Name: Wykorzystanie modelu EpiAirway do charakteryzowania długoterminowych interakcji gospodarz-patogen (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: Poznaj metodę długoterminowej ko-kultury NTHI z ludzkimi tkankami nabłonkowymi dróg oddechowych przy użyciu modelu EpiAirway. Technika ta umożliwia ocenę przetrwania bakterii i charakterystyk szczepowych w czasie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Patrickowi Haydenowi (MatTek) za pomocne dyskusje oraz Robertowi Smithowi i Libby Perry z Georgia Health Sciences University za ich umiejętności w zakresie EM. Badanie to zostało sfinansowane z grantu NIDCD DC010187 przyznanego D.A.D.

1. Przygotowanie komory z laminarnym przepływem powietrza dla tkanek EpiAirway
<ol>
<li>Ubrani w dedykowany fartuch laboratoryjny, z włosami związanymi z tyłu i w rękawiczkach, uruchomcie przepływ laminarny. Po 5 minutach przesuńcie wszystkie narzędzia znajdujące się w komorze (pipety, końcówki, probówki do wirowania itp.) na jedną stronę, spryskajcie wnętrze komory bezpieczeństwa biologicznego oraz przesłonę 70% etanolem i przetrzyjcie czystymi ręcznikami papierowymi. Ponownie spryskajcie oczyszczone wnętrze 70% etanolem i pozostawcie do wyschnięcia. Przenieście narzędzia na czystą stronę i powtórzcie procedurę z użyciem etanolu.</li>
<li>Używajcie końcówek do pipet z barierą aerozolową oraz dedykowanych pipet wewnątrz komory. Aby użyć indywidualnie pakowanych sterylnych pipet serologicznych, przeprowadźcie zatyczkę przez przepływ laminarny, otwórzcie ją i wsuńcie pipetę do komory, wyrzucając opakowanie na zewnątrz.</li>
<li>Wkładki EpiAirway muszą być obsługiwane za pomocą sterylnych pincet. Umieśćcie zakrzywione pęsety sekcyjne z cienką końcówką o długości 6 cali w samoczynnie uszczelniających workach do sterylizacji i poddajcie autoklawowaniu. Przygotujcie taką ilość, aby każdego dnia dostępne były co najmniej sześć sztuk.</li>
</ol>
2. Rozpakowywanie tkanek EpiAirway
<ol>
<li>Spryskaj powierzchnię roboczą w komorze z laminarnym przepływem powietrza 70% etanolem i przetrzyj czystymi ręcznikami papierowymi. Spryskaj ponownie i poczekaj, aż powierzchnia wyschnie przed użyciem. Otwórz pudełko EpiAirway i usuń styropian oraz materiały opakowaniowe.</li>
<li>Bezantybiotyczne podłoże konserwacyjne EpiAirway, AIR-100-MM ABF (MM), jest produktem zastrzeżonym firmy MatTek i jest przesyłane w zestawie z wkładkami. W komorze z laminarnym przepływem powietrza opisz sześć sterylnych probówek wirówkowych o pojemności 50 ml, podając rodzaj podłoża i datę, a następnie poluzuj zakrętki. Spryskaj butelkę z podłożem 70% etanolem i otwórz ją wewnątrz komory. Odmierz 25 ml MM do każdej probówki, używając nowej sterylnej pipety serologicznej dla każdej z nich, mocno zakręć nakrętki i przechowuj w temperaturze 4°C. Codziennie używaj świeżej porcji MM.</li>
<li>Powtórz krok 2.2 powyżej, używając nowej butelki 1 X Dulbecco's phosphate-buffered saline (D-PBS) z dodatkiem wapnia i magnezu. Powtórz czynność ponownie, używając D-PBS bez wapnia i magnezu. Wszystkie alikwoty przechowuj w temperaturze 4°C.</li>
<li>Wkładki EpiAirway AIR-100 dostarczane są w płytce 24-dołkowej w temperaturze 4°C na stałym podłożu zawierającym agarozę i muszą zostać przeniesione do płytek 6-dołkowych w celu użytkowania. Opisz każdą płytkę datą i opisem, używając markera odpornego na działanie etanolu. Wlej 1 ml MM EpiAirway o temperaturze 4°C do każdego dołka. Wyjmij płytkę transportową z opakowania, spryskaj 70% etanolem i umieść w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Usuń taśmę i otwórz płytkę. Używając autoklawowanej pęsety, usuń wilgotną gazę znajdującą się nad wkładkami EpiAirway.</li>
<li>Chwyć wkładkę autoklawowaną pęsetą, wykonując ruch obrotowy, aby ułatwić jej oddzielenie od agarozy, i umieść ją w dołku płytki 6-dołkowej. Część agarozy może przylgnąć do wkładki, szczególnie gdy temperatura płytki transportowej wzrośnie do temperatury otoczenia. Użyj sterylnego patyczka bawełnianego, aby ostrożnie usunąć agarozę z wkładki. Unikaj dotykania membrany i upewnij się, że pod wkładkami nie uwięzły pęcherzyki powietrza. Umieść płytkę w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37°C z zawartością 5% CO2.</li>
<li>Pozostaw tkanki w inkubatorze na co najmniej 24 godziny w celu ich ekwilibracji przed rozpoczęciem kokultur.</li>
</ol>
3. Konserwacja tkanek EpiAirway
<ol>
<li>Używając autoklawowanych pęset, wyjmij insert i delikatnie nanieś pipetą 200 µL podgrzanego wcześniej D-PBS z wapniem i magnezem na tkankę, a następnie delikatnie potrząśnij insertem. Przechyl insert pod kątem i przyłóż sterylną końcówkę pipety P1000 do plastikowego pierścienia utrzymującego membranę na dnie insertu. Nie dotykaj tkanki. Odessij płukanie D-PBS i przelej je do opisanej sterylnej probówki kriogenicznej. Próbki można zamrozić w temperaturze -20°C i poddać analizie pod kątem ekspresji mucyn i/lub cytokin w późniejszym terminie.</li>
<li>Wymieniaj podstawowe medium MM codziennie, odsysając je i zastępując 1 ml świeżego MM. Do każdego dołka używaj nowej końcówki pipety z filtrem. Zużyte media należy potraktować 10% wybielaczem przez noc, a następnie zutylizować.</li>
</ol>
4. Inokulacja tkanek EpiAirway
<ol>
<li>Wysiać świeżą kulturę nietypowalnego Haemophilus influenzae (NTHi) z zamrożonego zapasu w glicerolu na agar czekoladowy. Inkubować przez noc w inkubatorze z nawilżaniem i 5% CO2.</li>
<li>Następnego dnia resuspender pojedyncze kolonie NTHi w uprzednio ogrzanym D-PBS z dodatkiem wapnia i magnezu do uzyskania OD (600 nm) na poziomie około 0,7. Przed pomiarem gęstości optycznej energicznie wymieszać na wortexie. Relacja gęstości optycznej do liczby jednostek tworzących kolonie na ml (CFU/ml) dla NTHi jest taka, że OD (600 nm) wynosząca 0,2 odpowiada w przybliżeniu 1,0 x 108 CFU/ml. Zatem OD (600 nm) na poziomie 0,7 to około 3,5 x 108 CFU/ml. Algorytm ten należy zwalidować dla każdego szczepu NTHi przed inokulacją.</li>
<li>Tkanki EpiAirway AIR-100 są hodowane na wkładkach o powierzchni 0,6 cm2 i membranie o wielkości oczek 0,4 mikrona. Tkanki składają się z ~8,0 x 105 do ~1,0 x 106 komórek. W związku z tym inokulacja 1,0 x 107 CFU odpowiada wielokrotności zakażenia (MOI) na poziomie około 10 - 12. Aby przeprowadzić inokulację, opłukać każdą wkładkę EpiAirway zgodnie z opisem w punkcie 3.1, a następnie w komorze z laminarnym przepływem powietrza dodać 28 µL zawiesiny bakteryjnej przygotowanej w punkcie 4.2 na powierzchnię apikalną każdej wkładki EpiAirway. Nie inokulować podłoża basal MM. Umieścić każdą płytkę z powrotem w inkubatorze.</li>
</ol>
5. Ilościowe oznaczenie inokulum NTHi
<ol>
<li>Przygotować roztwór soli fosforanowo-buforowanej (PBS) z 0,1% żelatyną (PBS-G) i wysterylizować w autoklawie. Jałowe probówki Eppendorf o pojemności 1,5 ml opisać zgodnie z planowanymi rozcieńczeniami 1:10, ustalonymi na podstawie OD (600 nm) inokulum, a następnie do każdej probówki odnieść 900 µL sterylnego PBS-G.</li>
<li>Określić liczbę płytek z agarem czekoladowym niezbędnych do zliczenia zaszczepionych bakterii NTHi. Umieścić płytki w inkubatorze powietrznym dnem do góry, tak aby dno płytki opierało się o połowę górnej części, na jedną godzinę. Pozwoli to na ogrzanie płytek do 37°C oraz wysuszenie ich powierzchni, co ułatwi nanoszenie kropli NTHi.</li>
<li>Rozpocząć seryjne rozcieńczenia 1:10 inokulum, dodając 100 µL zawiesiny bakteryjnej z etapu 4.2 do pierwszej probówki. Każdą probówkę z rozcieńczeniem intensywnie mieszać w vorteksie przez 5 sekund przed wykonaniem kolejnego rozcieńczenia. Nanieść alikwoty o objętości 10 µL na uprzednio ogrzane i wysuszone płytki z agarem czekoladowym, wykorzystując połowę płytki dla każdego rozcieńczenia. Na połowie każdej płytki o średnicy 100 mm można zmieścić od pięciu do sześciu alikwotów po 10 µL bez ryzyka ich zlewania się. Po wyschnięciu płytek umieścić je dnem do góry w nawilżonym inkubatorze CO2 w temperaturze 37°C na noc.</li>
<li>Następnego dnia wyznaczyć CFU/ml, zliczając rozcieńczenia, w których w każdej kropli znajduje się od 15 do 30 wyraźnie oddzielnych kolonii, a następnie obliczyć rzeczywistą liczbę żywych bakterii NTHi w inokulum.</li>
</ol>
6. Długoterminowa kokultura z NTHi
<ol>
<li>Co 24 godziny należy przemyć wkłady zgodnie z instrukcją w punkcie 3.1, a następnie połączyć płukaniny z każdej tkanki zaszczepionej tym samym szczepem bakterii i zamrozić je w temperaturze -20°C w podpisanej probówce kriogenicznej do późniejszej analizy. Próbki te można poddać analizie w celu wykrycia obecności mucyn za pomocą techniki dot blot lub oceny ekspresji cytokin metodą ELISA. Alternatywnie można pobrać tkanki w celu izolacji mRNA i przeprowadzić qPCR dla wybranych genów. Codziennie należy wymieniać podstawowe medium MM zgodnie z punktem 3.2. Procedurę powtarzać przez cały czas trwania kokultury.</li>
</ol>
7. Pobieranie tkanek EpiAirway
<ol>
<li>Przygotować świeży 1% roztwór saponiny w D-PBS bez wapnia i magnezu, wysterylizować go przez filtrację i ogrzać do 37°C.</li>
<li>Ogrzać do 37°C probówkę 50 ml z MM oraz drugą z D-PBS bez wapnia i magnezu.</li>
<li>Przygotować probówki do rozcieńczeń zgodnie z punktem 5.1, a także jedną pustą sterylną probówkę Eppendorf 1,5 ml na każdy insert, opisaną numerem insertu i szczepem NTHi.</li>
<li>Z EpiAirways można zebrać bakterie całkowicie związane z komórkami, co obejmuje zarówno organizmy przylegające, jak i zinternalizowane, lub tylko bakterie zinternalizowane.</li>
<li>Określić liczbę płytek z agarem czekoladowym potrzebnych do metody drop-plating dla NTHi związanych z komórkami lub zinternalizowanych, opisać je i suszyć przez jedną godzinę w inkubatorze powietrznym zgodnie z punktem 5.2.</li>
<li>Aby zebrać całkowite bakterie związane z komórkami, przepłukać powierzchnię apikalną EpiAirways trzy razy 200 µl D-PBS bez wapnia i magnezu, a następnie przechylić insert i wypłukać pozostałe MM z błony bazalnej. Pierwszy płukanie można zamrozić do późniejszej analizy; kolejne płukanki należy odrzucić.</li>
<li>Umieścić wypłukany insert w nowej płytce 6-dołkowej bez MM i nanieść pipetą 250 µl sterylnego 1% roztworu saponiny z punktu 7.1 na powierzchnię apikalną każdej tkanki. Przenieść do inkubatora na 10 minut.</li>
<li>Wyjąć z inkubatora i za pomocą sterylnej końcówki pipety P1000 zeskrobać tkanki z błony, wykonując ruchy posuwisto-zwrotne, a następnie ruchy okrężne, aby usunąć tkankę z krawędzi insertu. Używając sterylnej końcówki pipety P1000 o szerokim otworze, przenieść zawiesinę do pustej opisanej probówki przygotowanej w punkcie 7.3. Dodać 250 µl D-PBS bez wapnia i magnezu na powierzchnię apikalną insertu.</li>
<li>Obejrzeć insert pod odwróconym mikroskopem fazowo-kontrastowym, aby sprawdzić, czy pozostała tkanka do zebrania. W razie potrzeby ponownie zeskrobać tkankę inną sterylną końcówką pipety P1000, a następnie dodać tę zawiesinę do probówki z punktu 7.8, używając sterylnej końcówki pipety P1000 o szerokim otworze. Uzupełnić całkowitą objętość w probówce do 1 ml za pomocą D-PBS bez wapnia i magnezu.</li>
<li>Intensywnie wymieszać zawiesinę komórkową na wirówce typu vortex z maksymalną prędkością przez jedną minutę. Używając sterylnej strzykawki 1 ml z igłą 26G, zaciągnąć zawiesinę do strzykawki przez igłę. Powoli przepuścić zawiesinę przez igłę 3 razy, uważając, aby nie wytworzyć pęcherzyków powietrza. Ponownie intensywnie wymieszać na vortexie przez jedną minutę.</li>
<li>Używając końcówki pipety o szerokim otworze, przenieść 100 µl zawiesiny do pierwszej probówki z rozcieńczeniem przygotowanej w punkcie 7.3. Intensywnie wymieszać na vortexie przez pięć sekund, a następnie wykonać seryjne rozcieńczenia 1:10. Nanieść wybrane rozcieńczenia metodą drop-plating na wysuszone powierzchniowo płytki z agarem czekoladowym.</li>
<li>Aby zebrać tylko bakterie zinternalizowane, wypłukać każdy insert 3 razy 200 µl D-PBS bez wapnia i magnezu. Zachować i zamrozić pierwsze płukanie. Dodać siarczan gentamycyny do uprzednio ogrzanego MM do końcowego stężenia 100 µg/ml. Przygotować 1,5 ml pożywki na każdy zbierany insert. Zastąpić bazalne MM pożywką MM zawierającą gentamycynę i dodać 300 µl MM z gentamycyną na powierzchnię apikalną. Umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze CO2 na jedną godzinę.</li>
<li>Usunąć MM z gentamycyną z powierzchni apikalnej i dokładnie wypłukać powierzchnię apikalną oraz błonę bazalną insertu uprzednio ogrzanym D-PBS bez wapnia i magnezu. Postąpić zgodnie z punktami 7.7-7.11.</li>
</ol>
8. Reprezentatywne wyniki: 
Na Ryc. 1 przedstawiono mikrografie z transmisyjnego mikroskopu elektronowego (A.) niezakażonej tkanki EpiAirway oraz (B.) tkanki po 5-dniowej kokulturze z NTHi. Długotrwała kokultura z NTHi nie powoduje istotnych uszkodzeń tkanek apikalnych, co podkreśla użyteczność modelu EpiAirway. Wykres przedstawiający liczbę zinternalizowanych bakterii ilościowo określonych w czasie wewnątrz tkanek pokazano na Ryc. 2. Oba wyniki są wysoce powtarzalne, co sprawia, że tkanki EpiAirway stanowią spójny i biologicznie istotny model in vitro ludzkich górnych dróg oddechowych do badania interakcji gospodarz-patogen w przypadku NTHi.
<img src="/files/ftp_upload/3261/3261fig1.jpg" alt="Porównanie SEM komórek niezakażonych i zakażonych; mikroskopia elektronowa, analiza struktury komórkowej." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> Rysunek 1. Skaningowa mikroskopia elektronowa tkanek EpiAirway. A. Niezinfekowana tkanka kontrolna. B. Tkanka po pięciu dniach kokultury z NTHi. W tkankach zakażonych nie obserwuje się istotnych uszkodzeń powierzchni apikalnej.
<img src="/files/ftp_upload/3261/3261fig2.jpg" alt="Wykres wzrostu bakterii, JCF/ml w funkcji czasu, wykres słupkowy, szczep GmR, wyniki inokulacji, badanie biotechnologiczne." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> Rycina 2. Liczba zinternalizowanych NTHi w czasie podczas kokultury EpiAirway. Szczep R2866 inokulowano w dawce około 1,0 x 107 CFU/insert (Dzień 0), a następnie pobierano próbki w celu oznaczenia zinternalizowanych bakterii w każdym wskazanym punkcie czasowym. Słupki reprezentują n=3 powtórzeń wykonanych w co najmniej dwóch seriach. Słupki błędu oznaczają SD.

<ol><li>Murphy, T. F., Apicella, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nontypeable+Haemophilus+influenzae%3A+a+review+of+clinical+aspects%2C+surface+antigens%2C+and+the+human+immune+response+to+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Rev.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Nontypeable Haemophilus influenzae: a review of clinical aspects, surface antigens, and the human immune response to infection.</a> Rev. Infect. Dis. 9, 1-15 (1987).</li>
<li>Murphy, T. F., Faden, H., Bakaletz, L. O., Kyd, J. M., Forsgren, A., Campos, J., Virji, M., Pelton, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nontypeable+Haemophilus+influenzae+as+a+pathogen+in+children%5BTitle%5D)+AND+%22Ped.+Infect.+Dis.+J%22%5BJournal%5D)">Nontypeable Haemophilus influenzae as a pathogen in children.</a> Ped. Infect. Dis. J. 28, 43-48 (2009).</li>
<li>Hotomi, M., Arai, J., Billal, D. S., Takei, S., KIkeda, Y., Ogami, M., Kono, M., Beder, L. B., Toya, K., Kimura, M., Yamanaka, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nontypeable+Haemophilus+influenzae+isolated+from+intractable+acute+otitis+media+internalized+into+cultured+human+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Auris+Nasus+Larynx%22%5BJournal%5D)">Nontypeable Haemophilus influenzae isolated from intractable acute otitis media internalized into cultured human epithelial cells.</a> Auris Nasus Larynx. 37, 137-144 (2010).</li>
<li>Chemuturi, N. V., Hayden, P., Kalausner, M., Donovan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+human+tracheal%2Fbronchial+epithelial+cell+culture+and+bovine+nasal+respiratory+explants+for+nasal+drug+transport+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharm.+Sci%22%5BJournal%5D)">Comparison of human tracheal/bronchial epithelial cell culture and bovine nasal respiratory explants for nasal drug transport studies.</a> J. Pharm. Sci. 94, 1976-1985 (2005).</li>
<li>Sharma, M., Schoop, R., Hudson, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+efficacy+of+Echinacea+in+a+3-D+tissue+model+of+human+airway+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Phytother.+Res%22%5BJournal%5D)">The efficacy of Echinacea in a 3-D tissue model of human airway epithelium.</a> Phytother. Res. 24, 900-904 (2010).</li>
<li>Sexton, K., Balharry, D., BeruBe, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+biomarkers+of+pulmonary+exposure+to+tobacco+smoke+components%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacogenet+Genomics%22%5BJournal%5D)">Genomic biomarkers of pulmonary exposure to tobacco smoke components.</a> Pharmacogenet Genomics. 10, 853-860 (2008).</li>
<li>Babu, R. J., Dayal, P., Singh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+cyclodextrins+on+the+complexation+and+nasal+permeation+of+melatonin%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Deliv%22%5BJournal%5D)">Effect of cyclodextrins on the complexation and nasal permeation of melatonin.</a> Drug Deliv. 6, 381-388 (2008).</li>
<li>Balharry, D., Sexton, K., BeruBe, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+approach+to+assess+the+toxicity+of+inhaled+tobacco+smoke+components%3A+nicotine%2C+cadmium%2C+formaldehyde+and+urethane%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology%22%5BJournal%5D)">An in vitro approach to assess the toxicity of inhaled tobacco smoke components: nicotine, cadmium, formaldehyde and urethane.</a> Toxicology. 244, 66-76 (2008).</li>
<li>Fahy, J. V., Dickey, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Airway+mucus+function+and+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Airway mucus function and dysfunction.</a> N. Engl. J. Med. 363, 2233-2247 (2010).</li>
<li>Huang, Y., Mikami, F., Jono, H., Zhang, W., Weng, X., Koga, T., Xu, H., Yan, C., Kai, H., Li, J. -D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opposing+roles+of+PAK2+and+PAK4+in+synergistic+induction+of+MUC5AC+mucin+by+bacterium+NTHi%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Opposing roles of PAK2 and PAK4 in synergistic induction of MUC5AC mucin by bacterium NTHi.</a> 359, 691-696 (2007).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Niniejsza metoda umożliwia badanie długoterminowych interakcji między gospodarzem a patogenem w biologicznie istotnym środowisku pierwotnych ludzkich tkanek dróg oddechowych na granicy faz powietrze-ciecz. W tym przypadku jako organizm zakaźny wykorzystano NTHi, jednak za pomocą tej metody można ilościowo określić interakcję każdej bakterii, która nie wywołuje w czasie niedopuszczalnej cytotoksyczności. Model EpiAirway może być również stosowany do badania wirusów, leków lub substancji chemicznych oddziałujących na górne...

<table><tbody><tr><td>Saponina</td><td>Calbiochem</td><td>558255-25GM</td><td>1% w D-PBS bez wapnia i magnezu, sterylizować przez filtrację</td></tr><tr><td>1 X Dulbecco&amp;rsquo;s fosforanowy bufor solny z wapniem i magnezem</td><td>Lonza Inc.</td><td>17-513Q</td><td></td></tr><tr><td>1 X Dulbecco&amp;rsquo;s fosforanowy bufor solny bez wapnia i magnezu</td><td>Lonza Inc.</td><td>17-515Q</td><td></td></tr><tr><td>Tkanki EpiAirway bez antybiotyków</td><td>MatTek Corp.</td><td>AIR-100-ABF</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka utrzymująca EpiAirway bez antybiotyków</td><td>MatTek Corp.</td><td>AIR-100-MM-ABF</td><td>Dostarczona w zestawie</td></tr><tr><td>10X fosforanowy bufor solny</td><td>EMD Millipore</td><td>6506</td><td>Rozcieńczyć do 1X przed użyciem</td></tr><tr><td>Żelatyna</td><td>JT Baker</td><td>2124-01</td><td>Dodać do końcowego stężenia 0,1% w 1 X PBS i autoklawować</td></tr><tr><td>Baza pożywki Difco GC (agar czekoladowy)</td><td>VWR international</td><td>90002-016</td><td>Autoklawować 36 g w 500 ml ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O i schłodzić do 60&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>Hemoglobina BBL (agar czekoladowy)</td><td>VWR international</td><td>90000-662</td><td>Autoklawować 10 g w 500 ml ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, schłodzić do 60&amp;#x00B0;C i zmieszać z powyższą bazą pożywki GC</td></tr><tr><td>Wzbogacacz BD BBL IsoVitaleX (agar czekoladowy)</td><td>VWR international</td><td>90000-414</td><td>Schłodzić mieszaninę bazy pożywki GC i hemoglobiny do 55&amp;#x00B0;C i dodać 10 ml rehydratowanego IsoVitaleX, wylać agar czekoladowy na płytki</td></tr><tr><td>Pęseta anatomiczna, z cienką końcówką, zakrzywiona</td><td>VWR international</td><td>82027-406</td><td></td></tr><tr><td>Samozamykające się torby do sterylizacji</td><td>VWR international</td><td>89140-802</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan gentamicyny, 10 mg/ml</td><td>Lonza Inc.</td><td>17-519Z</td><td>Dodać 10 µl/ml do EpiAirway MM w celu eliminacji gentamicyną</td></tr></tbody></table>

wykorzystanie modelu epiairway do charakteryzacji długotrwałych interakcji gospodarz-patogen

Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

Nietypowalne Haemophilus influenzae (NTHi) to przystosowane do organizmu człowieka bakterie Gram-ujemne, które mogą powodować nawracające i przewlekłe infekcje błony śluzowej dróg oddechowych 1; 2. Aby zbadać mechanizmy, dzięki którym organizmy te przeżywają na powierzchni i wewnątrz tkanek oddechowych, wymagany jest model umożliwiający skuteczną długotrwałą ko-kulturę bakterii i ludzkich komórek. Stosujemy pierwotne ludzkie tkanki nabłonka oddechowego hodowane na granicy powietrze-ciecz, model EpiAirway (MatTek, Ashland, MA). Są to nieunieśmiertelnione, dobrze zróżnicowane tkanki trójwymiarowe, które posiadają połączenia ścisłe, komórki rzęsate i nierzęsate, komórki kubkowe produkujące mucynę oraz zachowują zdolność do produkcji cytokin w odpowiedzi na infekcję.
Ten biologicznie istotny model in vitro ludzkich górnych dróg oddechowych może być wykorzystany na wiele sposobów; ogólnym celem tej metody jest prowadzenie długoterminowej kokultury tkanek EpiAirway z NTHi oraz ilościowe określanie bakterii związanych z komórkami i zinternalizowanych w czasie. Ponadto można określić produkcję mucyn oraz profil cytokin w zainfekowanych kokulturach. Podejście to stanowi udoskonalenie istniejących metod, ponieważ wiele obecnych protokołów wykorzystuje monowarstwy zanurzone lub hodowle komórek ludzkich w systemach Transwell, które nie są w stanie utrzymać infekcji bakteryjnych przez dłuższe okresy3. Na przykład, jeśli organizm może replikować się w znajdującym się powyżej medium, może to prowadzić do nieakceptowalnych poziomów cytotoksyczności i utraty komórek gospodarza, co przerywa eksperyment. Model EpiAirway pozwala na charakteryzację długoterminowych interakcji między gospodarzem a patogenem. Co więcej, ponieważ źródłem EpiAirway są prawidłowe ludzkie komórki tchawcowo-oskrzelowe, a nie linia unieśmiertelniona, każda z nich stanowi doskonałą reprezentację rzeczywistej tkanki górnych dróg oddechowych człowieka, zarówno pod względem struktury, jak i funkcji4.
W tej metodzie tkanki EpiAirway są odstawiane od związków przeciwbakteryjnych i przeciwgrzybiczych na 2 dni przed dostawą, a wszystkie procedury są przeprowadzane w warunkach wolnych od antybiotyków. Wymaga to szczególnych środków ostrożności, ponieważ zarówno bakterie, jak i pierwotne tkanki ludzkie są wykorzystywane w tej samej komorze z laminarnym przepływem powietrza i poddawane współhodowli przez dłuższe okresy.

Metoda ta umożliwia charakteryzację rozszerzonej kokultury bakteryjnej z EpiAirways, czyli pierwotną ludzką tkanką nabłonkową dróg oddechowych hodowaną na granicy faz powietrze-ciecz, która stanowi biologicznie istotny model in vitro. Podejście to można zastosować w przypadku każdego mikroorganizmu nadającego się do długotrwałej kokultury.

Wykorzystanie modelu EpiAirway do charakteryzacji długotrwałych interakcji gospodarz-patogen

Nietypowalne szczepy Haemophilus influenzae (NTHi) to przystosowane do organizmu człowieka bakterie Gram-ujemne, które mogą wywoływać nawracające i przewlekłe infekcje układu oddechowego...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest przeprowadzenie długoterminowej kokultury niepodtypowalnej pałeczki grypowej (Nontypeable Hemophilus influenzae lub NTHI) z pierwotnymi ludzkimi tkankami nabłonkowymi dróg oddechowych z wykorzystaniem modelu epi airway. Osiąga się to poprzez inokulację powierzchni apikalnej NTHI, aby w drugim kroku umożliwić bakteriom przyleganie i wnikanie do tkanek. Inserty są płukane co 24 godziny podgrzanym DPBS, aby naśladować normalny przepływ śluzu oraz usunąć produkty odpadowe mucyny i wszelkie szczątki komórkowe.Następnie tkanki są pobierane w wybranym punkcie czasowym, a następnie określa się przeżywalność całkowitej liczby komórek związanych z NTHI lub NTHI zinternalizowanych. Ostatecznie, za pomocą tej metody, można ocenić charakterystykę przeżywalności konkretnych szczepów NTHI w tkankach w czasie, w oparciu o liczbę żywych bakterii. Metoda ta może dostarczyć informacji na temat długotrwałych infekcji wywołanych przez nontypeable hemophilus influenza.Może ona być również wykorzystywana w badaniach nad innymi patogenami ludzkimi, takimi jak Moraxella. Procedurę tę zademonstruje dr Doin, stażysta podoktorski w moim laboratorium. Wyjmij płytkę transportową z opakowania i przygotuj się do rozpoczęcia eksperymentu. Spryskaj płytkę transportową 70% etanolem i umieść ją w komorze z bezpieczną pracą biologiczną.Do każdej studni płytki 6-dołkowej nalać 1 mL schłodzonego do 4 °C mediuma podtrzymującego do hodowli epi airways. Następnie, po zdjęciu taśmy, otworzyć płytkę i usunąć gazę przykrywającą wkłady epi airway. Używając pęsety i wykonując ruch obrotowy, wyjąć wkład z opakowania.Umieść wkład w jednym z dołków płytki sześciodołkowej. W razie potrzeby użyj sterylnego patyczka kosmetycznego, aby ostrożnie usunąć z wkładu resztki agaru, unikając dotykania membrany. Upewnij się, że pod wkładami nie pozostały pęcherzyki powietrza.Następnie umieść płytkę sześciodołkową w inkubatorze. Myj inserty codziennie w następujący sposób: uprzednio ogrzej DPBS z wapniem i magnezem, a następnie nabierz DPBS do końcówki. Za pomocą sterylnej pęsety delikatnie wyjmij insert i nanieś pipetą 200 µL ogrzanego DPBS na tkankę.Następnie delikatnie kołysz wkładem, aby równomiernie rozprowadzić DPBS, nie dotykając tkanki. Potem przechyl wkład pod kątem i przyłóż końcówkę pipety P 1000 do plastikowego pierścienia utrzymującego membranę na dnie wkładu. Następnie ostrożnie odessij roztwór buforowy i przelej go do probówki kriogenicznej w celu późniejszej analizy.Na koniec odessać pożywkę podtrzymującą i zastąpić ją jednym mililitrem świeżej pożywki. Podgrzać kolejną porcję DPBS z dodatkiem wapnia i magnezu. Dodać trzy mililitry podgrzanego DPBS do probówki o pojemności 15 mililitrów, a następnie przenieść do probówki pojedyncze kolonie nietypowalnej grypy lub NTHI, wyhodowane przez noc na agarze czekoladowym, w celu ich resuspensji.Następnie intensywnie wymieszaj zawartość probówki w wibratorze (vortex) przez co najmniej 10 sekund, a następnie zmierz gęstość optyczną. Kontynuuj dodawanie pojedynczych kolonii NTHI, aż stężenie bakterii osiągnie wartość OD 600 nanometrów wynoszącą około 0,7. Dalej, przemyj każdy insert dróg oddechowych EPI podgrzanym wcześniej DPBS w sposób opisany powyżej, a następnie nanieś 28 µL zawiesiny bakteryjnej na powierzchnię apikalną każdego insertu.Należy unikać szczepienia podstawowych pośrodków utrzymujących. Następnie płytkę należy przenieść z powrotem do inkubatora w celu kwantyfikacji NTHI; wcześniej należy podgrzać, a następnie osuszyć powierzchnię płytek z agaru czekoladowego. W kolejnym kroku należy wykonać rozcieńczenia seryjne inokulum NTHI w sterylnym PBS z 0,1% żelatyną lub PBSG.Nanieś 10 µL aliquotów inokulumu na płytki, a następnie inkubuj płytki przez noc w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2. Następnego dnia określ liczbę CFU na mililitr, licząc kolonie w rozcieczeniu, w którym w każdej kropli znajduje się od 15 do 30 wyraźnych kolonii, i oblicz pierwotną liczbę żywych komórek inokulumu NTHI, aby określić całkowitą liczbę bakterii związanych z komórkami. Przepłucz powierzchnię apikalną dróg oddechowych epi trzy razy, używając 200 µL DPBS bez wapnia i magnezu.Następnie przechyl insert i wypłucz pozostałe medium konserwujące z błony podstawnej. Umieść przemyty insert w nowej płytce sześcio-dołkowej i dodaj 250 µl sterylnego, 1% roztworu saponiny na powierzchnię apikalną każdej tkanki. Włóż płytkę z powrotem do inkubatora na 10 minut w celu inkubacji.Przygotuj probówki do rozcieńczeń seryjnych, napełniając każdą z nich 900 µL PBSG. Następnie, używając końcówki do pipety P 1000, zeskrob tkankę z błony, wykonując ruchy posuwisto-zwrotne, a następnie ruchy okrężne, aby usunąć tkankę z krawędzi wkładu. Następnie, używając sterylnej końcówki do pipety P 1000 o dużej średnicy otworu, przelej zawiesinę do pustej probówki typu einor o pojemności 1,5 mL.Następnie nanieś 250 µL DPBS na powierzchnię apikalną wkładki, a następnie obejrzyj wkładkę pod odwróconym mikroskopem fazokontrastowym, aby sprawdzić, czy pozostała jeszcze tkanka do pobrania. Przenieś zawiesinę do probówki typu einor i uzupełnij do 500 µL DPBS, energicznie mieszając. Podwiruj zawiesinę komórkową w wibratorze (vortex) przez jedną minutę.Następnie, używając sterylnej strzykawki o pojemności 1 ml z igłą 26 G, odessać zawiesinę do strzykawki przez igłę. Powoli przepuścić zawiesinę przez igłę trzy razy, uważając, aby nie wytworzyć pęcherzyków powietrza.Następnie energicznie wymieszaj zawiesinę w wir器ku (vortex) przez kolejną minutę. Dalej, używając końcówki do pipety o szerokim otworze, przenieś 100 µL zawiesiny do pierwszej probówki z roztworem rozcieńczającym. Energicznie wymieszaj zawartość probówki w wir器ku przez pięć sekund, a następnie wykonaj seryjne rozcieńczenia od 1:10 i nanieś kropelkowo rozcieńczenia na płytki z agar czekoladowy.Następnie inkubuj płytki przez noc w temperaturze 37 °C w 5% CO2, aby uzyskać liczbę żywych bakterii i zebrać bakterie zinternalizowane. Przelej każdy insert trzykrotnie 200 µL DPBS. Wymień podłoże podtrzymujące w komorze dolnej na podłoże zawierające 100 µg/mL siarczanu gentamycyny, a następnie dodaj 300 µL podłoża podtrzymującego z gentamycyną na powierzchnię apikalną.Przenieś wkłady z powrotem do inkubatora na jedną godzinę; podczas inkubacji wkładów podgrzej DPBS. Następnie usuń z powierzchni apikalnej podłoże utrzymujące zawierające gentamycynę. W dalszej kolejności dokładnie wypłucz powierzchnię apikalną oraz błonę bazalną wkładów, używając podgrzanego DPBS.Na koniec powtórz zaprezentowaną przed chwilą procedurę szorowania i odzyskiwania bakterii przed wykonaniem rozcieńczeń seryjnych i wysiewem zinternalizowanych bakterii przedstawionych na tej rycinie. Porównując obrazy z transmisyjnego mikroskopu elektronowego niezinfekowanych tkanek nabłonkowych dróg oddechowych po lewej stronie z tkanek nabłonkowych dróg oddechowych zainfekowanych NTHI przez pięć dni po prawej stronie, można zauważyć, że długotrwała kokultura z NTHI nie powoduje znacznych uszkodzeń tkanek apikalnych, co podkreśla użyteczność modelu nabłonkowego dróg oddechowych.Przedstawiono wykres obrazujący liczbę zinternalizowanych NTHI w czasie podczas współhodowli nabłonka dróg oddechowych. Szczep R 2 8 6 6 wprowadzono w ilości około 1 × 10⁷ CFU na wkładkę. Następnie zinternalizowane bakterie odzyskano i przeliczono w każdym wskazanym punkcie czasowym.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak przeprowadzić długoterminową kokulturę NTHI z pierwotnymi hormonalnymi tkankami oddechowymi przy użyciu modelu A PRE.

use-epiairway-model-for-characterizing-long-term-host-pathogen

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Zastosowanie modelu EpiAirway do charakteryzacji długotrwałych interakcji gospodarz-patogen

Source: Montefusco-Pereira, C. V. et al. P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives. J. Vis. Exp.(2020)This video demonstrates a co-culture model of bronchial epithelial cells and macrophage-like cells at the air-liquid interface to study host-pathogen interactions. Pathogenic bacterial infection compromises epithelial membrane integrity, triggering macrophage-like cell activation and...

Establishing a Co-Culture Model to Study Host-Pathogen Interactions at the Air-Liquid Interface

Ten artykuł skupia się na identyfikacji wysoce pewnych zestawów danych interakcji między białkami gospodarza i patogenu przy użyciu kombinacji dwóch ortogonalnych metod: drożdży dwuhybrydowych, a następnie wysokoprzepustowego testu interakcji w komórkach ssaków o nazwie HT-GPCA.

Podejście porównawcze do scharakteryzowania krajobrazu interakcji białko-białko gospodarz-patogen

Opisujemy metodę koralików agarowych w celu ustalenia trwałego, długotrwałego przewlekłego zakażenia dróg oddechowych Pseudomonas aeruginosa w modelu mysim.

Długotrwałe przewlekłe zakażenie dróg oddechowych Pseudomonas aeruginosa u myszy

Podczas gdy badania in vitro interakcji gospodarz-patogen pozwalają na scharakteryzowanie specyficznych odpowiedzi immunologicznych, modele in vivo są wymagane do obserwacji efektów złożonych odpowiedzi. Wykorzystując ekspozycję na Candida albicans, a następnie infekcję płuc za pośrednictwem Pseudomonas aeruginosa, ustaliliśmy mysi model interakcji mikrobiologicznych zaangażowanych w patogenność zapalenia płuc związaną z respiratorem.

Badanie społeczności drobnoustrojów in vivo: model interakcji między Candida albicans i Pseudomonas aeruginosa w drogach oddechowych za pośrednictwem gospodarza

Opisujemy protokół opóźnionej inokulacji do generowania przewlekłych infekcji ran u myszy immunokompetentnych.

Model opóźnionej inokulacji przewlekłego zakażenia ran Pseudomonas aeruginosa

Opisujemy protokół dla trójwymiarowego modelu kohodowli zakażonych dróg oddechowych, wykorzystującego komórki CFBE41o, makrofagi THP-1 i Pseudomonas aeruginosa, ustalony na granicy powietrze-ciecz. Model ten zapewnia nową platformę do jednoczesnego testowania skuteczności antybiotyków, funkcji bariery nabłonkowej i markerów stanu zapalnego.

P. aeruginosa (P. aeruginosa) Zakażona kohodowla 3D komórek nabłonka oskrzeli i makrofagów na granicy faz powietrze-ciecz w celu przedklinicznej oceny środków przeciwinfekcyjnych

Ten artykuł opisuje nowy model myszy do przejścia pneumokoków z bezobjawowego kolonizatora w patogen chorobotwórczy podczas infekcji wirusowej. Model ten można łatwo zaadaptować do badania interakcji wielodrobnoustrojowych i gospodarz-patogen w różnych fazach progresji choroby i u różnych gospodarzy.

Mysi model przejścia Streptococcus pneumoniae z kolonizatora w patogen po koinfekcji wirusowej podsumowuje chorobę zaostrzoną wiekiem

Enteroidy pojawiają się jako nowy model do badania fizjologii i patofizjologii tkanek, opracowywania leków i medycyny regeneracyjnej. W tym miejscu opisujemy system hodowli 2D enteroidów pochodzących z komórek pierwotnych bydła, który umożliwia kohodowlę z odpowiednimi typami komórek tkankowych. Model ten oferuje przewagę translacyjną w modelowaniu badań żołądkowo-jelitowych.

Opracowanie dwuwymiarowego systemu hodowli jednowarstwowej bydła pochodzącego z enteroidów pierwotnych do zastosowań w translacyjnych badaniach biomedycznych

Ten protokół opisuje czterogatunkowy model wielogatunkowego biofilmu polimikrobiologicznego dla płuc związanego z mukowiscydozą (CF), który może być wykorzystany do zbadania wpływu interakcji międzygatunkowych bakterii.

Hodowla biofilmu wielodrobnoustrojowego istotnego dla mukowiscydozy w celu zbadania fenotypów społeczności

Obecny protokół opisuje zastosowanie organotypowych modeli tkanek do badania interakcji gospodarz-patogen in vitro. W szczególności opisany system modelowy wykorzystuje wielowarstwowy nabłonek jamy ustnej narażony na działanie mikroorganizmów związanych z biofilmami (płytką nazębną) w kontekście zdrowia jamy ustnej w porównaniu z chorobą.

Organotypowe systemy modelowania tkanek do badania interakcji gospodarz-patogen in vitro

Obecnie brakuje modeli in vivo , które można by poddać badaniom przesiewowym w kierunku przewlekłych zakażeń bakteryjnych. W tym miejscu opisujemy protokół zakażenia rany za pomocą izolatu klinicznego Pseudomonas aeruginosa w celu wywołania trwałej infekcji u larw danio pręgowanego.

Modelowanie uporczywego zakażenia Pseudomonas aeruginosa u zranionych larw danio pręgowanego

Poznaj metodę długoterminowej ko-kultury NTHI z ludzkimi tkankami nabłonkowymi dróg oddechowych przy użyciu modelu EpiAirway. Technika ta umożliwia ocenę przetrwania bakterii i charakterystyk szczepowych w czasie.

Wykorzystanie modelu EpiAirway do charakteryzacji długotrwałych interakcji gospodarz-patogen

Przeglądaj więcej filmów