Bezosobnikowa mikroskopia fluorescencyjna na chipie

Ogólnym celem tej procedury jest zaprezentowanie bezsoczewkowej platformy do mikroskopii fluorescencyjnej na chipie, służącej do obrazowania obiektów fluorescencyjnych w bardzo szerokim polu widzenia. Aby to osiągnąć, cienki filtr absorpcyjny oraz światłowodową płytkę czołową umieszcza się delikatnie na macierzy czujników optoelektrycznych (CCDC CMOS), a następnie na płytce czołowej pozycjonuje się chip mikrofluidyczny. Następnie, za pomocą oleju dopasowującego współczynnik załamania światła, montuje się pryzmat z mikrochipem.

Wzbudzenie fluorescencyjne odbywa się poprzez boczną ściankę pryzmatu rombowego, natomiast oświetlenie holograficzne realizowane jest przez górną ściankę tego samego pryzmatu. Ostatecznie, z pozyskanych obrazów fluorescencyjnych można uzyskać mikroskopowe obrazy o wysokiej rozdzielczości poprzez dekodowanie surowych danych za pomocą algorytmów cyfrowych. W razie potrzeby, zdekodowane obiekty fluorescencyjne mogą być automatycznie liczone przy użyciu specjalnie opracowanego interfejsu.

Soczewka na chipie. Obrazowanie w ogólnym ujęciu ma na celu zastąpienie obszernych mikroskopów optycznych opartych na soczewkach prostszymi i bardziej kompaktowymi konstrukcjami. Ta rozwijająca się platforma technologiczna ma potencjał, aby dzięki nowym teoriom i algorytmom rekonstrukcji cyfrowej wyeliminować potrzebę stosowania masywnych i kosztownych komponentów optycznych.

Lista soczewek na platformie obrazowania on-chip obejmuje kilka komponentów optycznych, w tym macierz czujników cyfrowych, niespójne źródło oświetlenia, pryzmat, filtr absorpcyjny oraz płytkę czołową światłowodową lub stożek światłowodowy. W tej platformie do detekcji sygnału fluorescencyjnego z docelowych mikroobiektów można wykorzystać różne rodzaje macierzy czujników. Na potrzeby tego filmu zostanie użyte urządzenie ładunkowe CCD, a jako niespójne źródło światła do wzbudzenia fluorescencji posłuży zwykła dioda emitująca światło.

W celu uzyskania wymaganego tła w ciemnym polu, zgodnie z przedstawionym na schemacie rysunkiem, stosowane są równolegle dwie różne metody filtrowania wzbudzenia. Po pierwsze, wykorzystuje się pryzmat szklany lub szklaną półkulę, aby wywołać całkowite wewnętrzne odbicie (TIR) na dolnej powierzchni chipa mikrofluidycznego, w którym znajdują się badane próbki. Równolegle stosowany jest niedrogi filtr absorpcyjny, który usuwa słabo rozproszone światło wzbudzenia, które nie ulega procesowi TIR.

Po skutecznym odrzuceniu wzbudzenia za pomocą tych dwóch mechanizmów, w płaszczyźnie detektora rejestrowana jest jedynie emisja fluorescencyjna próbek. Pomimo tak dużej apertury numerycznej detekcji, surowe plamki fluorescencyjne w matrycy czujnika stają się dość szerokie, aby zaprojektować i lepiej kontrolować rozproszenie przestrzenne tego sygnału fluorescencyjnego. Jako alternatywa dla zwykłej płytki czołowej, między płaszczyzną obiektu a płaszczyzną czujnika zostanie umieszczona światłowodowa płytka czołowa.

Stożkowa płytka czołowa światłowodowa, która charakteryzuje się znacznie większą gęstością kabli światłowodowych na górnej fasetce w porównaniu z dolną, może być wykorzystana do obrazowania o wyższej rozdzielczości dzięki powiększeniu. Chipy mikrofluidyczne stosowane w tej platformie są wytwarzane z użyciem ścian z polidimetylosiloksanu umieszczonych na szkiełkach przedmiotowych w celu utworzenia mikrokanałów niezbędnych do obrazowania na chipie, aby rozpocząć montaż bezsoczewkowej platformy do obrazowania na chipie. Najpierw, usuń szkło osłonowe matrycy czujników optoelektronicznych za pomocą pióra próżniowego, a następnie delikatnie umieść cienki filtr absorpcyjny na górnej części aktywnego obszaru detektora.

Umieść płytkę czołową światłowodu na górze tego filtra absorpcyjnego. Następnie połóż wykonany chip mikrofluidyczny bezpośrednio na matrycy światłowodowej. Kolejno, nad chipem mikrofluidycznym należy zamontować pryzmat szklany, używając oleju dopasowującego współczynnik załamania światła w taki sposób, aby współczynnik załamania na granicy faz był zgodny ze współczynnikiem załamania szkła.

Podłącz źródła światła do światłowodów za pomocą złączy FC. Jednym z najtrudniejszych etapów tej procedury jest wyrównanie komponentów. Należy starannie ustawić odległości między elementami oraz pozycję i kąt oświetlenia.

Na koniec przesuń światłowód oświetlenia bocznego bliżej pryzmatu i dostosuj jego kąt tak, aby zapewnić całkowite wewnętrzne odbicie na granicy szkło-powietrze w miejscu odpowiadającym chipom mikroprzepływowym. Za pomocą tej platformy on-chip można obrazować podłoże dolne, różne rodzaje komórek lub modele zwierząt laboratoryjnych, jednak na potrzeby niniejszej demonstracji obrazowane będą leukocyty. Aby oznakować leukocyty barwnikiem fluorescencyjnym, najpierw wymieszaj około 100 µL krwi pełnej z około 1 mL buforu do płukania erytrocytów, inkubuj przez około trzy minuty w temperaturze pokojowej, a następnie odwiruj roztwór lizowanej krwi.

Po usunięciu górnej warstwy za pomocą mikropipety, zawiesić osad w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym w celu znakowania kwasów nukleinowych komórek barwnikiem fluorescencyjnym; dodać SYTO 16 do zawiesiny, a następnie inkubować próbkę przez około 30 minut w ciemności w temperaturze pokojowej. Po 30 minutach odwirować znakowaną próbkę. Usunąć nadsącz, aby zmniejszyć szum tła wynikający z emisji fluorescencji niezwiązanych barwników.

Reese zawiesił osad białych krwinek w około pięciu mililitrach PBS. Próbka jest teraz gotowa do wprowadzenia do układu mikroprzepływowego w celu przeprowadzenia bezsoczewkowego obrazowania fluorescencyjnego na chipie. Przed obrazowaniem białych krwinek platforma obrazująca musi zostać skalibrowana przy użyciu fluorescencyjnych mikrokulek.

Przygotować rozcieńczoną próbkę mikrokuleczek, używając wody dejonizowanej oraz roztworu surowych kuleczek. Za pomocą strzykawki z ostrą igłą wstrzyknąć tę początkową próbkę do chipa mikroprzepływowego od strony ścianek PDMS.

Po zmontowaniu komponentów w celu uzyskania obrazowania fluorescencyjnego na chipie, należy pozyskać surowe obrazy kulek fluorescencyjnych, korzystając z komputera i specjalnie opracowanego interfejsu LabVIEW. Należy upewnić się, że w całym polu widzenia znajduje się co najmniej 20 obrazów odizolowanych kulek fluorescencyjnych. Dane kalibracyjne należy zapisać, ponieważ zostaną one wykorzystane w dalszej części do kalibracji i wyznaczenia funkcji rozproszenia punktu (PSF) dla bezsoczewkowej platformy mikroskopii fluorescencyjnej.

Wyjmij chip mikrofluidyczny zawierający próbkę kulek fluorescencyjnych i odłącz pryzmat od tego chipu. Wstrzyknij wcześniej przygotowaną próbkę białych krwinek do innego, nieużywanego chipu mikrofluidycznego od strony ścianek PDMS. Ponownie złóż komponenty, zachowując te same warunki eksperymentalne, szczególnie w odniesieniu do odległości i mocy wzbudzenia.

Należy pozyskać surowe obrazy leukocytów, korzystając z niestandardowego programu LabVIEW z zastosowaniem tych samych parametrów oprogramowania, które wykorzystano dla fluorescencyjnych mikrokulek. Dane kalibracyjne oraz surowe obrazy leukocytów są następnie wykorzystywane do stworzenia obrazów o wyższej rozdzielczości w programie MATLAB za pomocą przetwarzania cyfrowego. W celach porównawczych przedstawiono tutaj reprezentatywne wyniki obrazowania na chipie z wykorzystaniem soczewki szerokokątnej dla mieszaniny zawierającej zielone fluorescencyjne cząsteczki o rozmiarach 4 µm i 10 µm, powiększenie mikroskopu 10x.

Dostarczono również obrazy z obiektywu, które są zgodne z przedstawionymi obrazami fluorescencyjnymi bezsoczewkowymi. Następnie zaprezentowano wyniki bezsoczewkowego obrazowania fluorescencyjnego w szerokim polu widzenia dla mieszaniny zawierającej 10 µm zielone i 10 µm czerwone cząsteczki fluorescencyjne. Obrazy fluorescencyjne bezsoczewkowe stanowią dobre dopasowanie do obrazów tych samych próbek uzyskanych przy użyciu obiektywu mikroskopowego 10x.

Rysunek ten przedstawia porównanie wydajności dekonwolucji Lucy'ego-Richardsona oraz próbkowania kompresyjnego opartego na algorytmach dekodowania w obrazowaniu różnych par kuleczek o średnicy 10 µm. Górny rząd ilustruje surowe obrazy fluorescencyjne bezsoczewkowe, w których obrazy wstawkowe pokazują porównania mikroskopowe tych samych cząstek uzyskane przy użyciu obiektywu 10x. Środkowy rząd prezentuje wyniki dekodowania kompresyjnego, natomiast dolny rząd ilustruje wyniki dekonwolucji Lucy'ego-Richardsona. DDCS i DLR odnoszą się odpowiednio do odległości od środka do środka i obrazów mikroskopowych, zdekodowanych obrazów kompresyjnych (CS) oraz obrazów bezsoczewkowych poddanych dekonwolucji LR.

Następnie przedstawiono cyfrowe przetwarzanie surowych obrazów soczewki o niższej fluorescencji. W celu uzyskania rozdzielczości przestrzennej poniżej 4 µm zastosowano algorytm oparty na próbkowaniu kompresyjnym, rozdzielając ściśle upakowane pary kulek o średnicy 2 µm. Wstawki prezentują porównania z obiektywu mikroskopu 40x, które są bardzo zgodne z odkodowanymi obrazami fluorescencyjnymi.

Tutaj D odnosi się do odległości między środkami na obrazach mikroskopowych. Natomiast DCS odnosi się do odległości między środkami na obrazach z soczewki dekodującej CS, charakteryzujących się mniejszą fluorescencją. Rysunek ten przedstawia wyniki obrazowania bezsoczewkowego fluorescencyjnie znakowanych białych krwinek.

Surowe obrazy bezsoczewkowe są szybko dekodowane przy użyciu dekodera opartego na CS, co wykazuje bardzo dobrą zgodność z konwencjonalnym obrazem mikroskopowym tej samej próbki uzyskanym za pomocą obiektywu 10x. Oprócz obrazowania, w razie potrzeby, zdekodowane obiekty fluorescencyjne mogą być również automatycznie zliczane przy użyciu specjalnie opracowanego interfejsu do zastosowań w cytometrii na chipie. Przedstawiono tutaj zaprojektowany na zamówienie, zautomatyzowany interfejs do zliczania obiektów fluorescencyjnych w środowisku Matlab. Zaprezentowano procedurę bezsoczewkowej mikroskopii fluorescencyjnej znakowanych komórek i mikrokulek w polu widzenia o powierzchni ośmiu centymetrów kwadratowych.

Jest to porównywalna platforma obrazowania chipowego z szybkim dekoderem kompresyjnym. Znajdzie ona szerokie zastosowanie w cytometrii wysokoprzepustowej, analizie mikrocząsteczek oraz w badaniach nad żywymi komórkami.