Name: Wzbogacanie komórek NK z ludzkiej krwi za pomocą zestawu RosetteSep firmy StemCell Technologies (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-10-01T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 52 s
Description: Poznaj metodę izolacji komórek NK z ludzkiej krwi za pomocą zestawu RosetteSep firmy StemCell Technologies. Technika selekcji negatywnej zapewnia wysoką czystość i żywotność komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Szczegółowy protokół jest dołączony do każdego koktajlu izolacyjnego Rosette Sep i jest dostępny online na stronie internetowej firmy StemCell Technologies 1.

<ol><li>Procedures and instruction manuals. , 
	
 <a target="_blank" href="http://www.stemcell.com/technical/technicalrsproc.aspx">http://www.stemcell.com/technical/technicalrsproc.aspx</a> Forthcoming.</li>
</ol>

Komórki wyizolowane za pomocą tej techniki mogą zostać następnie rozdzielone na różne populacje przy użyciu innych zestawów do separacji komórek.

<table><tbody><tr><td>Koktajl Rosette Sep dla ludzkich komórek NK</td><td>Odczynnik</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>15065</td><td></td></tr><tr><td>PBS, sterylny, 1x</td><td>Odczynnik</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14040-058</td><td></td></tr><tr><td>Pł Tk (FCS, FBS)</td><td>Odczynnik</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>16140-071</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque-1077</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10771</td><td></td></tr><tr><td colspan="5">PBS uzupełniony o 2% FCS oraz roztwory Histopaque muszą zostać doprowadzone do temperatury pokojowej przed rozpoczęciem procedury.</td></tr></tbody></table>

wzbogacanie komórek nk z ludzkiej krwi za pomocą zestawu rosettesep firmy stemcell technologies

Enrichment of NK Cells from Human Blood with the RosetteSep Kit from StemCell Technologies

Komórki natural killer (NK) to duże ziarniste limfocyty cytotoksyczne należące do wrodzonego układu odpornościowego, które odgrywają główną rolę w walce z nowotworami i infekcjami, ale biorą także udział w wczesnych etapach ciąży i odrzucaniu przeszczepów. Komórki te występują we krwi obwodowej, z której można je wyizolować. Izolacja komórek może odbywać się za pomocą selekcji pozytywnej lub negatywnej. W selekcji pozytywnej stosuje się przeciwciała skierowane przeciwko markerowi powierzchniowemu występującemu wyłącznie na komórkach będących przedmiotem zainteresowania, natomiast w selekcji negatywnej wykorzystuje się koktajle przeciwciał skierowanych przeciwko markerom powierzchniowym obecnym na wszystkich komórkach z wyjątkiem komórek docelowych. Ta druga technika daje korzyść w postaci pozostawienia komórek docelowych wolnych od przeciwciał, co zmniejsza ryzyko niepożądanej aktywacji lub różnicowania komórek. W tym protokole wideo demonstrujemy, jak oddzielić komórki NK z ludzkiej krwi poprzez selekcję negatywną, korzystając z zestawu RosetteSep firmy StemCell technologies. Procedura polega na pobraniu ludzkiej krwi obwodowej (zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez instytucjonalną komisję etyczną w celu ochrony uczestników) i zmieszaniu jej z koktajlem przeciwciał, które zwiążą się z markerami nieobecnymi na komórkach NK, ale obecnymi na wszystkich pozostałych komórkach mononuklearnych we krwi obwodowej (np. limfocytach T, monocytach...). Przeciwciała zawarte w koktajle są skoniugowane z przeciwciałami skierowanymi przeciwko glikoforynie A na erytrocytach. W rezultacie wszystkie niepożądane komórki oraz krwinki czerwone zostaną uwięzione w kompleksach. Mieszanina krwi i koktajlu przeciwciał jest następnie rozcieńczana, nakładana na gradient Histopaque i wirowana. Komórki NK (&gt;80% czystości) można zebrać na granicy fazy między Histopaque a rozcieńczonym osoczem. Podobne koktajle są dostępne do wzbogacania innych populacji komórek, takich jak ludzkie limfocyty T.

Komórki natural killer stanowią niewielką populację limfocytów. W niniejszym materiale pokazujemy, jak izolować te komórki z ludzkiej krwi metodą selekcji negatywnej, wykorzystując zestaw firmy StemCell Technologies. Uzyskane komórki są żywe i nieoznaczone przeciwciałami, w związku z czym nadają się do zastosowania w wielu procedurach.

Wzbogacanie komórek NK z ludzkiej krwi za pomocą zestawu RosetteSep firmy StemCell Technologies

Komórki natural killer (NK) to duże granularne limfocyty cytotoksyczne należące do wrodzonego układu odpornościowego, które odgrywają kluczową rolę w walce z nowotworami...

Witam, nazywam się Christine Beaton. Jestem asystentem badawczym w laboratorium George'a Chen w Departamencie Fizjologii i Biofizyki Uniwersytetu Kalifornijskiego w Irvine. Dzisiaj pokażę Państwu, jak przeprowadzić negatywną selekcję komórek natural killer z ludzkiej krwi przy użyciu zestawów cocktail kits firmy StemCell Technologies.Powodem, dla którego używamy zestawu firmy Stem Cell Technologies, jest to, że zapewnia on bardzo wysoką czystość komórek, a selekcja negatywna pozwala uzyskać komórki, które nie zostały związane z przeciwciałem. Dzięki temu unikamy nieprzewidzianych reakcji w tych komórkach. Sposób działania zestawu Tsep polega na wykorzystaniu przeciwciał, które wiążą wszystkie komórki krwi, których nie chcemy wyizolować.W moim przypadku są to limfocyty T, limfocyty B, monocyty, a następnie przeciwciała, które wiążą się z glikoforyną A w erytrocytach. Zastosowano tutaj metodę polegającą na połączeniu jednego przeciwciała przeciwko leukocytowi z przeciwciałem przeciwko erytrocytowi. W rezultacie powstanie kompleks składający się z jednego niepożądanego leukocytu oraz wielu erytrocytów. Ponieważ erytrocyty mają większą gęstość niż leukocyty, po nałożeniu mieszaniny zawierającej krew i przeciwciała na gradient i rozpoczęciu wirowania, erytrocyty opadną na dno probówki, pociągając za sobą wszystkie niepotrzebne leukocyty. Na górze gradientu można wówczas zebrać czyste lub prawie czyste komórki NK, które nie związały się z żadnym przeciwciałem.Przejdźmy zatem do izolacji komórek NK z probówki z ludzką krwią. Jest to świeżo pobrana krew w probówce z heparyną sodową. Jako gradient wykorzystam koktajl do wzbogacania ludzkich komórek NK Rosetep.W późniejszym etapie eksperymentu będę używać pakietu histo 10 77, który ma gęstość 1,077, a dodatkowo przygotowałem butelkę PBS uzupełnionego o 2% płodowej cielęcej surowicy. Upewniam się, że składniki te osiągną temperaturę pokojową przed użyciem, ponieważ przechowuję je w lodówce. Następnie wezmę całą probówkę z krwią i przeleję ją do probówki Falcon o pojemności 50 ml.Ponieważ jest to probówka próżniowa, wewnątrz panuje podciśnienie; aby otworzyć ją bez rozbryzgów, znajduję niewielkie wcięcie na zakrętce i ostrożnie ją unoszę, aby dopuścić powietrze do probówki. Gdy próżnia w probówce zostanie przerwana, mogę łatwiej zdjąć zakrętkę, a następnie, używając pipety 10 ml, pobieram całą zawartość krwi z probówki. Spodziewam się, że krwi powinno być około 10 ml.Mam tutaj 9,5 ml krwi i przelewam całość tych 9,5 ml do tej 50 ml rurki typu Falcon. Następnie pipeta z krwią trafia bezpośrednio do worka na odpady biologiczne; do rurki zawsze wlewam nieco wybielacza, zamykam ją, a następnie wkładam do worka na odpady biologiczne. Tak właśnie wygląda krew przed dodaniem koktajlu przeciwciał.Teraz dodam koktajl przeciwciał do krwi. Ponieważ mam około 9,5 ml krwi, a muszę dodać 50 µL koktajlu na 1 ml krwi, dodam do krwi 450 µL koktajlu. Następnie delikatnie wymieszam zawiesinę i niemal natychmiast pojawi się efekt grudkowania. Jak widać, grudki są już widoczne.W tym momencie następuje zjawisko krzyżowego wiązania (cross-linking) między niepożądanymi białymi krwinkami a czerwonymi krwinkami. Nastawię minutnik na 20 minut i pozostawię probówkę w komorze z laminarnym przepływem powietrza na ten czas. Krew inkubowała się przez 20 minut z koktajlem rozetkowym.Rozcieńczę go w stosunku jeden do jednego w PBS z dodatkiem płodowej surowicy bydlęcej. Tę mieszaninę naniosę na dwie 15 ml części histo pack 10 77. Następnie odwiruję próbkę w wirówce przez 20 minut.Mam około 10 µL krwi z koktajlem przeciwciał. Dodam zatem 10 µL PBS zawierającego 2% płodowej surowicy bydlęcej. Jest to rozcieńczenie w stosunku jeden do jednego.Będę mieszać delikatnie, ponieważ jak widać, po dodaniu PBS do krwi nie miesza się ona natychmiast. Dlatego po prostu delikatnie mieszam. Mam teraz mieszaninę PBS i krwi w stosunku jeden do jednego, którą dodam do 15 ml histo pack.Następnie ostrożnie nałożę warstwę, aby uniknąć wymieszania krwi z zestawem histo pack. W tym celu, zamiast używać pipety 25 µL, która pobrałaby całą krew, użyję pipety 10 µL i wykonam to w kilku krokach. Aby ułatwić nakładanie, trzymam probówkę z zestawem histo pack niemal poziomo.Naniosę niewielką ilość krwi na probówkę, a następnie skieruję ją w stronę histo packa. Następnie bardzo powoli będę warstwowo nakładać krew na histo pack. Gdy uzyskam odpowiednią warstwę krwi, będę mógł pipetować nieco szybciej i powoli przywrócić probówkę do pozycji pionowej.Teraz nałożyłem całe 20 ml mieszaniny krwi z koktajlem przeciwciał i PBS na dwie warstwy po 15 ml histo pack. Jeśli spojrzymy na połączenie w probówce, można zauważyć, że małe agregaty erytrocytów powoli opadają w głąb gradientu; zastosujemy wirowanie RET po prostu po to, aby przyspieszyć ten proces. Dzięki temu w ciągu 20 minut wszystkie erytrocyty znajdą się na dnie probówki.Istnieje jeden bardzo ważny punkt podczas przeprowadzania wirowania: należy wyłączyć hamulec, ponieważ zbyt szybkie hamowanie może zakłócić strukturę składników. Dlatego zawsze wyłączamy hamulec, a następnie ustawiam wirowanie na 20 minut i pozwalam urządzeniu wykonać zadanie. Składnik był teraz wirowany przez 20 minut.Mamy zatem różne warstwy komórek. Zaczynamy od dna probówki. Tutaj znajdują się wszystkie erytrocyty oraz komórki, które nas nie interesują.Nad nią znajduje się przejrzysta warstwa gradientu, a powyżej niej żółtawa warstwa osocza. Komórki, które nas interesują – komórki NK – to ta cienka, biała warstwa komórek znajdująca się pomiędzy gradientem a warstwą osocza.Oczywiście warstwa ta jest bardzo cienka, ponieważ komórki NK stanowią jedynie mniejszość komórek krwi. Teraz usunę warstwę komórek NK za pomocą sterylnej pipety Pasteura. Warstwę tę przeniosę do nowej, pustej probówki Falcon 50 ml.Następnie przechodzę do warstwy i ją odprowadzam. Oczywiście komórek jest bardzo mało. Gdy komórek jest dużo, można uzyskać bardzo czystą warstwę, podczas gdy przy tak niewielkiej liczbie komórek jest to trudniejsze.Zgodnie z zaleceniami producenta, rekomenduje się pobranie części gradientu wraz z komórkami, aby uniknąć ich utraty. Dlatego odpipetowuję go tak długo, aż przestanę widzieć tam komórki. Po pobraniu wszystkich komórek powinien być widoczny wyraźny kontrast między przejaśnionym odczynnikiem a żółtawą plazmą.Sądzę, że pobrałam już wszystkie komórki. Jeśli spojrzycie na gradient, w miejscu styku histo packu i osocza nie widać już żadnych białych, puszystych struktur. Usunęłam zatem z gradientu wszystkie widoczne komórki NK, przeniosłam je do nowej probówki Falcon o pojemności 50 ml i niezwłocznie dodałam do probówki PBS uzupełniony o 2% płodowej surowicy cielęcej.Dopełniłam objętość do 50 ml i teraz odwirować komórki, aby uzyskać osad. Będzie to pierwsze przemycie. Powtórzę tę procedurę drugi raz, aby przemyć komórki łącznie dwa razy.Po tym etapie komórki będą gotowe do dowolnej zaplanowanej procedury, takiej jak hodowla lub barwienie do cytometrii przepływowej. Czystość komórek NK powinna wynieść co najmniej 80%, a być może więcej. Stosując tę procedurę, uzyskiwałem czystość sięgającą 98%.Dzisiaj zaprezentowałem bardzo szybką i niezawodną technikę izolacji komórek NK z ludzkiej krwi przy użyciu zestawów StemCell Technologies. Oczywiście, jeśli chcą Państwo wyizolować inne typy komórek z krwi ludzkiej, szczurzej lub mysiej, mogą Państwo skorzystać z dowolnego z zestawów do izolacji limfocytów T. Dostępne są zestawy przeznaczone m.in. dla limfocytów T, limfocytów B, a nawet dla poszczególnych subpopulacji limfocytów T.

enrichment-nk-cells-from-human-blood-with-rosettesep-kit-from

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Wzbogacanie komórek NK z ludzkiej krwi za pomocą zestawu RosetteSep od StemCell Technologies

W niniejszej pracy opisujemy metodę wydajnej ekspansji i oczyszczania dużych ilości ludzkich komórek NK oraz oceny ich funkcji.

Ekspansja, oczyszczanie i ocena funkcjonalna ludzkich komórek NK z krwi obwodowej

Ten film demonstruje metodę analizy metabolizmu energetycznego w aktywowanych ludzkich komórkach NK za pomocą analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego. Różne inhibitory kompleksów łańcucha transportu elektronów wpływają na syntezę ATP, która jest mierzona za pomocą wskaźnika zużycia tlenu lub OCR, dostarczając wglądu w metabolizm komórkowy i bioenergetykę.

Monitorowanie metabolizmu energetycznego w ludzkich komórkach NK w czasie rzeczywistym za pomocą analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego

Ten protokół opisuje rozwój, ekspansję i obrazowanie in vivo komórek NK pochodzących z hESC i iPSC.

Rozwój, ekspansja i monitorowanie in vivo ludzkich komórek NK z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) i indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC)

Prosta i niezawodna metoda jest tutaj opisana do analizy zestawu funkcji komórek NK, takich jak degranulacja, produkcja cytokin i chemokiny w różnych podzbiorach komórek NK.

Test oparty na cytometrii przepływowej do monitorowania funkcji komórek NK

Celem tego badania było sformułowanie technologii, które pozwalają na skuteczną transdukcję genów w pierwotnych komórkach NK (natural killer). Transdukcja lentiwirusowa ludzkich lub mysich pierwotnych komórek NK za pośrednictwem dekstranu skutkuje wyższą wydajnością ekspresji genów. Ta metoda transdukcji genów znacznie poprawi manipulację genetyczną komórkami NK.

Dekstran zwiększa efektywność transdukcji lentiwirusowej mysich i ludzkich pierwotnych komórek NK

Metoda oparta na cytometrii przepływowej do ilościowego określania aktywności cytotoksycznej ludzkich komórek NK jest pokazana tutaj.

Test cytotoksyczności oparty na cytometrii przepływowej do oceny aktywności ludzkich komórek NK

Tutaj prezentujemy protokół masowej produkcji mysich komórek NK wyciszających geny za pomocą systemu różnicowania bez karmienia do mechanistycznych badań in vitro i in vivo.

Nowatorski system bez podajnika do masowej produkcji mysich komórek NK in vitro

Protokół do badania zdarzeń wywołanych przez FcγRIIIa przez przeciwciała terapeutyczne w ludzkich komórkach NK jest opisany tutaj. Ta platforma sztucznej stymulacji umożliwia badanie dalszych funkcji efektorowych, takich jak degranulacja, produkcja chemokin/cytokin i szlaki sygnałowe, w których pośredniczą części FcγRIIIa i Fc przeciwciał zaangażowanych w wiązanie.

Ocena zdarzeń związanych z ludzkimi komórkami NK wywołanych zaangażowaniem FcγRIIIa w obecności przeciwciał terapeutycznych

Obecny protokół pokazuje, jak odróżnić komórki CD3−/CD45+CD56+ o łagodnej cytotoksyczności od ludzkich komórek macierzystych o rozszerzonym potencjale (hEPSC) zarówno w warunkach hodowli 3D, jak i 2D. Pozwala to na rutynową walidację fenotypową bez niszczenia złożonego mikrośrodowiska.

Generowanie komórek NK z ludzkich komórek macierzystych o rozszerzonym potencjale

Tutaj prezentujemy metodę różnicowania i rozszerzania ludzkich komórek NK wyrażających chimeryczny receptor antygenowy (CAR) pochodzących z ludzkiego iPSC z ulepszonym zabijaniem przeciwko różnym nowotworom złośliwym. Protokół ten demonstruje różnicowanie i ekspansję komórek CAR-NK pochodzących z iPSC zoptymalizowanych pod kątem metody NK oraz pomiar aktywności przeciwnowotworowej przeciwko różnym liniom komórek nowotworowych.

Postępy w indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórkach NK wykazujących ekspresję receptora chimerycznego antygenu macierzystego

Poznaj metodę izolacji komórek NK z ludzkiej krwi za pomocą zestawu RosetteSep firmy StemCell Technologies. Technika selekcji negatywnej zapewnia wysoką czystość i żywotność komórek.

Wzbogacanie komórek NK z ludzkiej krwi za pomocą zestawu RosetteSep firmy StemCell Technologies

Przeglądaj więcej filmów