Name: Protokoły przygotowania, obrazowania i analizy próbek dla mikroskopii skaningowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: Poznaj kompleksowe protokoły przygotowania próbek mózgu myszy do mikroskopii skaningowej KESM, obejmujące utrwalanie, barwienie i osadzanie tkanek. Ta metoda umożliwia wizualizację sieci neuronowych i naczyniowych z rozdzielczością submikrometrową.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Projekt ten był finansowany przez NIH/NINDS (#1R01-NS54252), NSF (#0905041,#0079874), Texas Advanced Technology Program (#ATP-000512-0146-2001, #ATP-000512-0261-2001), Texas A&amp;M Research Foundation, Departament Informatyki i Inżynierii na Texas A&amp;M University oraz 3Scan. Chcielibyśmy podziękować Bernardowi Mesie (Micro Star Technologies) za konsultacje techniczne i wsparcie w zakresie aparatury KESM. Główne prace nad projektowaniem i wdrażaniem KESM zostały wykonane przez Bruce'a H. McCormicka, który zmarł w 2007 roku.

1. Przygotowanie preparatu: metoda Golgiego-Coxa
<ol>
	<li>Niniejszy protokół ściśle naśladuje protokół opracowany przez Mayericha i wsp.7.</li>
	<li>Myszy szczepu C57BL/6J poddaje się głębokiej anestezji z użyciem izofluranu w formie wziewnej, a następnie wykonuje dekapitację.</li>
	<li>Mózg zostaje wyjęty i umieszczony w roztworze utrwalającym Golgi-Cox (1% chromianu potasu, 1% dichromianu potasu i 1% chlorku rtęci w wodzie dejonizowanej).</li>
	<li>Mózg pozostawia się w roztworze Golgi-Cox w ciemności, w temperaturze pokojowej, od 10 do 16 tygodni.</li>
	<li>Wypłukuje się mózgi w wodzie dejonizowanej przez noc w ciemności.</li>
	<li>Wypłukany mózg zanurza się w 5% roztworze wodorotlenku amonu w wodzie dejonizowanej na 7 do 10 dni w ciemności w temperaturze pokojowej. Tak długi czas przygotowania miał zapewnić infiltrację całego mózgu, aby czarny osad mógł w pełni uformować się w tkance.</li>
	<li>Mózg płucze się ponownie w wodzie dejonizowanej w temperaturze pokojowej przez 4 godziny, a następnie odwadnia poprzez stopniowe zwiększanie stężenia alkoholi etylowych: 50% i 70% w lodówce (4 °C) oraz 85%, 95% (3 wymiany) i 10% (4 do 5 wymian) w temperaturze pokojowej. Mózg pozostawia się w każdym roztworze na 24 godziny.</li>
	<li>Odwodniony mózg umieszcza się następnie w acetonie (3 do 4 wymian, każda przez jeden dzień), a następnie w mieszaninie aralditu z acetonem w stosunkach araldit do acetonu odpowiednio 1:2, 1:1, 2:1 i na koniec w 10% araldicie (3 wymiany, każdorazowo przez noc) w lodówce (4 °C).</li>
	<li>Na koniec przetworzony mózg zatapia się w 10% araldicie i podgrzewa do 60 °C przez 3 dni (por. protokół zatapiania u Abbotta i Sotelo2). 
	W przypadku zatapiania próbek w LR White, przenosi się je z ostatniego 10% roztworu etanolu poprzez trzy wymiany roztworu LR White, z których każda jest przechowywana w lodówce przez noc, co stanowi standardową procedurę przed polimeryzacją. Wykonuje się trzy wymiany, aby zapewnić pełną infiltrację. Próbkę przenosi się następnie do świeżego LR White, który polimeryzuje w zamkniętym pojemniku w temperaturze 60 °C przez 24 godziny, co jest wymaganym czasem i temperaturą dla prawidłowej polimeryzacji.</li>
	<li>Rys. 1 przedstawia mózg barwiony metodą Golgi-Cox zatopiony w araldicie.</li>
	<li>Utwardzony blok z próbką montuje się następnie na metalowym pierścieniu do próbek za pomocą żywicy epoksydowej, a boki bloku przycina się w razie potrzeby (patrz rys. 2).</li>
</ol>
2. Przygotowanie preparatów: metoda Nissla
<ol>
	<li>Niniejszy protokół ściśle naśladuje protokół opracowany przez Mayerich i wsp.7</li>
	<li>Myszy podaje się głęboką narkozę przy użyciu ketaminy i ksylazyny wstrzykniętej dostronikally, a następnie przeprowadza perfuzję transkardiakalną przy użyciu 50 mL soli fizjologicznej w buforze fosforanowym (pH 7.4) w temperaturze pokojowej, a następnie 250 mL zimnej 4% paraformaldehidu w buforze fosforanowym (pH 7.4).</li>
	<li>Następnie przeprowadza się perfuzję myszy 10 mL roztworu 0,1% barwnika tioniny w wodzie dejonizowanej, a ciało umieszcza się w lodówce (4 °C) na 24 godziny.</li>
	<li>Po 24 godzinach mózg zostaje wyjęty z czaszki i umieszczony w świeżym roztworze 0,1% tioniny, a następnie pozostawiony w temperaturze 4 °C przez 7 dni. Tak długi czas trwania tej procedury miał zapewnić pełną infiltrację tioniny do preparatu en bloc.</li>
	<li>Następnie mózg poddaje się odbarwianiu i odwodnieniu poprzez stopniowanie stężenia etanolu, zaczynając od 50% etanolu w wodzie i zwiększając stężenie do 10% etanolu w okresie 6 tygodni. Próbki w stężeniach od 50% do 70% etanolu przechowuje się w lodówce (4 °C), a wszystkie kolejne zmiany etanolu powyżej 70% przechowuje się w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Po trzech zmianach acetonu (po 2-4 dniach w każdym roztworze w temperaturze pokojowej), mózg zostaje zatopiony w plastiku araldite zgodnie z protokołem opisanym w punktach 1.8-1.9 powyżej. W przypadku zastosowania LR white jako medium do zatapiania, stosuje się protokół opisany w punkcie 1.10 powyżej.</li>
</ol>
3. Przygotowanie preparatu: tusz indyjski
<ol>
	<li>Myszy podaje się głęboką anestezję za pomocą ketaminy i ksylazyny (1,7 mg ketaminy / 0,26 mg ksylazyny na 20 gramów masy ciała) wstrzykiwanych dostrojnie, a następnie przeprowadza perfuzję transkardialną przy użyciu 50 mL soli fizjologicznej w buforze fosforanowym (pH 7,4) o temperaturze pokojowej, po czym podaje się 250 mL 10% neutralnej formaliny buforowanej (pH 7,4) o temperaturze pokojowej, a na koniec 3,0 cc nierozcieńczonego tuszu indyjskiego.</li>
	<li>Perfuzja całego ciała solą fizjologiczną i utrwalaczem jest niezbędna do usunięcia krwi z układu sercowo-naczyniowego oraz utrwalenia tkanek. Perfuzja tuszem indyjskim jest konieczna, aby całkowicie wypełnić naczynia układu sercowo-naczyniowego.</li>
	<li>Otrzymany mózg jest następnie odwadniany w serii roztworów alkoholu etylowego o rosnącym stężeniu (25%-10%), a następnie zatapiany w plastiku araldite zgodnie z protokołem opisanym w punktach 1.8-1.9 powyżej. W przypadku zastosowania LR white jako medium do zatapiania, należy postępować zgodnie z protokołem w punkcie 1.10 powyżej.</li>
</ol>
4. Przygotowanie preparatów: gatunki generyczne, organy generyczne
<ol>
	<li>W przypadku ogólnym utrwalanie można przeprowadzić przy użyciu 10% neutralnego buforowanego formaliny lub 4% paraformaldehydu.</li>
	<li>Dla niewielkich objętości tkanek do utrwalania i barwienia zaleca się dyfuzję zamiast perfuzji. W przypadku małych organizmów lub organów barwienie można przeprowadzić również podczas procesu odwadniania.</li>
	<li>Protokół zatapiania w parafinie jest taki sam jak opisany powyżej, choć czasy infiltracji roztworami mogą zostać skrócone w przypadku organów lub organizmów znacznie mniejszych niż cały mózg myszy.</li>
</ol>
5. Konfiguracja i obrazowanie KESM
<ol>
	<li>Wyłączyć pompę, włączyć stół, włączyć kamerę, włączyć oświetlacz.</li>
	<li>Podnieść nóż i obiektyw.</li>
	<li>Zainstalować pierścień na próbkę.</li>
	<li>Zmierzyć wymiary próbki i utworzyć plik konfiguracyjny dla aplikacji KESM Stage Controller2.</li>
	<li>Uruchomić program KESM Stage Controller2 i zainicjować stół.</li>
	<li>Opuścić nóż/obiektyw, włączyć pompę.</li>
	<li>Ustawić ostrość obiektywu i kamery, obracając pokrętłem ostrości w układzie optycznym i dostosowując pole widzenia kamery względem krawędzi noża.</li>
	<li>Nacisnąć przycisk [Go], aby rozpocząć obrazowanie.</li>
	<li>Patrz Rys. 3-8. Szczegóły techniczne znajdują się w 9, 7.</li>
</ol>
6. Przetwarzanie obrazów i przygotowanie danych
<ol>
	<li>Skopiuj plik wykonywalny KESM Stack Processor do folderu z danymi, wewnątrz folderu z plikami konfiguracyjnymi (0, 01 itd.).</li>
	<li>Uruchom KESM Stack Processor, aby usunąć artefakty oświetlenia i znormalizować intensywność tła we wszystkich obrazach. Powtórz tę czynność dla wszystkich podfolderów z danymi.</li>
	<li>Przygotuj wielkoskalowe kafelki z zestawu danych, a następnie prześlij i skonfiguruj pliki na serwerze WWW KESM Brain Atlas.</li>
	<li>Patrz Rys. 9.</li>
</ol>
7. Wizualizacja i analiza danych
<ol>
	<li>Wizualizacja przy użyciu atlasu mózgu KESM. Przejdź pod adres <a href="http://kesm.cs.tamu.edu">http://kesm.cs.tamu.edu</a> i wybierz odpowiedni atlas.
	<ol>
		<li>Nawiguj w sposób analogiczny do map Google.</li>
		<li>Przybliżaj i oddalaj widok w sposób analogiczny do map Google.</li>
		<li>Aby przejść na inną głębokość, wybierz z menu rozwijanego wartość głębokości dla każdego kroku, a następnie kliknij [+] lub [-], aby zwiększyć lub zmniejszyć głębokość osi z.</li>
		<li>Dostosuj numer nakładki, korzystając z menu rozwijanego.</li>
		<li>Dostosuj interwał nakładki, korzystając z menu rozwijanego.</li>
		<li>Patrz Rys. 1.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wizualizacja przy użyciu MeVisLab.
	<ol>
		<li>Uruchom program MeVisLab.</li>
		<li>Utwórz nowy projekt.</li>
		<li>W dalszej części nowe moduły można tworzyć, wpisując nazwę modułu w polu poleceń.</li>
		<li>Utwórz moduł [Compose3Dfrom2DFiles] i przejdź do wybranego folderu. Wprowadź ciąg znaków pliku i kliknij [GetFileList]. Upewnij się, że wybrane obrazy mieszczą się w pamięci. Kliknij [Create3D], aby utworzyć wolumen.</li>
		<li>Utwórz moduł [SetWorldMatrix] i ustaw wartości „Scale” w sekcji „Elementary Transforms” dla x, y, z na odpowiedni rozmiar woksela (0,6, 0,7, 1,0 dla obiektywu 10X 0,45NA). Połącz [Compose3Dfrom2DFiles] z [SetWorldMatrix].</li>
		<li>W sekcji „Matrix Composition” ustaw Matrix oraz Transforms na „Ignore”, „Ignore”, „Forward”.</li>
		<li>Utwórz moduł [Arithmetic1] i ustaw „Function” na „Invert(Max-Img)”. 
		Połącz [SetWorldMatrix] z [Arithmetic1].</li>
		<li>Utwórz moduł [View3D] i podłącz [Arithmetic1].</li>
		<li>W module View3D, trzymając prawy przycisk myszy, przesuwaj kursor, aby dostosować próg. Możesz przycinać regiony, zmieniać orientację (przesuwając mysz przy wciśniętym lewym przycisku), zmieniać oświetlenie (renderowanie wolumetryczne lub MIP), włączać/wyłączać tło itp.</li>
		<li>Patrz Rys. 10.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. Reprezentatywne wyniki:
W niniejszej części prezentujemy dane oraz szczegóły dotyczące całego mózgu. Ryc. 12-15 przedstawiają zestawy danych z całego mózgu uzyskane za pomocą tuszu indyjskiego, metody Golgiego oraz barwienia Nissla 1, 4, 3.
<img alt="Konserwacja skamieniałości w bursztynie; materia organiczna widoczna wewnątrz bloku żywicy; okaz do badań paleontologicznych." src="/files/ftp_upload/3248/3248fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rycina 1. Utrwalony, barwiony i zatopiony mózg myszy
<img alt="Próbka zatopiona w żywicy do analizy materiałowej; badanie w stanie stałym, konfiguracja układu pomiarowego." src="/files/ftp_upload/3248/3248fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rysunek 2. Zatopiona próbka mózgu myszy zamocowana na pierścieniu do próbek.
<img alt="Układ mikroskopowy do wzbudzania optycznego; schemat obejmuje laser i detektory; stosowany w analizie spektroskopowej." src="/files/ftp_upload/3248/3248fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rycina 3. Mikroskop skanujący z ostrzem noża (KESM). Przedstawiono zdjęcie KESM z zaznaczonymi głównymi komponentami: (1) szybka kamera skanująca liniowo, (2) obiektyw mikroskopu, (3) zespół noża diamentowego i kolimator światła, (4) zbiornik na próbkę (do obrazowania w imersji wodnej), (5) precyzyjny trójosiowy stół z łożyskami powietrznymi, (6) iluminator mikroskopu światła białego, (7) pompa wodna (z tyłu) do usuwania wycinków tkanki, (8) serwer PC do sterowania stołem i akwizycji obrazu, (9) granitowa podstawa oraz (10) granitowy most.
<img alt="Schemat przekroju tkanki, konfiguracja mikroskopu, tor światła, ruch stolika, proces mikroskopii skanującej w linii." src="/files/ftp_upload/3248/3248fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 4"> 
Rysunek 4. Zasady obrazowania KESM. Przedstawiono zasadę działania KESM. Obiektyw oraz nóż są unieruchomione, podczas gdy próbka przymocowana do stołu pozycjonującego porusza się (strzałka z linią ciągłą) z rozdzielczością 20 nm i prędkością przemieszczania 1–5, zostając zeskrobana o nóż diamentowy (o szerokości 5 mm dla obiektywu 10X), co generuje cienki przekrój przesuwający się nad nożem (strzałka z linią ciągłą). Obrazowanie liniowe (line-scan) jest wykonywane w bezpośrednim sąsiedztwie samego wierzchołka noża.
<img alt="układ do dyfrakcji rentgenowskiej; sprzęt do analizy krystalograficznej; metoda wyznaczania struktury; instrument laboratoryjny." src="/files/ftp_upload/3248/3248fig5.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 5"> 
Rysunek 5. Pokrętła ustawiania ostrości kamery i obiektywu KESM.
<img alt="Układ spektroskopowy; wzbudzenie optyczne; pomiar absorpcji przejściowej; wyposażenie laboratoryjne." src="/files/ftp_upload/3248/3248fig6.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6. Montaż i elementy sterujące noża KESM.
<img alt="Układ mikroskopii optycznej; porównanie obrazowania w punkcie ostrości i poza punktem ostrości; analiza mikroskopowa." src="/files/ftp_upload/3248/3248fig7.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 7"> 
Rysunek 7. Wstępne ustawianie ostrości przez okno obserwacyjne.
<img alt="Interfejs układu optycznego do analizy emisji; ekran ustawień oprogramowania; konfiguracja spektroskopowa." src="/files/ftp_upload/3248/3248fig8.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 8"> 
Rysunek 8. Aplikacja KESM Stage Controller 2 (zrzut ekranu).
<img alt="Interfejs oprogramowania do przetwarzania obrazów, ładowanie sekwencji, kadrowanie, konfiguracja oświetlenia, zarządzanie danymi." src="/files/ftp_upload/3248/3248fig9.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 9"> 
Rycina 9. aplikacja procesora stosu KESM (zrzut ekranu).
<img alt="Interfejs oprogramowania do wizualizacji 3D służący do renderowania i analizy struktur molekularnych." src="/files/ftp_upload/3248/3248fig10.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 10"> 
Rysunek 10. Aplikacja MeVisLab (zrzut ekranu).
<img alt="Mikroskopia skanująca mózgu myszy z wykorzystaniem ostrza noża, barwienie metodą Golgiego, schemat przekroju poprzecznego." src="/files/ftp_upload/3248/3248fig11.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rysunek 1. Atlas mózgu KESM: interfejs internetowy (zrzut ekranu).
<img alt="Obrazowanie mikronaczyniowe; MRI przekrojów mózgu; widoki strzałkowy, poziomy i czołowy z powiększeniem szczegółów." src="/files/ftp_upload/3248/3248fig12.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 12"> 
Rycina 12. Dane z obrazowania całego mózgu metodą KESM z użyciem tuszu indyjskiego. Przedstawiono wizualizacje wolumetryczne stosów danych KESM dla zbioru danych naczyniowych. (a(a) Zbliżenie danych naczyniowych. Szerokość ~10 μm. (b-d) Trzy standardowe widoki całej sieci naczyniowej mózgu myszy (próbkowane z danych o wysokiej rozdzielczości). Szerokość ~10 mm.
<img alt="Obrazy z tomografii komputerowej (TK); 3D, strzałkowe, czołowe, poziome. Analiza obrazowania medycznego, anatomia, narzędzie diagnostyczne." src="/files/ftp_upload/3248/3248fig13.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 13"> 
Rycina 13. Dane Golgi całego mózgu myszy KESM.
<img alt="Struktury neuronalne; komórki Purkinjego, móżdżek, kora, komórki piramidalne; obraz mikroskopowy." src="/files/ftp_upload/3248/3248fig14.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 14"> 
Rysunek 14. Szczegóły danych Golgi KESM.
<img alt="Przekroje trójwymiarowego skanu mózgu; schematy A-D; obrazowanie MRI; analiza struktury mózgowia." src="/files/ftp_upload/3248/3248fig15.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 15"> 
Rycina 15. Dane z barwienia Nissla całego mózgu KESM. (aZbliżenie danych barwienia Nisslem. ~30 µm3(b-d) Trzy standardowe rzuty danych Nissla dla całego mózgu myszy (wyselekcjonowane z danych o wysokiej rozdzielczości). Przedstawiono przekrój poprzeczny w celu uzyskania wyraźnego obrazu struktur wewnętrznych.

<ol><li>Abbott, L. C. High-throughput imaging of whole small animal brains with the knife-edge scanning microscope. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAbbott%2C+LC+%22Neuroscience+Meeting+Planner%22">Neuroscience Meeting Planner</a>. Program No. 504.2, Society for Neuroscience. Washington, DC. (2008).</li>
<li>Abbott, L. C., Sotelo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+analysis+of+catecholaminergic+innervation+in+weaver+and+normal+mouse+cerebellar+cortices%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural analysis of catecholaminergic innervation in weaver and normal mouse cerebellar cortices.</a> Journal of Comparative Neurology. 426, 316-329 (2000).</li>
<li>Choe, Y., Abbott, L. C., Miller, D. E., Han, D., Yang, H. -F., Chung, J. R., Sung, C., Mayerich, D., Kwon, J., Micheva, K., Smith, S. J. Multiscale imaging, analysis, and integration of mouse brain networks. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChoe%2C+Y+%22Neuroscience+Meeting+Planner%22">Neuroscience Meeting Planner</a>. Program No. 516.3, Society for Neuroscience. San Diego, CA. (2010).</li>
<li>Choe, Y., Han, D., Huang, P. -S., Keyser, J., Kwon, J., Mayerich, D., Abbott, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+submicrometer+scans+of+mouse+brain+microstructure%3A+Neurons+and+vasculatures%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Meeting+Planner%22%5BJournal%5D)">Complete submicrometer scans of mouse brain microstructure: Neurons and vasculatures.</a> Neuroscience Meeting Planner. Program No. 389.10, Society for Neuroscience Program. Chicago, IL. (2009).</li>
<li>Choe, Y., Abbott, L. C., Han, D., Huang, P. S., Keyser, J., Kwon, J., Mayerich, D., Melek, Z., McCormick, B. H. Knife-edge scanning microscopy: High-throughput imaging and analysis of massive volumes of biological microstructures. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChoe%2C+Y+%22High-Throughput+Image+Reconstruction+and+Analysis%3A+Intelligent+Microscopy+Applications%22">High-Throughput Image Reconstruction and Analysis: Intelligent Microscopy Applications</a>. Ravi Rao, A., Cecchi, G. , Artech House. Boston, MA. 11-37 (2008).</li>
<li>Choe, Y., Abbott, L. C., Ponte, G., Keyser, J., Kwon, J., Mayerich, D., Miller, D., Han, D., Grimaldi, A. M., Fiorito, F., Edelman, D. B., McKinstry, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Charting+out+the+octopus+connectome+at+submicron+resolution+using+the+knife-edge+scanning+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Charting out the octopus connectome at submicron resolution using the knife-edge scanning microscope.</a> BMC Neuroscience. 11, Suppl 1. 136-136 (2010).</li>
<li>Mayerich, D., Abbott, L. C., McCormick, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knife-edge+scanning+microscopy+for+imaging+and+reconstruction+of+three-dimensional+anatomical+structures+of+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Knife-edge scanning microscopy for imaging and reconstruction of three-dimensional anatomical structures of the mouse brain.</a> Journal of Microscopy. 231, 134-143 (2008).</li>
<li>Mayerich, D., Kwon, J., Sung, C., Abbott, L. C., Keyser, J., Choe, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+macro-scale+Transmission+Imaging+of+Microvascular+Networks+Using+KESM%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Fast macro-scale Transmission Imaging of Microvascular Networks Using KESM.</a> Biomedical Optics Express. 2, 2888-2896 (2008).</li>
<li>McCormick, B. H. Development of the Brain Tissue Scanner. Technical Report. , Department of Computer Science, Texas A & M University. College Station, TX. (2002).</li>
<li>Sporns, O., Tononi, G., Kötter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+connectome%3A+A+structural+description+of+the+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">The human connectome: A structural description of the human brain.</a> PLoS Computational Biology. 1, 42-42 (2005).</li>
</ol>

Todd Huffman jest związany z 3Scan, firmą komercyjną, która produkuje i wprowadza na rynek technologię KESM (patent USA nr 6,744,572).

KESM umożliwia badanie dużych objętości próbek biologicznych (~1 cm3) z rozdzielczością submikrometryczną. Taka objętość jest wystarczająca do pomieszczenia całych organów małych zwierząt, takich jak mózgi, płuca, serca, nerki itp. Obrazy skanowania takich organów mogą dostarczyć bezprecedensowych ilościowych informacji o organizacji strukturalnej tych narządów oraz umożliwić modelowanie komputerowe różnych aspektów ich funkcjonowania, w tym dynamiki obwodów i sieci, właściwości elektrycznych, dynamiki przepływu cieczy i powietrza oraz dynamiki mięśniowej.
Przedstawiony w niniejszym artykule protokół przygotowania preparatu oraz protokół poanalityczny mają na celu ułatwienie zewnętrznym grupom badawczym dostępu do KESM oraz wynikowych danych. Protokół obsługi KESM pomoże tym zewnętrznym badaczom zrozumieć zalety i ograniczenia tej unikalnej metody obrazowania.

A correction was made to <a href="http://www.jove.com/video/3248">Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy</a>. Important modifications were made to the Nissl staining protocol.

A correction was made to <a href="http://http://www.jove.com/video/3248">Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy</a>. Important modifications were made to the Nissl staining protocol.

Erratum: Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy

protokoły przygotowania próbek, obrazowania i analizy dla mikroskopii skanującej krawędzią noża

Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy

Znaczące postępy w wysokoprzepustowych technikach mikroskopii 3D o wysokiej rozdzielczości umożliwiły pozyskiwanie dużych objętości danych neuroanatomicznych z rozdzielczością submikrometryczną. Jednym z pierwszych takich instrumentów generujących dane w skali całego mózgu jest skanujący mikroskop z ostrzem noża (Knife-Edge Scanning Microscope, KESM)7, 5, 9, opracowany i znajdujący się w laboratorium autorów. KESM był wykorzystywany do sekcjonowania i obrazowania całych mózgów myszy z rozdzielczością submikrometryczną, co pozwoliło ujawnić złożone szczegóły sieci neuronowych (metoda Golgiego)1, 4, 8, sieci naczyniowych (tusz indyjski)1, 4 oraz rozmieszczenia ciał komórkowych (metoda Nissla)3. Zastosowanie KESM nie ogranicza się tylko do myszy ani wyłącznie do mózgu. Z sukcesem obrazowano za jego pomocą mózg ośmiornicy6, płuca myszy oraz mózg szczura. Obecnie prowadzimy prace nad całymi embrionami danio pręgowanego. Dane tego typu mogą w znacznym stopniu przyczynić się do badań z zakresu konektomiki10, badań nad mikrokrążeniem i hemodynamicą oraz badań stereologicznych poprzez dostarczenie dokładnych danych referencyjnych. 
W niniejszym artykule opisano cały proces, obejmujący przygotowanie preparatów (utrwalanie, barwienie i zatapianie), konfigurację i ustawienie KESM, wykonywanie przekrojów oraz obrazowanie za pomocą KESM, przetwarzanie obrazów, przygotowanie danych a także wizualizację i analizę danych. Szczególny nacisk położono na przygotowanie preparatów oraz wizualizację i analizę uzyskanych danych KESM. Przewidujemy, że szczegółowy protokół przedstawiony w tym artykule pomoże w zwiększeniu dostępności do KESM oraz częstszym wykorzystywaniu tej metody.

Opisano pełny proces, od przygotowania preparatu mózgu, przez obrazowanie seryjnych przekrojów z wykorzystaniem mikroskopu skanującego o ostrzu noża (Knife-Edge Scanning Microscope), aż po wizualizację i analizę danych. Technika ta jest obecnie wykorzystywana do pozyskiwania danych z mózgów myszy, jednak znajduje zastosowanie również w przypadku innych organów i gatunków.

Protokoły przygotowania próbek, obrazowania i analizy dla mikroskopii skanującej krawędzią noża

Znaczące postępy w wysokoprzepustowych i wysokorozdzielczych technikach mikroskopii 3D umożliwiły pozyskiwanie dużych wolumenów danych neuroanatomicznych przy...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zademonstrowanie przygotowania preparatów biologicznych do skrawania i obrazowania za pomocą skaningowego mikroskopu ostrzem noża (KESM) oraz wizualizacji wynikowego stosu danych obrazowych. Jest to realizowane poprzez uprzednią fiksację, barwienie i zatopienie tkanki w celu przygotowania jej do obrazowania w KESM. Drugim krokiem procedury jest konfiguracja KESM oraz przeprowadzenie skrawania i obrazowania z wykorzystaniem automatycznego oprogramowania sterującego.Otrzymane obrazy poddawane są następnie odszumianiu, rejestracji i przycinaniu. Ostatnim krokiem jest wczytanie i analiza zestawów danych w internetowym atlasie oraz oprogramowaniu do wizualizacji 3D. W efekcie możliwe jest uzyskanie wyników obrazujących organizację neuronalną i naczyniową całego mózgu w rozdzielczości submikrometrowej.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami mezoskopowymi, takimi jak seryjna blokowa skaningowa mikroskopia elektronowa, jest możliwość obrazowania znacznie większych objętości, choć przy niższej rozdzielczości. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie konektomiki oraz neuronauki w ogóle. Pozwala ona uzyskać wgląd w organizację strukturalną mózgu, a może być również zastosowana do innych układów narządowych, takich jak płuca i nerki.Aby rozpocząć tę procedurę, wypreparowany mózg myszy umieszcza się w szklanym słoiku zawierającym roztwór Golgi-Cox. Słoik należy umieścić w ciemnym pudełku w temperaturze pokojowej na okres od 10 do 16 tygodni. Oddzielny etap utrwalania nie jest konieczny, ponieważ roztwór Golgi-Cox pełni funkcję utrwalacza.Po 10 do 16 tygodni, następnego dnia wypłukać mózg w wodzie dejonizowanej przez noc w ciemności, następnie zanurzyć wypłukany mózg w 5% roztworze wodorotlenku amonu w wodzie dejonizowanej na siedem do 10 dni w ciemności w temperaturze pokojowej. Po siedmiu do 10 dniach ponownie wypłukać mózg w wodzie dejonizowanej w temperaturze pokojowej przez cztery godziny. Następnie odwodnić mózg w szeregu roztworów etanolu o rosnącym stężeniu, pozostawiając go w każdym roztworze na 24 godziny: 50% etanolu i 70% etanolu w temperaturze czterech stopni Celsjusza oraz 85% etanolu.Trzykrotna wymiana na 95% etanol oraz od czterech do pięciu wymian na 100% etanol w temperaturze pokojowej. Następnie odwodniony mózg umieszcza się w acetonie, wykonując od trzech do czterech wymian, z których każda trwa jeden dzień. Po tym etapie mózg pozostawia się na noc w lodówce w kolejnych mieszaninach agarozu i acetonu o stosunkach agaroz do acetonu wynoszących odpowiednio 1:2, 1:1 oraz 2:1.Na koniec umieść mózg w 100%aite w lodówce, wykonując trzy wymiany roztworu, każda z nich w ciągu nocy. Następnie poddany obróbce mózg zostaje zatopiony w 100%aite i ogrzewany w temperaturze 60 °C przez trzy dni. Na koniec utwardzony blok próbki zostaje zamocowany na metalowym pierścieniu do próbek przy użyciu żywicy epoksydowej, a boki bloku zostają przycięte w razie potrzeby, aby rozpocząć tę procedurę.Upewnij się, że mysz znajduje się w głębokiej narkozie i nie reaguje na uciśnięcie palca u nogi. Następnie przeprowadź perfuzję przezsercową myszy, używając soli fizjologicznej w temperaturze pokojowej, a następnie zimnej 4% paraformaldehydy w buforze fosforanowym. W dalszej kolejności przepłucz mysz roztworem 0,1% thiokolu i barwnika w wodzie dejonizowanej.Następnie umieść ciało w lodówce w temperaturze 4°C na 24 godziny. Po upływie 24 godzin wyjmij mózg z naczynia i umieść go w świeżym roztworze 0,1% tioniny. Pozostaw mózg w temperaturze 4°C przez siedem dni.Po siedmiu dniach utrwalić i odwodnić mózg, stosując serię rozcieńczeń alkoholu etylowego. Przez okres sześciu tygodni: od trzech do pięciu dni w 50% etanolu, od siedmiu do 10 dni w 70% etanolu, około dwóch tygodni w każdym z roztworów 85% i 95% etanolu, a pozostały czas w 100% etanolu. Po trzech zmianach acetonu w temperaturze pokojowej, mózg zostaje zatopiony w tworzywie sztucznym w piecu o temperaturze 60°C.Aby rozpocząć procedurę barwienia sieci naczyniowej tuszem indyjskim, należy potwierdzić brak odruchu wycofania palca, co świadczy o głębokiej anestezji myszy. Następnie należy przeprowadzić perfuzję transkordialną myszy, używając soli fizjologicznej w buforze fosforanowym o temperaturze pokojowej, a następnie 10% neutralnego buforowanego formaliny w temperaturze pokojowej. Perfuzja całego ciała solą fizjologiczną i utrwalaczem jest niezbędna do usunięcia krwi z układu sercowo-naczyniowego oraz utrwalenia tkanek.Następnie należy przeprowadzić perfuzję myszy za pomocą 3,0 ccs nieutrzeźcionego tuszu indyjskiego do perfuzji. Zastosowanie tuszu indyjskiego jest niezbędne do całkowitego wypełnienia naczyń krwionośnych układu sercowo-naczyniowego. Po wyjęciu z organizmu myszy, uzyskany mózg jest odwadniany poprzez serię gradowanych alkoholi etylowych, a następnie zatapiany w plastiku erudite.Postępując zgodnie z opisanym wcześniej protokołem przygotowania KESM do obrazowania, włącz kamerę, iluminator oraz stół, a następnie podnieś nóż i obiektyw. Następnie zainstaluj pierścień na próbkę. Na koniec opuść obiektyw i nóż.Zmierz wymiary preparatu. Następnie utwórz plik konfiguracyjny dla kontrolera stolika KESM. Przed zainicjowaniem stolika należy podnieść nóż oraz obiektyw KESM.Uruchom kontroler stołu KESM stage controller two i zainicjuj stół. Następnie opuść nóż oraz obiektyw i włącz pompę. Ustaw ostrość obiektywu i kamery, obracając pokrętło ostrzenia w układzie optycznym i dostosowując pole widzenia kamery względem krawędzi noża.Klikaj krok po kroku, aby sprawdzić pierwsze etapy obrazowania i sekcjonowania. Następnie kliknij „go”, aby rozpocząć obrazowanie i sekcjonowanie w celu późniejszego przetwarzania obrazów.Uruchom procesor stosu KESM, aby usunąć artefakty oświetlenia i znormalizować intensywność tła we wszystkich obrazach. Powtórz czynność dla wszystkich podfolderów z danymi. Aby zwizualizować dane za pomocą atlasu mózgu KESM, przejdź na tę stronę internetową i wybierz odpowiedni atlas, aby przejść do innej głębokości.Wybierz z menu rozwijanego głębokość dla każdego kroku, a następnie kliknij plus, aby zwiększyć, lub minus, aby zmniejszyć głębokość Z. Inne opcje obejmują przybliżanie obrazu lub nawigację z wykorzystaniem atlasu mózgu KESM. Użyj menu rozwijanego, aby dostosować numer nakładki oraz interwał nakładki w celu wizualizacji danych za pomocą VIS lab.Uruchom aplikację i utwórz nowy projekt. Projekt powinien zawierać funkcję składania obrazu 3D z plików 2D, ustawienie arytmetyki macierzy świata na jeden oraz podgląd 3D. Należy ustawić odpowiednie parametry w takiej kolejności, w jakiej są one pokazane w podglądzie 3D, naciskając prawy przycisk myszy.Przesuń mysz, aby dostosować obszary progowe, które mogą zostać przycięte. Zmienniono orientację, oświetlenie lub włączono/wyłączono tło. Reprezentatywne wyniki KESM są zilustrowane w następujący sposób: klipy wideo pokazują najpierw wizualizacje wolumetryczne KESM, stosy danych z całego mózgu zabarwionego tuszem indyjskim dla zestawu danych naczyniowych, zaczynając od zbliżenia na dane naczyniowe o szerokości około 100 mikronów.Ten drugi klip z KESM przedstawia dane z całego mózgu zabarwionego tuszem indyjskim, ukazując trzy standardowe widoki unaczynienia całego mózgu myszy, pobrane z danych o wysokiej rozdzielczości o szerokości około 10 milimetrów. Widok strzałkowy, widok czołowy i widok poziomy, a także przelot przez przekrój czołowy. W tym klipie wideo zilustrowano dane Golgi z całego mózgu myszy KESM, pokazując przelot wzdłuż trzech różnych płaszczyzn cięcia, zaczynając od widoku bloku, a następnie widoku strzałkowego, czołowego i poziomego.Następnie przedstawiono szczegóły danych GoGy z całego mózgu myszy KESM. Ten pierwszy klip wideo przedstawia móżdżek i komórki Purkinjego. Ten drugi klip pokazuje korę oraz komórki paramitalne.Na koniec KESM. Dane NLE z całego mózgu zostały przedstawione w tych dwóch klipach wideo. Najpierw pokazano zbliżenie danych NLE.Ten drugi klip przedstawia trzy standardowe widoki danych Nle całego mózgu myszy, pobranych z danych o wysokiej rozdzielczości. Pokazano również przekrój poprzeczny, aby zapewnić wyraźny wgląd w struktury wewnętrzne. Ta technika utorowała drogę badaczom w dziedzinie neuronauki do eksploracji sieci neuronalnych i naczyniowych w mózgu myszy.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze zrozumieć zasady przygotowania próbek, obrazowania oraz analizy danych dla skaningowego mikroskopu z ostrzem noża.

specimen-preparation-imaging-analysis-protocols-for-knife-edge

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Źródło: Mukherjee, K., et. al. Analiza mitochondriów mózgu za pomocą seryjnej skaningowej mikroskopii elektronowej. J. Vis. exp. (2016)Ten film pokazuje przygotowanie,  obrazowanie i analiza tkanki mózgowej myszy przy użyciu seryjnego skaningowego mikroskopu elektronowego z blokową powierzchnią czołową (SBFSEM) w celu wizualizacji ultrastruktury mitochondriów, umożliwiając precyzyjne mapowanie ich morfologii i rozmieszczenia przestrzennego w aksonalnych i dendrytycznych przedziałach...

 Obrazowanie mitochondriów neuronalnych za pomocą seryjnego skaningowego mikroskopu elektronowego typu block-face

Pokazana tutaj jest metoda wizualizacji ultrastruktury macierzy zewnątrzkomórkowej w zdecelularyzowanych tkankach serca.

Skaningowa mikroskopia elektronowa zmacerowanej tkanki w celu wizualizacji macierzy zewnątrzkomórkowej

Opisano metodę, dzięki której nanocząstki kropek kwantowych (QD) mogą być używane do korelacyjnych badań immunocytochemicznych osadzonych w żywicy epoksydowej ludzkiej tkance patologicznej. Stosujemy komercyjne QD sprzężone z fragmentami przeciwciał, które są wizualizowane za pomocą szerokokątnej fluorescencyjnej mikroskopii świetlnej i transmisyjnej mikroskopii elektronowej.

Korelacyjna mikroskopia świetlna i elektronowa z wykorzystaniem nanocząstek kropek kwantowych

Ten raport opisuje protokół przygotowania próbki i specyficzne warunki obrazowania do wykonywania skaningowej transmisyjnej tomografii elektronowej grubych próbek biologicznych.

Przygotowanie i obserwacja grubych próbek biologicznych metodą skaningowej transmisyjnej tomografii elektronowej

To badanie przedstawia niezawodne i łatwe procedury uzyskiwania seryjnych ultracienkich odcinków mikroorganizmu bez drogiego sprzętu w transmisyjnej mikroskopii elektronowej.

Metoda otrzymywania seryjnych ultracienkich przekrojów mikroorganizmów w transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Ten protokół jest ukierunkowany na konkretne komórki w tkance do obrazowania w rozdzielczości nanoskali za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego (SEM). Duża liczba seryjnych odcinków materiału biologicznego zatopionego w żywicy jest najpierw obrazowana w mikroskopie świetlnym w celu identyfikacji celu, a następnie w sposób hierarchiczny w SEM.

Multimodalne hierarchiczne obrazowanie odcinków szeregowych w celu znalezienia określonych celów komórkowych w dużych objętościach

Tutaj prezentujemy protokół łączenia dwóch technik przetwarzania próbek, zamrażania wysokociśnieniowego i przetwarzania próbek wspomaganego mikrofalami, a następnie minimalnego zatapiania żywicy w celu pozyskiwania danych za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego z skupioną wiązką jonów (FIB-SEM). Wykazano to przy użyciu próbki nerwu piszczelowego myszy i Caenorhabditis elegans.

Przygotowanie próbki biologicznej poprzez zamrażanie pod wysokim ciśnieniem, wspomagane mikrofalami wzmocnienie kontrastu i minimalne zatapianie żywicy w celu obrazowania objętościowego

Przedstawiamy protokół do badania rozkładu mitochondriów i retikulum endoplazmatycznego w całych komórkach po modyfikacji genetycznej za pomocą korelacyjnej mikroskopii elektronowej światła i objętości, w tym barwienia peroksydazą askorbinianową 2 i peroksydazy chrzanowej, seryjnego cięcia komórek z i bez genu docelowego w tej samej sekcji oraz seryjnego obrazowania za pomocą mikroskopii elektronowej.

Obrazowanie mitochondriów i retikulum endoplazmatycznego za pomocą korelacyjnej mikroskopii świetlnej i objętościowej

Tutaj prezentujemy szczegółowe protokoły przetwarzania dla obrazowania delikatnych próbek tkanek za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM). Opisano trzy różne metody przetwarzania, a mianowicie suszenie chemiczne heksametylu disilazana (HMDS), proste suszenie powietrzem i suszenie w punkcie krytycznym dla przygotowania sztywnych skorupek jaj, zarodków we wczesnych stadiach rozwojowych i kultur grzybów.

Przetwarzanie zarodków, skorupek jaj i kultur grzybów do skaningowej mikroskopii elektronowej

Ten protokół przedstawia rutynową metodę korzystania z seryjnej skaningowej mikroskopii elektronowej (SBF-SEM), potężnej techniki obrazowania 3D. Skuteczne zastosowanie SBF-SEM zależy od prawidłowych technik utrwalania i barwienia tkanek, a także od starannego rozważenia ustawień obrazowania. Protokół ten zawiera praktyczne rozważania dotyczące całego tego procesu.

Seryjna skaningowa mikroskopia elektronowa ze skaningiem blokowym (SBF-SEM) próbek tkanek biologicznych

Wprowadziliśmy nowatorską technikę obrazowania zwaną Optical Multilayer Interference Tomography (OMLIT), która umożliwia bezstronne obrazowanie wszystkich komórek w próbkach mózgu na mezoskali i może być płynnie zintegrowana z procesem obrazowania taśmowej szeregowej skaningowej mikroskopii elektronowej na tej samej próbce.

Metoda optycznego obrazowania zgodna z mikroskopią skaningową do mezoskopowego mapowania mózgu w całych komórkach

Poznaj kompleksowe protokoły przygotowania próbek mózgu myszy do mikroskopii skaningowej KESM, obejmujące utrwalanie, barwienie i osadzanie tkanek. Ta metoda umożliwia wizualizację sieci neuronowych i naczyniowych z rozdzielczością submikrometrową.

Protokoły przygotowania próbek, obrazowania i analizy dla mikroskopii skanującej krawędzią noża

Przeglądaj więcej filmów