Izolacja i hodowla komórek macierzystych grzebienia nerwowego z ludzkich mieszków włosowych

Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie i hodowla pierwotnych komórek macierzystych grzebienia nerwowego lub N CSC z tkanek ludzkiej skóry głowy. Osiąga się to poprzez najpierw przekleństwo ludzkiej skóry głowy w paski o szerokości jednego centymetra i inkubację w pożywce zawierającej dis baye. Skóra jest następnie układana w świeżym podłożu, a mieszki włosowe są zatykane.

Drugim etapem zabiegu jest potraktowanie mieszków włosowych trypsyną i uzyskanie zawiesin jednokomórkowych. Ostatnim etapem procedury jest sortowanie CD 2 71 HNK jednego podwójnie dodatniego ncsc za pomocą cytometrii przepływowej i umieszczenie płytki hodowlanej. Ostatecznie mikroskopia z kontrastem fazowym jest wykorzystywana do badania powstawania i wzrostu sfery nerwicowej, gdzie demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ pionowe etapy ekstrakcji i izolacji zdrowia są trudne do nauczenia, ponieważ bardzo trudno jest wypreparować skórę i cząsteczki zdrowia pod mikroskopem.

Aby przygotować się do hodowli komórek macierzystych, pokryj dno każdej studzienki sześciodołkowej płytki poli de lycyną, pozwól płytkom wyschnąć w kapturze. Po wyschnięciu studzienek spłucz sterylną wodą i nabierz aspiracji, a następnie pozwól studzienkom ponownie wyschnąć. Pokryj płytki roztworem fibronektyny w ilości 0,17 miligrama na mililitr

Następnie, zanim fibronektyna wyschnie na płytce w pożywce hodowlanej NCSC, przygotuj i przygotuj następujące podłoża i odczynniki. 97% D-M-E-M-F 12 2%B 27 suplement 1% i dwa suplementy B-F-G-E-G-F IGF jeden i diss. Pobrać świeżą skórę głowy dorosłego człowieka z zabiegów liftingu twarzy lub tkankę głowy płodu i umyć ją PBS zawierającą penicylinę streptomycynę.

Przenieś skórę do 50-mililitrowych probówek i inkubuj w DMEM z 10 miligramami na mililitr przestrzeni DIS w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie do czterech godzin lub przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie przenieś skórę na wysterylizowaną szalkę Petriego i usuń włosy ze skóry, chwytając łodygę włosa w pobliżu powierzchni skóry i ciągnąc mocno i płynnie. Mieszki włosowe będą albo wykazywać morfologię antygenu orgen, inkubować izolowane fragmenty mieszków włosowych w 0,05% tripach w EDTA przez 15 do 20 minut w temperaturze pokojowej z okazjonalnym potrząsaniem.

Następnie dodaj cztery mililitry DMEM z 10% FBS, aby zatrzymać reakcję. Następnie przepuść nabłonek mieszków włosowych przez filtr 40 mikronów, aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki zawierającą komórki o różnej wielkości i kształcie. Następnie obracaj zawiesinę z prędkością 200 razy G przez pięć minut.

Ostrożnie wyrzuć supernatant S i ponownie zawieś osad w jednym mililitrze PBS z 2% FBS Aby wyizolować N CSC, najpierw korzystając z faktów, oznacz komórki przeciwciałami przeciwko sprzężonej z PC integrynie CD 2 71 FE C sprzężonej hnk jeden lub CD 2 71 PE sprzężonej z alfa czwórką przez inkubację na lodzie przez 40 minut w ciemnej wirówce w temperaturze 200 razy G przez pięć minut w temperaturze pokojowej i odessać supernatant. Ponownie zawiesić komórki w PBS zawierającym 2% FBS i dwa mikrogramy na mililitr. Jodek propidyny do wyprowadzenia martwych komórek.

Przeprowadź sortowanie komórek za pomocą cytometrii przepływowej i zbierz hodowlę komórek podwójnie dodatnich CD 2 71 H i K z jednym podwójnie dodatnim wynikiem lub podwójnie dodatnim CD 2 71 alfa czterema integrynami. Komórki w ultra niskich płytkach mocujących w pożywce NCSC, zmieniając podłoże raz dziennie. Codziennie sprawdzaj hodowlę komórkową pod mikroskopem.

NCSC zacznie tworzyć pływające małe agregaty po kilku dniach, a dobrze uformowane kule w ciągu dwóch do pięciu tygodni w hodowli, w zależności od wieku dawców. Przerost pojawi się w ciągu kilku dni w obszarze wybrzuszenia, a dobrze uformowane kulki in situ w ciągu kilku tygodni, gdy całe mieszki włosowe zostaną wyhodowane w pożywce NCSC. Aby rozszerzyć hodowle NCSC, umyj komórki raz podgrzanym PBS dwa razy tripy w EDTA do 37 stopni Celsjusza.

Następnie dodaj go do komórek na siedem do 15 minut, aby komórka macierzysta mieszków włosowych gradu się odłączyła. Aby zatrzymać tripsin, DODAJ DMEM z 10% FBS, delikatnie pipetuj w górę iw dół, aby rozproszyć komórki. Następnie wiruj w dół z prędkością 200 razy G przez pięć minut.

Ponownie zawiesić komórki w pożywce NCSC i płytkach pokrytych hodowlą i fibronektyną w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Kultura NCSC. Pożywka jest wystarczająca do utrzymania ludzkiego NCSC w stanie niezróżnicowanym.

Bez potrzeby stosowania komórek żywicielskich keratynocyty nie będą się namnażać i stopniowo umierać w pożywce. Niektóre małe okrągłe komórki będą się namnażać i tworzyć małe agregaty w zawiesinie. Po trzech do pięciu dniach, te unoszące się w powietrzu agregaty powoli zwiększają swoje rozmiary, tworząc trójwymiarowe struktury podobne do kul, zwane kulami włosów.

Podczas hodowli zakodowanych płytek, N CSC przyczepiają się do powierzchni i rosną szybciej niż komórki tworzące kule w zawiesinie, zarówno komórki tworzące kule, jak i przyczepione komórki macierzyste. Ekspresja markerów NCSC, gdy całe mieszki włosowe są hodowane, kulki tworzą się w obszarze odpowiadającym obszarowi wybrzuszenia. Po obejrzeniu filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak izolować i hodować.

Pierwotna nerwowa komórka macierzysta z tkanek hermy skóry głowy.