Name: Wykrywanie i genogrupowanie norowirusów z kału dzieci za pomocą jednoetapowego RT-PCR firmy Taqman (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-22T12:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 16 s
Description: Poznaj metodę jednoetapowego RT-PCR TaqMan do wykrywania i genogrupowania norowirusów z kału dzieci. Ta technika poprawia diagnostykę wirusowego zakażenia przewodu pokarmowego w pediatrii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Narodowemu Ośrodkowi Badawczemu nad Kaliciwirusami w Centrum Kontroli i Zapobiegania Chorobom (CDC) za uprzejme przekazanie standardu i dodatnich próbek kontrolnych NoV oraz laboratoriom Szkoły Zdrowia Publicznego Uniwersytetu Johns Hopkins za dostarczenie odczynników.

1. Próbki kału
<ol>
 <li>Próbki kału należy przechowywać w zamrożeniu, aby zachować RNA. W celu przygotowania 10% zawiesiny fekalnej, należy odważyć około 0,1 g rozmrożonej próbki kału i uzupełnić objętość do 1 ml za pomocą PBS.</li>
 <li>Należy przygotować alikwoty po 200 μl, aby uniknąć wielokrotnego zamrażania i rozmrażania. Alikwoty należy przechowywać w temperaturze -70 °C.</li>
 <li>Przed użyciem w procesie ekstrakcji, alikwoty należy rozmrozić i odwirować przy 4,000 g przez 10 min.</li>
</ol>
2. Przygotowanie cząsteczek krzemionki do ekstrakcji z użyciem guanidyny i krzemionki
<ol>
 <li>W temperaturze pokojowej zawiesić 30 g dwutlenku krzemu i dopełnić dH2O do objętości 250 mL. </li>
 <li>Po 24 h sedymentacji odessać 215 mL nadosadu. Dopełnić dH2O do 250 mL i zawiesić osad krzemionki poprzez wstrząsanie. </li>
 <li>Po kolejnych 24 h odessać nadosad i dostosować pH zawiesiny krzemionki do pH 2,0 za pomocą kwasu solnego (HCl). Rozdzielić zawiesinę krzemionki do butelek szklanych i poddać autoklawowaniu. </li>
</ol>
3. Przygotowanie buforu L6 do ekstrakcji z użyciem guanidyny i krzemionki
<ol>
 <li>W temperaturze pokojowej przygotować bufor L6, rozpuszczając 60 g tiocyjanianu guanydyny (GuSCN) oraz 1,3 g Triton X-100 w 50 mL 0,1 M Tris-HCl, pH 6,4, oraz w 11 mL roztworu 0,2 M EDTA, pH 8,0.</li>
</ol>
4. Przygotowanie buforu L2 do ekstrakcji z użyciem guanidyny i krzemionki
<ol>
 <li>W temperaturze pokojowej przygotować bufor L2, rozpuszczając 180 g tiocyjanianu guanydynium (GuSCN) w 150 mL 0,1 M Tris-HCl o pH 6,4.</li>
</ol>
5. Procedura ekstrakcji
<ol>
 <li>W każdej ekstrakcji należy uwzględnić próbkę kału dodatnią pod kątem NoV jako kontrolę dodatnią oraz wodę traktowaną DEPC jako kontrolę ujemną.</li>
 <li>W probówce do mikrocentrifugi wymieszać następujące składniki: 1 mL buforu L6, 20 μL cząsteczek krzemionkowych, a następnie dodać 200 μL 10% zawiesiny ekstraktu z kału. Krótko wymieszać na wirówce typu vortex i pozostawić w temperaturze pokojowej (RT) na 15 min.</li>
 <li>Wirować zawiesinę przy 6000 g przez 10 s i dwukrotnie przemyć osad 1 ml buforu L2, a następnie dwukrotnie przemyć 70% etanolem i raz acetonem. Suszyć osad w suchym bloku grzejnym w temperaturze 56 °C przez 5 min.</li>
 <li>Nawodnić RNA w osadzie krzemionkowym, dodając 50 μL dH20 wolnej od RNaz. Dodać 1 μL RNasin, wymieszać poprzez odwracanie probówki i inkubować w temperaturze 56 °C przez 15 min.</li>
 <li>Wirować przez 3 min z maksymalną prędkością w wirówce stołowej i zebrać 40 μL nadnadistratu zawierającego RNA.</li>
 <li>Ilość wyekstrahowanego RNA w próbkach oznaczyć za pomocą spektrofotometru Nanodrop 2000 (Thermo scientific). Następnie przechowywać w temperaturze -70 °C do momentu użycia, maksymalnie przez 6 miesięcy. (Uwaga: Lepszym sposobem na zachowanie nienaruszonego całkowitego RNA jest jego konwersja do cDNA).</li>
</ol>
6. Alternatywna ekstrakcja z użyciem komercyjnego zestawu QIAamp Viral RNA Kit
Pełne instrukcje znajdują się w instrukcji dołączonej do zestawu QIAGEN. W skrócie procedura przebiega następująco:
<ol>
 <li>Do probówki 1,5 mL pipetować 560 μL Buforu AVL zawierającego RNA nośnikowe, a następnie dodać 140 μL 10% zawiesiny kałowej. Mieszać przez 15 s za pomocą pulsacyjnego wstrząsania w wirówce (vortexingu). Inkubować w temperaturze pokojowej (RT) przez 10 min. </li>
 <li>Do próbki dodać 560 μL etanolu (96-100%) i mieszać przez 15 s za pomocą pulsacyjnego vortexingu, a następnie krótko odwirować. </li>
 <li>Nanieść 630 μL otrzymanego roztworu na kolumnę wirówkową umieszczoną w 2 mL probówce zbiorczej. Wirować przez 1 min przy 6 000 g, a następnie przenieść kolumnę do czystej probówki 2 mL. </li>
 <li>Przemyć kolumnę zawierającą związane RNA przy użyciu 500 μL Buforu AW1 i wirować przy 6 000 g przez 1 min. Umieścić kolumnę w czystej 2 mL probówce zbiorczej. </li>
 <li>Przemyć kolumnę za pomocą 500 μL Buforu AW2 i wirować z maksymalną prędkością (20 000 g lub 14 000 rpm) przez 3 min. </li>
 <li>Umieścić kolumnę wirówkową w czystej mikroprobówce 1,5 mL, dodać 40 μL wody traktowanej DEPC i eluować RNA z maksymalną prędkością wirowania. Powtórzyć czynność raz, aby uzyskać końcową objętość 80 μL elowanego RNA. </li>
 <li>Oznaczyć ilość wyekstrahowanego RNA za pomocą spektrofotometru Nanodrop 2000 (Thermo scientific). Następnie przechowywać w temperaturze -70 °C do momentu użycia, maksymalnie przez 6 miesięcy. (Uwaga: Lepszą metodą zachowania całkowitego RNA w nienaruszonej formie jest jego konwersja do cDNA).</li>
</ol>
7. Detekcja norowirusa w wyekstrahowanym RNA za pomocą jednokrokowego Real Time RT-PCR z zastosowaniem specyficznych sond Taqman
Systemy do PCR w czasie rzeczywistym StepOnePlus Real Time PCR Systems (Applied Biosystems).
Metodyka
<ol>
 <li>Przetrzyj i oczyść wszystkie powierzchnie robocze, pipety i wirówki preparatem RNase AWAY, aby usunąć ewentualne zanieczyszczenia RNazami.</li>
 <li>Przygotuj mieszaniny główne (master mixy) do przesiewowego badania NoV GI i GII zgodnie z Tabelą 1. Primery i sondy Taqman wymieniono w Tabeli 2.</li>
 <li>Odważ 10 μL odpowiedniego master mixu do każdej probówki reakcyjnej.</li>
 <li>Do odpowiednich studniek reakcyjnych dodaj 5 μL nierozcieńczonego RNA nieznanej próbki, wody traktowanej DEPC jako kontrolę negatywną lub RNA kontroli pozytywnej GI odpowiednio GII. Wszystkie próbki należy analizować w duplikacie. Kontrole pozytywne i standardy o stężeniu odpowiednio 300 μg/μL i 500 μg/μL zostały dostarczone przez National Calicivirus Laboratory Center for Disease Control and Prevention (CDC).</li>
 <li>Wiruj płytkę reakcyjną z prędkością 6 000 g przez 10 s.</li>
 <li>W ekranie właściwości eksperymentu zdefiniuj i wybierz typ eksperymentu dla danego przebiegu. Upewnij się, że odczynniki TaqMan są wyświetlane jako typ odczynników oraz że wybrano odczyt Pre-PCR i amplifikację.</li>
 <li>Przeprowadź reakcje o objętości 15 μL zgodnie z profilem termicznym w Tabeli 3.</li>
 <li>Przeanalizuj wyniki.</li>
</ol>
8. Genotypowanie NoV GI i GII z wykorzystaniem konwencjonalnej RT-PCR i sekwencjonowania
(Nie wspomniano o tym w tym filmie, ponieważ jest to metoda powszechna i szeroko stosowana.)
Instrument. Systemy PCR w czasie rzeczywistym Applied Biosystems StepOne i StepOnePlus z szablonem Quantitec.
Metodyka
<ol>
 <li>Przed genotypowaniem, za pomocą opisanego powyżej przesiewowego badania RT-PCR, należy określić genogrupę (GI lub GII) próbek. RNA NoV grupy GI musi zostać powielone przy użyciu master mixu do genotypowania GI, a RNA NoV grupy GII przy użyciu master mixu do genotypowania GII. </li>
 <li>Pipetować master mixy do genotypowania NoV GI i GII zgodnie z Tabelą 4. Primery GI SKF/SKR oraz G2 SKF/SKR wymieniono w Tabeli 5. </li>
 <li>Do probówek reakcyjnych o pojemności 0,2 mL odmierzyć aliquoty po 45 μL odpowiedniego master mixu. </li>
 <li>Do każdej probówki kontroli negatywnej dodać 5 μL wody traktowanej DEPC, a do odpowiedniej probówki reakcyjnej dodać 5 μL wcześniej przebadanego, pozytywnego pod kątem NoV (GI i/lub GII) RNA. </li>
 <li>Przeprowadzić reakcje o objętości 50 μL zgodnie z profilem termicznym zawartym w Tabeli 6. </li>
 <li>Produkty PCR zawierające co najmniej 100 ng/μL powielonego regionu kapsydu wysłać do firmy Macrogen w celu oczyszczenia i sekwencjonowania. (9700 Great Seneca Hwy. Rockville, MD 20850 oraz koszt 10 USD za próbkę za sekwencjonowanie). </li>
</ol>
9. Reprezentatywne wyniki
<img src="/files/ftp_upload/3232/3232fig1.jpg" alt="Wykres amplifikacji PCR; cykl vs. ΔRn; kontrole, krzywe próbek; kwantyfikacja DNA; graf." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1 przedstawia reprezentatywne wyniki badania Taqman One-Step RT-PCR wykonanego w celu analizy RNA wyizolowanego z próbek kału pobranych od dzieci z biegunką. Cykl progowy (Ct) dla próbki pozytywnej ustalono na wartość mniejszą lub równą Ct 37 dla GI oraz Ct 39 dla GII. Wartości Ct dla kontroli pozytywnych w obrębie złącza ORF1-ORF2 wyniosły odpowiednio mniej niż 27 dla GI i 18 dla GII. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3232/3232fig1large.jpg" target="_blank"> Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek</a>.
<img src="/files/ftp_upload/3232/3232fig2.jpg" alt="Wykres porównawczy metody własnej z zestawem QIAamp RNA wykazujący korelację; równanie y=0,984x+0,1901." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2 przedstawia bezpośrednie porównanie wartości Ct uzyskanych metodą in silica z użyciem guanidynium oraz przy użyciu zestawu QiAmp Viral RNA. Dane z obu testów znajdują się bardzo blisko linii równości (nachylenie = 1 i punkt przecięcia = 0). Potwierdzają to analiza regresji oraz współczynnik korelacji. Wszystkie kontrole negatywne zostały ocenione i w obu metodach uzyskały wynik 0. 
 <table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Mieszanina Master Mix </td>
 <td>Stężenie końcowe</td>
 <td>Objętość (μL)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>H20 PCR</td>
 <td> </td>
 <td>2.875</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Quantitect RT-PCR Master Mix</td>
 <td>1x</td>
 <td>6.250</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mieszanina do RT</td>
 <td>1x</td>
 <td>0.125</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>50 μM starter Cog R</td>
 <td>1 μM</td>
 <td>0.250</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>50 μM Starter Cog F</td>
 <td>1 μM</td>
 <td>0.250</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 μM Sonda pierścieniowa</td>
 <td>1 μM</td>
 <td>0.125/0.250*</td>
 </tr>
 <tr>
 <td> </td>
 <td> </td>
 <td>10.00</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
 * Do testów GI wykorzystano 0,250 μL każdej sondy, natomiast do testów GII wykorzystano 0,125 μL każdej sondy.
Tabela 1. Master mix Qiagen Quantitect do przesiewowego wykrywania GI i GII (Trujillo et al., 2006).7
 <table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Nazwa</td>
 <td>grupa Geno-</td>
 <td>Zastosowanie</td>
 <td>Sekwencja (5' do 3')</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cog 1R</td>
 <td>GI</td>
 <td>Starter</td>
 <td>CTT AGA CGC CAT CAT CAT TYA C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cog 1F</td>
 <td>UK</td>
 <td>Starter</td>
 <td>CGY TGG ATG CGN TTY CAT GA</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cog 2R</td>
 <td>GII</td>
 <td>Starter</td>
 <td>TCG ACG CCA TCT TCA TTC ACA</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cog 2F</td>
 <td>GII</td>
 <td>Starter</td>
 <td>CAR GAR BCN ATG TTY AGR TGG ATG AG</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pierścień 1A</td>
 <td>Układ pokarmowy</td>
 <td>Sonda</td>
 <td>FAM-AGA TYG CGA TCY CCT GTC CA-BHQ-1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pierścień 1B</td>
 <td>UKW</td>
 <td>Sonda</td>
 <td>FAM-AGA TCG CGG TCT CCT GTC CA-BHQ-1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ring2-TP</td>
 <td>GII</td>
 <td>Sonda</td>
 <td>FAM-TGG GAG GGC GAT CGC AAT CT-BHQ-1</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
Tabela 2. Oligonukleotydy starterów i sond wykorzystane do ilościowej RT-PCR w czasie rzeczywistym dla genogrup I i II (Kageyama et al., 2003).8
 <table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Krok</td>
 <td>Temp (°C)</td>
 <td>Czas (min)</td>
 <td> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1</td>
 <td>50 </td>
 <td>30:00</td>
 <td>synteza cDNA</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2</td>
 <td>95</td>
 <td>15:00</td>
 <td>aktywacja polimerazy Taq HotStart</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>3</td>
 <td>95</td>
 <td>00:15</td>
 <td> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td> </td>
 <td>60</td>
 <td>01:00</td>
 <td>45 cykli</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
Tabela 3. Profil termiczny dla jednowykrocznej reakcji RT-PCR Taqman w czasie rzeczywistym (Trujillo et al., 2006).7
 <table border="1">
 <tbody >
 <tr>
 <td>Mieszanina główna (Master Mix)</td>
 <td>Stężenie końcowe</td>
 <td>Objętość (μL)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>H2O PCR</td>
 <td> </td>
 <td>29.50</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5X Qiagen RT-PCR Buffer</td>
 <td>1x</td>
 <td>10.00</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 mM dNTP Mix</td>
 <td>0.4 mM</td>
 <td>2.00</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mieszanina enzymów</td>
 <td> </td>
 <td>2.00</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>40 U/μL RNAsin</td>
 <td>20 U/μL</td>
 <td>0.50</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 μM SKF</td>
 <td>0.1 μM</td>
 <td>0.50</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 μM SKR</td>
 <td>0.1 μM</td>
 <td>0.50</td>
 </tr>
 </tbody>
 <tbody>
 <tr>
 <td> </td>
 <td> </td>
 <td>45.00</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
Tabela 4. Master mix Qiagen One-Step RT-PCR do genotypowania GI i GII.
 <table border="1">
 <tbody >
 <tr>
 <td>Nazwa</td>
 <td>Grupa genetyczna</td>
 <td>Zastosowanie</td>
 <td>Sekwencja (5' do 3')</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>G1SKF</td>
 <td>GI</td>
 <td>Starter</td>
 <td>5'- CTG CCC GAA TTY GTA AAT GA - 3</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>G1SKR</td>
 <td>GI</td>
 <td>Starter</td>
 <td>5'- CCA ACC CAR CCA TTR TAC A -'3</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>G2SKF</td>
 <td>GII</td>
 <td>Starter</td>
 <td>5'- CNT GGG AGG GCG ATC GCA A - 3</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>G2SKR</td>
 <td>GII</td>
 <td>Starter</td>
 <td>5'- CCR CCN GCA TRH CCR TTR TA CAT- 3</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
Tabela 5. Primery użyte do amplifikacji regionu C obszaru kapsydu (Kojima et al., 2002).5
 <table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Krok</td>
 <td>Temp. (°C)</td>
 <td>Czas (min)</td>
 <td> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1</td>
 <td>60</td>
 <td>30:00</td>
 <td>synteza cDNA</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2</td>
 <td>96</td>
 <td>15:00</td>
 <td>aktywacja polimerazy Taq HotStart</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>3</td>
 <td>94</td>
 <td>00:30</td>
 <td> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td> </td>
 <td>52</td>
 <td>01:00</td>
 <td>40 cykli</td>
 </tr>
 <tr>
 <td> </td>
 <td>72</td>
 <td>00:30</td>
 <td> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>4</td>
 <td>72</td>
 <td>10:00</td>
 <td>Wyżarzanie</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
Tabela 6. Profil termiczny dla Taqman One-Step RT-PCR.

<ol><li>Medici, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+epidemiology+of+Norovirus+infections+in+sporadic+cases+of+viral+gastroenteritis+among+children+in+Northern+Italy%5BTitle%5D)+AND+%22L.+Medical+Virology%22%5BJournal%5D)">Molecular epidemiology of Norovirus infections in sporadic cases of viral gastroenteritis among children in Northern Italy.</a> L. Medical Virology. 78, (2006).</li>
<li>Vidal, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+recombinant+Norovirus+causing+outbreaks+of+gastroenteritis+in+Santiago%2C+Chile%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clinica+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Novel recombinant Norovirus causing outbreaks of gastroenteritis in Santiago, Chile.</a> J. Clinica Microbiology. 4, (2006).</li>
<li>Xavier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+caliciviruses+associated+with+acute+infantile+gastroenteritis+in+Salvador%2C+an+urban+center+in+Northeast+Brazil%5BTitle%5D)+AND+%22Braz.+J.+Med.+Biol.+Res%22%5BJournal%5D)">Detection of caliciviruses associated with acute infantile gastroenteritis in Salvador, an urban center in Northeast Brazil.</a> Braz. J. Med. Biol. Res. 42, (2009).</li>
<li>Boom, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+simple+method+for+purification+of+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid and simple method for purification of nucleic acids.</a> J. Clin. Microbiol. 28, 495-503 (1990).</li>
<li>Kojima, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genogroup-specific+PCR+primers+for+detection+of+Norwalk-like+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Genogroup-specific PCR primers for detection of Norwalk-like viruses.</a> J. Virol. Methods. 100, 107-114 (2002).</li>
<li>Mattison, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicenter+comparison+of+two+norovirus+ORF2-based+genotyping+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Multicenter comparison of two norovirus ORF2-based genotyping protocols.</a> J. Clin. Microbiol. 47, 3927-3932 (2009).</li>
<li>Trujillo, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+TaqMan+real-time+reverse+transcription-PCR+for+rapid+detection%2C+quantification%2C+and+typing+of+norovirus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Use of TaqMan real-time reverse transcription-PCR for rapid detection, quantification, and typing of norovirus.</a> J. Clin. Microbiol. 44, 1405-1412 (2006).</li>
<li>Kageyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+broadly+reactive+and+highly+sensitive+assay+for+Norwalk-like+viruses+on+real-time+quantitative+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A broadly reactive and highly sensitive assay for Norwalk-like viruses on real-time quantitative RT-PCR.</a> J. Clin. Microbiol. 41, 1548-1557 (2003).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Stosując ekonomiczną, wewnętrzną metodę izolacji kwasów nukleinowych z próbek kału, uzyskujemy wyniki równoważne z wynikami otrzymanymi przy użyciu komercyjnego zestawu QIAmp Viral RNA firmy Qiagen, a w połączeniu z opracowaną w naszym laboratorium metodą TaqMan RT-PCR jesteśmy w stanie wykryć szeroki zakres genotypów NoV należących do genogrup GI i GII. W niedawnej publikacji dotyczącej protokołu dla regionu C zgłoszono wskaźniki genotypowania na poziomie 78%6. Ponieważ różnorodność współczesnych szczepów NoV...

<table><tbody><tr><td>Izotiocyjanian guanidyny</td><td>Sigma-Adrich</td><td>G9277</td><td></td></tr><tr><td>Tris HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5941</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Krzemionka</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5631</td><td></td></tr><tr><td>Triton X 100</td><td>VWR</td><td>14530</td><td></td></tr><tr><td>Węglan dwuetylowopirokarbonianu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-5758</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw QIAamp viral RNA Mini Kit (250)</td><td>Qiagen</td><td>52906</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw QuantiTec Probe RT-PCR kit (200)</td><td>Qiagen</td><td>204443</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw Qiagen One Step RT-PCR Kit (200)</td><td>Qiagen</td><td>210212</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor RNazy 2000 jednostek</td><td>A. Biosystems</td><td>N808-0119</td><td>2000 jednostek/fiolka</td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek nieprzywierające i wolne od RNaz</td><td>Ambion</td><td>AM12450</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza UltraPure 1000</td><td>Invitrogen</td><td>16550-100</td><td></td></tr></tbody></table>

wykrywanie i genogrupowanie norowirusów z kału dzieci za pomocą jednoetapowej reakcji rt-pcr taqman

Detection and Genogrouping of Noroviruses from Children's Stools By Taqman One-step RT-PCR

Norowirusy (NoVs) są główną przyczyną sporadycznych ognisk ostrego zapalenia żołądkowo-jelitowego u ludzi w każdym wieku na całym świecie. Stanowią one istotną przyczynę hospitalizacji dzieci, wywierając wpływ na zdrowie publiczne podobny do rotawirusów. NoV są wirusami RNA o dużej różnorodności genetycznej, a nowe szczepy pojawiają się stale. Rozpoznaje się pięć genogrup, z czego GI i GII wraz z ich licznymi genotypami i podtypami są najważniejsze w kontekście zakażeń ludzkich. Niemniej jednak diagnostyka tych dwóch genotypów pozostaje problematyczna, co opóźnia rozpoznanie i leczenie. 1, 2, 3
W przypadku ekstrakcji RNA z próbek kału najczęściej stosowaną metodą jest wykorzystanie komercyjnego zestawu QIAmp Viral RNA firmy Qiagen. Metoda ta łączy właściwości wiążące membrany z żelu krzemionkowego, bufory kontrolujące aktywność RNaz i zapewniające optymalne wiązanie RNA z kolumną, a także szybkość wirowania w mikrocentryfudze. Jest to metoda prosta, szybka i niezawodna, realizowana w kilku krokach szczegółowo opisanych w instrukcji producenta.
 Norowirus jest drugim po rotawirusie najczęstszymy powodem występowania biegunki. Diagnostyka norowirusa powinna być dostępna we wszystkich badaniach nad patogenezą biegunki, a także podczas ognisk epidemicznych lub w indywidualnych przypadkach biegunki. Obecnie jednak diagnostyka norowirusa jest ograniczona do zaledwie kilku ośrodków ze względu na brak prostych metod diagnostycznych. Opóźnia to proces rozpoznania i leczenia 1, 2, 3. Dodatkowo, ze względu na koszty i regulacje dotyczące transportu żrących buforów w obrębie i pomiędzy krajami, stosowanie gotowych zestawów komercyjnych wiąże się z problemami logistycznymi. W związku z tym w niniejszym protokole opisujemy alternatywną, ekonomiczną metodę opracowaną wewnątrz laboratorium, opartą na pierwotnej metodzie Boom et al.4, która wykorzystuje właściwości wiązania kwasów nukleinowych przez cząsteczki krzemionki wraz z właściwościami antynukleazowymi tiocyjanianu guanydinium.
W celu detekcji i przypisania do genogrup (GI i GII) izolatów NoV z próbek kału opracowano kilka protokołów RT-PCR wykorzystujących różne cele. Panuje konsensus, że RT-PCR z wykorzystaniem chemii TaqMan byłby najlepszą techniką molekularną do diagnostyki, ponieważ łączy wysoką czułość, swoistość i powtarzalność z wysoką przepustowością i łatwością użycia. W niniejszej pracy opisujemy test celujący w region złącza ramki odczytu 1 (ORF1)-ORF2; jest to najbardziej konserwatywny region genomu NoV, a zatem najodpowiedniejszy do diagnostyki. Do dalszej analizy genetycznej szczegółowo opisano konwencjonalny RT-PCR celujący w wysoce zmienny N-końcowy fragment białek kapsydu (Region C) z wykorzystaniem starterów pierwotnie opisanych przez Kojimę et al. 5. Sekwencjonowanie produktu PCR z konwencjonalnego PCR umożliwia rozróżnienie genotypów należących do genogrup GI i GII.

Opisano jednokrokowy test RT-PCR do detekcji i identyfikacji genogrup izolatów norowirusa z kałków dziecięcych, wykorzystujący primery i sondy TaqMan specyficzne dla regionu złącza otwartej ramki odczytu 1 (ORF1)-ORF2, który jest najbardziej konserwatywnym regionem genomu norowirusa. Szczegółowo przedstawiono niekomercyjną, kosztowo efektywną metodę ekstrakcji RNA.

Wykrywanie i genogrupowanie norowirusów z kału dzieci za pomocą jednoetapowej reakcji RT-PCR TaqMan

Norowirusy (NoVs) są główną przyczyną sporadycznych wybuchów ostrego gastroenteritis u ludzi w każdym wieku na całym świecie. Stanowią one istotną przyczynę...

Wykrywanie neurowirusa w wyekstrahowanym RNA za pomocą jednokrokowego R-T-P-C-R w czasie rzeczywistym z zastosowaniem specyficznych sond TECHMAN. Dzisiaj porozmawiamy o neurowirusie. Jest to zespół z Limy w Peru, składający się z przedstawicieli uniwersytetu oraz Uniwersytetu Johna Hopkinsa.Okazuje się, że norowirusy są prawdopodobnie jedną z najbardziej pomijanych przyczyn biegunek. Nasza grupa badawcza ustaliła, że norowirusy zajmują drugie miejsce po koronawirusach pod względem liczby hospitalizacji dzieci z powodu biegunki, a także pod względem liczby zachorowań w populacji. Dlaczego zatem NOROWIRUSY nie były wcześniej diagnozowane?Powodem jest fakt, że jest to wirus RNA, którego nie można hodować, dlatego do diagnostyki wymagane są specjalistyczne metody biologii molekularnej. Metodami tymi są RT-PCR; niniejszy materiał zademonstruje, jak wykorzystać RT-PCR do diagnostyki norowirusów. Wewnętrzna metoda Ciag GUINE (boom et al. 1989): do ekstrakcji viralnego RNA z próbek kału zastosowano wewnętrzną metodę G guine ATE.Ta metoda stanowi alternatywę dla komercyjnego zestawu do izolacji viralnego RNA ca amp. Obie metody opierają się na właściwościach wiązania kwasów nukleinowych przez cząsteczki krzemionki. W połączeniu z właściwościami antynukleazowymi G Guad Dium Bio NA, przygotowanie zawiesiny krzemionki do ekstrakcji RNA.Aby przygotować cząsteczki krzemionki, odważyć 30 gramów dwutlenku krzemu, dodać 250 mililitrów wody zdemineralizowanej i zawiesić krzem poprzez wstrząsanie. Po 24 godzinach sedymentacji usunąć 215 mililitrów nadkładu, dodać poprzez ssanie 250 mililitrów wody zdemineralizowanej i ponownie zawiesić krzem poprzez wstrząsanie. Po kolejnych 24 godzinach usunąć nadkład poprzez ssanie i dostosować pH zawiesiny krzemionki do pH 2.0 przy użyciu kwasu solnego, a następnie przelać zawiesinę krzemionki do szklanych butelek i poddać autoklawowaniu w celu ekstrakcji z g guin i krzemionki.Przejdziemy teraz do ekstrakcji viralnego RNA przy użyciu cząsteczek krzemionki przygotowanych w poprzednim kroku. Przechowywać w temperaturze -70 °C do momentu użycia. Aby przygotować 10% zawiesinę fekalną, należy pobrać około 0,1 g kału i uzupełnić do jednego mililitra PBS przed ekstrakcją.Próbki z niższą zawartością materiału należy wymieszać w wstrząsarce wirowej przez pięć sekund, a następnie odwirować przy 4 000 RPM przez 10 minut. W każdej reakcji należy zastosować próbkę kału dodatnią pod kątem neurowirusów jako kontrolę dodatnią oraz wodę potraktowaną DEPC w probówce do mikrowirówki. Wymieszać następujące składniki: 1 ml buforu L6, 20 µL przygotowanych cząsteczek krzemionkowych oraz 200 µL ekstraktu kałowego.Krótko wymieszaj na wirówce typu vortex i pozostaw próbki w temperaturze pokojowej na 15 minut. Centryfuguj przez 15 sekund. Następnie przemyj osad dwukrotnie buforem L two, potem dwukrotnie 70% ethanol oraz raz buforem acid on.Osad wysuszyć w suchym bloku grzejnym w temperaturze 56 °C przez pięć minut. Nawodnić RNA w osadzie krzemionkowym, dodając 50 µL wolnej od RNA wody destylowanej. Dodać 1 µL RNA sin, wymieszać w vortexie i pozostawić w temperaturze 56 °C przez 15 minut.Wiruj przez trzy minuty z maksymalną prędkością i pobierz supernatant zawierający RNA. Skwantyfikuj próbki metodą nanodrop i przechowuj wyekstrahowane RNA w temperaturze -70°C. Do ekstrakcji wirusowego RNA użyj zestawu komercyjnego.W tej części zaprezentujemy ekstrakcję RNA z kałozie przy użyciu dostępnego komercyjnie zestawu kay amp viral RNA. Zestaw zawiera następujące elementy: kolumny z żelem krzemionkowym MinPin, bufor A-V-L, bufor A-W1, bufor A-W2, bufor A-VE oraz RNA nośnikowe. W skrócie procedura przebiega następująco.Wymieszaj część buforu A VL z nośnikowym RNA i wymieszaj na wortexie. Przenieś roztwór do probótek o pojemności 1,5 ml, dodając 114 µL zawiesiny kałowej, i wymieszaj poprzez krótkie mieszanie w wortexie. Inkubuj w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Przecentryfuguj próbki (krótkie wirowanie).Dodaj etanol do próbek i mieszaj poprzez wytrząsanie przez 15 sekund. Następnie krótko odwiruj i przenieś roztwór do kolumny wirówki w probówce zbiorczej o pojemności 2 mL. Odwiruj.Następnie umieść kolumnę wirówkową w nowej probówce zbiorczej. Przemyj kolumnę z wywiązanym RNA, używając buforu A W bez dodatku nośnika RNA, a następnie odwiruj. Umieść kolumnę w czystej probówce zbiorczej o pojemności dwóch mililitrów i przemyj kolumnę buforem.Próbkę wirować w wirówce W2 z maksymalną prędkością; umieścić kolumnę w czystej probówce do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mililitra i wirować z maksymalną prędkością. Następnie wyodrębnić RNA za pomocą buforu a VE; przechowywać viral RNA w temperaturze minus 70 stopni Celsjusza do momentu użycia. Detekcję neurowirusa w wyekstrahowanym RNA przeprowadzić za pomocą jednokrokowego real-time PCR z zastosowaniem specyficznych sond TaqMan. Aby przygotować master mix dla genogrupy 1 i genogrupy 2, przechowywać mieszaninę enzymu RT w lodzie podczas analizy. Zestaw zawiera następujące komponenty: wodę PCO, master mix, 2x primery oraz sondy dla Dina.Startery i sonda grupy pierwszej dla Dina Grupy drugiej. I na koniec, mieszanka enzymu RT, odwiruj reagent przed użyciem, do PCR woda, master mix 2X, startery COG G1 forward i reverse oraz sondy ring 1A i 1B dla UniGroup. Master mix grupy pierwszej i startery COG G2 for VA reverse oraz sonda.Wymieszaj drugą probówkę dla grupy Theo (master mix). Na koniec dodaj enzym artix do obu mieszanin master mix dla grup INO. Wymieszaj na wirówce (vortex) i nalić 10 µL odpowiedniego master mixu do studzienek reakcyjnych.Do kolejnego zestawu dodaj pięć mikrolitrów nierozcieńczonego RNA, pięć mikrolitrów pozytywnych kontrol RNA G1 i G2 oraz pięć mikrolitrów kontroli negatywnej do odpowiednich kół reakcyjnych. Wirować przez 10 sekund przy 6 000 g. Oprogramowanie w kroku pierwszym wyświetla ustawienia zaawansowane.W ekranie właściwości eksperymentu eksperyment jest zidentyfikowany jako norowirus. Typ eksperymentu w ekranie celu to obecność lub brak. Wprowadź nazwę celu, który chcesz wykryć w płytce reakcyjnej PCR.Gina, grupy pierwszej i drugiej reportera fam oraz gaśnika Tamara na ekranie próbek i powtórzeń. Wprowadź liczbę próbek oraz kontroli dodatnich i ujemnych zawartych na płytce reakcyjnej, a następnie wybierz, które próbki lub kierunek celu należy ustawić w metodzie uruchamiania. W pierwszej kolejności przeprowadź odwrotną transkrypcję w temperaturze 50 °C w celu syntezy komplementarnego DNA.Następnie podnieś temperaturę do 95 °C, aby aktywować polimerazę hot-start. Rozpocznij cykle od inkubacji w 95 °C, po której następuje połączony etap przyłączania starterów i amplifikacji w 60 °C. Powtórz cykl od czterech do pięciu razy, a następnie wróć do konfiguracji płytki.Kliknij zapisz szablon i zapisz eksperyment. Kliknij start run. Ekran wykresu amplifikacji pozwala na podgląd amplifikacji próbek w miarę gdy urządzenie gromadzi dane w czasie rzeczywistym podczas przebiegu, a także na analizę kontrastu wykresu.Znormalizowana fluorescencja i numer cyklu. W początkowych cyklach PCR zmiana sygnału fluorescencyjnego jest niewielka. Wyznacza to linię bazową.Wzrost fluorescencji powyżej linii bazowej wskazuje na wykrycie nagromadzonego celu. Powyżej linii bazowej należy ustawić stały próg fluorescencji. Parametr CT (cykl progowy) definiuje się jako ułamkową liczbę cykli, przy której fluorescencja przekracza ustalony próg.Ekran wykresu amplifikacji jest przydatny do identyfikacji i badania nieprawidłowej amplifikacji, takiej jak zwiększona fluorescencja w studzienkach kontroli negatywnej oraz brak wykrywalnej fluorescencji w oczekiwanym cyklu. Metoda z zestawu jest niezawodna, jednak wymaga ogromnej ilości czasu i zasobów. Przedstawiliśmy tutaj równie niezawodną metodę, która jest kosztowo efektywna i wykorzystuje łatwo dostępne w kraju odczynniki, co pozwala uniknąć zależności od materiałów kupowanych za granicą; wszystko to ostatecznie doprowadzi do bardziej dostępnej diagnostyki i szybkiego leczenia najczęstszych wirusowych przyczyn gastroenteritis u dzieci, stosując ekonomiczną metodę wewnętrzną izolacji kwasów nukleinowych, która pozwoliła uzyskać podobne wyniki.Uzyskane za pomocą komercyjnego zestawu firmy Kerogen, wraz z TAC MAN, R-T-P-C-R, który został opracowany w naszym laboratorium. Możemy wykryć szeroki zakres infekcji neurowirusowych. Test okazał się użyteczny w rutynowej diagnostyce, ponieważ eliminuje obróbkę produktów po amplifikacji, skracając tym samym czas trwania analizy.Poza diagnostyką, protokół ten może być również wykorzystany do wyjaśnienia epidemiologii infekcji neurowirusami, co czyni go przydatnym w ramach kontroli zdrowia publicznego w odniesieniu do tej choroby.

detection-genogrouping-noroviruses-from-children-s-stools-taqman-one

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Wykrywanie i Genogrupowanie Norowirusów z Kału Dzieci Metodą Taqman One-step RT-PCR

Metoda EPA 1615 wykorzystuje filtr elektrododatni do koncentracji enterowirusów i norowirusów w środowisku i wodach pitnych. Niniejszy manuskrypt opisuje procedurę pobierania próbek do analiz metodą 1615.

Metoda EPA 1615. Pomiar występowania enterowirusów i norowirusów w wodzie za pomocą hodowli i RT-qPCR. I. Pobieranie próbek wirusów

Tutaj prezentujemy procedurę pomiaru całkowitej liczby wirusów zdolnych do hodowli za pomocą linii komórkowej nerki Buffalo Green Monkey. Procedura zapewnia ustandaryzowane narzędzie do pomiaru występowania zakaźnych wirusów w środowisku i wodach pitnych.

Metoda EPA 1615. Pomiar występowania enterowirusów i norowirusów w wodzie za pomocą hodowli i RT-qPCR. II. Całkowity test na obecność wirusa hodowlanego

Tutaj prezentujemy procedurę ilościowego oznaczania enterowirusa i norowirusa w wodach środowiskowych i pitnych za pomocą odwrotnej transkrypcji ilościowej PCR. Średni odzysk wirusa z wód gruntowych przy użyciu tej znormalizowanej procedury z metody EPA 1615 wynosił 20% dla wirusa polio i 30% dla mysiego norowirusa.

Metoda EPA 1615. Pomiar występowania enterowirusów i norowirusów w wodzie za pomocą hodowli i RT-qPCR. Część III. Wykrywanie wirusów za pomocą RT-qPCR

Metodologia pobierania próbek oparta na makropianie została opracowana i oceniona pod kątem wykrywania i kwantyfikacji norowirusa na twardych powierzchniach środowiskowych.

Metoda pobierania wymazów w celu wykrycia ludzkiego norowirusa na powierzchniach

Rutynowe metody wykrywania wykorzystujące amplifikację genomu wirusa są ograniczone przez ich niezdolność do odróżnienia cząsteczek zakaźnych od niezakaźnych. Celem tego artykułu jest przedstawienie szczegółowych protokołów alternatywnych metod wspomagających dyskryminację zakaźnych cząstek norowirusa za pomocą wiązania aptamerów, dynamicznego rozpraszania światła i transmisyjnej mikroskopii elektronowej.

Alternatywne metody in vitro do oznaczania integralności strukturalnej kapsydu wirusa

Ilościowa analiza łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym w połączeniu z odwrotną transkrypcją (RT-qPCR) jest szeroko stosowana do pomiaru poziomu infekcji wirusem RNA. W tym miejscu przedstawiamy bezpośredni test RT-qPCR, który nie wymaga etapu oczyszczania RNA, opracowany do oznaczania ilościowego kilku wirusów RNA, w tym wirusa dengi.

Pomiar RNA wirusa dengi w supernatancie hodowli zakażonych komórek za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym

Ten protokół diagnozuje wirusa Tilapia Lake (TiLV) w tkankach tilapii za pomocą metodologii RT-PCR. Cała metoda jest opisana od rozwarstwienia tkanek do całkowitej ekstrakcji RNA, a następnie syntezy cDNA i wykrywania TiLV za pomocą konwencjonalnego PCR lub ilościowego PCR przy użyciu dsDNA wiążącego fluorescencyjny barwnik wiążący.

Wykrywanie wirusa Tilapia Lake za pomocą konwencjonalnego RT-PCR i SYBR Green RT-qPCR

Tutaj prezentujemy dwa protokoły, jeden do pomiaru specyficznego tempa wzrostu, a drugi do zdolności wiązania komórek rotawirusa za pomocą testu płytki nazębnej i RT-qPCR. Protokoły te są dostępne w celu potwierdzenia różnic w fenotypach między szczepami rotawirusa.

Testy specyficznej szybkości wzrostu i zdolności wiązania komórkowego rotawirusa

Protokół wykorzystuje nieinwazyjne pobieranie próbek kału w połączeniu z ilościową reakcją łańcuchową polimerazy, aby zaoferować wygodną i szybką metodę diagnostyczną infekcji Helicobacter pylori i jej odporności na klarytromycynę i chinolony.

Wykrywanie zakażenia Helicobacter pylori i oporności na antybiotyki za pomocą ilościowej analizy reakcji łańcuchowej polimerazy w stolcu

Ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym (qPCR) jest szybką i czułą metodą badania poziomów ekspresji różnych cząsteczek mikroRNA (miRNA) w próbkach nowotworowych. Zastosowanie tej metody pozwala na amplifikację, kwantyfikację i analizę ekspresji setek różnych cząsteczek miRNA z tej samej matrycy cDNA.

Wykrywanie mikroRNA w guzach prostaty za pomocą ilościowej reakcji PCR w czasie rzeczywistym (qPCR)

Poznaj metodę jednoetapowego RT-PCR TaqMan do wykrywania i genogrupowania norowirusów z kału dzieci. Ta technika poprawia diagnostykę wirusowego zakażenia przewodu pokarmowego w pediatrii.

Wykrywanie i genogrupowanie norowirusów z kału dzieci za pomocą jednoetapowej reakcji RT-PCR TaqMan

Przeglądaj więcej filmów