Podłużna ocena utraty masy kostnej kończyn tylnych myszy po urazie rdzenia kręgowego z wykorzystaniem nowej metodologii in vivo
7 grudnia 2011
Przeprowadzono podłużne badanie ubytku kostnego w kościach udowych i piszczelowych u dorosłych myszy po urazie rdzenia kręgowego, wykorzystując sekwencyjne skanowanie rentgenowskie w niskiej dawce. Ubytek kostny w kości piszczelowej stwierdzono w trakcie całego badania, natomiast ubytek kostny w kości udowej wykryto dopiero 40 dni po urazie.
Niniejsza procedura prezentuje nową metodę stosowaną do wykrywania i ilościowego określania zależnej od czasu utraty gęstości kości kończyn tylnych u myszy po urazie rdzenia kręgowego. Jest to realizowane poprzez wykonanie w pierwszej kolejności przecięcia rdzenia kręgowego u znieczulonej myszy w warunkach sterylnych i zatwierdzonych przez komisję ALAC. Następnie, po okresie rekonwalescencji, zwierzę zostaje ponownie znieczulone i wykonuje się obrazy rentgenowskie kości piszczelowej i strzałkowej obu prawych i lewych kończyn tylnych.
Procedurę tę wykonuje się co tydzień, aż do 40 dni po urazie. Następnie przeprowadzana jest analiza obrazów z prześwietleń rentgenowskich. Ostatnim etapem jest ocena gęstości kości w badaniu pośmiertnym na wyciętych kościach kończyn tylnych.
Ostatecznie wyniki pokazują, w jaki sposób uraz rdzenia kręgowego indukuje szybką i postępującą utratę gęstości kości w kończynach tylnych myszy. Ta nowatorska metoda zapewnia wysoką rozdzielczość przestrzenną i czasową, wykorzystując niższe dawki promieni rentgenowskich niż te stosowane w innych technikach obrazowania. Osteoporoza jest stanem zagrażającym życiu, który dotyka osoby żyjące z urazem rdzenia kręgowego.
Proponujemy nową metodę do zastosowania w badaniach nad urazami rdzenia kręgowego u zwierząt, która umożliwia badaczowi długofalową obserwację utraty masy kostnej związanej z osteoporozą. Jest to istotne z dwóch powodów. Po pierwsze, pozwoli to na badanie mechanizmów kształtujących rozwój osteoporozy.
Po drugie, umożliwia nam ono testowanie nowych interwencji zaprojektowanych w celu zapobiegania lub potencjalnego odwrócenia rozwoju osteoporozy u pacjentów z urazami rdzenia kręgowego. Chociaż metoda ta może dostarczyć wiedzy na temat osteoporozy wywołanej urazem rdzenia kręgowego, może ona zostać zastosowana również do innych układów, takich jak utrata masy kostnej związana z wiekiem występująca u kobiet w okresie pomenopauzalnym, a także do innych redukcji gęstości kości wywołanych urazami; nieużywanie kończyn wynikające z unieruchomienia, po złamaniach lub innych uszkodzeniach może prowadzić do znacznej utraty masy kostnej w procesie gojenia. Zastosowanie podłużnego obrazowania całego organizmu za pomocą niskodawkowego promieniowania rentgenowskiego może otworzyć nowe drogi w opracowywaniu terapii mających na celu zminimalizowanie lub zapobieganie tym problemom.
Przeprowadzić operację uszkodzenia rdzenia kręgowego zgodnie z procedurami sandera oraz zgodnie z lokalnymi wytycznymi instytucjonalnej komisji ds. opieki i użytkowania zwierząt. Następnie, zaczynając od 10. dnia po operacji rdzenia kręgowego i kontynuując w odstępach 10-dniowych aż do 40. dnia, ocenić prawe i lewe kości udowe oraz piszczelowe żywych, znieczulonych zwierząt z przzecięciem rdzenia kręgowego oraz nieuszkodzonych kontroli w tym samym wieku, wykonując skanowanie za pomocą systemu ivus Lumina XR. Przed rozpoczęciem skanowania zainicjować urządzenie Lumina XR, aby umożliwić wewnętrznej kamerze osiągnięcie temperatury roboczej wynoszącej minus 90 stopni Celsius.
Umieść znieczulone zwierzę na platformie wewnątrz urządzenia Lumina xr. Następnie zainstaluj obiektyw o dużym powiększeniu, aby umożliwić ustawienie ostrości zarówno na obszarze kości udowej, jak i piszczelowej. Sprawdź, czy badany obiekt jest prawidłowo ustawiony w polu widzenia.
W razie potrzeby należy otworzyć drzwiczki i zmienić pozycję zwierzęcia. Prawidłowe ustawienie zwierzęcia przedstawiono tutaj. Po właściwym wypozycjonowaniu można wykonać funkcję rentgenowską.
Wybierz z rozwijanej listy energii wartość odpowiednią dla zwierzęcia. Następnie otwórz panel sterowania. Włącz funkcję promieni rentgenowskich, zaznaczając pole x-ray, a następnie wykonaj zdjęcie rentgenowskie.
Cały kość udowa oraz kość piszczelowa powinny być widoczne, tak jak pokazano tutaj. Ponieważ oprogramowanie do obrazowania na żywo domyślnie wyświetla przetworzone obrazy rentgenowskie, należy upewnić się, że wyświetlane są surowe obrazy rentgenowskie, wchodząc do menu narzędzi filtrowania korekcji i odznaczając opcję absorpcji promieni rentgenowskich. Surowe dane obrazu są automatycznie zapisywane na dysku twardym.
Zapisywane są również reprezentatywne pliki TIFF. Po obrazowaniu mysz jest wracana do swojej klatki domowej, gdzie może dojść do regeneracji pod obserwacją badacza. Następnie proces powtarza się dla kolejnej myszy.
W pierwszej kolejności otwórz oprogramowanie, klikając dwukrotnie ikonę obrazu żywego w pojawiły się oknie dialogowym. Wybierz interesujący Cię folder i kliknij OK. Wczytaj obraz rentgenowski, klikając przycisk Przeglądaj.
Przeglądarka obrazów na żywo wyświetla wybrane dane wraz z identyfikatorem użytkownika. Informacje o etykietach oraz konfiguracji kamery. Aby otworzyć dane, należy dwukrotnie kliknąć wiersz danych. Wyświetlony zostanie obraz oraz paleta narzędzi.
Otwarte dane są podświetlone na niebiesko w przeglądarce. Następnie kliknij narzędzia ROI. W palecie narzędzi w sekcji ROI tools otwórz rozwijaną listę typów i wybierz measurement ROI.
Aby załadować trzy obszary zainteresowania (ROI) wykorzystane w tym doświadczeniu, kliknij ikonę kwadratu i załaduj kwadraty. Używając linijki, zmierz długość kości udowej, a następnie dostosuj długość dwóch kwadratów tak, aby stanowiły jedną ósmą całkowitej długości kości udowej. Dostosuj szerokość kwadratów tak, aby stanowiły jedną dwudziestą czwartą całkowitej długości kości udowej.
Teraz za pomocą linijki zmierz jedną ósmą odległości od proksymalnego końca kości udowej i umieść jeden prostokąt tak, aby był wycentrowany w tej pozycji. Przesuń drugi prostokąt do dystalnego końca kości udowej i ustaw go tak, aby znajdował się centralnie w obrębie regionu beleczkowego kolana. Następnie zmierz długość kości piszczelowej.
Dostosuj długość ramki do jednej ósmej całkowitej długości piszczeli. Dostosuj szerokość do jednej trzydziestej całkowitej długości piszczeli. Na koniec umieść ramkę w taki sposób, aby była wycentrowana i znajdowała się w odległości jednej ósmej całkowitej długości piszczeli od proksymalnego końca piszczeli, jak pokazano tutaj.
Następnie należy kliknąć ikonę pomiaru; na obrazie rentgenowskim pojawią się pomiary intensywności ROI, a także pojawi się tabela pomiarów ROI. Wyeksportuj tę tabelę do wybranej lokalizacji jako plik dot CSV. Pozwoli to na otwarcie tabeli za pomocą programu Excel.
Powtórz ten krok dla wszystkich zapisanych obrazów przeznaczonych do analizy. Na koniec skonsoliduj wszystkie dane w jednym arkuszu programu Excel. Istotność statystyczną określa się za pomocą testu t-Studenta, wykorzystując oprogramowanie takie jak Microsoft Excel lub Sigma Plot 11.0; jeśli jest to pożądane, wyniki można porównać z wynikami uzyskanymi z analizy gęstości kości po śmierci za pomocą dwuenergetycznej absorpcyjnej densytometrii rentgenowskiej (DXA), stosując standardowe protokoły dla tej metody.
Względną utratę gęstości kości piszczelowej i udowej u myszy po urazie rdzenia kręgowego w porównaniu z myszami naiwnymi można wykryć za pomocą opisanej powyżej metody. Rysunek ten przedstawia utratę gęstości kości w bliższej części piszczeli 10, 20, 30 i 40 dni po urazie. W porównaniu z grupą kontrolną w tym samym wieku, po zaledwie 10 dniach następuje istotny 12% spadek gęstości kości piszczelowej, a po 40 dniach utrata gęstości kości sięga 15%.
Tutaj widzimy utratę gęstości kości w bliższej części kości udowej po urazie rdzenia kręgowego, 10, 20, 30 i 40 dni po urazie. W porównaniu z grupą kontrolną w tym samym wieku, 40 dni po urazie zaobserwowano 7% spadek gęstości kości w bliższej części kości udowej. Ten wykres przedstawia utratę gęstości kości w dalszej części kości udowej 10, 20, 30 i 40 dni po urazie rdzenia kręgowego.
W porównaniu z grupą kontrolną naiwną w tym samym wieku, utrata gęstości kości w dystalnej części kości udowej była obserwowalna już 10 dni po urazie i utrzymywała się przez resztę eksperymentu. Ten reprezentatywny obraz danych z geometrii absorpcyjnej rentgenowskiej o podwójnej energii (DXA) przedstawia wyniki zawartości minerałów kostnych oraz gęstości mineralnej kości. Wycięte kości udowe przeanalizowano 40 dni po urazie rdzenia kręgowego.
Aby porównać skuteczność metody przedstawionej w niniejszym protokole z innymi obecnie dostępnymi metodami, na tym rysunku przedstawiono analizę geometrii dual-energy X-ray absorptiometry (DXA) zawartości minerałów kostnych w gramach w kości udowej myszy z urazem rdzenia kręgowego 40 dni po operacji w porównaniu z grupą naiwną w tym samym wieku. Zaobserwowano istotną utratę zawartości minerałów kostnych o 12% u myszy z urazem rdzenia kręgowego w porównaniu z grupą naiwną.
Tutaj widzimy analizę gęstości mineralnej kości w miligramach na centymetr kwadratowy w kości udowej myszy z urazem rdzenia kręgowego 40 dni po urazie w porównaniu z dopasowanymi pod względem wieku myszami naiwnymi, wykonaną za pomocą analizy geometrycznej DXA (dual-energy X-ray absorptiometry). Utrata gęstości mineralnej kości nie zmieniła się znacząco, ale wykazała trend podobny do zawartości mineralnej kości. Po opanowaniu tej techniki, badanie można przeprowadzić w 20 do 30 minut, jednak należy pamiętać, że kluczowe jest prawidłowe ułożenie kończyn tylnych.
Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo wiedzieć, jak przeprowadzić podłużną ocenę gęstości kości u żywych zwierząt po urazie rdzenia kręgowego przy użyciu urządzenia Caliper Instruments Lumina XR.
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia nową metodę wykrywania i ilościowego określania utraty gęstości kości w kończynach tylnych myszy po urazie rdzenia kręgowego. Wykorzystując obrazowanie niskodawkowym promieniowaniem rentgenowskim, badacze mogą monitorować zmiany w czasie, co ujawniło znaczną utratę masy kostnej w kościach piszczelowych oraz opóźnioną utratę w kościach udowych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- neuronauka
- zdrowie kości
- techniki obrazowania
Wstęp
- Uraz rdzenia kręgowego często prowadzi do osteoporozy.
- Utrata gęstości kości może znacząco wpływać na powrót do zdrowia i jakość życia.
- Obecne metody obrazowania mogą nie zapewniać wystarczającej rozdzielczości czasowej.
- Obrazowanie rentgenowskie niskiej dawki stanowi obiecującą alternatywę.
Cel badania
- Opracowanie metody podłużnej oceny utraty gęstości kości po urazie rdzenia kręgowego.
- Zrozumienie mechanizmów osteoporozy w modelach urazu rdzenia kręgowego.
- Ocena potencjalnych interwencji zapobiegających utracie masy kostnej.
Zastosowane metody
- Wykonanie przerwania rdzenia kręgowego u znieczulonych myszy.
- Cotygodniowe obrazowanie rentgenowskie kości kończyn tylnych przez 40 dni.
- Analiza obrazów w celu ilościowego określenia zmian gęstości kości.
- Ocena pośmiertna wyciętych kości w celu walidacji.
Główne wyniki
- Wykryto znaczną utratę masy kostnej w kościach piszczelowych w trakcie całego badania.
- Utratę masy kostnej w kościach udowych zaobserwowano począwszy od 40. dnia po urazie.
- Metoda ta umożliwia szczegółowe monitorowanie zmian gęstości kości.
- Potencjalne zastosowania obejmują inne schorzenia wpływające na gęstość kości.
Wnioski
- Ta nowatorska metoda obrazowania dostarcza wiedzy na temat osteoporozy indukowanej urazem rdzenia kręgowego.
- Umożliwia ona badaczom analizę postępu ubytku kostnego w czasie.
- W przyszłych badaniach podejście to może zostać wykorzystane do testowania nowych interwencji terapeutycznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Podłużna ocena utraty gęstości kości w modelach przedklinicznych umożliwia mechanistyczną redukcję ryzyka w opracowywaniu terapeutyków przeciwosteoporotycznych. Metoda ta wspiera walidację celu poprzez kwantyfikację zmian gęstości kości kończyn tylnych zależnych od czasu po urazie rdzenia kręgowego. Zapewnia ona wiarygodność prognostyczną przy ocenie interwencji mających na celu zapobieganie utracie kości lub jej odwrócenie u populacji unieruchomionych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wstępne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych dotyczących mechanizmów utraty gęstości kości po SCI.
- Wartość operacyjna: Wspiera walidację funkcjonalną celów terapeutycznych poprzez mierzalne, podłużne pomiary BMD i BMC.
- Wartość prognostyczna: Ułatwia selekcję projektów z portfolio poprzez identyfikację celów o mierzalnym wpływie na zachowanie tkanki kostnej.
Przesiewy i opracowanie testu
- Gotowość testu: Przygotowanie zwalidowanych systemów biologicznych do przesiewania związków z wykorzystaniem powtarzalnego obrazowania rentgenowskiego o niskiej dawce.
- Wyniki ilościowe: Generowanie standaryzowanych odczytów BMD i BMC, umożliwiających wiarygodną ocenę związków w różnych punktach czasowych.
- Ponowne wykorzystanie platformy: Skalowalne możliwości obrazowania podłużnego, możliwe do zastosowania w wielu modelach utraty masy kostnej.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla choroby: Modeluje osteoporozę indukowaną przez SCI z translacyjną zgodnością z utratą masy kostnej poniżej miejsca uszkodzenia u ludzi.
- Ciągłość przedkliniczna: Łączy etap odkryć z walidacją przedkliniczną poprzez seryjne monitorowanie gęstości kości in vivo.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Dostarcza informacji do decyzji typu go/no-go w oparciu o podłużne trajektorie utraty masy kostnej oraz skuteczność interwencji.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w proces badawczy, od walidacji celu po ewaluację przedkliniczną, umożliwiając wielokrotną ocenę zmian gęstości kości in vivo w czasie.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków poprzez ilościowe określanie postępu utraty masy kostnej w kościach piszczelowych i udowych po SCI.
- Przesiew: Zapewnia powtarzalność analizy i czułość ilościową w wykrywaniu wczesnych (kość piszczelowa, dzień 10.) i opóźnionych (kość udowa, dzień 40.) fenotypów utraty masy kostnej.
- Analityka: Dostarcza pomiary intensywności w oparciu o ROI oraz dane możliwe do eksportu do formatu CSV w celu porównania statystycznego za pomocą testów t.
- Badania translacyjne: Łączy z walidacją przedkliniczną poprzez pośmiertne potwierdzenie DXA utraty BMC wyznaczonej za pomocą IVIS Lumina XR (12% w 40. dniu).
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Służy jako wielokrotnego użytku platforma obrazowania podłużnego dla modeli osteoporozy, zaniku z nieużywania oraz utraty masy kostnej związanej z wiekiem.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zapewnia pewność predykcyjną w walidacji celu poprzez mechanistycznie istotne dane dotyczące utraty gęstości kości w czasie.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzację, powtarzalność oraz obrazowanie podłużne przy niskiej dawce w obrębie kohort.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go poprzez redukcję niepewności biologicznej w odczytach skuteczności działania na kości.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację związków z uwzględnieniem ryzyka na podstawie profilów długofalowego zachowania kości.
Kwestie wdrożeniowe
- Wymaga doświadczenia w obchodzeniu się z gryzoniami, przeprowadzaniu operacji urazów rdzenia kręgowego oraz obrazowaniu żywych zwierząt.
- Zależne od instrumentarium IVIS Lumina XR z możliwością wykorzystania niskoenergetycznego promieniowania rentgenowskiego oraz oprogramowania do analizy ROI.
- Wymaga międzyzespołowej standaryzacji protokołów obrazowania, schematów znieczulenia i definicji ROI dla obszarów kostnych.
- Wiąże się z koniecznością dostosowania metody do różnych obszarów kostnych (kość piszczelowa vs. kość udowa) oraz modeli urazów innych niż SCI.
- Ograniczone przez konieczność walidacji pośmiertnej oraz potencjalną zmienność w pozycjonowaniu zwierząt i ich rekonwalescencji.
