Name: Obrazowanie adhezji leukocytów do śródbłonka naczyń przy wysokim ciśnieniu śródświetlnym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-23T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 20 s
Description: Poznaj metodę obrazowania adhezji leukocytów do śródbłonka w izolowanych naczyniach pod ciśnieniem. Technika umożliwia badanie zapalenia naczyń i roli nadciśnienia w miażdżycy w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Niniejsze badanie było częściowo finansowane przez program OIS rządu stanu Wiktoria, granty programowe i projektowe National Health and Medical Research Council of Australia (JPF Chin-Dusting) oraz stypendium doktoranckie (D Michell).

1. Izolacja tętnic szyjnych
<ol>
	<li>Uśmierć 10-tygodniowe szczury Sprague Dawley poprzez uduszenie CO2/O2.</li>
	<li>Wypreparuj lewą i prawą tętnicę szyjną wspólną wraz z aortą i sercem, dbając o minimalne rozciąganie naczyń.</li>
	<li>W lodowatym buforze Krebsa oddziel tętnice szyjne od aorty i serca, a następnie przeprowadź precyzyjną dyssekcję.</li>
	<li>Przechowuj wyizolowane naczynia w buforze Krebsa w lodzie przed montażem.</li>
</ol>
Przybliżony czas = 45 min
2. Przygotowanie komory naczynia
<ol>
	<li>Przez proksymalny i dystalny konektor komory naczyniowej przepłucz bufor Krebsa, utrzymując fizjologiczne pH poprzez infuzję karbogenu (95% O2; 5% CO2) do bufora w temperaturze 37°C.</li>
	<li>Upewnij się, że rurki i kaniule zostały całkowicie przepłukane i są odpowiednio wyrównane.</li>
	<li>Przepłucz buforem Krebsa przetworniki P1 (proksymalny) i P2 (dystalny). Zamknij kurki, aby upewnić się, że w przetwornikach nie ma pęcherzyków powietrza.</li>
	<li>Podłącz przetworniki do odpowiadających im konektorów i ponownie przepłucz buforem Krebsa, upewniając się, że nie ma pęcherzyków powietrza. Zamknij kurki prowadzące do komory.</li>
</ol>
Przybliżony czas = 15 min
3. Pressuryzacja komory naczynia
<ol>
	<li>Włącz urządzenie do generowania ciśnienia: serwomechanizm ciśnienia, monitor ciśnienia oraz pompę perystaltyczną (Rysunek 1).</li>
	<li>Przy włączonej pompie perystaltycznej i serwomechanizmie ciśnienia ustawionym na tryb automatyczny, przepuść bufor Krebsa przez dren przy ciśnieniu 20 mmHg (pokrętło na pozycji 1), upewniając się, że w układzie nie ma pęcherzyków powietrza.</li>
	<li>Podłącz dren do zamkniętego przetwornika P2. Ciśnienie powinno się ustabilizować.</li>
	<li>Otwórz kran P2 prowadzący do komory naczynia, aby wypłukać pęcherzyki powietrza, a następnie go zamknij.</li>
	<li>Napełnij kąpiel buforem Krebsa (5 - 7 mL).</li>
</ol>
Oryż. czas = 10 mins
4. Montaż naczynia
<ol>
	<li>Pod mikroskopem stereoskopowym nałóż czarne opaski poliestrowe na każdą kaniulę (Rysunek 2).</li>
	<li>Rozsuń kaniule i uchwyty kaniul, a następnie zamocuj ¼ naczynia (koniec łuku aorty) na kaniuli P1. Należy uważać, aby nie przerwać naczynia.</li>
	<li>Za pomocą strzykawki wypełnionej buforem Krebsa delikatnie wypłucz nadmiar krwi z naczynia przez przetwornik P1. Zamknij dostęp z P1 do komory.</li>
	<li>Zabezpiecz naczynie na kaniuli P1 za pomocą opaski poliestrowej.</li>
	<li>Zbliż kaniule/uchwyty kaniul w celu zamocowania naczynia na kaniuli P2.</li>
	<li>Zamocuj koniec dystalny naczynia (~¼ długości) na kaniuli dystalnej. Zabezpiecz opaską poliestrową.</li>
</ol>
Orysz. czas = 20 min
5. Nadawanie ciśnienia w naczyniu
<ol>
	<li>Dostosuj uchwyty kaniul, aby upewnić się, że naczynie nie jest zgięte ani nadmiernie rozciągnięte.</li>
	<li>Przy zamkniętych zaworach P1 i P2 do komory przełącz serwomechanizm ciśnienia z trybu automatycznego na ręczny. Sprawdź na serwomechanizmie ciśnienia, czy w ciągu 10 sekund nie następuje ciągły spadek ciśnienia. Jeśli tak, występuje nieszczelność, a połączenia i przetworniki muszą zostać odpowiednio zabezpieczone.</li>
	<li>Przełącz serwomechanizm ciśnienia z powrotem w tryb automatyczny, a następnie otwórz zawór P2 do komory. Obserwując pod mikroskopem, zauważ rozszerzenie naczynia w momencie otwarcia zaworu do komory.</li>
	<li>Przełącz serwomechanizm ciśnienia w tryb ręczny. Ponownie sprawdź, czy w ciągu 10 sekund nie następuje ciągły spadek ciśnienia. Jeśli występuje nieszczelność, system nie jest szczelny ciśnieniowo, co prawdopodobnie oznacza dziurę w naczyniu.</li>
	<li>Przełącz z powrotem w tryb automatyczny i otwórz zawór P1 do komory. W ustawieniu ręcznym sprawdź, czy ciśnienie pozostaje stabilne.</li>
	<li>W przypadku braku nieszczelności, w ustawieniu ręcznym zwiększ wartość na pokrętle do 2 (40 mmHg).</li>
	<li>Ustaw tryb automatyczny i obserwuj naczynie pod mikroskopem. W razie potrzeby dostosuj uchwyt kaniuli, aby upewnić się, że naczynie nie jest zgięte. Sprawdź szczelność w ustawieniu ręcznym.</li>
	<li>Powtarzaj kroki 5.6 - 5.7, zwiększając wartość na pokrętle do 3 (60 mmHg), 4 (80 mmHg) i kolejnych, aż do osiągnięcia pożądanego ciśnienia.</li>
</ol>
Oryż. czas = 15 - 30 min
6. Inkubacja naczynia ciśnieniowego
<ol>
	<li>Podłączyć kontroler temperatury ustawiony na 37°C.</li>
	<li>Za pomocą drugiej pompy perystaltycznej perfundować bufor Krebsa (1 mL/min) do kąpieli w komorze naczyniowej.</li>
	<li>Podłączyć aspirator do komory, upewniając się, że usuwana jest tylko górna warstwa kąpieli.</li>
	<li>Inkubować naczynie pod ciśnieniem w temperaturze 37°C przez 1 godzinę przy ustawieniu ciśnienia w trybie automatycznym.</li>
	<li>Okresowo sprawdzać szczelność układu pod względem wycieków ciśnienia (przełączając na tryb ręczny).</li>
	<li>Efekty różnych interwencji farmakologicznych można obserwować, po prostu dodając związek do kąpieli podczas inkubacji.</li>
</ol>
Czas trwania: ok. 1 godzina
7. Perfuzja naczynia pod ciśnieniem pełną krwią
<ol>
	<li>Podczas inkubacji należy uzyskać co najmniej 7,5 mL pełnej krwi ludzkiej na naczynie, pobranej do 40 U heparyny/mL krwi. Inkubować w probówce typu Falcon 50 ml w temperaturze 37°C.</li>
	<li>Na 10 minut przed zakończeniem inkubacji należy znakować krew barwnikiem VybrantDil (1:1000) przez 10 minut w temperaturze 37°C w ciemności.</li>
	<li>Po 10 minutach zebrać krew do strzykawki, usuwając wszelkie pęcherzyki powietrza, a następnie podłączyć ją do pompy strzykawkowej z osłoną grzewczą ustawioną na 37°C.</li>
	<li>Zamknąć przetwornik P1 prowadzący do komory/naczynia i podłączyć strzykawkę oraz przewód odpływowy.</li>
	<li>Przepłukać układ krwią z przepływem 1000 μL/min przez przewód odpływowy, aby usunąć pęcherzyki powietrza.</li>
	<li>Otworzyć P1 do komory. Serwomechanizm ciśnienia automatycznie dostosuje parametry, aby utrzymać pożądane ciśnienie.</li>
	<li>Perfundować krew z przepływem 100 μL/min.</li>
	<li>Używając mikroskopu fluorescencyjnego sprzężonego z kamerą cyfrową, zarejestrować dwa pola perfundowanego naczynia przez 15 sekund w odstępach 1, 3, 5, 7,5 i 10 minut.</li>
	<li>Po perfuzji integralność i funkcję śródbłonka można ocenić za pomocą technik farmakologicznych, takich jak miograf, a ekspresję cząsteczek adhezyjnych można określić metodą immunohistochemii w celu dalszej walidacji odpowiedzi zapalnej.</li>
</ol>
Oryż. czas = 15 mins
8. Reprezentatywne wyniki:
Schematyczny rysunek układu komory ciśnieniowej przedstawiono na Rysunku 1. Dzięki zastosowaniu kamery cyfrowej sprzężonej z mikroskopem fluorescencyjnym wyniki można wizualizować natychmiastowo za pomocą nagrań wideo w czasie rzeczywistym. Reprezentatywne obrazy wideo widoczne są na Rysunku 3, gdzie leukocyty uznaje się za przylepione do śródbłonka, jeśli pozostają w bezruchu przez 10 sekund. Dzięki nagraniom wideo w pętli można obliczyć średnią liczbę przylepionych komórek na pole widzenia. Choć zarówno niskie (Rysunek 3A), jak i wysokie (Rysunek 3B) ciśnienie powodują pewien stopień adhezji, przy wyższym ciśnieniu wewnątrzświatłowym obserwuje się znaczący wzrost adhezji leukocytów, co zostało również wykazane ilościowo (Rysunek 4).
<img alt="Schemat perfuzji, układ kaniulowanego naczynia z przetwornikami, monitorami ciśnienia, kontrolą temperatury." src="/files/ftp_upload/3221/3221fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Schemat komory naczyniowej do badań ex vivo pod ciśnieniem. Kaniulowane naczynie połączone z proksymalnym (P1) i dystalnym (P2) przetwornikiem, co umożliwia manipulację ciśnieniem krwi wewnątrz naczynia. Perfuzja odbywa się poprzez przetwornik P1, a ciśnienie jest utrzymywane za pomocą przetwornika P2.
<img alt="Schemat układu mikroprzepływowego do badania dynamiki płynów; widoczne kanały i elektrody." src="/files/ftp_upload/3221/3221fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Kanula z wiązaniami. Do każdej kanuli przymocowano czarne poliestrowe wiązania.
<img alt="Analiza mikroskopowa rozkładu cząsteczek w cieczy; obraz z mikroskopu fluorescencyjnego pokazujący wariancję przestrzenną." src="/files/ftp_upload/3221/3221fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Reprezentatywne obrazy wideo. Dynamiczna adhezja komórek (czerwona strzałka) w świetle fluorescencyjnym przy 80 mmHg (A) i 120 mmHg (B) po 10 minutach perfuzji.
<img alt="Wykres adhezji leukocytów; liczba komórek/pole widzenia w funkcji czasu; porównanie efektów ciśnienia 80 vs. 120 mmHg." src="/files/ftp_upload/3221/3221fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4. Adhezja leukocytów w tętnicach szyjnych szczurów Sprague Dawley po 1 godzinie inkubacji przy niskim (80 mmHg) i wysokim ciśnieniu (120 mmHg). ***P&lt;0.001, analizowane za pomocą dwuczynnikowej analizy wariancji z powtarzanymi pomiarami (2-way repeated measures ANOVA) z zastosowaniem testu post hoc Bonferroniego.

<ol><li>Lopez, A. D., Mathers, C. D., Ezzati, M., Jamison, D. T., Murray, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+and+regional+burden+of+disease+and+risk+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Global and regional burden of disease and risk factors.</a> Lancet. 367, 1747-1757 (2001).</li>
<li>Szczech, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+kidney+injury+and+cardiovascular+outcomes+in+acute+severe+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Acute kidney injury and cardiovascular outcomes in acute severe hypertension.</a> Circulation. 121, 2183-2191 Forthcoming.</li>
<li>Rodriguez-Garcia, J. L., Botia, E., de La Sierra, A., Villanueva, M. A., Gonzalez-Spinola, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Significance+of+elevated+blood+pressure+and+its+management+on+the+short-term+outcome+of+patients+with+acute+ischemic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hypertens%22%5BJournal%5D)">Significance of elevated blood pressure and its management on the short-term outcome of patients with acute ischemic stroke.</a> Am J Hypertens. 18, 379-384 (2005).</li>
<li>Levy, D., Larson, M. G., Vasan, R. S., Kannel, W. B., Ho, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+progression+from+hypertension+to+congestive+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">The progression from hypertension to congestive heart failure.</a> JAMA. 275, 1557-1562 (1996).</li>
<li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+to+the+site+of+inflammation%3A+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nat Rev Immunol. 7, 678-689 (2007).</li>
<li>Riou, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+pressure+promotes+monocyte+adhesion+to+the+vascular+wall%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">High pressure promotes monocyte adhesion to the vascular wall.</a> Circ Res. 100, 1226-1233 (2007).</li>
<li>Ley, K., Gaehtgens, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial%2C+not+hemodynamic%2C+differences+are+responsible+for+preferential+leukocyte+rolling+in+rat+mesenteric+venules.+Circ+Res%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Endothelial, not hemodynamic, differences are responsible for preferential leukocyte rolling in rat mesenteric venules. Circ Res.</a> 69, 1034-1041 (1991).</li>
<li>Bernhagen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MIF+is+a+noncognate+ligand+of+CXC+chemokine+receptors+in+inflammatory+and+atherogenic+cell+recruitment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">MIF is a noncognate ligand of CXC chemokine receptors in inflammatory and atherogenic cell recruitment.</a> Nat Med. 13, 587-596 (2007).</li>
<li>Woollard, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiological+levels+of+soluble+P-selectin+mediate+adhesion+of+leukocytes+to+the+endothelium+through+Mac-1+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Pathophysiological levels of soluble P-selectin mediate adhesion of leukocytes to the endothelium through Mac-1 activation.</a> Circ Res. 103, 1128-1138 (2008).</li>
<li>Eberth, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importance+of+pulsatility+in+hypertensive+carotid+artery+growth+and+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hypertens%22%5BJournal%5D)">Importance of pulsatility in hypertensive carotid artery growth and remodeling.</a> J Hypertens. 27, 2010-2021 (2009).</li>
<li>Cooke, J. P., Rossitch, E., Andon, N. A., Loscalzo, J., Dzau, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+activates+an+endothelial+potassium+channel+to+release+an+endogenous+nitrovasodilator%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Flow activates an endothelial potassium channel to release an endogenous nitrovasodilator.</a> J Clin Invest. 88, 1663-1671 (1991).</li>
</ol>

Protokół badania został zatwierdzony przez Komisję Etyki ds. Zwierząt Alfred Medical Research and Education Precinct oraz Komisję Etyczną Alfred Hospital.

Jest to zmodyfikowana metoda badania adhezji leukocytów do śródbłonka w nienaruszonych, izolowanych naczyniach krwionośnych w czasie rzeczywistym, w warunkach ciśnieniowych. Sama perfuzja komory naczyniowej umożliwia szybką walidację prozapalnych szczepów dużych naczyń myszy i szczurów. Możliwość manipulacji ciśnieniem pozwala na obserwację dynamicznych interakcji komórkowych w zakresie od niskiego do bardzo wysokiego ciśnienia wewnątrzświatłowego, co lepiej odwzorowuje warunki fizjologiczne i patofizjologiczne. Za pomocą odpowiedniego programu do obrazowania komórek można również zmierzyć średnicę naczyń, a w konsekwencji określić i manipulować przepływem ścinającym oraz jego szybkością.
Dzięki możliwościom miograficznym, zastosowanie interwencji farmakologicznych w kąpieli wprowadza dodatkowy wymiar możliwych warunków eksperymentalnych w tym modelu, co umożliwia badania szlaków mechanistycznych i sygnalizacyjnych. Chociaż podczas manipulacji ciśnieniem nie można potwierdzić zachowania śródbłonka, odpowiedzi na ACh i PE można przeprowadzić po perfuzji9.
Należy zaznaczyć, że ta konfiguracja demonstruje wpływ ciśnienia wewnątrzświatłowego na oddziaływania międzykomórkowe, a nie efekty tętniącego przepływu krwi ani ciśnień skurczowych lub rozkurczowych. Ponadto, choć zaobserwowano wpływ gwałtownych zmian ciśnienia na adhezję leukocytów, układ ten może być również wykorzystany do badania przewlekłych efektów ciśnienia (np. poprzez wydłużenie czasu inkubacji i zastosowanie modelu zwierzęcego z przewlekłym nadciśnieniem). W tej konfiguracji zaprezentowano tętnice szyjne wspólne szczurów Sprague Dawley, jednak można zastosować inne linie i gatunki, odpowiednio dostosowując rozmiar kaniuli. W rzeczywistości istotne jest, aby zauważyć, że wiek i masa ciała zwierząt wpływają na rozmiar naczynia, a zatem konfiguracja musi być dostosowana indywidualnie do każdego naczynia. Staranna i dokładna dyssekcja tkanki łącznej może znacznie poprawić wizualizację leukocytów.

<table><tbody><tr><td>Mikroskop </td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>SteREO Discovery V.20</td><td></td></tr><tr><td>Pompa strzykawkowa PHD 2000</td><td>Harvard Apparatus</td><td>70-2016</td><td></td></tr><tr><td>Aparat cyfrowy i kontroler</td><td>Hamamatsu Corp.</td><td>C4742-95</td><td></td></tr><tr><td>System iluminacji fluorescencyjnej</td><td>Lumen Dynamics</td><td>X-Cite 120</td><td></td></tr><tr><td>Komora naczyniowa</td><td>Instrumentacja systemów żywych</td><td>CH/1/SH</td><td></td></tr><tr><td>Serwokontroler ciśnienia i pompa perystaltyczna</td><td>Aparatura do badania układów żywych</td><td>PS - 200</td><td></td></tr><tr><td>Monitor ciśnienia perfuzyjnego </td><td>Aparatura do badania systemów żywych</td><td>PM - 4</td><td></td></tr><tr><td>2 x przetwornik ciśnienia</td><td>Instrumentacja systemów żywych</td><td>PT - F</td><td></td></tr><tr><td>Regulator temperatury</td><td>Aparatura do badań systemów żywych</td><td>TC-01</td><td></td></tr><tr><td>Pompa perystaltyczna</td><td>Instech Laboratories, Inc</td><td>P720</td><td></td></tr><tr><td>roztwór do znakowania komórek VybrantDil</td><td>Invitrogen</td><td>V-22885</td><td>Stosować w rozcieńczeniu 1:1000</td></tr></tbody></table>

obrazowanie adhezji leukocytów do śródbłonka naczyniowego przy wysokim ciśnieniu wewnątrzświatłowym

Imaging Leukocyte Adhesion to the Vascular Endothelium at High Intraluminal Pressure

Na całym świecie nadciśnienie tętnicze występuje u około jednej czwartej populacji i jest głównym biomedycznym czynnikiem ryzyka zgonów. W układzie naczyniowym nadciśnienie wiąże się z dysfunkcją śródbłonka i zwiększonym stanem zapalnym, co prowadzi do miażdżycy oraz różnych stanów chorobowych, takich jak przewlekła choroba nerek2, udar3 i niewydolność serca4. Pierwszym krokiem w zapaleniu naczyń prowadzącym do aterogenezy jest kaskada adhezji, która obejmuje toczenie (rolling), kotwiczenie (tethering), przyleganie oraz następującą po nich transmigrację leukocytów przez śródbłonek. Rekrutacja i gromadzenie się leukocytów na śródbłonku są pośredniczone przez nadekspresję cząsteczek adhezyjnych, takich jak cząsteczka adhezyjna komórek naczyniowych-1 (VCAM-1), wewnątrzkomórkowa cząsteczka adhezyjna-1 (ICAM-1) i E-selektyna, a także przez wzrost uwalniania cytokin i chemokin oraz nadekspresję reaktywnych form tlenu5. Metody in vitro, takie jak statyczne testy adhezji, pomagają określić mechanizmy zaangażowane w adhezję komórka-komórka, a także w analizę cząsteczek adhezyjnych. Metody zastosowane w poprzednich badaniach in vitro wykazały, że gwałtowne wzrosty ciśnienia na śródbłonku mogą prowadzić do adhezji monocytów oraz nadekspresji cząsteczek adhezyjnych i markerów zapalnych6; jednak, podobnie jak w wielu testach in vitro, badania te nie były prowadzone w czasie rzeczywistym w fizjologicznych warunkach przepływu ani z użyciem krwi pełnej. Dlatego w modelach zwierzęcych coraz częściej wykorzystuje się testy in vivo do wykazania zapalenia naczyń i rozwoju blaszki miażdżycowej. Mikroskopia witalna jest obecnie szeroko stosowana do oceny adhezji, toczenia, migracji i transmigracji leukocytów7-9. W przypadku łączenia efektów ciśnienia z adhezją leukocytów do śródbłonka, badania in vivo są mniej liczne. Jedna z takich prac bada efekty przepływu i sił ścinania na wzrost i przebudowę tętnic w czasie rzeczywistym, lecz markery zapalne oceniano jedynie za pomocą immunohistochemii10. Przedstawiamy tutaj model rejestracji adhezji leukocytów w czasie rzeczywistym w nienaruszonych, poddanym ciśnieniu naczyniach krwionośnych z wykorzystaniem perfuzji krwi pełnej. Metodologia ta jest modyfikacją modelu perfuzji komory naczyniowej ex vivo9, która umożliwia analizę w czasie rzeczywistym interakcji adhezyjnych między leukocytami a śródbłonkiem w nienaruszonych naczyniach. Nasza modyfikacja pozwala na manipulację ciśnieniem wewnątrzświatłowym do 200 mmHg, co umożliwia badania nie tylko w fizjologicznych warunkach przepływu, ale także w różnych warunkach ciśnienia. Choć systemy mikrografii ciśnieniowej były wcześniej wykorzystywane do obserwacji ściany naczyń i średnicy światła11 oraz skurczu naczyń, jest to pierwszy raz, gdy wykazano interakcje leukocyt-śródbłonek w czasie rzeczywistym. Prezentujemy tę technikę z wykorzystaniem tętnic szyjnych pobranych od szczurów i kaniulowanych do wykonanej na zamówienie komory przepływowej sprzężonej z mikroskopem fluorescencyjnym. Komora naczyniowa jest wyposażona w duże szkiełko przykrywowe na dnie, co umożliwia zastosowanie obiektywu o dużej średnicy i krótkiej odległości roboczej do obrazowania naczynia. Ponadto można wykorzystać wybrane agonisty i/lub antagonisty, aby dalej badać mechanizmy kontrolujące adhezję komórkową. Zalety tej metody w stosunku do mikroskopii witalnej obejmują brak konieczności przeprowadzania inwazyjnego zabiegu chirurgicznego, co pozwala na uzyskanie większej przepustowości badań. Metoda ta umożliwia również zastosowanie miejscowej terapii inhibitorami w wybranym naczyniu, podczas gdy metoda witalna umożliwia jedynie systemowe podanie inhibitora.

Jest to metoda wizualizacji adhezji leukocytów do śródbłonka w pobranych naczyniach poddanym ciśnieniu. Technika ta umożliwia badanie adhezji naczyniowej w warunkach przepływu ścinającego przy różnych ciśnieniach wewnątrzświatłowych do 200 mmHg, co pozwala na naśladowanie patofizjologicznych warunków nadciśnienia tętniczego.

Obrazowanie adhezji leukocytów do śródbłonka naczyniowego przy wysokim ciśnieniu wewnątrzświatłowym

Informuje się, że nadciśnienie tętnicze występuje u około jednej czwartej populacji na całym świecie i jest głównym biomedycznym czynnikiem ryzyka śmiertelności na świecie. ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wizualizacja adhezji leukocytów do śródbłonka w pobranych naczyniach pod ciśnieniem. Osiąga się to poprzez uprzednią izolację tętnicy szyjnej szczura lub myszy. Następnie naczynie zostaje zamocowane w komorze ciśnieniowej.Następnie naczynie poddaje się ciśnieniu i inkubuje przez jedną godzinę przy żądanym ciśnieniu. Na koniec przez naczynie pod ciśnieniem perfunduje się znakowaną pełną krew. W rezultacie można uzyskać dane obrazujące w czasie rzeczywistym adhezję leukocytów do endotelium za pomocą dostosowanej komory naczyniowej ex vivo, połączonej z precyzyjnym serwem oraz mikroskopem fluorescencyjnym.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak statyczne testy adhezji, jest możliwość obserwacji adhezji leukocytów w nienaruszonych, funkcjonalnych tętnicach z wykorzystaniem krwi pełnej. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w badaniach nad nadciśnieniem tętniczym, takie jak wpływ wysokiego ciśnienia wewnątrzświatowego na stan zapalny oraz sposób, w jaki może on przyczyniać się do rozwoju miażdżycy. Po wyizolowaniu tętnic szyjnych od 10-tygodniowych szczurów linii spread dolly oraz przygotowaniu i utlenieniu komory perfuzyjnej, zamocuj naczynie pod mikroskopem dissectingowym, najpierw nakładając czarne opaski poliestrowe na każdą kaniulę, a następnie przenieś naczynie do kąpieli i zamocuj jedną czwartą naczynia na kaniuli P1.Należy uważać, aby nie przerwać naczynia, używając strzykawki wypełnionej buforem Krebsa. Delikatnie wypłukać nadmiar krwi z naczynia przez przetwornik P1. Zamknąć dopływ z P1 do komory.Za pomocą poliestrowej więzi przymocuj naczynie do kaniuli P one. Przesuń kaniule i uchwyty kaniul bliżej, aby zamontować je na kaniuli P two. Zamontuj dystalny koniec jednej czwartej naczynia na kaniuli P two.Zabeziecz go poliestrową opaską, aby rozpocząć napowietrzanie naczynia. Dostosuj uchwyty kaniuli, aby upewnić się, że naczynie nie jest wygięte ani rozciągnięte przy zamkniętych zaworach P one i P two doprowadzających do komory. Przełącz serwomechanizm ciśnienia z trybu automatycznego na ręczny.Sprawdź serwomechanizm ciśnienia, aby zweryfikować, czy w ciągu 10 sekund nie występuje spadek ciśnienia. Spadek ciśnienia wskazuje na obecność nieszczelności, co oznacza, że połączenia i przetwornik muszą zostać zabezpieczone, aby zapewnić ich szczelność ciśnieniową. Przełącz serwomechanizm ciśnienia z powrotem w tryb automatyczny, następnie otwórz zawór P dwa do komory pod mikroskopem i zaobserwuj rozszerzenie naczynia.Gdy kurek do komory jest otwarty, przełącz serwomechanizm ciśnienia w tryb ręczny. Ponownie sprawdź, czy nie nastąpiły spadki ciśnienia.Jeśli spadek ciśnienia będzie nadal występował, oznacza to, że układ nie jest szczelny i prawdopodobnie w naczyniu znajduje się otwór. Przełącz urządzenie z powrotem w tryb automatyczny i otwórz zawór P1 do komory. W ustawieniu ręcznym sprawdź, czy ciśnienie pozostaje stabilne.Jeśli stan jest stabilny, przekręć pokrętło na wartość dwa, co zwiększy ciśnienie w naczyniu do 40 mmHg. Przełącz urządzenie w tryb automatyczny i obserwuj naczynie pod mikroskopem. W razie potrzeby skoryguj położenie uchwytu kaniuli w ustawieniu manualnym, aby upewnić się, że naczynie nie jest zagięte.Sprawdź, czy nie ma wycieków. Następnie zwiększaj wartość na tarczy o jeden inkrement, przełączając w międzyczasie na tryb automatyczny, aby obserwować naczynie pod mikroskopem, aż do osiągnięcia pożądanej wartości ciśnienia. Po osiągnięciu pożądanej wartości ciśnienia przenieś komorę pod stereomikroskop.Podłącz regulator temperatury ustawiony na 37 °C. Następnie podłącz pompę perystaltyczną i aspirator, aby zapewnić stałą wymianę buforu Krebsa w kąpieli. Inkubuj naczynie ciśnieniowe w temperaturze 37 °C przez jedną godzinę.Okresowo sprawdzać szczelność. Do 7,5 ml pobranej krwi pełnej dodać barwnik w ciemności. Następnie inkubować przez 10 minut w temperaturze 37 °C.Pobrać krew do strzykawki, usuwając pęcherzyki powietrza, a następnie podłączyć ją do pompy strzykawkowej z płaszczem grzewczym ustawionym na 37 °C. Zamknąć przetwornik P1 prowadzący do komory i podłączyć strzykawkę oraz dren odpływowy. Przepłukać układ krwią z przepływem 1000 µL/min przez dren odpływowy w celu usunięcia pęcherzyków powietrza, a następnie otworzyć dopływ z P1 do komory.Serwomechanizm ciśnienia będzie automatycznie dostosowywał parametry w celu utrzymania pożądanego ciśnienia; należy perfundować krew z prędkością 100 µL/min, używając mikroskopu fluorescencyjnego połączonego z kamerą cyfrową, aby zarejestrować dwa pola perfundowanego naczynia przez 15 sekund w kilku punktach czasowych. Poniżej przedstawiono reprezentatywne obrazy leukocytów, przy czym leukocyty uznaje się za przylegające do śródbłonka, jeśli pozostają w miejscu przez 10 sekund. Dzięki nagraniom wideo w pętli można zliczyć średnią liczbę komórek na pole, przy czym zarówno niskie, jak i wysokie ciśnienie będą powodować pewien stopień adhezji.Obserwuje się znaczący wzrost adhezji leukocytów przy wyższym ciśnieniu wewnątrzświatowym. Zostało to wykazane ilościowo na tym wykresie, gdzie większa liczba komórek na pole widzenia przylega przy ciśnieniu 120 w porównaniu do 80 mm Hg. Po wykonaniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak PCR i immunohistochemia, w celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, na przykład dotyczące ekspresji genów i białek cząsteczek adhezyjnych.

imaging-leukocyte-adhesion-to-vascular-endothelium-at-high

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Obrazowanie Adhezji Leukocytów do Endotelium Naczyniowego przy Wysokim Ciśnieniu Śródświatłowym

W niniejszej pracy opisujemy nieinwazyjną metodę mikroskopii dwufotonowej (2P) służącą do badania homingu leukocytów w poduszce stopy myszy. Omówiamy aspekty techniczne przygotowania tkanki do obrazowania i przeprowadzamy czytelnika przez typowy eksperyment – od początkowej konfiguracji, przez wykonanie, aż po gromadzenie danych.

Nieinwazyjne obrazowanie homingu i migracji leukocytów in vivo

Rekrutacja leukocytów do wątroby odbywa się w wyspecjalizowanych kanałach sinusoid wątrobowych, które są wyściełane unikalnymi komórkami śródbłonka sinusoidalnego wątroby.  Mikroskopia z kontrastem fazowym rekrutacji leukocytów przez ludzki śródbłonek sinusoidalny wątroby w warunkach fizjologicznego naprężenia ścinającego może ułatwić wyjaśnienie mechanizmów molekularnych, które leżą u podstaw tego procesu.

Test adhezji przepływowej do badania rekrutacji leukocytów do ludzkiego śródbłonka sinusoidalnego wątroby w warunkach naprężeń ścinających

Leukocyty przenikają przez monowarstwę śródbłonka drogą parakomórkową lub transkomórkową. Opracowaliśmy prosty test do śledzenia rozkładu endogennej złączowej VE-kadheryny i PECAM-1 podczas transśródbłonkowej migracji leukocytów pod przepływem fizjologicznym, aby rozróżnić dwie drogi transmigracji.

Obrazowanie w czasie rzeczywistym połączeń komórka-komórka śródbłonka podczas transmigracji neutrofili pod wpływem przepływu fizjologicznego

Tutaj prezentujemy protokół, który pozwala badaczowi ocenić dynamikę rekrutacji leukocytów ex vivo poprzez podłączenie komory pokrytej cząsteczkami adhezyjnymi pochodzącymi ze śródbłonka do układu krążenia myszy. Metoda ta ma istotne zalety, ponieważ pozwala na ocenę leukocytów we względnych warunkach biologicznych.

Ocena interakcji leukocytów-śródbłonka w warunkach przepływu w autoperfuzyjnym teście komorowym ex vivo z mikroprzepływem

To uproszczone zastosowanie mikroskopii przyżyciowej żył krezkowych u myszy może być używane w różnych modelach zapalenia do obserwacji interakcji leukocytów-śródbłonka i płytek krwi-leukocytów.

Mikroskopia przyżyciowa interakcji leukocytów-śródbłonka i płytek krwi-leukocytów w żyłach krezkowych u myszy

Ten manuskrypt opisuje zastosowanie transgenicznych myszy reporterowych i różnych dróg podawania barwników fluorescencyjnych w nadciśnieniu wywołanym angiotensyną II za pomocą przyżyciowej mikroskopii wideo naczyń krwionośnych do oceny aktywacji komórek odpornościowych i ich zdolności do zwijania się i przylegania do śródbłonka.

Wizualizacja wałowania i adhezji leukocytów u myszy z infuzją angiotensyny II: techniki i pułapki

Leukocyty chętnie oddziałują z komórkami naczyniowymi i płytkami krwi po uszkodzeniu ściany naczynia lub podczas stanu zapalnego. W tym miejscu opisujemy prosty test oparty na przepływie laminarnym, aby scharakteryzować mechanizmy molekularne, które leżą u podstaw interakcji między leukocytami a ich partnerami komórkowymi.

Testy oparte na przepływie laminarnym w celu zbadania rekrutacji leukocytów na hodowanych komórkach naczyniowych i przylegających płytkach krwi

Ten protokół krok po kroku zawiera szczegółowy opis konfiguracji eksperymentu i analizy danych do oceny reakcji zapalnych w hiPSC-EC oraz analizy adhezji leukocytów w przepływie fizjologicznym.

Test mikroprzepływowy do oceny adhezji leukocytów do indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek śródbłonka pochodzących z komórek macierzystych (hiPSC-EC)

W tym protokole, do badania interakcji między komórkami leukocytów w chorobie zapalnej stosuje się biomimetyczne badanie mikropłynów, które może odtworzyć fizjologicznie istotne środowisko mikrokrążenia i odtworzyć całą kaskadę adhezji/migracji leukocytów.

System mikrofizjologiczny do badania interakcji między leukocytami a komórkami śródbłonka podczas stanu zapalnego

Mikroskopia fluorescencyjna przyżyciowej może być wykorzystana do badania interakcji leukocytów-śródbłonka i perfuzji naczyń włosowatych w czasie rzeczywistym. Protokół ten opisuje metody obrazowania i ilościowego oznaczania tych parametrów w mikrokrążeniu płucnym za pomocą stabilizowanego próżniowo systemu obrazowania płuc.

Przyżyciowa mikroskopia fluorescencyjna szerokokątnego mikrokrążenia płucnego w eksperymentalnym ostrym uszkodzeniu płuc z wykorzystaniem systemu obrazowania stabilizowanego próżniowo

Demonstrujemy metodę oznaczania ścian układu krwionośnego siatkówki i przylegających leukocytów. Te przylegające leukocyty można następnie policzyć pod mikroskopem fluorescencyjnym jako parametr stanu zapalnego lub odpowiedź tego zapalenia na terapie.

Kwantyfikacja adherentnych leukocytów wywołanych cukrzycą w unaczynieniu siatkówki

Poznaj metodę obrazowania adhezji leukocytów do śródbłonka w izolowanych naczyniach pod ciśnieniem. Technika umożliwia badanie zapalenia naczyń i roli nadciśnienia w miażdżycy w czasie rzeczywistym.

Obrazowanie adhezji leukocytów do śródbłonka naczyniowego przy wysokim ciśnieniu wewnątrzświatłowym

Przeglądaj więcej filmów