Jednodniowy schemat przepływu pracy do wykrywania patogenów bakteryjnych i testowania oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe na podstawie posiewów krwi
9 lipca 2012
Projekt prostego, jednodniowego schematu pracy do diagnostyki patogenów bakteryjnych umożliwia szybkie rozpoznawanie infekcji krwi. Uwzględnienie ośmiu klinicznie istotnych celów bakteryjnych i ich profili oporności na antybiotyki daje klinicyście wstępny wgląd w ten sam dzień, co może prowadzić do bardziej odpowiedniej terapii.
Ogólnym celem tej procedury jest identyfikacja i ocena wrażliwości izolatów z posiewów krwi na antybiotyki w czasie krótszym niż w przypadku konwencjonalnych metod. Osiąga się to poprzez uprzednią identyfikację izolatu posiewu krwi. Korzystanie z nowatorskiego 16-s rybosomalnego testu DNA MultiPro PCR.
Następnie izolat inkubuje się z panelem antybiotyków przez sześć godzin. Następnym krokiem jest określenie wzrostu lub wzrostu inhibicji izolatu w obecności antybiotyku za pomocą ilościowego testu 16 s rybosomalnego D-N-A-P-C-R. Ostatecznie wyniki pokazują, że identyfikacja i badanie wrażliwości na antybiotyki izolatu posiewu krwi można uzyskać szybciej dzięki połączeniu hodowli i PCR.
Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak te wykorzystujące zautomatyzowane systemy phoenix lub IIC, jest to, że nie jest wymagany wcześniejszy status hodowli, a wyniki identyfikacji i testów wrażliwości na antybiotyki mogą być dostępne w ciągu tego samego dnia. Procedurę zademonstrują Vandy Hanson i doktoranci GID z naszego laboratorium Rozcieńcz 100 mikrolitrów posiewu krwi z dodatnim wynikiem wzrostu drobnoustrojów w probówce reakcyjnej zawierającej 900 mikrolitrów 0,9% chlorku sodu. Następnie odwirować próbkę w temperaturze 13 400 razy G przez pięć minut, aby po odwirowaniu bakterie uległy osadzeniu.
Reese, zawiesić granulat w 100 mikrolitrach sterylnej wody demineralizowanej. Zainstaluj próbkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza do dalszego użycia. Gdy wszystkie próbki będą gotowe, przygotuj mieszaniny reakcyjne PCR w czasie rzeczywistym, aby amplifikować specyficzne 16-s rybosomalne DNA z badanych bakterii.
Użyj wody demineralizowanej, aby dostosować objętość do 20 mikrolitrów na reakcję. Podwielokrotność 20 mikrolitrów mieszanki PCR na dołek w 96-dołkowej płytce PCR. Następnie dodaj pięć mikrolitrów próbki do każdej studzienki i zamknij płytkę PCR.
Następnie uruchom PCR w systemie PCR w czasie rzeczywistym A BI Prism 7, 900 HT, aby przeanalizować wyniki po zakończeniu PCR, najpierw użyj zakładki ustawień analizy, aby dostosować analizę CT do 0,1. Następnie zawęź konfiguracje linii bazowej, aby rozpocząć cykl szósty i zakończyć cykl 15. Zapisz wartość CT dla każdej próbki.
Wartość odcięcia, aby uznać wynik PCR za pozytywny, można ogólnie ustawić na wartość CT wynoszącą 35. W tym przykładzie profil identyfikacyjny posiewu krwi zakażonego bakterią E. coli przedstawiono w dwóch mieszankach reakcyjnych. Uwzględniono uniwersalne startery rybosomalnego DNA 16 s i wygenerowano dwie krzywe amplifikacji CT 25.2 i 25.95.
Trzecia krzywa amplifikacji pochodzi z sondy specyficznej dla Coli. Inne specyficzne sondy nie generowały wykrywalnych sygnałów. Po zidentyfikowaniu patogenu można wykonać testy antybiotykowe.
Zacznij od przeniesienia pięciu mililitrów bulionu z dodatniego posiewu krwi do probówki separatora surowicy. Odwirować próbkę o temperaturze 2000 razy G przez 10 minut po odwirowaniu, wyrzucić środek supan z probówki. Następnie za pomocą sterylnego bawełnianego wacika przenieś bakterie z warstwy żelu probówki do 0,9% chlorku sodu, aż do uzyskania roztworu o zmętnieniu 0,5 wzorca McFarlanda.
Odpowiada to około 1,5 razy 10 ośmiu jednostkom tworzącym kolonie na mililitr. Następnie rozcieńczyć zawiesinę w podwójnym stężeniu Muller Hinton. Dwa buliony, aby uzyskać stężenie około pięć razy 10 do pięciu jednostek tworzących kolonię na mililitr.
Podwielokrotność 50 mikrolitrów na studzienkę zawiesiny na płytce do mikromiareczkowania zawierającej już 50 mikrolitrów na studzienkę wybranych antybiotyków. Pamiętaj, aby uwzględnić dodatnie kontrole wzrostu dla każdej próbki przy użyciu studzienek z wodą zamiast antybiotyków. Przykryj talerz po zakończeniu.
Następnie inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez sześć godzin, aby umożliwić rozwój bakterii. Należy pamiętać o przechowywaniu podwielokrotności zawiesiny bakteryjnej w temperaturze czterech stopni Celsjusza jako negatywnej kontroli wzrostu. Po sześciogodzinnej inkubacji przenieść zawartość każdej studzienki i próbkę kontroli ujemnej do oddzielnych sterylnych probówek.
Po pięciominutowym odwirowaniu 16 000 razy. G, usunąć 80 mikrolitrów supernatantu i ponownie zawiesić granulki w 80 mikrolitrach sterylnej wody demineralizowanej. Rozcieńczyć próbki w temperaturze od 1 do 10 w wodzie przed użyciem ich do 16-s rybosomalnej reakcji DNA w czasie rzeczywistym.
Przygotuj mieszankę PCR przy użyciu IQ cyber green super mix i 16 s starterów rybosomalnego DNA oraz podwielokrotności 20 mikrolitrów na studzienkę w 96-dołkowej płytce PCR. Następnie dodaj pięć mikrolitrów każdej próbki do studzienek i uszczelnij płytkę.
Następnie uruchom PCR, aby przeanalizować wyniki. Najpierw oblicz wartość odcięcia CT. Ogólnie rzecz biorąc, odcięta CT jest równa CT pozytywnej kontroli wzrostu plus 0,5 razy CT negatywnej kontroli wzrostu minus CT kontroli wzrostu.
Jednak w przypadku piperacyliny piperacyliny z tazobaktamem i CEF dazadi w pałeczkach Gram-ujemnych, a także dla amoksycyliny, oksacyliny i trimetoprimu z sulfametoksazolem w Staphylococcus aureus lub z amoksycyliny. W enterococcus SPP współczynnik mnożenia wynoszący 0,5 należy zmniejszyć do 0,25. Podatność lub odporność szczepów w każdej próbce można określić, porównując CT próbki z ct odcięcia.
Wartość CT powyżej wartości odcięcia wskazuje na podatność, podczas gdy CT poniżej wartości odcięcia wskazuje na oporność. Oto przykład wykresu amplifikacji wrażliwości na antybiotyki. Zidentyfikowany wcześniej szczep E. coli został przetestowany pod kątem wrażliwości na kilka antybiotyków, z których każdy jest reprezentowany przez oddzielną krzywą.
Próbki o niskiej wartości CT to próbki, w których nastąpił wzrost w obecności antybiotyku wskazującego na oporność na badany antybiotyk. Wręcz przeciwnie, wysoka wartość CT reprezentuje próbkę, w której nie nastąpił wzrost, co wskazuje na podatność na badany antybiotyk po opanowaniu. Tę technikę można wykonać w ciągu dziewięciu godzin, jeśli jest wykonywana prawidłowo.
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia jednodniowy schemat postępowania w celu diagnostyki patogenów bakteryjnych w zakażeniach krwi. Metoda ta umożliwia szybką identyfikację ośmiu istotnych klinicznie celów bakteryjnych oraz ich profili oporności na antybiotyki, co ułatwia podejmowanie terminowych decyzji terapeutycznych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Mikrobiologia
- Diagnostyka kliniczna
- Oporność na antybiotyki
Wprowadzenie
- Zakażenia krwi stanowią poważne zagrożenie dla zdrowia i wymagają niezwłocznej diagnozy.
- Konwencjonalne metody identyfikacji patogenów mogą być czasochłonne.
- Szybka identyfikacja oraz testy wrażliwości są kluczowe dla skutecznego leczenia.
- Niniejsze badanie wprowadza nowatorskie podejście oparte na metodzie PCR w celu usprawnienia procesu diagnostycznego.
Cel badania
- Opracowanie szybkiego schematu postępowania w celu identyfikacji patogenów bakteryjnych w posiewach krwi.
- Ocena wrażliwości izolatów na antybiotyki w tym samym dniu.
- Porównanie efektywności tej metody z tradycyjnymi technikami diagnostycznymi.
Zastosowane metody
- Wykorzystanie testu MultiPro PCR dla 16S rDNA w celu identyfikacji patogenów.
- Inkubacja izolatów z panelem antybiotyków w celu przeprowadzenia testów wrażliwości.
- Ilościowy PCR w celu określenia zahamowania wzrostu w obecności antybiotyków.
- Analiza wyników z wykorzystaniem specyficznych progów wartości CT do oceny wrażliwości.
Główne wyniki
- Przepływ pracy umożliwia identyfikację patogenów oraz badanie ich wrażliwości w ciągu kilku godzin.
- Wyniki wskazują, że metoda ta jest szybsza niż konwencjonalne systemy zautomatyzowane.
- Wykazano pomyślną identyfikację E. coli oraz profilu jej oporności na antybiotyki.
- Technikę tę można przeprowadzić efektywnie przy minimalnych wymaganiach dotyczących wcześniejszego hodowania.
Wnioski
- Ten szybki schemat diagnostyczny może znacząco usprawnić opiekę nad pacjentami w przypadkach zakażeń krwi.
- Połączenie technik hodowlanych i PCR zwiększa szybkość diagnozy i wdrożenia leczenia.
- Zaleca się dalszą walidację w warunkach klinicznych w celu potwierdzenia skuteczności.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Szybka identyfikacja patogenów oraz badanie wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe w ciągu jednego dnia roboczego eliminuje krytyczne wąskie gardło w zarządzaniu zakażeniami krwi, umożliwiając terminowe podejmowanie decyzji dotyczących antybiotykoterapii. Ten schemat postępowania zmniejsza zależność od długotrwałych metod opartych na hodowlach, wspierając szybszą deeskalację lub eskalację schematów empirycznych. Dostarczając praktyczne dane mikrobiologiczne w ciągu godzin, a nie dni, zwiększa on pewność prognostyczną przy wyborze środków przeciwdrobnoustrojowych we wczesnym stadium i zmniejsza ryzyko zastosowania niewłaściwej terapii.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia walidację funkcjonalną celów przeciwdrobnoustrojowych poprzez powiązanie identyfikacji patogenu z profilami podatności fenotypowej w kontrolowanych warunkach.
- Wartość operacyjna: Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego w przypadku kandydatów na antybiotyki dzięki szybkiej korelacji identyfikacji genetycznej z wynikami hamowania wzrostu.
- Wartość prognostyczna: Generuje ilościowe dane o podatności oparte na wartościach progowych, które pomagają w priorytetyzacji związków wiodących w programach odkrywania nowych leków przeciwbakteryjnych.
Przesiew i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Zapewnia zstandaryzowany, ilościowy odczyt (wartości CT) do oceny hamowania wzrostu bakterii, co umożliwia powtarzalny screening związków przeciwko izolatom klinicznym.
- Wartość operacyjna: Ułatwia przygotowanie testu poprzez wykorzystanie bezpośrednio przetworzonego materiału z posiewów krwi, co minimalizuje zmienność przedanalityczną i zwiększa przepustowość.
- Skalowalność: Kompatybilność z platformami PCR na 96 dołków pozwala na równoległe testowanie wielu antybiotyków i izolatów w celu efektywnej optymalizacji związków wiodących.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Łączy etap odkrywania z oceną przedkliniczną poprzez wykorzystanie klinicznie istotnych patogenów izolowanych z posiewów krwi, co zwiększa trafność modelu choroby.
- Redukcja ryzyka mechanistycznego: Umożliwia wczesną ocenę skuteczności antybiotyków przeciwko szczepom opornym, zmniejszając ryzyko niepowodzeń na późnych etapach rozwoju produktów.
- Korelacja z biomarkerami: Wspiera identyfikację sygnatur genetycznych związanych z wrażliwością poprzez zestawione profilowanie genotypowe i fenotypowe.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta integruje się z kontinuum odkrywania leków przeciwbakteryjnych, od wczesnej walidacji celu po optymalizację związku wiodącego, zapewniając szybką charakterystykę patogenów oraz profilowanie podatności w celu wsparcia decyzji dotyczących dalszego rozwoju związków.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez poprzez umożliwienie szybkiej identyfikacji gatunków patogenów oraz ocenę hamowania wzrostu indukowanego przez antybiotyki.
- Przesiewanie: Dostarcza zestandaryzowane, ilościowe wyniki podatności, które pozwalają na porównanie skuteczności związków w odniesieniu do wielu izolatów klinicznych.
- Analityka: Generuje dane o hamowaniu wzrostu w oparciu o wartość CT, które służą jako mierzalne punkty końcowe do oceny aktywności przeciwbakteryjnej i mechanizmów oporności.
- Badania translacyjne: Wykorzystuje patogeny bezpośrednio z dodatnich posiewów krwi, co zwiększa znaczenie w odniesieniu do modeli infekcji ludzkich i walidację przedkliniczną.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy możliwość ponownego wykorzystania zdolności diagnostycznych w programach przeciwbakteryjnych, ograniczając nadmiarowe opracowywanie metod w różnych projektach.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w wyborze wiodących związków przeciwbakteryjnych poprzez dostarczenie szybkich danych korelacyjnych fenotyp-genotyp.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność i standaryzację dzięki określonym czasom inkubacji, progom CT oraz kontrolowanym kontrolom wzrostu.
- Wartość strategiczna: Zwiększa efektywność podejmowania decyzji go/no-go poprzez skrócenie czasu uzyskiwania danych o wrażliwości z dni do godzin.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację kandydatów na antybiotyki z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o wczesne profile wrażliwości wobec istotnych klinicznie patogenów.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy specjalistycznej z zakresu mikrobiologii molekularnej oraz projektowania i interpretacji testów real-time PCR.
- Zależne od dostępu do aparatury do ilościowej PCR z możliwością multipleksowania i analizy krzywych topnienia.
- Wymaga standaryzowanych protokołów obróbki posiewów krwi, przygotowania paneli antybiotyków oraz kontroli zanieczyszczeń.
- Wymaga dostosowania stężeń antybiotyków i czasów inkubacji dla różnych kombinacji patogen-lek.
- Ograniczone do patogenów tlenowych i fakultatywnie beztlenowych; patogeny ściśle beztlenowe mogą wymagać alternatywnych procedur.
