Name: Badanie cytoszkieletu aktynowego w żywych komórkach śródbłonka eksprymujących GFP-aktynę (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Poznaj metodę obserwacji dynamicznych zmian cytoszkieletu aktynowego w żywych komórkach śródbłonka przy użyciu obrazowania GFP-aktyna. Technika ta umożliwia analizę dynamiki cytoszkieletu w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Plazmid GFP-β-actin został hojnie udostępniony przez dr. Wayne'a Orra z Wydziału Patologii LSUHSC-S i namnożony w laboratorium dr Becky Worthylake z Wydziału Farmakologii LSUHSC-NO. Praca ta była finansowana z grantów National Institutes of Health (P20 RR-018766) oraz American Heart Association (05835386N).

<ol><li>Spindler, V., Schlegel, N., Waschke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+GTPases+in+control+of+microvascular+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Role of GTPases in control of microvascular permeability.</a> Cardiovasc. Res. 87, 243-253 (2010).</li>
<li>Wojciak-Stothard, B., Ridley, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rho+GTPases+and+the+regulation+of+endothelial+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Vascul.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Rho GTPases and the regulation of endothelial permeability.</a> Vascul. Pharmacol. 39, 187-199 (2002).</li>
<li>Yuan, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+transduction+pathways+in+enhanced+microvascular+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Signal transduction pathways in enhanced microvascular permeability.</a> Microcirculation. 7, 395-403 (2000).</li>
<li>Birukov, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+GTPases+in+mechanosensitive+regulation+of+endothelial+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Small GTPases in mechanosensitive regulation of endothelial barrier.</a> Microvasc. Res. 77, 46-52 (2009).</li>
<li>Duran, W. N., Sanchez, F. A., Breslin, J. W. Microcirculatory Exchange Function. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDuran%2C+WN+%22Handbook+of+Physiology%3A+Microcirculation%22">Handbook of Physiology: Microcirculation</a>. Tuma, R. F., Duran, W. N., Ley, K. , 2nd Edition, Elsevier. San Diego. 81-124 (2008).</li>
<li>Hu, Y. L., Chien, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+motion+of+paxillin+on+actin+filaments+in+living+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Dynamic motion of paxillin on actin filaments in living endothelial cells.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 357, 871-876 (2007).</li>
<li>Borm, B., Requardt, R. P., Herzog, V., Kirfel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+ruffles+in+cell+migration%3A+indicators+of+inefficient+lamellipodia+adhesion+and+compartments+of+actin+filament+reorganization%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell.+Res%22%5BJournal%5D)">Membrane ruffles in cell migration: indicators of inefficient lamellipodia adhesion and compartments of actin filament reorganization.</a> Exp. Cell. Res. 302, 83-95 (2005).</li>
<li>Hotulainen, P., Lappalainen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+fibers+are+generated+by+two+distinct+actin+assembly+mechanisms+in+motile+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Stress fibers are generated by two distinct actin assembly mechanisms in motile cells.</a> J. Cell. Biol. 173, 383-394 (2006).</li>
<li>Pellegrin, S., Mellor, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+stress+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Actin stress fibres.</a> J. Cell. Sci. 120, 3491-3499 (2007).</li>
<li>Ballestrem, C., Wehrle-Haller, B., Imhof, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+dynamics+in+living+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Actin dynamics in living mammalian cells.</a> J. Cell. Sci. 111, 1649-1658 (1998).</li>
<li>Helmke, B. P., Rosen, A. B., Davies, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+mechanical+strain+of+an+endogenous+cytoskeletal+network+in+living+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Mapping mechanical strain of an endogenous cytoskeletal network in living endothelial cells.</a> Biophys. J. 84, 2691-2699 (2003).</li>
<li>Birukova, A. A., Smurova, K., Birukov, K. G., Kaibuchi, K., Garcia, J. G., Verin, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Rho+GTPases+in+thrombin-induced+lung+vascular+endothelial+cells+barrier+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Role of Rho GTPases in thrombin-induced lung vascular endothelial cells barrier dysfunction.</a> Microvasc. Res. 67, 64-77 (2004).</li>
<li>van Nieuw Amerongen, G. P., van Delft, S., Vermeer, M. A., Collard, J. G., van Hinsbergh, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+RhoA+by+thrombin+in+endothelial+hyperpermeability%3A+role+of+Rho+kinase+and+protein+tyrosine+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Activation of RhoA by thrombin in endothelial hyperpermeability: role of Rho kinase and protein tyrosine kinases.</a> Circ. Res. 87, 335-340 (2000).</li>
<li>Moy, A. B., Blackwell, K., Kamath, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+histamine+and+thrombin+on+endothelial+barrier+function+through+actin-myosin+tension%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Differential effects of histamine and thrombin on endothelial barrier function through actin-myosin tension.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 282, H21-H29 (2002).</li>
<li>Wittman, T., Littlefield, R., Waterman-Storer, C. Fluorescent speckle microscopy of cytoskeletal dynamics in living cells. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWittman%2C+T+%22Live+Cell+Imaging%3A+A+Laboratory+Manual%22">Live Cell Imaging: A Laboratory Manual</a>. Goldman, R. D., Spector, D. L. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 184-204 (2005).</li>
<li>Rabut, G., Ellenberg, J. Photobleaching techniques to study mobility and molecular dynamics of proteins in live cells: FRAP, iFRAP, and FLIP. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRabut%2C+G+%22Live+Cell+Imaging%3A+A+Laboratory+Manual%22">Live Cell Imaging: A Laboratory Manual</a>. Goldman, R. D., Spector, D. L. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 101-126 (2005).</li>
</ol>

Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.

Obrazowanie GFP-aktyny w żywych komórkach śródbłonka umożliwia szczegółową analizę dynamiki cytoszkieletu aktynowego w odpowiedzi na bodźce zapalne. Metoda ta może być również przydatna w rozwijaniu wcześniejszych odkryć wykazujących przebudowę cytoszkieletu w odpowiedzi na siły fizyczne, takie jak naprężenie ścinające11. Ponadto metoda ta pozwala na szczególną ocenę wpływu dynamiki cytoszkieletu aktynowego na różne aktywności komórek śródbłonka, w tym migrację, mitozę, tworzenie i dojrzewanie połączeń międzykomórkowych oraz utrzymanie funkcji barierowej.
Na przedstawionych danych można zaobserwować zachowanie cytoszkieletu aktynowego komórek śródbłonka przed i po traktowaniu trombyną. Wzdłuż krawędzi komórek śródbłonka zaobserwowano formowanie i regresję lokalnych lamellipodiów w czasie, zarówno w niezrastających się, jak i w zrastających się monowarstwach komórkowych. Traktowanie trombyną przejściowo przerwało procesy formowania i wymiany lamellipodiów. Trombyna spowodowała również niewielki skurcz komórek, co jest zgodne z wcześniejszymi doniesieniami, według których trombyna indukuje tworzenie stresowych włókien aktynowych oraz zwiększa rozwój napięcia dośrodkowego w komórkach śródbłonka12-14. Dzięki badaniom obrazowym żywych komórek, takim jak niniejsze, można obecnie określić pochodzenie włókien stresowych. W komórkach HUVEC większość włókien stresowych bierze początek na obwodzie komórki i przypomina poprzeczne włókna łukowate w komórkach migrujących8, 9. Inną zaletą tej metody w porównaniu z wykorzystaniem komórek utrwalonych jest możliwość ilościowego określenia liczby włókien stresowych w poszczególnych komórkach przed i po traktowaniu trombyną, co eliminuje błąd selekcji między grupami eksperymentalnymi.
W ramach niniejszego protokołu oceniamy dynamiczny ruch krawędzi komórki oraz włókien stresowych aktyny. Aby zrozumieć dynamikę monomerów aktyny w komórkach śródbłonka, można zastosować bardziej zaawansowane techniki, takie jak fluorescencyjne odzyskiwanie po fotowybielaniu (FRAP) lub mikroskopia plamkowa fluorescencyjna (FSM)15, 16. Ponadto, ponieważ śródbłonek naczyń mikrokrwionośnych może stanowić lepszy model funkcji bariery mikronaczyniowej, logicznym kierunkiem przyszłych badań jest optymalizacja protokołów transfekcji w celu efektywnej ekspresji GFP-aktyny w komórkach śródbłonka naczyń mikrokrwionośnych.
Podsumowując, obrazowanie żywych komórek śródbłonka wykazujących ekspresję GFP-aktyny stanowi potężne narzędzie do określenia, w jaki sposób cytoszkielet aktynowy komórek śródbłonka reaguje na różne rodzaje bodźców. Badania z wykorzystaniem ściśle konfluencyjnych monowarstw śródbłonka pomogą określić rolę dynamicznych struktur, takich jak bogate w aktynę lamellipodia i poprzeczne łukowate włókna stresu, w funkcji bariery śródbłonka. Ponadto obrazowanie żywych komórek śródbłonka wykazujących ekspresję GFP-aktyny lub innych białek fuzyjnych umożliwiających wizualizację innych struktur wewnątrzkomórkowych dostarczy szczegółowych informacji czasowo-przestrzennych niezbędnych do zrozumienia mechanizmów sygnalizacyjnych i strukturalnych, które determinują integralność bariery.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;1. Roztwór roboczy 5x Ringera&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>EMD Millipore</td><td>SX0420-3</td><td>35 g</td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>JT Baker</td><td>3040</td><td>1,75 g</td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-3881</td><td>1,47 g</td></tr><tr><td>Siarczan magnezu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-9397</td><td>1,44 g</td></tr><tr><td>Sterylna woda filtrowana</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>do objętości 1 L</td></tr><tr><td colspan="4">Przefiltrować sterylnie do autoklawowanych butelek i przechowywać w 4&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;2. Bufor MOPS&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3183</td><td>125,6 g</td></tr><tr><td>Sterylna woda filtrowana</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>do objętości 1 L</td></tr><tr><td colspan="4">Przefiltrować sterylnie do autoklawowanych butelek i przechowywać w 4&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;3. Fizjologiczny roztwór soli z albuminą (APSS)&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Roztwór roboczy Ringera (5x)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>200 mL </td></tr><tr><td>Bufor MOPS</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>5 mL </td></tr><tr><td>Fosforan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-9638</td><td>0,168 g</td></tr><tr><td>Pirowinian sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5280</td><td>0,22 g</td></tr><tr><td>Sól sodowa EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ED2SS</td><td>0,0074 g</td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td>0,901 g</td></tr><tr><td>Albumina wołowa</td><td>USB Corp., Affymetrix</td><td>10856</td><td>10 g</td></tr><tr><td>Sterylna woda filtrowana</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>do objętości 1 L</td></tr><tr><td colspan="4">Dostosować pH do 7,4 w 37&amp;#x00B0;C, następnie przefiltrować sterylnie do autoklawowanych butelek i przechowywać w 4&amp;#x00B0;C.</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;4. 0,9% roztwór soli fizjologicznej&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>EMD Millipore</td><td>SX0420-3</td><td>9 g</td></tr><tr><td>Sterylna woda filtrowana</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>do objętości 1 L</td></tr><tr><td colspan="4">Przefiltrować sterylnie do autoklawowanych butelek i przechowywać w 4&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;5. 1,5% roztwór żelatyny&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Żelatyna ze skóry wieprzowej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2500</td><td>15 g</td></tr><tr><td>0,9% roztwór soli fizjologicznej</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>do objętości 1 L</td></tr><tr><td colspan="4">Podgrzać roztwór do 37&amp;#x00B0;C, aby całkowicie rozpuścić żelatynę. Gdy roztwór jest jeszcze ciepły, przefiltrować go sterylnie do autoklawowanych butelek i przechowywać w 4&amp;#x00B0;C</td></tr></tbody></table>

badanie cytoszkieletu aktynowego w żywych komórkach śródbłonka wykazujących ekspresję gfp-aktyny

Study of the Actin Cytoskeleton in Live Endothelial Cells Expressing GFP-Actin

Śródbłonek mikro naczyniowy pełni ważną rolę jako selektywnie przepuszczalna bariera dla płynów i substancji rozpuszczonych. Połączenia przylegające między komórkami śródbłonka regulują przepuszczalność śródbłonka, a wiele badań wskazało na istotny wkład cytoszkieletu aktynowego w utrzymanie integralności tych połączeń1-5. Uważa się, że korowy pierścień aktynowy jest ważny dla utrzymania stabilnych połączeń1, 2, 4, 5. Z kolei włókna stresowe aktyny mają generować napięcie dośrodkowe wewnątrz komórek śródbłonka, co osłabia połączenia2-5. Wiele z tych teorii oparto na badaniach, w których komórki śródbłonka poddawano działaniu mediatorów stanu zapalnego znanych z tego, że zwiększają one przepuszczalność śródbłonka, a następnie utrwalano komórki i znakowano F-aktynę w celu obserwacji mikroskopowej. Badania te zapewniają jednak bardzo ograniczone zrozumienie roli cytoszkieletu aktynowego, ponieważ obrazy utrwalonych komórek stanowią jedynie przekroje czasowe, nie dostarczając informacji o dynamice struktur aktynowych5.
Obrazowanie żywych komórek pozwala na uwzględnienie dynamicznej natury cytoszkieletu aktynowego w badaniach nad mechanizmami determinującymi szczelność bariery śródbłonka. Główną zaletą tej metody jest możliwość oceny wpływu różnych bodźców zapalnych na struktury aktynowe w komórkach śródbłonka w tym samym zestawie żywych komórek przed i po zastosowaniu preparatu, co eliminuje potencjalne błędy systematyczne, które mogą wystąpić podczas obserwacji utrwalonych preparatów. Ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC) są transfektowane plazmidem GFP-β-actin i hodowane do uzyskania konfluencji na szkiełkach podstawkowych. Obrazy time-lapse GFP-aktyny w konfluencyjnych komórkach HUVEC są rejestrowane przed i po dodaniu mediatorów zapalnych, które wywołują zależne od czasu zmiany w szczelności bariery śródbłonka. Badania te umożliwiają wizualną obserwację sekwencji zmian w cytoszkieletu aktynowym, które przyczyniają się do przerwania i późniejszej odbudowy bariery śródbłonka.
Nasze wyniki konsekwentnie wykazują lokalne tworzenie się i obrót bogatych w aktynę lamellipodiów w komórkach śródbłonka. Można również zaobserwować tworzenie i ruch aktynowych włókien stresowych. Analizę częstotliwości powstawania i obrotu lokalnych lamellipodiów przed i po zastosowaniu stymulacji zapalnej można udokumentować za pomocą analizy kymografów. Badania te dostarczają istotnych informacji na temat dynamicznej natury cytoszkieletu aktynowego w komórkach śródbłonka, co może zostać wykorzystane do odkrycia nieznanych wcześniej mechanizmów molekularnych, ważnych dla zachowania integralności bariery śródbłonkowej.

Obrazowanie mikroskopowe żywych komórek śródbłonka wykazujących ekspresję GFP-actin pozwala na charakterystykę dynamicznych zmian w strukturach cytoszkieletu. W przeciwieństwie do technik wykorzystujących utrwalone preparaty, metoda ta umożliwia szczegółową ocenę zmian czasowych w cytoszkielecie aktynowym w tych samych komórkach przed, w trakcie i po różnych bodźcach fizycznych, farmakologicznych lub zapalnych.

Badanie cytoszkieletu aktynowego w żywych komórkach śródbłonka wykazujących ekspresję GFP-aktyny

Śródbłonek mikrokrążenia pełni istotną rolę jako selektywnie przepuszczalna bariera dla płynów i substancji rozpuszczonych. Złącza przylegające między komórkami śródbłonka...

Celem niniejszej procedury jest obserwacja dynamicznych zmian w cytoszkielecie aktynowym żywych komórek śródbłonka. Najpierw należy przeprowadzić transfekcję ludzkich komórek śródbłonka pępaż rozmroku plasmidem A GFP beta actin i hodować je do osiągnięcia konfluencji na szkiełkach podstawkowych. Następnie szkiełka należy umieścić w komorze do obrazowania żywych komórek z podgrzewanym stolikiem i infuzją fizjologicznego roztworu albuminy.Ostatnim krokiem jest akwizycja danych z wybranego obszaru komórek poprzez rejestrację obrazów w technice time-lapse przed i po podaniu środka farmakologicznego. Analiza wykresów typu Chime za pomocą oprogramowania do analizy obrazu, takiego jak Image J, może dostarczyć informacji na temat lokalnych wypustek podostawnych (podia), takich jak odległość, czas i prędkość wypustek, a także ruch włókien aktynowych w czasie. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak obrazowanie immunofluorescencyjne, jest to, że obrazowanie żywych komórek pozwala na uwzględnienie dynamicznego charakteru aktyny i cytoszkieletu w badaniach nad mechanizmami determinującymi przepuszczalność śródbłonka.Podczas gdy utrwalone i barwione komórki stanowią jedynie statyczne obrazy, dostarczają one niewielu informacji o dynamice aktu i cytoszkieletu przed i po traktowaniu mediatorem zapalnym. W komorze z laminarnym przepływem powietrza wysterylizuj szkiełka podstawowe w 70% etanolu przez dwie minuty, a następnie pozostaw do wyschnięcia na powietrzu. Umieść każde szkiełko w 10 centymetrowej płytce hodowlanej i dodaj 300 µL ciepłego roztworu żelatyny do środka, nie dotykając krawędzi szkiełka. Po pięciu minutach odessaj ciecz.Następnie należy zebrać konfluencyjną hodowlę ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej lub VE za pomocą 0,25% trypsyny EDTA. Należy policzyć komórki i poddać je wirowaniu. Odessać jak największą ilość pożywki SUP natum przed reakcją transfekcji z wykorzystaniem zestawu VE nuclear effector kit.Resuspenduj osady komórkowe w podstawowym roztworze efektorów jądrowych i dodaj od 0,2 do 2 µg plazmidu wektora GFP beta-aktyny. Przenieś 100 µL zawiesiny komórek do naczynia qve dla efektorów jądrowych. Kilkakrotnie stuknij w przykryte naczynie vete, aby upewnić się, że między dnem Q vet a próbką do transfekcji nie ma pęcherzyków powietrza.Umieść Q VET w urządzeniu nuclear effector two i uruchom program A 0 3 4, przenosząc za pomocą pipety transferowej z zestawu nuclear effector kit 500 µL podgrzanego pożywki EGM two MV do qve. Następnie przenieś mieszaninę z powrotem do probówki do mikrowirówki i inkubuj przez 15 minut. Delikatnie wymieszaj raz zawiesinę przetransfekowanych VE i nanieś 300 µL zawiesiny na pokrywek szkiełko pokryte żelatyną, nie dotykając krawędzi.Następnie inkubować od jednej do czterech godzin. Skontrolować transfektowane komórki, aby potwierdzić ich przywieranie do szkiełka podstawowego. Następnie dodać do płytki 10 ml medium E GM two MV i kontynuować inkubację w celu ekspresji GFP.W pierwszej kolejności należy wprowadzić do grawitacyjnego systemu przepływowego roztwór soli fizjologicznej z albuminą (PSS), a następnie podłączyć go do grzałki przepływowej. Następnie należy dostosować regulator przepływu tak, aby uzyskać przepływ wynoszący około 40 mililitrów na godzinę. Po tym stop należy zatrzymać przepływ, zamykając kranik stopowy za pomocą aplikatora z bawełnianym końcem.Nałóż smar próżniowy na zewnętrzną krawędź dolnej strony kąpieli diamentowej. Następnie wyjmij z inkubatora transfektowaną hodowlę. Delikatnie unieś szkiełko nakrywkę za pomocą pęsety.Następnie, używając chusteczki Kim wipe, wchłoń nadmiar pożywki EGM two MV z dolnego preparatu, ustawiając komórki stroną górną do góry. Umieść kąpiel diamentową nad szkiełkiem nakrywkowym, aby utworzyć komorę. Szybko umieść komorę w podgrzewaczu przedmiotu.Zaciśnij zaciski nad komorą i pipetuj około 1 ml pożywki EGM two MV z płytki do komory. Następnie przymocuj wąż próżniowy do uchwytu po lewej stronie komory, a linię A PSS z grzałki przepływowej do kanału po prawej stronie komory. Następnie włącz próżnię i otwórz linię A PSS, aby umożliwić perfuzję kąpieli nad transfekowanymi komórkami.Włącz również grzejnik przepływowy, ustawiając temperaturę na 37 °C. Następnie umieść sondę termistora stolika grzewczego w kąpieli wodnej przy krawędzi i włącz podgrzewanie stolika do 37 °C. Aby usunąć pozostałości pożywki EGM two MV oraz osady z sortowania, ostrożnie przetrzyj spód szkiełka nakrywnego chusteczką Kim nasączoną 70% etanolem, a następnie suchą chusteczką Kim. Pozostawytransfected komórki HU do ekwilibracji na 30 minut.Zablokuj kursor. Skup się na wybranym obszarze hodowli komórek przeznaczonych do badania. Ustaw czas ekspozycji kamery w przedziale od 0.5 do 2 sekund, w zależności od intensywności sygnału GFP Act w komórkach.Należy również ustawić odstępy czasu oraz czas trwania eksperymentu. Następnie, przy wyłączonym oświetleniu pomieszczenia, należy wykonać pojedyncze zdjęcie w celu oceny ustawień. Następnie należy zarejestrować serię time-lapse, monitorując powstające obrazy zgodnie z wymaganiami.W typowym protokole należy uzyskać od 20 do 30 minut obrazów bazowych przed dodaniem czynnika testowego, a następnie przeprowadzić dodatkową akwizycję obrazów przez okres od 0,5 do czterech godzin. Na koniec, zgodnie ze szczegółami zawartymi w towarzyszącym tekście, należy ocenić odległość występu, trwałość oraz prędkość wypustek lamellipodialnych za pomocą analizy wykresów CH. W typowym eksperymencie aktyna GFP jest ekspresowana w ponad 50% przetransfekowanych komórek VE w sposób losowy.Obrazy te, pozyskiwane raz na minutę, utrwaliły GFP aktyny w całej cytoplazmie, a także w strukturach włóknistych i w lokalnych melipodiach wysuwających się wzdłuż krawędzi komórki. Trwałość odległości oraz prędkość wypustek komórkowych są ilościowo określane na podstawie zestawów obrazów time-lapse. Przy użyciu analizy kymografu w pierwszej kolejności rysowana jest linia o szerokości jednego piksela, mniej więcej prostopadle do krawędzi komórki.Obszar ten jest wyodrębniany z każdego obrazu z zestawu time-lapse w celu utworzenia montażu tego regionu w czasie lub wykresu chime. W ujęciu od lewej do prawej na wykresie chime wypustki są reprezentowane jako ruchy w górę na krawędzi komórki. Po nałożeniu linii na krawędź jednej z tych wypustek można zebrać dane pikselowe przypisane do tej linii, aby ilościowo określić dynamikę wypustek. Całkowita liczba wypustek na wykresie chime może służyć do oszacowania częstotliwości powstawania wypustek.Analiza ta przedstawia ruchy włókien stresowych, które formują się w pobliżu peryferii komórki i przemieszczają się w stronę jej centrum, gdzie ostatecznie ulegają rozpadowi. Na wykresie chio włókna stresowe widoczne są jako ciągłe linie w obszarze cytoplazmy, często przemieszczające się w dół i w prawo w kierunku centrum komórki. W przypadkach, gdy włókna są trudne do dostrzeżenia na oryginalnym wykresie chio, filtr maski wyostrzającej poprawia ostrość obrazu. Linie narysowane na włóknach stresowych ułatwiają zbieranie danych o pikselach przy użyciu funkcji pomiaru. Alternatywnie, linie narysowane od początku do końca zidentyfikowanego włókna stresowego pozwalają na uzyskanie średnich danych o pikselach dla całego okresu obserwacji włókna.Niniejsza prezentacja zademonstrowała sposób analizy danych z zestawu obrazów time-lapse za pomocą analizy wykresów w oprogramowaniu takim jak Image J. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat badania dynamiki cytoszkieletu aktynowego w odpowiedzi na mediatory zapalne przy użyciu obrazowania żywych komórek przetransfekowanych komórek śródbłonka.

study-actin-cytoskeleton-live-endothelial-cells-expressing-gfp

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Badanie cytoszkieletu aktynowego w żywych komórkach śródbłonka ekspresujących GFP-aktynę

Wybór, mikroiniekcja i obrazowanie znakowanej fluorescencyjnie F-aktyny za pomocą fluorescencyjnej mikroskopii plamkowej (FSM).

Obrazowanie żywych komórek w celu analizy dynamiki F-aktyny za pomocą fluorescencyjnej mikroskopii plamistej (FSM)

Niniejszy protokół opisuje obrazowanie poszczególnych neuronów lub komórek grzebienia neuronalnego w żywych embrionach danio pruzebrzuchego. Metoda ta jest wykorzystywana do badania zachowań komórkowych oraz lokalizacji aktyny przy użyciu konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej w trybie time-lapse.

Obrazowanie na żywo ruchliwości komórek oraz cytoszkieletu aktynowego pojedynczych neuronów i komórek grzebienia nerwowego w embrionach danio pręgowanego

Celem niniejszej pracy jest przeszkolenie czytelnika w obsłudze zintegrowanego mikroskopu sił atomowych i obrazowania optycznego do stymulacji mechanicznej żywych komórek w hodowli. Przedstawiono szczegółowy protokół krok po kroku. Zaprezentowano reprezentatywny zestaw danych obrazujący odpowiedź żywych komórek na stymulację mechaniczną.

Badanie odpowiedzi żywych komórek na stymulację mechaniczną za pomocą zintegrowanej mikroskopii optycznej i sił atomowych

Opisano metodę wizualizacji i kwantyfikacji końców barbed F-aktyny w stożkach wzrostu neuronów. Po hodowli neuronów na szkiełkach podstawowych, komórki poddaje się permeabilizacji za pomocą roztworu zawierającego saponinę. Następnie krótka inkubacja w buforze z saponiną zawierającym rodaminę-aktynę pozwala na wbudowanie fluorescencyjnej aktyny w wolne końce barbed aktyny.

Znakowanie końców typu barbed F-aktyny rodaminą-aktyną w permeabilizowanych stożkach wzrostu neuronów

Procesy komórkowe, takie jak migracja komórek, były tradycyjnie badane na dwuwymiarowych, sztywnych powierzchniach plastikowych. Niniejszy raport opisuje technikę bezpośredniej wizualizacji lokalizacji białek oraz analizy dynamiki białek w komórkach migrujących w bardziej fizjologicznie istotnej macierzy trójwymiarowej.

Obrazowanie żywych komórek migrujących, wykazujących ekspresję białek z fluorescencyjnym znacznikiem, w macierzy trójwymiarowej

Łącząc transplantację komórek, znakowanie cytoszkieletu i podejście do utraty/wzmocnienia funkcji, ten protokół opisuje, w jaki sposób migrująca prospektywna płytka przedstrunowa danio pręgowanego może być wykorzystana do analizy funkcji genu kandydującego w migracji komórek in vivo.

Analiza migracji komórek in vivo przy użyciu przeszczepów komórek i obrazowania poklatkowego w zarodkach danio pręgowanego

Wczesne funkcje endosomów zależą od polimeryzacji F-aktyny. W tym miejscu opisujemy oparty na mikroskopii test in vitro, który odtwarza zarodkowanie i polimeryzację F-aktyny na wczesnych błonach endosomalnych w probówkach, czyniąc w ten sposób tę złożoną serię reakcji podatną na manipulacje biochemiczne i genetyczne.

In vitro Polimeryzacja F-aktyny na wczesnych endosomach

Opisujemy, jak techniki mikro- i fotomanipulacji, takie jak FRAP i fotoaktywacja, umożliwiają określenie parametrów ruchliwości i czasoprzestrzennej dynamiki białek w migrujących komórkach. Odczyty eksperymentalne obejmują dynamikę subkomórkową i obrót regulatorów ruchliwości lub leżącego u podstaw cytoszkieletu aktynowego.

Techniki mikromanipulacji pozwalające na analizę dynamiki morfogenetycznej i obrotu regulatorów cytoszkieletu

Przedstawiamy prosty, efektywny czasowo i wysokoprzepustowy test oparty na spektroskopii fluorescencyjnej do ilościowego oznaczania włókien aktynowych w próbkach biologicznych ex vivo z tkanek mózgowych gryzoni i ludzi.

Efektywny czasowo test oparty na spektroskopii fluorescencji do oceny stanu polimeryzacji aktyny w tkankach mózgu gryzoni i ludzi

Ten protokół ma na celu zmierzenie parametrów dynamicznych (wypukłości, retrakcje, falbany) wypukłości na krawędzi komórek rozsiewających.

Pomiar dynamiki wypukłości krawędzi komórki podczas rozprzestrzeniania się za pomocą mikroskopii żywych komórek

Prezentujemy protokoły prostych testów mikroprzepływowych filamentów aktynowych, w połączeniu z mikroskopią fluorescencyjną, które pozwalają na dokładne monitorowanie poszczególnych filamentów aktynowych w czasie rzeczywistym, podczas sekwencyjnego wystawiania ich na działanie różnych roztworów białkowych.

Wykorzystanie mikrofluidyki i mikroskopii fluorescencyjnej do badania dynamiki składania pojedynczych filamentów i wiązek aktyny

Poznaj metodę obserwacji dynamicznych zmian cytoszkieletu aktynowego w żywych komórkach śródbłonka przy użyciu obrazowania GFP-aktyna. Technika ta umożliwia analizę dynamiki cytoszkieletu w czasie rzeczywistym.

Badanie cytoszkieletu aktynowego w żywych komórkach śródbłonka wykazujących ekspresję GFP-aktyny

Przeglądaj więcej filmów