Name: Wzbogacanie komórek NK z ludzkiej krwi za pomocą zestawu RosetteSep firmy StemCell Technologies (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-10-01T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 52 s
Description: Poznaj metodę izolacji komórek NK z ludzkiej krwi za pomocą zestawu RosetteSep firmy StemCell Technologies. Technika selekcji negatywnej zapewnia wysoką czystość i żywotność komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Szczegółowy protokół jest dołączony do każdego koktajlu izolacyjnego Rosette Sep i jest dostępny online na stronie internetowej firmy StemCell Technologies 1.

<ol><li>Procedures and instruction manuals. , 
	
 <a target="_blank" href="http://www.stemcell.com/technical/technicalrsproc.aspx">http://www.stemcell.com/technical/technicalrsproc.aspx</a> Forthcoming.</li>
</ol>

Komórki wyizolowane za pomocą tej techniki mogą zostać następnie rozdzielone na różne populacje przy użyciu innych zestawów do separacji komórek.

<table><tbody><tr><td>Koktajl Rosette Sep dla ludzkich komórek NK</td><td>Odczynnik</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>15065</td><td></td></tr><tr><td>PBS, sterylny, 1x</td><td>Odczynnik</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14040-058</td><td></td></tr><tr><td>Pł Tk (FCS, FBS)</td><td>Odczynnik</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>16140-071</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque-1077</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10771</td><td></td></tr><tr><td colspan="5">PBS uzupełniony o 2% FCS oraz roztwory Histopaque muszą zostać doprowadzone do temperatury pokojowej przed rozpoczęciem procedury.</td></tr></tbody></table>

wzbogacanie komórek nk z ludzkiej krwi za pomocą zestawu rosettesep firmy stemcell technologies

Enrichment of NK Cells from Human Blood with the RosetteSep Kit from StemCell Technologies

Komórki natural killer (NK) to duże ziarniste limfocyty cytotoksyczne należące do wrodzonego układu odpornościowego, które odgrywają główną rolę w walce z nowotworami i infekcjami, ale biorą także udział w wczesnych etapach ciąży i odrzucaniu przeszczepów. Komórki te występują we krwi obwodowej, z której można je wyizolować. Izolacja komórek może odbywać się za pomocą selekcji pozytywnej lub negatywnej. W selekcji pozytywnej stosuje się przeciwciała skierowane przeciwko markerowi powierzchniowemu występującemu wyłącznie na komórkach będących przedmiotem zainteresowania, natomiast w selekcji negatywnej wykorzystuje się koktajle przeciwciał skierowanych przeciwko markerom powierzchniowym obecnym na wszystkich komórkach z wyjątkiem komórek docelowych. Ta druga technika daje korzyść w postaci pozostawienia komórek docelowych wolnych od przeciwciał, co zmniejsza ryzyko niepożądanej aktywacji lub różnicowania komórek. W tym protokole wideo demonstrujemy, jak oddzielić komórki NK z ludzkiej krwi poprzez selekcję negatywną, korzystając z zestawu RosetteSep firmy StemCell technologies. Procedura polega na pobraniu ludzkiej krwi obwodowej (zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez instytucjonalną komisję etyczną w celu ochrony uczestników) i zmieszaniu jej z koktajlem przeciwciał, które zwiążą się z markerami nieobecnymi na komórkach NK, ale obecnymi na wszystkich pozostałych komórkach mononuklearnych we krwi obwodowej (np. limfocytach T, monocytach...). Przeciwciała zawarte w koktajle są skoniugowane z przeciwciałami skierowanymi przeciwko glikoforynie A na erytrocytach. W rezultacie wszystkie niepożądane komórki oraz krwinki czerwone zostaną uwięzione w kompleksach. Mieszanina krwi i koktajlu przeciwciał jest następnie rozcieńczana, nakładana na gradient Histopaque i wirowana. Komórki NK (&gt;80% czystości) można zebrać na granicy fazy między Histopaque a rozcieńczonym osoczem. Podobne koktajle są dostępne do wzbogacania innych populacji komórek, takich jak ludzkie limfocyty T.

Komórki natural killer stanowią niewielką populację limfocytów. W niniejszym materiale pokazujemy, jak izolować te komórki z ludzkiej krwi metodą selekcji negatywnej, wykorzystując zestaw firmy StemCell Technologies. Uzyskane komórki są żywe i nieoznaczone przeciwciałami, w związku z czym nadają się do zastosowania w wielu procedurach.

Wzbogacanie komórek NK z ludzkiej krwi za pomocą zestawu RosetteSep firmy StemCell Technologies

Komórki natural killer (NK) to duże granularne limfocyty cytotoksyczne należące do wrodzonego układu odpornościowego, które odgrywają kluczową rolę w walce z nowotworami...

Witam, nazywam się Christine Beaton. Jestem asystentem badawczym w laboratorium George'a Chen w Departamencie Fizjologii i Biofizyki Uniwersytetu Kalifornijskiego w Irvine. Dzisiaj pokażę Państwu, jak przeprowadzić negatywną selekcję komórek natural killer z ludzkiej krwi przy użyciu zestawów cocktail kits firmy StemCell Technologies.Powodem, dla którego używamy zestawu firmy Stem Cell Technologies, jest to, że zapewnia on bardzo wysoką czystość komórek, a selekcja negatywna pozwala uzyskać komórki, które nie zostały związane z przeciwciałem. Dzięki temu unikamy nieprzewidzianych reakcji w tych komórkach. Sposób działania zestawu Tsep polega na wykorzystaniu przeciwciał, które wiążą wszystkie komórki krwi, których nie chcemy wyizolować.W moim przypadku są to limfocyty T, limfocyty B, monocyty, a następnie przeciwciała, które wiążą się z glikoforyną A w erytrocytach. Zastosowano tutaj metodę polegającą na połączeniu jednego przeciwciała przeciwko leukocytowi z przeciwciałem przeciwko erytrocytowi. W rezultacie powstanie kompleks składający się z jednego niepożądanego leukocytu oraz wielu erytrocytów. Ponieważ erytrocyty mają większą gęstość niż leukocyty, po nałożeniu mieszaniny zaw

enrichment-nk-cells-from-human-blood-with-rosettesep-kit-from

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Wzbogacanie komórek NK z ludzkiej krwi za pomocą zestawu RosetteSep od StemCell Technologies

W niniejszej pracy opisujemy metodę wydajnej ekspansji i oczyszczania dużych ilości ludzkich komórek NK oraz oceny ich funkcji.

Ekspansja, oczyszczanie i ocena funkcjonalna ludzkich komórek NK z krwi obwodowej

Ten film demonstruje metodę analizy metabolizmu energetycznego w aktywowanych ludzkich komórkach NK za pomocą analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego. Różne inhibitory kompleksów łańcucha transportu elektronów wpływają na syntezę ATP, która jest mierzona za pomocą wskaźnika zużycia tlenu lub OCR, dostarczając wglądu w metabolizm komórkowy i bioenergetykę.

Monitorowanie metabolizmu energetycznego w ludzkich komórkach NK w czasie rzeczywistym za pomocą analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego

Ten film demonstruje technikę genetycznej modyfikacji komórek NK za pośrednictwem rybonukleoproteiny Cas9. Rybonukleoproteina Cas9, składająca się z endonukleazy Cas9 związanej z przewodnikiem RNA (gRNA) utworzonego przez parowanie zasad CRISPR RNA (crRNA) i transaktywującego crRNA (tracrRNA), jest wprowadzana do pierwotnych komórek NK za pomocą elektroporacji. Rybonukleoproteina atakuje i rozszczepia DNA gospodarza w miejscu docelowym, prowadząc do nokautu genu poprzez modyfikację genu...

Technika edycji genów w komórkach NK przy użyciu CRISPR Cas9

Ten protokół opisuje rozwój, ekspansję i obrazowanie in vivo komórek NK pochodzących z hESC i iPSC.

Rozwój, ekspansja i monitorowanie in vivo ludzkich komórek NK z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) i indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC)

Prosta i niezawodna metoda jest tutaj opisana do analizy zestawu funkcji komórek NK, takich jak degranulacja, produkcja cytokin i chemokiny w różnych podzbiorach komórek NK.

Test oparty na cytometrii przepływowej do monitorowania funkcji komórek NK

Celem tego badania było sformułowanie technologii, które pozwalają na skuteczną transdukcję genów w pierwotnych komórkach NK (natural killer). Transdukcja lentiwirusowa ludzkich lub mysich pierwotnych komórek NK za pośrednictwem dekstranu skutkuje wyższą wydajnością ekspresji genów. Ta metoda transdukcji genów znacznie poprawi manipulację genetyczną komórkami NK.

Dekstran zwiększa efektywność transdukcji lentiwirusowej mysich i ludzkich pierwotnych komórek NK

Tutaj prezentujemy protokół masowej produkcji mysich komórek NK wyciszających geny za pomocą systemu różnicowania bez karmienia do mechanistycznych badań in vitro i in vivo.

Nowatorski system bez podajnika do masowej produkcji mysich komórek NK in vitro

Tutaj prezentujemy protokół genetycznej modyfikacji pierwotnych lub rozszerzonych komórek NK (ang. human natural killer) za pomocą rybonukleoprotein Cas9 (Cas9/RNPs). Korzystając z tego protokołu, wygenerowaliśmy ludzkie komórki NK z niedoborem receptora 2 czynnika wzrostu b (TGFBR2) i fosforybozylotransferazy hipoksantynowej 1 (HPRT1).

Generowanie nokautujących pierwotnych i ekspandowanych ludzkich komórek NK przy użyciu rybonukleoprotein Cas9

Protokół do badania zdarzeń wywołanych przez FcγRIIIa przez przeciwciała terapeutyczne w ludzkich komórkach NK jest opisany tutaj. Ta platforma sztucznej stymulacji umożliwia badanie dalszych funkcji efektorowych, takich jak degranulacja, produkcja chemokin/cytokin i szlaki sygnałowe, w których pośredniczą części FcγRIIIa i Fc przeciwciał zaangażowanych w wiązanie.

Ocena zdarzeń związanych z ludzkimi komórkami NK wywołanych zaangażowaniem FcγRIIIa w obecności przeciwciał terapeutycznych

Obecny protokół pokazuje, jak odróżnić komórki CD3−/CD45+CD56+ o łagodnej cytotoksyczności od ludzkich komórek macierzystych o rozszerzonym potencjale (hEPSC) zarówno w warunkach hodowli 3D, jak i 2D. Pozwala to na rutynową walidację fenotypową bez niszczenia złożonego mikrośrodowiska.

Generowanie komórek NK z ludzkich komórek macierzystych o rozszerzonym potencjale

Tutaj prezentujemy metodę różnicowania i rozszerzania ludzkich komórek NK wyrażających chimeryczny receptor antygenowy (CAR) pochodzących z ludzkiego iPSC z ulepszonym zabijaniem przeciwko różnym nowotworom złośliwym. Protokół ten demonstruje różnicowanie i ekspansję komórek CAR-NK pochodzących z iPSC zoptymalizowanych pod kątem metody NK oraz pomiar aktywności przeciwnowotworowej przeciwko różnym liniom komórek nowotworowych.

Postępy w indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórkach NK wykazujących ekspresję receptora chimerycznego antygenu macierzystego

Poznaj metodę izolacji komórek NK z ludzkiej krwi za pomocą zestawu RosetteSep firmy StemCell Technologies. Technika selekcji negatywnej zapewnia wysoką czystość i żywotność komórek.

Wzbogacanie komórek NK z ludzkiej krwi za pomocą zestawu RosetteSep firmy StemCell Technologies

Przeglądaj więcej filmów