Indukcja i monitorowanie adoptywnej nadwrażliwości opóźnionej u szczurów

Nazywam się Christine Beaton. Jestem asystentem badawczym w laboratorium George'a Chen w Katedrze Fizjologii i Biofizyki Uniwersytetu Kalifornijskiego w Irvine. W ciągu najbliższych kilku dni zaprezentuję Państwu procedurę indukowania i pomiaru adaptacyjnej reakcji opóźnionej nadwrażliwości (DTH) u szczurów rasy Lewis.

Cała procedura trwa pięć dni i w ramach tego materiału pokażę Państwu, jak aktywować limfocyty T specyficzne dla antygenu, a następnie, dwa dni później, wstrzyknąć je do organizmów naiwnych szczurów. Kolejne dwa dni później poddamy szczury próbie prowokacyjnej, aplikując w uszy antygen, względem którego limfocyty T są specyficzne. Dzień później zmierzymy stopień stanu zapalnego u tych zwierząt.

Aby uzyskać surowicę do hodowli tkankowych, muszę pobrać krew. W tym celu wykonuję punkcję serca. Kładę lewy palec wskazujący na splot słoneczny, a następnie wprowadzam igłę w kierunku serca, przechodząc między żebrami, i aspiruję jak największą ilość krwi.

Z jednego pobrania, w zależności od dnia i wydajności, możemy uzyskać od 2 do 10 ml krwi od danego szczura. Serum jest nam niezbędne w hodowli, ponieważ chcemy hodować komórki szczura rasy Lewis w serum syngeneicznym. W związku z tym będzie to serum szczura rasy Lewis.

Następnie przenoszę krew do probówki, uważając, aby zdjąć igłę z strzykawki, aby uniknąć hemolizy, ponieważ chcę wykorzystać surowicę do hodowli tkankowej w późniejszym czasie. Teraz usunę grasicę, ponieważ serce przestało bić i szczur nie żyje.

Najpierw spryskuję obszar 70% ethanol로, aby upewnić się, że żadne włoski nie będą latać i nie dostaną się do narządu, ponieważ jest on przeznaczony do hodowli tkankowej. Do przeprowadzenia sekcji używam narzędzi autoklawowanych. W pierwszej kolejności usuwam skórę.

Po usunięciu skóry ostrożnie wykonuję nacięcia po obu stronach klatki piersiowej, aby upewnić się, że nie uszkodzę grasicy znajdującej się tuż nad sercem. Grasica jest tutaj widoczna jako blady, niemal biały organ położony bezpośrednio nad sercem. Usuwam ją, dbając o to, aby wyciąć cały organ, jednak nie staram się robić tego zbyt precyzyjnie, ponieważ później oczyścimy go w komorze z laminarnym przepływem powietrza.

Następnie umieszczam go w probówce zawierającej PBS uzupełniony o penicylinę i streptomycynę. Aby zapobiec wzrostowi bakterii, przygotuję teraz zawiesinę pojedynczych komórek. W tym celu użyję sitka komórkowego o oczkach 70 µm.

Oczywiście będę używać wyłącznie sterylnego sprzętu. Przenoszę grasicę do szalki Petriego. Jak widać, nie jest ona zbyt czysta.

grasica jest organem o białym zabarwieniu, na którym znajdują się węzły chłonne i skrzepy krwi. Dlatego zamierzam je usunąć. Do przesiewacza do komórek wleję około 10 ml PBS z dodatkiem antybiotyków, aby był przygotowany na przyjęcie oczyszczonej grasicy.

Aby go oczyścić, po prostu usuwam wszystkie zanieczyszczenia z grasicy. Teraz moja grasica jest niemal całkowicie czysta, więc chwycę ją pęsetą, pokroję na małe kawałki nożyczkami nad filtrem do komórek (cell strainer) i umieszczę wszystkie małe fragmenty grasicy wewnątrz filtra. Po zakończeniu tej czynności użyję tłoka sterylnej strzykawki o pojemności 1 mL, aby przygotować zawiesinę pojedynczych komórek, przeciskając kawałki grasicy przez filtr do komórek.

Pojedyncze komórki przejdą przez sito i znajdą się w moim PBS po zewnętrznej stronie separatora komórek. Teraz, gdy przecisnąłem komórki przez separator, widać, że PBS nie jest już przejrzysty. Jest wypełniony zawiesiną pojedynczych komórek, którą przeniosę do probówki 50 ml przechowywanej w lodzie.

Procedurę tę powtórzę kilka razy, ponownie napełniając sitko do komórek PBS, naciskając tłok strzykawki i przenosząc płyn do probówki, aż w probówce znajdzie się od 30 do 40 ml PBS. Tak wygląda sitko do komórek po zakończeniu tego etapu. Po zebraniu wszystkich komórek poddam je wirowaniu przez około 10 minut przy 1200 RPM.

Oto komórki, które wyjęłam z wirówki; osad jest dość duży, co jest spodziewane, ponieważ teraz pozbywam się supernatantu. Osad oczywiście wciąż znajduje się na dnie probówki. Aby ułatwić resuspensję, rozbiję osad, gdy jest on jeszcze niemal suchy.

W tym celu uderzam w probówkę palcem dość mocno, aż do momentu, gdy widać, że pelet jest całkowicie rozbity i ponownie otrzymaliśmy zawiesinę pojedynczych komórek. Teraz resuspenduję komórki w sterylnym PBS, dodając 5 mL PBS na każdą probówkę. Ponieważ mam tylko jedną probówkę, dodaję 5 mL.

Oto zawiesina, którą przeniosę do irradiatora. Stosowany przeze mnie poziom napromieniowania to 30 Gy, aby upewnić się, że komórki nadal żyją, ale obumrą w ciągu kilku godzin. Dzięki temu będą one w stanie przetworzyć antygen, lecz nie zanieczyszczą mojej hodowli.

Jeśli przyjrzymy się limfocytom T, które chcemy aktywować, zauważymy, że nie wyglądają one wcale zdrowo. Niektóre z nich zaczęły obumierać. Mają dziwne kształty i nie są już wykrywalne.

Komórki te są zatem gotowe do aktywacji. Po czasie inkubacji są one w rzeczywistości „spragnione” antygenu. Niezwykle ważne jest ich szybkie wypłukanie, ponieważ niektóre z nich obumrą i uwolnią do roztworu związki toksyczne.

Następnie dopełniam probówkę do 50 ml roztworem PBS. Jednocześnie przenoszę limfocyty T oczekujące na stymulację do drugiej probówki o pojemności 50 ml, aby móc wirować obie probówki w tym samym czasie.

Oto krew, którą pobrałem jakiś czas temu; pozostawiłem ją na 10 minut w temperaturze 37°C, a następnie umieściłem na lodzie. Jak widać, krew całkowicie skrzepła. Teraz muszę oddzielić z niej surowicę.

Aby zebrać surowicę w pierwszym kroku, użyję sterylnej pipety Pasteura, aby oddzielić skrzep od ścianek probówki i zebrać cały płyn zawierający interesujące mnie serum, a także niektóre komórki, które nie zostały uwięzione w skrzepie. Następnie przeniosę ten płyn do drugiej probówki. Podczas przenoszenia czasami odrywają się małe fragmenty skrzepu, ale nie stanowi to dużego problemu, ponieważ i tak muszę usunąć komórki, które wciąż znajdują się w tym płynie.

Następnie odwiruję moją probówkę z cieczą. Pozwoli to usunąć komórki oraz wszelkie fragmenty skrzepu. Teraz odwiruję płynną część krwi, aby oddzielić komórki od surowicy. Wirowanie przez dwie minuty będzie wystarczające.

Surowica została już odwirowana, więc teraz usunę ją z komórek. Nie jest to idealny przykład, ponieważ surowica powinna mieć żółtawy kolor, a ta jest czerwona, co świadczy o wystąpieniu hemolizy. Mimo że nie jest to przykład wzorcowy, pokażę Państwu sposób jej filtrowania.

Używam strzykawki z filtrem 0,2 µm i zamierzam przefiltrować surowicę, aby upewnić się, że jest sterylna. Jednak ze względu na wystąpienie hemolizy, nie wykorzystam tej partii surowicy do stymulacji. Użyję surowicy szczura rasy Louis, która została zamrożona podczas poprzedniego eksperymentu.

Oto probówki z limfocytami T po lewej stronie i komórkami prezentującymi antygen po prawej. Teraz usunę supernatant z obu probówek. Następnie, tak jak wcześniej, rozbiję osady, stukując palcem w dno, aby upewnić się, że komórki znów tworzą zawiesinę pojedynczych komórek.

Przeprowadzę tę procedurę dla obu zestawów komórek: limfocytów T oraz komórek prezentujących antygen. Następnie zawieszę je i dokonam ich policzenia. Potem zmieszam 3 miliony limfocytów T z 150 milionami komórek prezentujących antygen i umieszczę je w czalkach Petriego o średnicy 10 centymetrów.

Przy całkowitej objętości 10 ml mamy tutaj dwie probówki z surowicą. Po prawej stronie znajduje się probówka przygotowana dzisiaj; ma ona czerwonawy kolor z powodu hemolizy, natomiast po lewej jest probówka przygotowana kilka dni temu i przechowywana w zamrożeniu. Ma ona żółtawy kolor i nie wykazuje hemolizy, co jest znacznie lepszym wynikiem.

Tego właśnie użyję dzisiaj do hodowli tkankowej. Mam wystarczającą liczbę komórek, aby zasiedlić sześć szalek Petriego, więc do komórek prezentujących antygen wleję 30 ml pożywki, a do limfocytów T 30 ml tej samej pożywki. Następnie do probówki z komórkami prezentującymi antygen dodam antygen, którym jest albuminowy koniugat.

Mój roztwór zapasowy ma stężenie 1 mg/ml, a końcowe stężenie w szalkach Petriego powinno wynosić 10 µg/ml. Do komórek T dodam surowicę szczura rasy Lewis. Dodam jej tyle, aby w szalkach Petriego ostatecznie uzyskać 1% surowicy szczura.

Zamierzam zhomogenizować zawiesinę komórek prezentujących antygen, a następnie przenieść 5 ml tej zawiesiny komórkowej do każdej z moich szalek Petriego. Po wyjęciu zawiesiny komórek prezentujących antygen zauważą Państwo, że zawsze pojawia się niewielka grudka tłuszczu i tkanki włóknistej. Jest to zjawisko całkowicie normalne.

Pojawia się to podczas wszystkich naszych przygotowań podłoża. Nie jest to powód do niepokoju. Dlatego po prostu usuwam to, jeśli mi się uda, w przeciwnym razie pozostawiam to w szalce Petriego.

Nie wpływa to w żaden sposób na moją hodowlę komórkową. Gdy już przeniosę wszystkie APC do naczyń Petriego, powtórzę tę procedurę z limfocytami T. Do każdego z tych naczyń Petriego dodam 5 mL zawiesiny limfocytów T.

Wszystkie komórki znajdują się już w szalkach Petriego; bardzo ważne jest, aby dokładnie je wymieszać, tak aby wszystkie limfocyty T miały możliwość kontaktu z komórką prezentującą antygen. W tym celu układam szalki w stosie i mieszam zawartość, kreśląc szalkami niewidoczne ósemki. Powtarzam tę czynność kilka razy, aby upewnić się, że wszystkie komórki zostały dobrze wymieszane.

Po zakończeniu mieszania, przełożę naczynia do inkubatora w wilgotnej atmosferze w temperaturze 37°C i 5%CO2. Pozostawię je w inkubatorze na 48 godzin. Po tym czasie pożywka nieco zmieniła kolor na bardziej pomarańczowy, a komórki zostały odpowiednio aktywowane.

Następnie sprawdzam wszystkie szalki Petriego jedna po drugiej pod mikroskopem. Bardzo duże komórki to aktywowane limfocyty T, a bardzo małe to martwe komórki prezentujące antygen. Stymulacja przebiegła bardzo dobrze, co widać po ogromnym rozmiarze limfocytów T.

A jeśli lekko przesunę szalkę Petriego, ojej, widzą Państwo po lewej stronie, a teraz w centrum, znajduje się duża skupisko komórek – są to komórki aktywnie się dzielące. Teraz przeniosę wszystkie komórki do probówek do wirowania, aby móc je odwirować, policzyć, a następnie wstrzyknąć 10 milionów szczurom. Stymulacja była tak skuteczna, że nie potrzebuję wszystkich tych limfocytów T do wstrzyknięcia jednemu szczurowi.

Zatem użyję komórek pochodzących tylko z dwóch szalek Petriego. Odwirować je, aby odseparować 10 milionów komórek do iniekcji, a pozostałe komórki umieszczę w hodowli, aby zamrozić je za kilka dni.

Pożywka hodowlana to standardowa pożywka do hodowli limfocytów T z dodatkiem czynnika wzrostu limfocytów T oraz surowicy konia. Ponieważ limfocyty T są nieadherentne, nie muszę podejmować wielu działań. Upewniam się jedynie, że większość komórek zostanie przeniesiona wraz z pożywką.

Na koniec przepłuczę wszystkie płytki Petriego nową pożywką, aby upewnić się, że odzyskałam wszystkie komórki. Użyję 10 ml pożywki, tej samej, której używałam do stymulacji. Myślę, że w każdej płytce Petriego większość limfocytów T została już pobrana wraz z pierwszą porcją pożywki. Zazwyczaj pożywka wypływa z płytki, więc nie jest to absolutnie konieczne, ale ponieważ te komórki są cenne, nie chcę stracić żadnej z nich.

Zatem odwiruję je. Pozwoli to usunąć część martwych komórek i w ten sposób rozpocznę pracę z komórkami. Chcę im również podać świeżą pożywkę.

Ponownie wirować będę z prędkością 1 500 RPM przez około osiem minut. Pozostawiam włączony hamulec, ponieważ jedynie pelletuję komórki. Następnie odstawiamy obie probówki i w jednej z nich widzę małe pellety.

To pochodzi z dwóch szalek Petriego. A tutaj znajduje się osad z czterech szalek Petriego. Osady są duże, ponieważ nie zawierają one tylko aktywowanych limfocytów T, ale także komórek prezentujących antygen.

Teraz odlejemy supernatant, a do komórek przeznaczonych do wstrzyknięcia dodam 1 mL pożywki, w której zostaną one zawieszone. Pozostałe komórki zawieszę w 100 mL pożywki hodowlanej z czynnikiem wzrostu limfocytów T i surowicą konia. To są komórki, które zostaną wstrzyknięte.

Następnie komórki te przeniosę do dwóch kolb o pojemności 50 ml każda. Do każdej kolby dodam 10% czynnika wzrostu limfocytów T, pochodzenia kostnego. Dodam również 10% serum konia inaktywowane ciepłem.

Następnie dodaję większość potrzebnej pożywki. Nie pipetuję jej wielokrotnie w górę i w dół, ponieważ limfocyty T nie tolerują intensywnego pipetowania. Pipetuję je zatem w minimalnych, absolutnie niezbędnych ilościach, a po zakończeniu są one gotowe.

Są gotowe do umieszczenia w inkubatorze, będę je sprawdzać codziennie. Prawdopodobnie będę musiał je rozdzielić po 24 godzinach, jeśli nie po 40, to na pewno po 48 godzinach. Będę je jednak sprawdzać każdego dnia.

Wykazują one tendencję do bardzo szybkiego wzrostu w obecności czynnika wzrostu limfocytów T. Dlatego muszą być pasażowane co najmniej co 48 godzin, a prawdopodobnie częściej. Sprawdzę również kolor pożywki hodowlanej.

Teraz są aktywowane, zatem są w pełni aktywne. To najlepszy moment, aby wstrzyknąć je szczurowi. Za dwa dni przeprowadzimy próbę prowokacyjną w uchu szczura.

Jeśli poczekamy kilka dni, aż komórki powrócą do stanu spoczynku, nie dotrą one tak szybko do miejsca stanu zapalnego. Umieszczę je teraz w inkubatorze w temperaturze 37 °C przy 5%CO2, a następnie użyję igły 25G do wstrzyknięcia ich szczurowi. Po wstrzyknięciu komórek do organizmu szczura, pozostawię go tutaj i przeprowadzę próbę wywołania stanu zapalnego w uszach za 48 godzin.

Kilka dni temu wstrzyknąłem szczurowi w okolice lędźwiowe specyficzne dla albuminy limfocyty T znakowane GFP. Dzisiaj zamierzam przeprowadzić próbę wyzwalania reakcji u tego samego szczura w uchu. W prawe ucho wstrzyknę albuminę.

Do lewego ucha wstrzyknę jedynie PBS. Dawka wstrzykiwanej woliny wynosi 20 µg w 20 µL. Jako albuminę stosuję mieszaninę w stosunku jeden do jednego albuminy znakowanej Texas Red i albuminy nieznakowanej.

Oto toaleta, na której pokażę Państwu sposób wykonywania zastrzyku. Jestem praworęczny, więc używam lewej ręki. Zdejmuję rękawiczkę z lewej ręki, aby móc umieścić jeden palec pod uchem, a drugi nad nim, w celu rozciągnięcia skóry; pozwala mi to dokładnie widzieć położenie igły i wprowadzić ją pomiędzy dwie warstwy skóry w obszarze, który jest bardzo cienki.

W tym celu używam igieł o rozmiarze 27 G, aby wprowadzić substancję za pomocą bardzo cienkiego narzędzia. Po obróceniu ucha wyraźnie widać, gdzie podano Texas Red, a gdzie PBS. Obecnie mamy 42 godziny po wyzwaniu w obrębie ucha i użyję mikrometru z zapadką, aby zmierzyć grubość małżowiny.

Zmierzę zatem oba uszy: prawe, które zostało poddane próbie z albuminą, oraz lewe, które nie było poddane próbie. Różnica w grubości uszu pozwoli nam określić intensywność stanu zapalnego. To, co zaprezentowałem tutaj, to cała procedura przeprowadzenia odczynu opóźnionego typu (DTH) u szczurów.

Przedstawiłem sposób aktywacji antygenowo swoistych limfocytów T in vitro, metodę ich adoptywnego transferu do organizmów szczurów, a następnie sposób wywoływania odpowiedzi zapalnej u tych zwierząt oraz pomiar stopnia stanu zapalnego. W laboratorium Chand rutynowo stosujemy tę procedurę w celu badania wpływu blokerów kanałów potasowych na stan zapalny u szczurów.