminating bulky optical components. The platform enables rapid screening of fluorescently labeled samples over ultra-wide fields of view, supporting scalable cytometric and microarray applications. Its integration with digital decoding algorithms enhances predictive confidence in target validation and phenotypic screening by delivering quantitative, reproducible imaging data.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through high-resolution imaging of fluorescently labeled cellular targets over large areas.
- Operational Value: Supports functional target validation by providing label-specific signal detection without optical complexity.
- Predictive Value: Enhances portfolio triage by generating reliable imaging data for mechanistic de-risking of cellular pathways.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream screening by enabling uniform excitation and collection of fluorescent signals across microfluidic channels.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility through fixed optical geometry and digital point spread function calibration.
- Scalability: Facilitates high-throughput screening readiness via imaging of vertically stacked micro-channels, increasing sample throughput per run.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports disease-relevant imaging of primary cells such as white blood cells, enabling biomarker-aligned readouts.
- Preclinical Alignment: Bridges discovery to preclinical validation by providing quantitative imaging outputs compatible with histopathological benchmarks.
- Risk-Adjusted Decisions: Enables data-driven advancement decisions through automated counting and spatial distribution analysis of fluorescent objects.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early target hypothesis testing through lead identification and preclinical validation, particularly for assays requiring wide-field, label-specific detection.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by resolving subcellular fluorescent signals in primary cell populations.
- Screening: Delivers assay readiness through reproducible fluorescent signal capture and digital reconstruction across large fields of view.
- Analytics: Provides quantitative measurements such as object count, intensity, and spatial distribution via compressive sampling-based decoding.
- Translational Research: Connects to preclinical workflows through imaging of clinically relevant cell types like white blood cells, enabling biomarker correlation.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable imaging platform across multiple projects due to its modular design and algorithm-driven adaptability.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through high-resolution, label-specific imaging over wide fields of view.
- Operational Value: Standardization and scalability via fixed optical components and automated image decoding.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions by reducing biological ambiguity in phenotypic screening data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization through high-content, reproducible imaging outputs for lead selection.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescent labeling, microfluidic handling, and digital image processing.
- Dependent on optoelectronic sensor arrays, fiber optic face plates, and prism-based excitation systems.
- Necessitates cross-team standardization of calibration protocols using fluorescent microbeads for point spread function derivation.
- Adaptation considerations include microfluidic channel design and excitation power tuning across different cell types or bead sizes.
- Practical limitations include dependency on fluorescent signal strength and potential background from unbound dyes, mitigated by washing steps.
