Protokoły przygotowania próbek, obrazowania i analizy dla mikroskopii skanującej krawędzią noża
9 grudnia 2011
Opisano pełny proces, od przygotowania preparatu mózgu, przez obrazowanie seryjnych przekrojów z wykorzystaniem mikroskopu skanującego o ostrzu noża (Knife-Edge Scanning Microscope), aż po wizualizację i analizę danych. Technika ta jest obecnie wykorzystywana do pozyskiwania danych z mózgów myszy, jednak znajduje zastosowanie również w przypadku innych organów i gatunków.
Ogólnym celem niniejszej procedury jest zademonstrowanie przygotowania preparatów biologicznych do skrawania i obrazowania za pomocą skaningowego mikroskopu ostrzem noża (KESM) oraz wizualizacji wynikowego stosu danych obrazowych. Jest to realizowane poprzez uprzednią fiksację, barwienie i zatopienie tkanki w celu przygotowania jej do obrazowania w KESM. Drugim krokiem procedury jest konfiguracja KESM oraz przeprowadzenie skrawania i obrazowania z wykorzystaniem automatycznego oprogramowania sterującego.
Otrzymane obrazy poddawane są następnie odszumianiu, rejestracji i przycinaniu. Ostatnim krokiem jest wczytanie i analiza zestawów danych w internetowym atlasie oraz oprogramowaniu do wizualizacji 3D. W efekcie możliwe jest uzyskanie wyników obrazujących organizację neuronalną i naczyniową całego mózgu w rozdzielczości submikrometrowej.
Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami mezoskopowymi, takimi jak seryjna blokowa skaningowa mikroskopia elektronowa, jest możliwość obrazowania znacznie większych objętości, choć przy niższej rozdzielczości. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie konektomiki oraz neuronauki w ogóle. Pozwala ona uzyskać wgląd w organizację strukturalną mózgu, a może być również zastosowana do innych układów narządowych, takich jak płuca i nerki.
Aby rozpocząć tę procedurę, wypreparowany mózg myszy umieszcza się w szklanym słoiku zawierającym roztwór Golgi-Cox. Słoik należy umieścić w ciemnym pudełku w temperaturze pokojowej na okres od 10 do 16 tygodni. Oddzielny etap utrwalania nie jest konieczny, ponieważ roztwór Golgi-Cox pełni funkcję utrwalacza.
Po 10 do 16 tygodni, następnego dnia wypłukać mózg w wodzie dejonizowanej przez noc w ciemności, następnie zanurzyć wypłukany mózg w 5% roztworze wodorotlenku amonu w wodzie dejonizowanej na siedem do 10 dni w ciemności w temperaturze pokojowej. Po siedmiu do 10 dniach ponownie wypłukać mózg w wodzie dejonizowanej w temperaturze pokojowej przez cztery godziny. Następnie odwodnić mózg w szeregu roztworów etanolu o rosnącym stężeniu, pozostawiając go w każdym roztworze na 24 godziny: 50% etanolu i 70% etanolu w temperaturze czterech stopni Celsjusza oraz 85% etanolu.
Trzykrotna wymiana na 95% etanol oraz od czterech do pięciu wymian na 100% etanol w temperaturze pokojowej. Następnie odwodniony mózg umieszcza się w acetonie, wykonując od trzech do czterech wymian, z których każda trwa jeden dzień. Po tym etapie mózg pozostawia się na noc w lodówce w kolejnych mieszaninach agarozu i acetonu o stosunkach agaroz do acetonu wynoszących odpowiednio 1:2, 1:1 oraz 2:1.
Na koniec umieść mózg w 100%aite w lodówce, wykonując trzy wymiany roztworu, każda z nich w ciągu nocy. Następnie poddany obróbce mózg zostaje zatopiony w 100%aite i ogrzewany w temperaturze 60 °C przez trzy dni. Na koniec utwardzony blok próbki zostaje zamocowany na metalowym pierścieniu do próbek przy użyciu żywicy epoksydowej, a boki bloku zostają przycięte w razie potrzeby, aby rozpocząć tę procedurę.
Upewnij się, że mysz znajduje się w głębokiej narkozie i nie reaguje na uciśnięcie palca u nogi. Następnie przeprowadź perfuzję przezsercową myszy, używając soli fizjologicznej w temperaturze pokojowej, a następnie zimnej 4% paraformaldehydy w buforze fosforanowym. W dalszej kolejności przepłucz mysz roztworem 0,1% thiokolu i barwnika w wodzie dejonizowanej.
Następnie umieść ciało w lodówce w temperaturze 4°C na 24 godziny. Po upływie 24 godzin wyjmij mózg z naczynia i umieść go w świeżym roztworze 0,1% tioniny. Pozostaw mózg w temperaturze 4°C przez siedem dni.
Po siedmiu dniach utrwalić i odwodnić mózg, stosując serię rozcieńczeń alkoholu etylowego. Przez okres sześciu tygodni: od trzech do pięciu dni w 50% etanolu, od siedmiu do 10 dni w 70% etanolu, około dwóch tygodni w każdym z roztworów 85% i 95% etanolu, a pozostały czas w 100% etanolu. Po trzech zmianach acetonu w temperaturze pokojowej, mózg zostaje zatopiony w tworzywie sztucznym w piecu o temperaturze 60°C.
Aby rozpocząć procedurę barwienia sieci naczyniowej tuszem indyjskim, należy potwierdzić brak odruchu wycofania palca, co świadczy o głębokiej anestezji myszy. Następnie należy przeprowadzić perfuzję transkordialną myszy, używając soli fizjologicznej w buforze fosforanowym o temperaturze pokojowej, a następnie 10% neutralnego buforowanego formaliny w temperaturze pokojowej. Perfuzja całego ciała solą fizjologiczną i utrwalaczem jest niezbędna do usunięcia krwi z układu sercowo-naczyniowego oraz utrwalenia tkanek.
Następnie należy przeprowadzić perfuzję myszy za pomocą 3,0 ccs nieutrzeźcionego tuszu indyjskiego do perfuzji. Zastosowanie tuszu indyjskiego jest niezbędne do całkowitego wypełnienia naczyń krwionośnych układu sercowo-naczyniowego. Po wyjęciu z organizmu myszy, uzyskany mózg jest odwadniany poprzez serię gradowanych alkoholi etylowych, a następnie zatapiany w plastiku erudite.
Postępując zgodnie z opisanym wcześniej protokołem przygotowania KESM do obrazowania, włącz kamerę, iluminator oraz stół, a następnie podnieś nóż i obiektyw. Następnie zainstaluj pierścień na próbkę. Na koniec opuść obiektyw i nóż.
Zmierz wymiary preparatu. Następnie utwórz plik konfiguracyjny dla kontrolera stolika KESM. Przed zainicjowaniem stolika należy podnieść nóż oraz obiektyw KESM.
Uruchom kontroler stołu KESM stage controller two i zainicjuj stół. Następnie opuść nóż oraz obiektyw i włącz pompę. Ustaw ostrość obiektywu i kamery, obracając pokrętło ostrzenia w układzie optycznym i dostosowując pole widzenia kamery względem krawędzi noża.
Klikaj krok po kroku, aby sprawdzić pierwsze etapy obrazowania i sekcjonowania. Następnie kliknij „go”, aby rozpocząć obrazowanie i sekcjonowanie w celu późniejszego przetwarzania obrazów.
Uruchom procesor stosu KESM, aby usunąć artefakty oświetlenia i znormalizować intensywność tła we wszystkich obrazach. Powtórz czynność dla wszystkich podfolderów z danymi. Aby zwizualizować dane za pomocą atlasu mózgu KESM, przejdź na tę stronę internetową i wybierz odpowiedni atlas, aby przejść do innej głębokości.
Wybierz z menu rozwijanego głębokość dla każdego kroku, a następnie kliknij plus, aby zwiększyć, lub minus, aby zmniejszyć głębokość Z. Inne opcje obejmują przybliżanie obrazu lub nawigację z wykorzystaniem atlasu mózgu KESM. Użyj menu rozwijanego, aby dostosować numer nakładki oraz interwał nakładki w celu wizualizacji danych za pomocą VIS lab.
Uruchom aplikację i utwórz nowy projekt. Projekt powinien zawierać funkcję składania obrazu 3D z plików 2D, ustawienie arytmetyki macierzy świata na jeden oraz podgląd 3D. Należy ustawić odpowiednie parametry w takiej kolejności, w jakiej są one pokazane w podglądzie 3D, naciskając prawy przycisk myszy.
Przesuń mysz, aby dostosować obszary progowe, które mogą zostać przycięte. Zmienniono orientację, oświetlenie lub włączono/wyłączono tło. Reprezentatywne wyniki KESM są zilustrowane w następujący sposób: klipy wideo pokazują najpierw wizualizacje wolumetryczne KESM, stosy danych z całego mózgu zabarwionego tuszem indyjskim dla zestawu danych naczyniowych, zaczynając od zbliżenia na dane naczyniowe o szerokości około 100 mikronów.
Ten drugi klip z KESM przedstawia dane z całego mózgu zabarwionego tuszem indyjskim, ukazując trzy standardowe widoki unaczynienia całego mózgu myszy, pobrane z danych o wysokiej rozdzielczości o szerokości około 10 milimetrów. Widok strzałkowy, widok czołowy i widok poziomy, a także przelot przez przekrój czołowy. W tym klipie wideo zilustrowano dane Golgi z całego mózgu myszy KESM, pokazując przelot wzdłuż trzech różnych płaszczyzn cięcia, zaczynając od widoku bloku, a następnie widoku strzałkowego, czołowego i poziomego.
Następnie przedstawiono szczegóły danych GoGy z całego mózgu myszy KESM. Ten pierwszy klip wideo przedstawia móżdżek i komórki Purkinjego. Ten drugi klip pokazuje korę oraz komórki paramitalne.
Na koniec KESM. Dane NLE z całego mózgu zostały przedstawione w tych dwóch klipach wideo. Najpierw pokazano zbliżenie danych NLE.
Ten drugi klip przedstawia trzy standardowe widoki danych Nle całego mózgu myszy, pobranych z danych o wysokiej rozdzielczości. Pokazano również przekrój poprzeczny, aby zapewnić wyraźny wgląd w struktury wewnętrzne. Ta technika utorowała drogę badaczom w dziedzinie neuronauki do eksploracji sieci neuronalnych i naczyniowych w mózgu myszy.
Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze zrozumieć zasady przygotowania próbek, obrazowania oraz analizy danych dla skaningowego mikroskopu z ostrzem noża.
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje kompleksowy proces przygotowania preparatów mózgu do obrazowania z wykorzystaniem mikroskopu skanującego z nożem w krawędzi (Knife-Edge Scanning Microscope, KESM). Technika ta jest stosowana głównie w przypadku mózgów myszy, lecz ma zastosowanie również w odniesieniu do innych organów i gatunków.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Konektonomika
- Techniki obrazowania
Wstęp
- Metoda KESM umożliwia obrazowanie dużych objętości próbek biologicznych.
- Metoda ta pozwala na poznanie organizacji neuronalnej i naczyniowej.
- Przewyższa ona tradycyjne metody, takie jak seryjna skaningowa mikroskopia elektronowa powierzchni bloków (SBF-SEM).
- Ma zastosowanie w różnych układach organów poza mózgiem.
Cel badania
- W celu zaprezentowania przygotowania i obrazowania preparatów biologicznych.
- W celu wizualizacji i analizy danych z KESM.
- W celu zbadania organizacji strukturalnej w rozdzielczości submikrometrycznej.
Zastosowane metody
- Fiksacja, barwienie i zatopienie tkanki mózgowej.
- Konfiguracja i obsługa KESM do obrazowania.
- Przetwarzanie danych, w tym odszumianie i rejestracja.
- Wizualizacja danych z wykorzystaniem atlasu internetowego oraz oprogramowania 3D.
Główne wyniki
- Skuteczne obrazowanie struktur całego mózgu w wysokiej rozdzielczości.
- Wizualizacja sieci neuronalnych i naczyniowych.
- Wykazanie zdolności KESM do przetwarzania większych objętości.
- Wgląd w organizację strukturalną mózgu i innych organów.
Wnioski
- KESM jest potężnym narzędziem w badaniach nad konektomiką.
- Metoda ta pogłębia nasze zrozumienie struktury mózgu.
- Można ją dostosować do pracy z różnymi próbkami biologicznymi.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Mikroskopia skanująca z krawędzią noża (KESM) umożliwia wysokoprzepustowe obrazowanie 3D całych organów z rozdzielczością submikrometryczną, dostarczając kluczowych danych referencyjnych dla konektomiki i badań naczyniowo-nerwowych. Możliwość ta wspiera wczesny etap walidacji celów terapeutycznych poprzez ujawnianie organizacji strukturalnej sieci neuronowych i naczyniowych w systemach istotnych dla przebiegu chorób. Metoda ta zwiększa pewność prognostyczną w modelach przedklinicznych, dostarczając mierzalnych i powtarzalnych zbiorów danych anatomicznych niezbędnych do mitygacji ryzyka mechanistycznego.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania leków i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez mapowanie całego mózgu w celu analizy architektury neuronalnej i naczyniowej z rozdzielczością submikrometryczną.
- Wartość operacyjna: Dostarcza dokładnych danych referencyjnych dla stereologii i konektomiki, co redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celów.
- Wartość prognostyczna: Wspiera selekcję projektów w portfolio poprzez dostarczanie ilościowych odczytów strukturalnych, które korelują z efektami funkcjonalnymi w modelach chorób.
Przesiewy i opracowanie testów
- Wartość naukowa: Pozwala na generowanie zestandaryzowanych, powtarzalnych stosów obrazów 3D, odpowiednich do późniejszej analizy zmian strukturalnych wywołanych przez związki chemiczne.
- Wartość operacyjna: Umożliwia automatyzację procesów sekcjonowania i obrazowania z jednolitym rozdzielczością w osi z, co poprawia powtarzalność testów w ramach poszczególnych badań.
- Skalowalność: Ułatwia przygotowanie zwalidowanych systemów biologicznych (np. mózgu, płuc, nerek myszy) do zastosowań w badaniach przesiewowych wysokiej treści (high-content screening).
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Oferuje obrazowanie układów istotnych dla chorób (np. mózgu gryzoni, mózgu ośmiornicy, embrionów zebrafish), co pozwala na dopasowanie do odkrywania biomarkerów translacyjnych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia ciągłość od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną poprzez dostarczanie podłużnych, wielkoskalowych danych anatomicznych.
- Mitygacja ryzyka: Wspiera decyzje o postępach prac w oparciu o analizę ryzyka, umożliwiając precyzyjną kwantyfikację zmian naczyniowo-nerwowych w modelach przedklinicznych.
Integracja potoku i przepływu pracy
KESM wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków – od wczesnego testowania hipotez dotyczących punktów uchwytu, przez identyfikację wiodących związków, aż po walidację przedkliniczną, w szczególności w odniesieniu do celów neurologicznych i naczyniowych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez obrazowanie całych organów w celu analizy sieci neuronalnych i naczyniowych.
- Przesiewy: Dostarcza ustandaryzowane, gotowe do analizy zestawy danych 3D z wynikami ilościowymi do oceny fenotypów strukturalnych.
- Analityka: Umożliwia przetwarzanie danych (odszumianie, rejestracja, przycinanie) oraz wizualizację za pomocą atlasów internetowych i oprogramowania 3D do analiz porównawczych.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość przedkliniczną dzięki możliwości zastosowania u wielu gatunków (mysz, szczur, zebrafish, ośmiornica) oraz obrazowaniu w skali całego organu.
- Wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Funkcjonuje jako wielokrotnego użytku platforma obrazowania dla międzyprojektowych kampanii mapowania neuroanatomicznego i naczyniowego.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zapewnia pewność prognostyczną w walidacji celu dzięki wysokorozdzielczemu fenotypowaniu strukturalnemu całego organu.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzację, powtarzalność i skalowalność w pozyskiwaniu danych 3D pomiędzy laboratoriami i systemami modelowymi.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go poprzez redukcję biologicznego ryzyka na późnych etapach dzięki wczesnemu ograniczaniu ryzyka strukturalnego.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację skorygowaną o ryzyko dzięki mierzalnym punktom końcowym anatomicznym, które określają kryteria przejścia do kolejnych etapów.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie histologii, przetwarzania tkanek oraz obsługi instrumentarium mikroskopowego.
- Zależność od specjalistycznego sprzętu, w tym mikrotomu, stolika optycznego oraz oprogramowania do automatycznego sterowania pracą KESM.
- Konieczność standaryzacji protokołów barwienia (np. metodą Golgiego, tuszem indyjskim, metodą Nissla) oraz procedur zatapiania tkanek pomiędzy zespołami.
- Wymaga uwzględnienia modyfikacji w zależności od systemów modelowych (np. mózg myszy vs. embrion danio przebrany) ze względu na różnice w wielkości i gęstości tkanek.
- Ograniczenie wynikające z długiego czasu przygotowania preparatów (od tygodni do miesięcy) na etapie fiksacji i odwadniania.
