Jednodniowy schemat przepływu pracy do wykrywania patogenów bakteryjnych i testowania oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe na podstawie posiewów krwi
July 9th, 2012
Projekt prostego, jednodniowego schematu pracy do diagnostyki patogenów bakteryjnych umożliwia szybkie rozpoznawanie infekcji krwi. Uwzględnienie ośmiu klinicznie istotnych celów bakteryjnych i ich profili oporności na antybiotyki daje klinicyście wstępny wgląd w ten sam dzień, co może prowadzić do bardziej odpowiedniej terapii.
Ogólnym celem tej procedury jest identyfikacja i ocena wrażliwości izolatów z posiewów krwi na antybiotyki w czasie krótszym niż w przypadku konwencjonalnych metod. Osiąga się to poprzez uprzednią identyfikację izolatu posiewu krwi. Korzystanie z nowatorskiego 16-s rybosomalnego testu DNA MultiPro PCR.
Następnie izolat inkubuje się z panelem antybiotyków przez sześć godzin. Następnym krokiem jest określenie wzrostu lub wzrostu inhibicji izolatu w obecności antybiotyku za pomocą ilościowego testu 16 s rybosomalnego D-N-A-P-C-R. Ostatecznie wyniki pokazują, że identyfikacja i badanie wrażliwości na antybiotyki izolatu posiewu krwi można uzyskać szybciej dzięki połączeniu hodowli i PCR.
Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak te wykorzystujące zautomatyzowane systemy phoenix lub IIC, jest to, że nie jest wymagany wcześniejszy status hodowli, a wyniki identyfikacji i testów wrażliwości na antybiotyki mogą być dostępne w ciągu tego samego dnia. Procedurę zademonstrują Vandy Hanson i doktoranci GID z naszego laboratorium Rozcieńcz 100 mikrolitrów posiewu krwi z dodatnim wynikiem wzrostu drobnoustrojów w probówce reakcyjnej zawierającej 900 mikrolitrów 0,9% chlorku sodu. Następnie odwirować próbkę w temperaturze 13 400 razy G przez pięć minut, aby po odwirowaniu bakterie uległy osadzeniu.
Reese, zawiesić granulat w 100 mikrolitrach sterylnej wody demineralizowanej. Zainstaluj próbkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza do dalszego użycia. Gdy wszystkie próbki będą gotowe, przygotuj mieszaniny reakcyjne PCR w czasie rzeczywistym, aby amplifikować specyficzne 16-s rybosomalne DNA z badanych bakterii.
Użyj wody demineralizowanej, aby dostosować objętość do 20 mikrolitrów na reakcję. Podwielokrotność 20 mikrolitrów mieszanki PCR na dołek w 96-dołkowej płytce PCR. Następnie dodaj pięć mikrolitrów próbki do każdej studzienki i zamknij płytkę PCR.
Następnie uruchom PCR w systemie PCR w czasie rzeczywistym A BI Prism 7, 900 HT, aby przeanalizować wyniki po zakończeniu PCR, najpierw użyj zakładki ustawień analizy, aby dostosować analizę CT do 0,1. Następnie zawęź konfiguracje linii bazowej, aby rozpocząć cykl szósty i zakończyć cykl 15. Zapisz wartość CT dla każdej próbki.
Wartość odcięcia, aby uznać wynik PCR za pozytywny, można ogólnie ustawić na wartość CT wynoszącą 35. W tym przykładzie profil identyfikacyjny posiewu krwi zakażonego bakterią E. coli przedstawiono w dwóch mieszankach reakcyjnych. Uwzględniono uniwersalne startery rybosomalnego DNA 16 s i wygenerowano dwie krzywe amplifikacji CT 25.2 i 25.95.
Trzecia krzywa amplifikacji pochodzi z sondy specyficznej dla Coli. Inne specyficzne sondy nie generowały wykrywalnych sygnałów. Po zidentyfikowaniu patogenu można wykonać testy antybiotykowe.
Zacznij od przeniesienia pięciu mililitrów bulionu z dodatniego posiewu krwi do probówki separatora surowicy. Odwirować próbkę o temperaturze 2000 razy G przez 10 minut po odwirowaniu, wyrzucić środek supan z probówki. Następnie za pomocą sterylnego bawełnianego wacika przenieś bakterie z warstwy żelu probówki do 0,9% chlorku sodu, aż do uzyskania roztworu o zmętnieniu 0,5 wzorca McFarlanda.
Odpowiada to około 1,5 razy 10 ośmiu jednostkom tworzącym kolonie na mililitr. Następnie rozcieńczyć zawiesinę w podwójnym stężeniu Muller Hinton. Dwa buliony, aby uzyskać stężenie około pięć razy 10 do pięciu jednostek tworzących kolonię na mililitr.
Podwielokrotność 50 mikrolitrów na studzienkę zawiesiny na płytce do mikromiareczkowania zawierającej już 50 mikrolitrów na studzienkę wybranych antybiotyków. Pamiętaj, aby uwzględnić dodatnie kontrole wzrostu dla każdej próbki przy użyciu studzienek z wodą zamiast antybiotyków. Przykryj talerz po zakończeniu.
Następnie inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez sześć godzin, aby umożliwić rozwój bakterii. Należy pamiętać o przechowywaniu podwielokrotności zawiesiny bakteryjnej w temperaturze czterech stopni Celsjusza jako negatywnej kontroli wzrostu. Po sześciogodzinnej inkubacji przenieść zawartość każdej studzienki i próbkę kontroli ujemnej do oddzielnych sterylnych probówek.
Po pięciominutowym odwirowaniu 16 000 razy. G, usunąć 80 mikrolitrów supernatantu i ponownie zawiesić granulki w 80 mikrolitrach sterylnej wody demineralizowanej. Rozcieńczyć próbki w temperaturze od 1 do 10 w wodzie przed użyciem ich do 16-s rybosomalnej reakcji DNA w czasie rzeczywistym.
Przygotuj mieszankę PCR przy użyciu IQ cyber green super mix i 16 s starterów rybosomalnego DNA oraz podwielokrotności 20 mikrolitrów na studzienkę w 96-dołkowej płytce PCR. Następnie dodaj pięć mikrolitrów każdej próbki do studzienek i uszczelnij płytkę.
Następnie uruchom PCR, aby przeanalizować wyniki. Najpierw oblicz wartość odcięcia CT. Ogólnie rzecz biorąc, odcięta CT jest równa CT pozytywnej kontroli wzrostu plus 0,5 razy CT negatywnej kontroli wzrostu minus CT kontroli wzrostu.
Jednak w przypadku piperacyliny piperacyliny z tazobaktamem i CEF dazadi w pałeczkach Gram-ujemnych, a także dla amoksycyliny, oksacyliny i trimetoprimu z sulfametoksazolem w Staphylococcus aureus lub z amoksycyliny. W enterococcus SPP współczynnik mnożenia wynoszący 0,5 należy zmniejszyć do 0,25. Podatność lub odporność szczepów w każdej próbce można określić, porównując CT próbki z ct odcięcia.
Wartość CT powyżej wartości odcięcia wskazuje na podatność, podczas gdy CT poniżej wartości odcięcia wskazuje na oporność. Oto przykład wykresu amplifikacji wrażliwości na antybiotyki. Zidentyfikowany wcześniej szczep E. coli został przetestowany pod kątem wrażliwości na kilka antybiotyków, z których każdy jest reprezentowany przez oddzielną krzywą.
Próbki o niskiej wartości CT to próbki, w których nastąpił wzrost w obecności antybiotyku wskazującego na oporność na badany antybiotyk. Wręcz przeciwnie, wysoka wartość CT reprezentuje próbkę, w której nie nastąpił wzrost, co wskazuje na podatność na badany antybiotyk po opanowaniu. Tę technikę można wykonać w ciągu dziewięciu godzin, jeśli jest wykonywana prawidłowo.
Przegląd
Ten artykuł przedstawia jednodniowy proces diagnozy patogenów bakteryjnych w infekcjach krwiotwórczych. Metoda ta pozwala na szybkie zidentyfikowanie ośmiu klinicznie istotnych docelowych bakterii i ich profili oporu na antybiotyki, ułatwiając terminowe decyzje terapeutyczne.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Mikrobiologia
- Diagnostyka kliniczna
- Oporność na antybiotyki
Tło
- Infekcje krwiotwórcze stanowią znaczące zagrożenie zdrowotne i wymagają pilnej diagnozy.
- Konwencjonalne metody identyfikacji patogenów mogą być czasochłonne.
- Szybka identyfikacja i badanie wrażliwości są kluczowe dla skutecznego leczenia.
- To badanie wprowadza nowatorskie podejście oparte na PCR, aby usprawnić proces diagnostyczny.
Cel badania
- Opracowanie szybkiego procesu zidentyfikowania patogenów bakteryjnych w hodowlach krwi.
- Ocena wrażliwości na antybiotyki izolatów w tym samym dniu.
- Porównanie efektywności tej metody z tradycyjnymi technikami diagnostycznymi.
Stosowane metody
- Wykorzystanie testu PCR MultiPro na bazie DNA rybosomalnego 16S do identyfikacji patogenów.
- Inkubacja izolatów z panelem antybiotyków w celu badania wrażliwości.
- Ilościowa PCR do określenia hamowania wzrostu w obecności antybiotyków.
- Analiza wyników przy użyciu określonych progów wartości CT do oceny wrażliwości.
Główne wyniki
- Proces umożliwia identyfikację patogenów i badanie wrażliwości w ciągu kilku godzin.
- Wyniki wskazują, że metoda jest szybsza niż konwencjonalne zautomatyzowane systemy.
- Udało się zidentyfikować E. coli i jego profil oporu na antybiotyki.
- Technikę tę można wykonać efektywnie przy minimalnych wymaganiach dotyczących uprzedniego hodowania.
Wnioski
- Ten szybki proces diagnostyczny może znacząco poprawić leczenie pacjentów w przypadku infekcji krwiotwórczych.
- Łączenie technik hodowli i PCR zwiększa szybkość diagnozy i leczenia.
- Zaleca się dalszą weryfikację w warunkach klinicznych, aby potwierdzić skuteczność.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Rapid pathogen identification and antimicrobial susceptibility testing within a single workday addresses a critical bottleneck in bloodstream infection management, enabling timely antibiotic therapy decisions. This workflow reduces reliance on prolonged culture-based methods, supporting faster de-escalation or escalation of empiric regimens. By delivering actionable microbiological data in hours rather than days, it enhances predictive confidence in early-stage antimicrobial selection and reduces the risk of inappropriate therapy.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional validation of antimicrobial targets by linking pathogen identification with phenotypic susceptibility profiles under controlled conditions.
- Operational Value: Supports mechanistic de-risking of antibiotic candidates through rapid correlation of genetic identification with growth inhibition outcomes.
- Predictive Value: Generates quantitative, threshold-based susceptibility data that inform lead compound prioritization in antibacterial discovery programs.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a standardized, quantitative readout (CT values) for assessing bacterial growth inhibition, enabling reproducible compound screening against clinical isolates.
- Operational Value: Facilitates assay readiness by using directly processed blood culture material, minimizing pre-analytical variability and enhancing throughput.
- Scalability: Compatible with 96-well PCR platforms, allowing parallel testing of multiple antibiotics and isolates for efficient lead optimization.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical evaluation by using clinically relevant pathogens isolated from blood cultures, improving disease model relevance.
- Mechanistic De-risking: Enables early assessment of antibiotic efficacy against resistant strains, reducing late-stage failure risk in development pipelines.
- Biomarker Alignment: Supports identification of susceptibility-associated genetic signatures through paired genotypic and phenotypic profiling.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the antibacterial discovery continuum from early target validation through lead optimization, providing rapid pathogen characterization and susceptibility profiling to inform compound progression decisions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling rapid identification of pathogen species and assessment of antibiotic-induced growth inhibition.
- Screening: Delivers standardized, quantitative susceptibility outputs that allow comparison of compound efficacy across multiple clinical isolates.
- Analytics: Generates CT-based growth inhibition data that serve as measurable endpoints for evaluating antibacterial activity and resistance mechanisms.
- Translational Research: Uses pathogens directly from positive blood cultures, enhancing relevance to human infection models and preclinical validity.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable diagnostic capability for antibacterial programs, reducing redundant method development across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in antibacterial lead selection by providing rapid, phenotype-genotype correlation data.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through defined incubation times, CT thresholds, and controlled growth controls.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision efficiency by reducing time-to-susceptibility data from days to hours.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of antibiotic candidates based on early susceptibility profiles against clinically relevant pathogens.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular microbiology and real-time PCR assay design and interpretation.
- Dependent on access to quantitative PCR instrumentation with multiplexing and melt curve capabilities.
- Necessitates standardized protocols for blood culture processing, antibiotic panel preparation, and contamination controls.
- Requires adaptation of antibiotic concentrations and incubation times for different pathogen-drug combinations.
- Limited to aerobic and facultative anaerobic pathogens; strict anaerobes may require alternative workflows.
