Skaningowa mikroskopia konfokalna i mikroendoskopia z częstotliwością wideo

Ten film pokazuje, jak skonstruować skaningowy mikroskop konfokalny z szybkością wideo przy użyciu standardowych, gotowych komponentów. Skaningowy mikroskop konfokalny opiera się na skoordynowanym ruchu dwóch luster skanujących w celu przesunięcia wiązki w poprzek płaszczyzny rastrowej Światło z pierwszego lustra jest skanowane poziomo przez pierwszy zestaw soczewek przekaźnikowych, które skupiają je z powrotem w nieruchomym punkcie na drugim lustrze skanującym. Ten sam ruch skanowania jest następnie przenoszony przez soczewki skanujące i tubus, umieszczając teraz rozszerzoną wiązkę światła na tylnej aperturze soczewki obiektywu.

Drugie zwierciadło, którego ruch jest powolny w porównaniu z pierwszym zwierciadłem, jednocześnie skanuje oś Y, co pozwala na skanowanie akcji powyżej i poniżej ilustrowanej płaszczyzny oraz tworzenie prostokątnego rastra na powierzchni próbki. Główną zaletą tego protokołu w porównaniu z zakupem dostępnego na rynku mikroskopu jest niski koszt i możliwość dostosowania instrumentu do specyficznych potrzeb projektu obrazowania. Podczas pracy z jakimkolwiek laserem należy podjąć odpowiednie środki bezpieczeństwa, aby zapobiec obrażeniom oka.

Pamiętaj, aby nosić odpowiednie okulary ochronne do lasera, gdy tylko jest to możliwe. Widzowie i/lub badacze, którzy nie ustawiają się aktywnie w jednej linii lub nie pracują z wiązką, powinni zawsze nosić okulary. Usuń wszystkie błyszczące i odblaskowe zegarki lub biżuterię.

Co najważniejsze, pamiętaj, aby przez cały czas podążać za belką i kontrolować ją, kończąc jej ścieżkę za pomocą bloku belki lub zamontowanej wizytówki. Jest to szczególnie ważne w przypadku wykładania luster, ponieważ ścieżka wiązki może być trudna do przewidzenia. Nigdy też nie umieszczaj oczu na poziomie ścieżki wiązki.

Wyłącz laser, jeśli chcesz przekroczyć płaszczyznę wiązki przed montażem mikroskopu. Upewnij się, że dostępny jest cały sprzęt niezbędny do budowy, w tym płytka stykowa optyczna i wsporniki 90 stopni, wszystkie lustra, soczewki i dichroik, a także odpowiednie zaciski i elementy montażowe, zarówno lustra skanujące, jak i fotodetektor. Przydatne jest również posiadanie pod ręką generatora funkcji, aby przetestować działanie skanowania i manipulować lustrami podczas wyrównywania.

Zdecydowanie zaleca się również przykręcenie płytki stykowej w celu zapewnienia stabilności. Rozpocznij budowę mikroskopu, umieszczając pigtail fiber ator w uchwycie optycznym i umieszczając ten zespół na środku optycznej płytki stykowej. Odpowiada to początkowi niebieskiej wiązki, jak pokazano tutaj.

Włącz źródło światła. Użyj regulacyjnych, aby z grubsza wyregulować belkę tak, aby poruszała się w linii prostej zarówno w poziomie, jak i w pionie. Umieść tęczówkę przed kolatorem światłowodów.

Następnie dostosuj wysokość przysłony tak, aby wiązka przechodziła przez środek. Następnie odsuń tęczówkę od nadajnika wzdłuż ścieżki wiązki. Sprawdź wyrównanie belki.

Użyj dwóch regulacyjnych, aby w razie potrzeby zmienić położenie belki na tęczówce. Umieść zamontowane lustro diiczne na ścieżce wiązki tak aby wiązka laserowa znajdowała się w środku lustra. Obróć uchwyt lusterka, aby odbić wiązkę pod kątem około 90 stopni, upewniając się, że wysokość wiązki się nie zmienia.

Clamp lustro do stołu, dokręcając na uchwycie. Następnie umieść zamontowane rezonansowe zwierciadło metryczne galwanu na ścieżce wiązki laserowej. Należy zwrócić uwagę, aby wiązka lasera była ustawiona dokładnie w poziomym środku powierzchni lustra.

Obróć mocowanie lustra, aby odbić wiązkę lasera pod kątem 90 stopni. Następnie z grubsza dostosuj odbicie od lustra, aby utrzymać tę samą wysokość wiązki laserowej w pionie. Następnie weź dwie tęczówki i umieść je bezpośrednio przed rezonansową galą.

Następnie, używając wiązki laserowej odbitej od rezonansowego lustra gal jako odniesienia, ustaw ich wysokość w pionie jak poprzednio. Teraz używając otworów na na płytce stykowej optycznej jako prowadnicy do oka, zaciśnij dwie tęczówki w linii prostej. Dostosuj pierwsze lustro na ścieżce, czyli dichroiczny, aby wyśrodkować wiązkę na pierwszej tęczówce.

Następnie dostosuj drugie lustro na ścieżce. Rezonansowy gal do wyśrodkowania wiązki na drugiej tęczówce. Iteracyjnie dopasuj te dwa lustra, aż wiązka zostanie wyrównana przez obie tęczówki.

Upewnienie się, że wiązka laserowa odbita od rezonansowego zwierciadła galowego jest nadal odbita od przybliżonego środka lustra. Jeśli wiązka jest odchylona, wyreguluj mocowanie kollektora światłowodów i powtórz regulacje z wiązką wyśrodkowaną na obu otwartych tęczówkach. Następnym krokiem jest umieszczenie dwóch soczewek przekaźnikowych, które będą obrazować pierwszą stacjonarną płaszczyznę telecentryczną, na drugiej stacjonarnej płaszczyźnie telecentrycznej.

W przypadku tego konkretnego mikroskopu wybrane soczewki w pierwszym przekaźniku mają tę samą ogniskową F, więc odległość między dwoma lustrami wynosi tutaj po prostu cztery F. W tej konfiguracji F równa się 90 milimetrom, więc cztery pozycje F będą oddalone od lustra skanującego o 360 milimetrów. Aby upewnić się, że soczewki są dokładnie wyśrodkowane na ścieżce wiązki, umieść pierwszą soczewkę na ścieżce wiązki i spójrz na plamkę wiązki laserowej na następnej tęczówce na ścieżce wiązki. Podążając za obiektywem, dostosuj wysokość obiektywu tak, aby pionowy środek wiązki znajdował się w środku przysłony.

Następnie dostosuj poziome położenie belki, aby wyśrodkować belkę na przysłony. Powtórz ten proces z drugą soczewką. Następnie zostanie ustawione lustro skanujące, a mikroskop zostanie obrócony, aby ułatwić proste umieszczanie i wyrównywanie części, które w przeciwnym razie musiałyby być regulowane w pionie.

Aby znaleźć dokładną pozycję drugiej płaszczyzny telecentrycznej, podłącz rezonansowy gal O do jednostki skanującej i włącz ją. Użyj wizytówki, aby prześledzić ścieżkę wiązki skanowania przez dwie soczewki. Druga płaszczyzna telecentryczna będzie znajdować się około czterech F od rezydenta gal O i może być zidentyfikowana jako miejsce, w którym wiązka skanująca wydaje się nieruchoma.

Zaznacz ołówkiem tabliczkę stykową pod tym miejscem. Po zidentyfikowaniu płaszczyzny telecentrycznej ustaw wejście lustra skanującego na zero woltów i włącz sprzęt sterujący lustrem, aby lustro ustawiło się w pozycji neutralnej. Następnie umieść standardowe zwierciadło skanujące w dokładnym miejscu płaszczyzny tele

Wyreguluj pozycję lustra tak, aby wiązka na płaszczyźnie teleskopowej uderzała dokładnie w środek lustra skanującego i dokręć mocowanie lustra. Teraz poluzuj blokującą mocującą lustro gal i obróć je, upewnij się, że wiązka rozchodzi się pionowo. Teraz wyłącz laser i elektronikę skanującą.

Odłącz światłowód i odłącz lusterka skanujące. Następnie za pomocą wsporników montażowych do płytek stykowych pod kątem 90 stopni. Przymocuj drugą płytkę stykową do pierwszej.

Na koniec ostrożnie obróć cały mikroskop tak, aby nowa płytka stykowa leżała płasko i użyj zacisku, aby zamocować mikroskop na miejscu. Podłącz ponownie gal o i laser tutaj i pamiętaj, aby przywrócić gal O do zera woltów. Pozostałą część wcześniej pionowej konfiguracji można łatwo przeprowadzić na płaskiej płytce stykowej.

Następnie skonfigurujemy drugi zestaw soczewek przekaźnikowych, formalnie nazywany soczewką skanującą i soczewką tubusu. Prosimy o zapoznanie się z dołączonym pisemnym protokołem, aby uzyskać bardzo ważne informacje na temat wyboru odpowiedniej kombinacji soczewek. Zacznij od ustawienia soczewek.

Najpierw rozłóż lustra potrzebne do skierowania wiązki do soczewki obiektywu. Umieść pierwsze duże dwucalowe lustro blisko krawędzi płytki stykowej i obróć uchwyt lustra, aby odbić wiązkę lasera o około 90 stopni mniej więcej. Dostosuj odbicie od lustra, aby utrzymać tę samą pionową wysokość wiązki.

Następnie umieść drugie dwucalowe lustro na przeciwległej krawędzi płytki stykowej, aby skierować wiązkę pod kątem 90 stopni i użyj regulacyjnych, aby zamocować na miejscu. Następnie ustaw dwie przysłony i wyreguluj dwa lustra jak poprzednio, aby wyśrodkować wiązkę. Następnie umieść soczewkę skanującą na swojej ogniskowej od gal na ścieżce wiązki i dostosuj jej położenie poziome i pionowe.

Aby wyśrodkować plamkę lasera na pierwszej tęczówce między dwoma lustrami. Ostrożnie umieść dużą dwucalową soczewkę tubusu w odpowiedniej odległości od soczewki skanującej i dostosuj jej położenie poziome i pionowe, aby wyśrodkować wiązkę na pierwszej przysłonie. W tej konfiguracji soczewka tubusu jest umieszczona w odległości 75 milimetrów plus 300 milimetrów Ze wszystkimi elementami na miejscu.

Podłącz gal O do wyjścia standardowego generatora funkcji elektrycznych lub obwodu sterującego i ustaw napięcie szczytowe na szczytowe na jeden do trzech woltów. Następnie rozpocznij skanowanie dwóch luster za pomocą wizytówki. Zlokalizuj wiązkę laserową w płaszczyźnie stacjonarnej, 300 milimetrów za soczewką tuby.

Umieść soczewkę obiektywu na ścieżce wiązki, upewniając się, że tylna przysłona soczewki obiektywu znajduje się jak najbliżej płaszczyzny stacjonarnej. Skonfiguruj stolik próbki, upewniając się, że przesuwne mocowanie osi Z nie uderza w mocowanie obiektywu podczas przesuwania w poprzek jego zakresu. Aby skonfigurować konfokal, otworek i detektor, zacznij od odłączenia wszystkich zasilaczy i światłowodów.

Obróć zespół mikroskopu tak, aby ponownie spoczywał na płytce stykowej, przytrzymując rezonansowe lustro skanujące. Po ponownym podłączeniu światłowodu do kolimatora i standardowego lustra skanującego, zasilających, zasilających i sterujących, umieść zero woltów na napięciu sterującym napędzającym standardowy gal skanujący, jak poprzednio na stoliku, umieść próbkę warstwy z jasnym barwnikiem między dwoma szkiełkami nakrywkowymi. Następnie włącz źródło lasera i ustaw ostrość barwnika.

Dostosuj moc lasera, aby fluorescencja była jak najjaśniejsza za pomocą wizytówki. Prześledź emisję fluorescencyjną z próbki przez soczewkę obiektywu przez system skanujący do zwierciadła dichroicznego, które odbija wiązkę laserową i przekazuje emisję fluorescencyjną. Znajdź ten fluorescencyjny sygnał po drugiej stronie lustra dichroicznego.

Teraz przyciemnij światła w pokoju. Umieść lustro za lustrem dichroicznym, aby odbijać emisję pod kątem 90 stopni. Następnie za pomocą tęczówki z lustrem skieruj wiązkę fluorescencji jak najbardziej prosto i równolegle do płytki stykowej.

Następnie konfokalna jednostka otworkowa zostanie skonfigurowana przy użyciu zespołu do montażu klatki filtra przestrzennego firmy Thor Labs. Ten diagram przedstawia konfigurację. Lustro skanujące znajduje się w nieruchomych płaszczyznach, które są tele ze stacjonarnym obiektywem.

Pary soczewek w płaszczyźnie tylnej przysłony między płaszczyznami nieruchomymi działają w celu przekazywania zeskanowanych wiązek. Pierwsza para soczewek ma soczewkę o równej ogniskowej, tworząc teleskop jeden do jednego. Druga para soczewek, znana formalnie jako soczewka skanująca i soczewka tubusu, nie musi mieć równej długości ogniskowej i często służy jako teleskop rozszerzający wiązkę, aby zapewnić przepełnienie tylnej apertury obiektywu.

Światło emitowane z próbki przemieszcza się z powrotem przez system skanujący i przechodzi przez zwierciadło dichroiczne. Soczewka o krótkiej ogniskowej lub soczewka obiektywowa skupia światło emisyjne przez konfokalny otwór, który jest następnie zestawiany przez soczewkę. Ostatnia soczewka skupia emisję z filtrem konfokalnym na lampie powielacza fotograficznego.

Umieść filtr przestrzenny w jednej linii ze ścieżką wiązki emisyjnej, zwracając uwagę, aby wyśrodkować pierwsze mocowanie soczewki skupiającej na wiązce emisyjnej. W tym przypadku wybrano filtr przestrzenny o rozmiarze otworu 100 mikronów. Następnie zamontuj obiektyw o krótkiej ogniskowej w aparacie i przesuń mocowanie translacyjne Z, aż będzie można zaobserwować wyraźną ostrość na powierzchni otworka.

Upewnij się, że całe urządzenie jest zorientowane wzdłuż linii prostej wyznaczonej przez wiązkę fluorescencyjną. Clamp urządzenie do płytki stykowej. Teraz za pomocą pokręteł regulacyjnych na stoliku translacyjnym wyreguluj dwie osie, aby przeprowadzić wyszukiwanie 2D na powierzchni otworkowej, aby znaleźć punkt, w którym sygnał fluorescencyjny przez otworek jest maksymalizowany.

Następnie umieść soczewkę powlekającą na uchwycie klatkowym Po otworze za pomocą wizytówki znajdź jon fluorescencyjny, który przechodzi przez jednostkę konfokalną i przesuń soczewkę powlekającą wzdłuż słupków, aż emitowana fluorescencja zostanie jak najbardziej zebrana. Skonfiguruj zespół rurki powielacza zdjęć. Umieść soczewkę o ogniskowej 50 milimetrów na ścieżce wiązki emisji fluorescencji i znajdź jej ogniskową.

Zaznacz tę pozycję na płytce stykowej. Teraz całkowicie wyłącz laser i ustaw tubus powielacza zdjęć tak, aby jego okienko znajdowało się jak najbliżej zaznaczonego punktu ogniskowego. Następnie za pomocą regulowanych tubusów obiektywu podłącz zespół do soczewki skupiającej.

Owiń ciemną taśmą wszystkie odsłonięte ścieżki wiązki podążające za otworkiem, włącz laser, utrzymując jego moc na bardzo niskim poziomie. Włącz lampę fotopowielacza, dokładnie odczytując jej napięcie na oscyloskopie. Wraz ze wzrostem intensywności lasera zwiększaj napięcie, aż na ekranie oscyloskopu będzie widoczny odczyt podobny do skoku i/lub przesunięcie prądu stałego.

Potwierdź, że ten sygnał rzeczywiście powstaje w wyniku fluorescencji, wyłączając zasilanie lasera lub blokując ścieżkę wiązki, aby zaobserwować utratę sygnału. Na koniec iteracyjnie wyrównaj otwór, aby uzyskać maksymalny sygnał na oscyloskopie. Najpierw manipulując pozycją Z soczewki skupiającej, a następnie dostosowując etap translacji YZ, sprzęt mikroskopu szybkości wideo jest kompletny.

Najpierw wyłącz rurkę powielacza zdjęć. Teraz podłącz lustra, niestandardowe tablice kontrolne i komputer zgodnie ze schematem w dołączonym pisemnym protokole. System ten może być przystosowany do wykonywania konfokalnej skaningowej mikroendoskopii.

Zastępując stolik stolikiem światłowodowym, zapoznaj się z dołączonym tekstem lub szczegółami. Gotowy pionowy konfokalny mikroskop skaningowy i mikroendoskop powinny wyglądać tak, jak pokazano tutaj. Wiązki laserowe i emisyjne zostały narysowane jako przewodnik do oka.

Podczas operacji mikroendoskopii uchwyt światłowodowy utrzymuje światłowód na miejscu do eksperymentów. Ten uchwyt światłowodowy można łatwo zastąpić stopniem XY do zastosowań. Pokazana tutaj pionowa platforma mikroskopowa jest reprezentatywnym obrazem testowym wykonanym małą literą M wydrukowaną na białej wizytówce przy użyciu karty przechwytywania klatek wideo w celu wygenerowania obrazów z przychodzącego sygnału. Bielone.

Biała księga zawiera siłę fluoru, która jest łatwo wzbudzana przez promieniowanie UV i niebieskie światło, co skutkuje jasnym tłem za ciemnością. Do zebrania tej fluorescencyjnej emisji wybrano literę M i filtr emisyjny wyśrodkowany na 515 nanometrach. Niewielkie zniekształcenie obrazu można zaobserwować zwłaszcza w pobliżu bocznych krawędzi ramki obrazu.

Zniekształcenie to wynika z sinusoidalnego wzorca skanowania ośmiokilohercowego lustra gvo i jest szczegółowo omówione w dokumencie towarzyszącym. Ten film przedstawia przykładowe dane dotyczące szybkości odtwarzania wideo uzyskane przez zeskanowanie wizytówki. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś teraz dobrze zrozumieć, jak zbudować i ustawić konfokalny mikroskop skaningowy z szybkością wideo.

Nie zapominaj, że praca ze światłem laserowym może być niezwykle niebezpieczna i podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak usunięcie całej odblaskowej biżuterii, a także unikanie pracy z oczami na poziomie linii wiązki.