Name: Indukcja i monitorowanie adopcyjnej nadwrażliwości typu opóźnionego u szczurów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-10-01T00:00:00.000+00:00
Duration: 22 min 6 s
Description: Poznaj metodę indukcji adopcyjnej nadwrażliwości typu opóźnionego u szczurów Lewis. Protokół obejmuje aktywację komórek T pamięci efektorowej, ich iniekcję oraz monitorowanie odpowiedzi zapalnej w uchu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy dr. Alexanderowi Flugelowi (Martinsried, Niemcy) za udostępnienie linii limfocytów T specyficznych dla owalbuminy, znakowanych GFP, wykorzystanej w niniejszym protokole.

1. Stymulacja limfocytów T specyficznych dla owalbuminy
Spoczynkowe limfocyty T specyficzne dla owalbuminy stymuluje się owalbuminą w obecności napromieniowanych tymocytów szczura Lewis (30 Gy) pełniących rolę komórek prezentujących antygen (APCs), w ośrodku stymulującym (przygotowanym w DMEM + Pen/Strep/L-Glut + NEAA + RPMI Vitamins + 2ME + surowica szczura + owalbumina, w stężeniach końcowych podanych na liście materiałów).
Przygotowanie surowicy szczura
<ol>
<li>Pobieramy surowicę od szczurów poświęcanych jako dawców grasicy.</li>
<li>Szczury zostają poddane głębokiej anestezji poprzez inhalację halotanem, a następnie, przy użyciu strzykawek 10 ml i igieł 23 G 1", poprzez perfuzję serca pobierana jest jak największa ilość krwi (5-10 ml na szczura), po czym szczury są bezzwłocznie dekapitowane w celu potwierdzenia śmierci.</li>
<li>Pozostawia się krew do skrzepnięcia przez 10 min w temperaturze 37°C, a następnie przez 10 min na lodzie.</li>
<li>Skrzep zostaje usunięty, a pozostała ciecz poddana wirowaniu.</li>
<li>Surowicę zbiera się, filtruje sterylnie i przechowuje w temperaturze -20°C.</li>
</ol>
Przygotowanie komórek prezentujących antygen
<ol>
<li>Za pomocą sterylnych narzędzi pobierz grasicę od od decapitated szczura i umieść ją w PBS z penicyliną i streptomycyną (PBS-PS) w temperaturze 0°C.</li>
<li>Przenieś grasicę do komory z laminarnym przepływem powietrza, oczyść ją z zakrzepów krwi i innych zanieczyszczeń tkankowych, a następnie pokrój na małe kawałki bezpośrednio do sitka komórkowego (Fisher # 08-771-2) umieszczonego w szalce Petriego o średnicy 10 cm zawierającej 10 ml PBS-PS.</li>
<li>Każdy kawałek tkanki przeciśnij przez sitko komórkowe, używając tłoka sterylnej strzykawki 1 ml. Zbierz zawiesinę pojedynczych komórek do probówki 50 ml w temperaturze 0°C.</li>
<li>Przepłucz sitko komórkowe dodatkowymi 20-40 ml PBS-PS. Odwiruj zawiesinę z prędkością 1250g, a następnie resuspenduj osad w PBS-PS (5 ml na jedną grasicę) w temperaturze 0°C.</li>
<li>Naświetl tę zawiesinę (30 Gy) w irradiatorze gamma i natychmiast przemyj ją dwukrotnie 50 ml PBS-PS. Uwaga: Najlepszymi dawcami grasicy są młode dorosłe szczury w wieku 5-7 tygodni. Można stosować szczury do 10 tygodnia, jednak liczba komórek z czasem maleje. Płeć nie ma znaczenia, choć zdarza się twierdzić, że samce są lepszymi dawcami grasicy. My zawsze stosujemy samice, ponieważ wszystkie nasze zwierzęta są kwaterowane w tym samym pomieszczeniu, a nie chcemy trzymać samców i samic razem. </li>
</ol>
Stymulacja
<ol>
<li>Jednorazowo przemyj limfocyty T, a następnie je policz.</li>
<li>Policz komórki prezentujące antygen (APC).</li>
<li>W 10 cm szalce Petriego zawierającej 10 ml medium stymulującego wymieszaj 3 x 106 limfocytów T specyficznych dla owalbuminy z 150 x 106 APC.</li>
<li>Inkubuj przez 48 godzin w temperaturze 37°C.</li>
</ol>
2. Adopcyjny transfer limfocytów T specyficznych dla owalbuminy
<ol>
<li>Jako biorców wykorzystujemy samice szczurów w wieku 7-10 tygodni.</li>
<li>Należy policzyć limfocyty T; powinny być duże i okrągłe. Komórki prezentujące antygen będą martwe.</li>
<li>Limfocyty T należy odwirować, a następnie resuspender w PBS w stężeniu 10 x 106 cells/ml.</li>
<li>Wstrzyknąć 1 ml drogą doszpikową, używając strzykawek 3 ml i igieł 23 G 1".</li>
</ol>
3. Wywołanie reakcji poprzez podanie antygenu do ucha
<ol>
<li>Dwa dni po transferze adopcyjnym wstrzyknij 20 μl roztworu owalbuminy o stężeniu 1 mg/ml (= antygen właściwy) do jednego ucha oraz sól fizjologiczną (lub antygen niewłaściwy) do drugiego ucha. NIE filtruj roztworu antygenu, ponieważ może to doprowadzić do utraty agregatów wzmacniających reakcję zapalną. Uwaga: Szczury powinny być poddane znieczuleniu, aby uniknąć ich ruchów. Jeśli jesteś praworęczny, przytrzymaj ucho między lewym kciukiem a palcem wskazującym, tak aby palec wskazujący znajdował się wewnątrz ucha, a szczur był zwrócony w Twoją stronę. </li>
<li>Wstrzyknij roztwór w małżowinę uszną, używając igieł 27G ½". Staraj się wstrzykiwać preparat wszystkim szczurom dokładnie w tym samym miejscu.</li>
</ol>
4. Pomiar DTH
<ol>
<li>Ucho zacznie czerwienieć i puchnąć, co będzie oznaką stanu zapalnego. Zmierz grubość każdego ucha za pomocą mikrometru z zapadką (na przykład model PK-0505 firmy Mitutoyo).</li>
<li>Wykonaj 5-6 pomiarów dla każdego ucha w każdym punkcie czasowym i oblicz średnią.</li>
<li>Maksymalny obrzęk powinien wystąpić między 24 a 72 godzinami.</li>
</ol>

<ol><li>Beeton, C., Barbaria, J., Devaux, J., Benoliel, A. -M., Gola, M., Sabatier, J. -M., Bernard, D., Crest, M., Beraud, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+blocking+of+voltage-gated+K%2B+channels+treats+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+and+inhibits+T-cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Selective blocking of voltage-gated K+ channels treats experimental autoimmune encephalomyelitis and inhibits T-cell activation.</a> J. Immunol. , 166-936 (2001).</li>
<li>Beeton, C., Chandy, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+and+monitoring+of+active+delayed+type+hypersensitivity+%28DTH%29in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Induction and monitoring of active delayed type hypersensitivity (DTH)in rats.</a> J Vis Exp. (5), (2007).</li>
</ol>

Wyzwanie antygenowe można przeprowadzić również w innych miejscach, na przykład w skórze pleców (2). Uważamy jednak, że wykorzystanie małżowiny usznej, jak pokazano w tym filmie, pozwala na najdokładniejszy pomiar reakcji DTH.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>12430-062</td><td>500ml</td></tr><tr><td>Pirowinian sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8636</td><td>stężenie końcowe 1 mM, w pożywce do stymulacji</td></tr><tr><td>Penicylina &amp;#8211; Streptomycyna &amp;#8211; L-Glutamina</td><td>Cambrex/BioWhittaker</td><td>17-718R</td><td>odpowiednio 100 u/ml - 100 &amp;#x03BC;g/ml - 4 mM, stężenie końcowe, w pożywce do stymulacji</td></tr><tr><td>Niezbędne aminokwasy nieistotne</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R7131</td><td>NEAA, stężenie końcowe 1%, w pożywce do stymulacji</td></tr><tr><td>Witaminy RPMI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R7256</td><td>stężenie końcowe 1%, w pożywce do stymulacji</td></tr><tr><td>beta-merkapto&amp;#8211;etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td>2ME, stężenie końcowe 50 &amp;#x03BC;M, w pożywce do stymulacji</td></tr><tr><td>Syngeniczne serum szczura</td><td></td><td></td><td>stężenie końcowe 1%. Patrz wyjaśnienie w protokole.</td></tr><tr><td>Owalbumina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5503</td><td>stężenie końcowe 10 &amp;#x03BC;g/ml, w pożywce do stymulacji.</td></tr></tbody></table>

indukcja i monitorowanie adoptywnej nadwrażliwości opóźnionej u szczurów

Induction and Monitoring of Adoptive Delayed-Type Hypersensitivity in Rats

Opóźniona nadwrażliwość (DTH) to reakcja zapalna pośredniczona przez limfocyty T pamięci efektorowej wykazujące ekspresję receptora CCR7, które infiltrują miejsce wstrzyknięcia antygenu, przeciwko któremu układ odpornościowy został uprzednio uwrażliwiony. Reakcja zapalna charakteryzuje się zaczerwienieniem i obrzękiem w miejscu podania antygenu. Jest to wygodny model do określania skuteczności immunosupresantów in vivo. Skórną reakcję DTH można wywołać poprzez adoptywny transfer antygenowo-specyficznych limfocytów T lub poprzez aktywną immunizację antygenem, a następnie wewnątrzskórne podanie tego antygenu w celu wywołania reakcji zapalnej w określonym obszarze skóry. Odpowiedzi DTH można indukować za pomocą różnych antygenów, na przykład owalbuminy, tuberkuliny, toksoidu tężcowego lub hemocyjaniny z małży z rodzaju Keyhole. Takie reakcje można wywołać również przeciwko autoantygenom, na przykład przeciwko białku zasadownemu mieliny (MBP) u szczurów z eksperymentalnym autoimmunologicznym zapaleniem mózgu i rdzenia indukowanym MBP, co stanowi model zwierzęcy stwardnienia rozsianego (1).

W niniejszym materiale demonstrujemy, jak wywołać adoptywną reakcję DTH u szczurów linii Lewis. Najpierw stymulujemy in vitro limfocyty T specyficzne dla owalbuminy, a następnie wstrzykujemy te aktywowane komórki do jamny szczurów naiwnych. Po dwudniowym okresie równowagowania komórek in vivo, podajemy szczurom owalbuminę do małżowiny jednego ucha, podczas gdy do drugiego ucha wstrzykujemy sól fizjologiczną. Reakcja zapalna będzie widoczna w czasie od 3 do 72 godzin później; grubość ucha zostanie zmierzona jako wskaźnik nasilenia reakcji DTH.

Opóźniona nadwrażliwość (DTH) jest reakcją zapalną pośredniczoną przez limfocyty T pamięci efektorowej (TEM) wykazujące ekspresję CCR7. W niniejszym materiale demonstrujemy, jak aktywować swoiste dla antygenu komórki TEM, indukować adopcyjną reakcję DTH u szczurów linii Lewis oraz monitorować odpowiedź zapalną.

Indukcja i monitorowanie adoptywnej nadwrażliwości opóźnionej u szczurów

Opóźniona nadwrażliwość (DTH) jest reakcją zapalną pośredniczoną przez limfocyty T pamięci efektorowej CCR7+, które infiltrują miejsce wstrzyknięcia...

Nazywam się Christine Beaton. Jestem asystentem badawczym w laboratorium George'a Chen w Katedrze Fizjologii i Biofizyki Uniwersytetu Kalifornijskiego w Irvine. W ciągu najbliższych kilku dni zaprezentuję Państwu procedurę indukowania i pomiaru adaptacyjnej reakcji opóźnionej nadwrażliwości (DTH) u szczurów rasy Lewis.Cała procedura trwa pięć dni i w ramach tego materiału pokażę Państwu, jak aktywować limfocyty T specyficzne dla antygenu, a następnie, dwa dni później, wstrzyknąć je do organizmów naiwnych szczurów. Kolejne dwa dni później poddamy szczury próbie prowokacyjnej, aplikując w uszy antygen, względem którego limfocyty T są specyficzne. Dzień później zmierzymy stopień stanu zapalnego u tych zwierząt.Aby uzyskać surowicę do hodowli tkankowych, muszę pobrać krew. W tym celu wykonuję punkcję serca. Kładę lewy palec wskazujący na splot słoneczny, a następnie wprowadzam igłę w kierunku serca, przechodząc między żebrami, i aspiruję jak największą ilość krwi.Z jednego pobrania, w zależności od dnia i wydajności, możemy uzyskać od 2 do 10 ml krwi od danego szczura. Serum jest nam niezbędne w hodowli, ponieważ chcemy hodować komórki szczura rasy Lewis w serum syngeneicznym. W związk

induction-monitoring-adoptive-delayed-type-hypersensitivity

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Indukcja i monitorowanie uodpawiedzi nadwrażliwości opóźnionej u szczurów

W tym filmie zaprezentowano indukcję oraz ocenę kliniczną modelu zwierzęcego stwardnienia rozsianego: przewlekłego nawracającego eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia u szczurów linii DA. Choroba, wywołana immunizacją szczurów emulsją zawierającą cały rdzeń kręgowy szczura i pełny adiuwant Freunda, wykazuje objawy kliniczne przypominające przebieg choroby u ludzi.

Indukcja i ocena kliniczna przewlekłej postaci nawrotowej eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia

Opóźniona nadwrażliwość (DTH) jest reakcją zapalną pośredniczoną przez CCR7-efektorowe limfocyty T pamięci. W niniejszej pracy demonstrujemy, jak indukować aktywną reakcję DTH u szczurów linii Lewis oraz monitorować odpowiedź zapalną.

Indukcja i monitorowanie aktywnej nadwrażliwości opóźnionej (DTH) u szczurów

W niniejszym materiale prezentujemy metodę indukowania oraz rejestrowania przebiegu reakcji nadwrażliwości opóźnionej (DTH) w uchu szczura. Następnie demonstrujemy przygotowanie tkanki ucha szczura do obrazowania dwufotonowego odpowiedzi efektorowych i pamięciowych limfocytów T.

Obrazowanie limfocytów T pamięci efektorowej w uchu po indukcji adoptywnej reakcji nadwrażliwości opóźnionej

W niniejszym filmie przedstawiono sposób indukowania autoimmunologicznego zapalenia przysadki u myszy szczepu SJL oraz metodę oceny stopnia jego nasilenia za pomocą badania histopatologicznego.

Indukcja eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia przysadki u myszy szczepu SJL

Opisujemy wartościowy test diagnostyczny, który mógłby potencjalnie służyć do podejmowania decyzji o odstawieniu immunosupresji po transplantacji, bez zwiększania ryzyka odrzucenia przeszczepu. Test ten opiera się na zasadach nadwrażliwości opóźnionej i umożliwia dokładną ocenę zarówno efektorowych, jak i regulacyjnych odpowiedzi immunologicznych specyficznych dla dawcy, generowanych przez biorców.

Test opóźnionej nadwrażliwości trans-vivo w badaniu regulacji specyficznej dla antygenu

Tutaj prezentujemy protokół indukcji tolerancji w transplantacji i oceniamy in vitro i in vivo zdolność tłumienia różnych podzbiorów komórek od biorcy oraz status immunologiczny biorcy wobec dawcy lub egzogennych antygenów.

Ocena in vitro i in vivo aktywności supresyjnej komórek T, B i mieloidalnych oraz odpowiedzi humoralnych u biorców przeszczepów

Opisujemy tutaj metody leczenia noworodków kapsaicyną w celu wywołania atopowego zapalenia skóry u szczurów oraz ekspozycję na odparowany formaldehyd, aby zbadać wpływ inhalacji formaldehydu na atopowe zapalenie skóry.

Skutki narażenia na działanie formaldehydu na szczurzy model atopowego zapalenia skóry wywołanego leczeniem kapsaicyną u noworodków

Ten protokół wykorzystuje mieszane peptydy G6PI do konstruowania modeli reumatoidalnego zapalenia stawów, które są bliższe modelom ludzkiego reumatoidalnego zapalenia stawów w limfocytach T CD4+ i cytokinach. Niezmienne limfocyty T NK o wysokiej czystości (głównie iNKT2) o określonych fenotypach i funkcjach uzyskano przez indukcję in vivo i oczyszczanie in vitro do immunoterapii adoptywnej.

Immunoterapia adoptywna komórek iNKT u myszy RZS indukowanych izomerazą glukozo-6-fosforanową (G6PI)

Nadwrażliwość kontaktowa (CHS) to mysi eksperymentalny model alergicznego kontaktowego zapalenia skóry (ACD). CHS opiera się na uczuleniu na reaktywny hapten poprzez malowanie ogolonej skóry klatki piersiowej i brzucha, a następnie prowokację skóry ucha rozcieńczonym haptenem, powodując reakcję obrzęku, która jest oceniana na różne sposoby.

Nadwrażliwość kontaktowa jako mysi model alergicznego kontaktowego zapalenia skóry

Tutaj prezentujemy zwięzły protokół tworzenia modelu wcześniaka, ułatwiający badania nad wczesnym leczeniem bólu poporodowego. Metoda polega na wykonaniu cesarskiego cięcia na trzy dni przed spodziewanym porodem, ekstrakcji wcześniaków poprzez histerektomię i zintegrowaniu ich z biologicznym potomstwem matki zastępczej.

Model wcześniaka do badań nad bólem

Badanie pokazuje rolę skóry w modulacji odpowiedzi immunologicznych u myszy poprzez immunizację epikutanną (EC). Szczepienie EC antygenem białkowym może hamować odpowiedzi immunologiczne w przypadku nadwrażliwości kontaktowej lub odwracać supresję indukowaną przez skórę, gdy jest połączona z molekularnymi wzorcami związanymi z patogenem. Szczepienia EC wykazują obiecujące zastosowanie jako skuteczne, bezigłowe podejście do immunoterapii.

Model murinowy immunomodulacji indukowanej przez skórę

Poznaj metodę indukcji adopcyjnej nadwrażliwości typu opóźnionego u szczurów Lewis. Protokół obejmuje aktywację komórek T pamięci efektorowej, ich iniekcję oraz monitorowanie odpowiedzi zapalnej w uchu.

Indukcja i monitorowanie adoptywnej nadwrażliwości opóźnionej u szczurów

Przeglądaj więcej filmów