Badanie cytoszkieletu aktynowego w żywych komórkach śródbłonka wykazujących ekspresję GFP-aktyny

Celem niniejszej procedury jest obserwacja dynamicznych zmian w cytoszkielecie aktynowym żywych komórek śródbłonka. Najpierw należy przeprowadzić transfekcję ludzkich komórek śródbłonka żyły pępkowej plazmidem A GFP beta actin i hodować je do osiągnięcia pełnej konfluencji na szkiełkach nakrywkowych. Następnie szkiełka nakrywkowe należy umieścić w komorze do obrazowania żywych komórek z podgrzewanym stolikiem i infuzją fizjologicznego roztworu albuminowego.

Ostatnim krokiem jest akwizycja danych z wybranego obszaru komórek poprzez sekwencyjne wykonywanie zdjęć (time-lapse) przed i po podaniu środka farmakologicznego. Analiza wykresów przy użyciu oprogramowania do przetwarzania obrazów, takiego jak Image J, pozwala uzyskać informacje na temat lokalnych wypustek lamelypodialnych, takich jak ich odległość, czas i prędkość, a także ruch włókien aktynowych w czasie. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak obrazowanie immunofluorescencyjne, jest to, że obrazowanie żywych komórek pozwala uwzględnić dynamiczny charakter aktynoszkieletu w badaniach nad mechanizmami determinującymi przepuszczalność śródbłonka.

Podczas gdy utrwalone i barwione komórki stanowią jedynie migawki w czasie i dostarczają niewielu informacji o dynamice aktyny i cytoszkieletu przed i po traktowaniu mediatorem zapalnym, w komorze z laminarnym przepływem powietrza należy wysterylizować szkiełka nakrywkowe w 70% etanolu przez dwie minuty, a następnie pozostawić do wyschnięcia na powietrzu. Każdą nakrywkę umieść w 10 centymetrowej płytce hodowlanej i dodaj 300 µL ciepłego roztworu żelatyny na środek, nie dotykając krawędzi nakrywki. Po pięciu minutach odessaj ciecz.

Następnie należy zebrać konfluenczną kulturę ludzkich komórek śródbłonka żyły pępkowej (VE) za pomocą 0,25% trypsyny z EDTA. Należy policzyć komórki i poddać je wirowaniu. Odessać jak największą ilość pożywki SUP natum przed reakcją transfekcji z wykorzystaniem zestawu VE nuclear effector kit.

Resuspender osady komórkowe w podstawowym roztworze efektora jądrowego i dodać od 0,2 do 2 µg plazmidu wektora GFP beta aktyny. Przenieść 100 µl zawiesiny komórkowej do Q-Vette z efektorem jądrowym. Kilkukrotnie stuknąć przykryte Q-Vette, aby upewnić się, że między dnem naczynia a próbką do transfekcji nie ma pęcherzyków powietrza.

Umieść Q VET w urządzeniu nuclear effector two i uruchom program A 0 3 4, używając pipety transferowej z zestawu nuclear effector, aby przenieść do qve podgrzaną porcję 500 µL pożywki EGM two MV. Następnie przenieś mieszaninę z powrotem do probówki do wirówki i inkubuj przez 15 minut. Delikatnie wymieszaj raz zawiesinę transfekowanych VE i nanieś 300 µL zawiesiny na pokrywkę szkiełkowa pokrytą żelatyną, unikając dotykania krawędzi.

Następnie inkubuj przez jedną do czterech godzin. Sprawdź przetransfekowane komórki, aby potwierdzić ich przyleganie do szkiełka podstawowego. Następnie dodaj do płytki 10 ml pożywki E GM two MV i kontynuuj inkubację w celu ekspresji GFP.

W pierwszej kolejności należy wprowadzić do systemu przepływu grawitacyjnego roztwór soli fizjologicznej z albuminą (PSS), a następnie podłączyć go do grzałki przepływowej. Następnie należy wyregulować regulator przepływu tak, aby uzyskać strumień o wartości około 40 milliliters per hour. Po tym stop należy zatrzymać przepływ, zamykając kurek za pomocą aplikatora z bawełnianym końcem.

Nałóż smar próżniowy na zewnętrzną krawędź dolnej strony kąpieli diamentowej. Następnie wyjmij z inkubatora kulturę poddaną transfekcji. Delikatnie podnieś szkiełko przykrywowe za pomocą pęsety.

Następnie, używając chusteczki Kimwipe, odsącz nadmiar pożywki EGM two MV z dolnego szkiełka, układając komórki stroną górną do góry. Umieść kąpiel diamentową nad szkiełkiem nakrywką, aby utworzyć komorę. Szybko umieść komorę w podgrzewaczu stolika.

Zaciśnij zaciski nad komorą i pipetą przenieś około 1 ml pożywki EGM two MV z płytki do komory. Następnie podłącz wąż próżniowy do uchwytu po lewej stronie komory oraz linię A PSS z grzałki przepływowej do kanału po prawej stronie komory. Następnie włącz próżnię i otwórz linię A PSS, aby rozpocząć perfuzję kąpieli nad transfekowanymi komórkami.

Włącz również grzałkę przepływową, ustawiając temperaturę na 37 °C. Następnie umieść sondę termistora dla podgrzewanego stolika w kąpieli przy krawędzi i włącz grzałkę stolika na 37 °C. Aby usunąć resztki pożywki EGM two MV oraz osady z sortowania, ostrożnie przetrzyj spód szkiełka nakrywkowego chusteczką Kim nasączoną 70% etanolem, a następnie suchą chusteczką Kim. Pozostaw transfektowane komórki HU na 30 minut w celu equilibracji.

Zablokuj kursor. Skup się na wybranym obszarze hodowli komórek przeznaczonych do badania. Ustaw czas ekspozycji kamery w zakresie od 0.5 do dwóch sekund, w zależności od intensywności sygnału GFP Act w komórkach.

Należy również ustawić interwał i czas trwania eksperymentu. Następnie, przy wyłączonym oświetleniu pomieszczenia, należy wykonać pojedyncze zdjęcie w celu oceny ustawień. Następnie należy przeprowadzić serię zdjęć poklatkowych, monitorując obrazy w miarę potrzeb.

W typowym protokole należy zarejestrować obrazy bazowe przez 20 do 30 minut przed dodaniem czynnika testowego, a następnie kontynuować akwizycję obrazów przez od 0,5 do czterech godzin. Na koniec, zgodnie ze szczegółami zawartymi w tekście towarzyszącym, należy ocenić dystans, trwałość i prędkość protruzji lamellipodiów za pomocą analizy wykresów CH. W typowym eksperymencie GFP actin jest ekspresyjne w ponad 50% przetransfekowanych VE w sposób losowy.

Obrazy te, pozyskiwane raz na minutę, uchwyciły GFP aktynę w całej cytoplazmie, a także w strukturach włóknistych i lokalnych melipodiach wystających wzdłuż krawędzi komórki. Trwałość odległości i prędkość wypustek komórkowych są ilościowo określone na podstawie zestawów obrazów z serii czasowej. W analizie graficznej chm w pierwszej kolejności rysowana jest linia o szerokości jednego piksela, mniej więcej prostopadła do krawędzi komórki.

Obszar ten jest wyodrębniany z każdego obrazu z serii time-lapse w celu stworzenia montażu zmian w tym obszarze w czasie lub wykresu krawędziowego (chime graph). W ujęciu od lewej do prawej na wykresie krawędziowym wypustki są reprezentowane jako ruchy w górę na krawędzi komórki. Po nałożeniu linii na krawędź jednej z tych wypustek można zebrać powiązane z nią dane pikselowe, aby ilościowo określić dynamikę wypustek. Całkowitą liczbę wypustek na wykresie krawędziowym można wykorzystać do oszacowania częstotliwości ich powstawania.

Analiza ta przedstawia ruchy włókien stresowych, które formują się w pobliżu peryferii komórki i przemieszczają się w stronę jej centrum, gdzie ostatecznie ulegają rozpadowi. Na wykresie chio włókna stresowe widoczne są jako ciągłe linie w obszarze cytoplazmy, często poruszające się w dół i w prawo w kierunku centrum komórki. W przypadkach, gdy włókna są trudne do dostrzeżenia na oryginalnym wykresie chio, filtr maski wyostrzającej (unsharp mask filter) wyostrza obraz, a linie narysowane na włóknach stresowych ułatwiają zbieranie danych pikselowych przy użyciu funkcji pomiaru. Alternatywnie, linie prowadzone od początku do końca zidentyfikowanego włókna stresowego pozwalają na obliczenie średniej masy danych pikselowych przez cały czas obserwacji włókna.

W niniejszej prezentacji zaprezentowano sposób analizy danych z zestawu obrazów time-lapse za pomocą analizy wykresów w oprogramowaniu takim jak Image J. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dogłębną wiedzę na temat badania dynamiki cytoszkieletu aktynowego w odpowiedzi na mediatory stanu zapalnego przy użyciu obrazowania żywych komórek w przypadku przetransfekowanych komórek śródbłonka.