Wykorzystanie modelu EpiAirway do charakteryzacji długotrwałych interakcji gospodarz-patogen

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest przeprowadzenie długoterminowej kokultury niepodtypowalnej pałeczki grypowej (Nontypeable Hemophilus influenzae lub NTHI) z pierwotnymi ludzkimi tkankami nabłonkowymi dróg oddechowych z wykorzystaniem modelu epi airway. Osiąga się to poprzez inokulację powierzchni apikalnej NTHI, aby w drugim kroku umożliwić bakteriom przyleganie i wnikanie do tkanek. Inserty są płukane co 24 godziny podgrzanym DPBS, aby naśladować normalny przepływ śluzu oraz usunąć produkty odpadowe mucyny i wszelkie szczątki komórkowe.

Następnie tkanki są pobierane w wybranym punkcie czasowym, a następnie określa się przeżywalność całkowitej liczby komórek związanych z NTHI lub NTHI zinternalizowanych. Ostatecznie, za pomocą tej metody, można ocenić charakterystykę przeżywalności konkretnych szczepów NTHI w tkankach w czasie, w oparciu o liczbę żywych bakterii. Metoda ta może dostarczyć informacji na temat długotrwałych infekcji wywołanych przez nontypeable hemophilus influenza.

Może ona być również wykorzystywana w badaniach nad innymi patogenami ludzkimi, takimi jak Moraxella. Procedurę tę zademonstruje dr Doin, stażysta podoktorski w moim laboratorium. Wyjmij płytkę transportową z opakowania i przygotuj się do rozpoczęcia eksperymentu. Spryskaj płytkę transportową 70% etanolem i umieść ją w komorze z bezpieczną pracą biologiczną.

Do każdej studni płytki 6-dołkowej nalać 1 mL schłodzonego do 4 °C mediuma podtrzymującego do hodowli epi airways. Następnie, po zdjęciu taśmy, otworzyć płytkę i usunąć gazę przykrywającą wkłady epi airway. Używając pęsety i wykonując ruch obrotowy, wyjąć wkład z opakowania.

Umieść wkład w jednym z dołków płytki sześciodołkowej. W razie potrzeby użyj sterylnego patyczka kosmetycznego, aby ostrożnie usunąć z wkładu resztki agaru, unikając dotykania membrany. Upewnij się, że pod wkładami nie pozostały pęcherzyki powietrza.

Następnie umieść płytkę sześciodołkową w inkubatorze. Myj inserty codziennie w następujący sposób: uprzednio ogrzej DPBS z wapniem i magnezem, a następnie nabierz DPBS do końcówki. Za pomocą sterylnej pęsety delikatnie wyjmij insert i nanieś pipetą 200 µL ogrzanego DPBS na tkankę.

Następnie delikatnie kołysz wkładem, aby równomiernie rozprowadzić DPBS, nie dotykając tkanki. Potem przechyl wkład pod kątem i przyłóż końcówkę pipety P 1000 do plastikowego pierścienia utrzymującego membranę na dnie wkładu. Następnie ostrożnie odessij roztwór buforowy i przelej go do probówki kriogenicznej w celu późniejszej analizy.

Na koniec odessać pożywkę podtrzymującą i zastąpić ją jednym mililitrem świeżej pożywki. Podgrzać kolejną porcję DPBS z dodatkiem wapnia i magnezu. Dodać trzy mililitry podgrzanego DPBS do probówki o pojemności 15 mililitrów, a następnie przenieść do probówki pojedyncze kolonie nietypowalnej grypy lub NTHI, wyhodowane przez noc na agarze czekoladowym, w celu ich resuspensji.

Następnie intensywnie wymieszaj zawartość probówki w wibratorze (vortex) przez co najmniej 10 sekund, a następnie zmierz gęstość optyczną. Kontynuuj dodawanie pojedynczych kolonii NTHI, aż stężenie bakterii osiągnie wartość OD 600 nanometrów wynoszącą około 0,7. Dalej, przemyj każdy insert dróg oddechowych EPI podgrzanym wcześniej DPBS w sposób opisany powyżej, a następnie nanieś 28 µL zawiesiny bakteryjnej na powierzchnię apikalną każdego insertu.

Należy unikać szczepienia podstawowych pośrodków utrzymujących. Następnie płytkę należy przenieść z powrotem do inkubatora w celu kwantyfikacji NTHI; wcześniej należy podgrzać, a następnie osuszyć powierzchnię płytek z agaru czekoladowego. W kolejnym kroku należy wykonać rozcieńczenia seryjne inokulum NTHI w sterylnym PBS z 0,1% żelatyną lub PBSG.

Nanieś 10 µL aliquotów inokulumu na płytki, a następnie inkubuj płytki przez noc w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2. Następnego dnia określ liczbę CFU na mililitr, licząc kolonie w rozcieczeniu, w którym w każdej kropli znajduje się od 15 do 30 wyraźnych kolonii, i oblicz pierwotną liczbę żywych komórek inokulumu NTHI, aby określić całkowitą liczbę bakterii związanych z komórkami. Przepłucz powierzchnię apikalną dróg oddechowych epi trzy razy, używając 200 µL DPBS bez wapnia i magnezu.

Następnie przechyl insert i wypłucz pozostałe medium konserwujące z błony podstawnej. Umieść przemyty insert w nowej płytce sześcio-dołkowej i dodaj 250 µl sterylnego, 1% roztworu saponiny na powierzchnię apikalną każdej tkanki. Włóż płytkę z powrotem do inkubatora na 10 minut w celu inkubacji.

Przygotuj probówki do rozcieńczeń seryjnych, napełniając każdą z nich 900 µL PBSG. Następnie, używając końcówki do pipety P 1000, zeskrob tkankę z błony, wykonując ruchy posuwisto-zwrotne, a następnie ruchy okrężne, aby usunąć tkankę z krawędzi wkładu. Następnie, używając sterylnej końcówki do pipety P 1000 o dużej średnicy otworu, przelej zawiesinę do pustej probówki typu einor o pojemności 1,5 mL.

Następnie nanieś 250 µL DPBS na powierzchnię apikalną wkładki, a następnie obejrzyj wkładkę pod odwróconym mikroskopem fazokontrastowym, aby sprawdzić, czy pozostała jeszcze tkanka do pobrania. Przenieś zawiesinę do probówki typu einor i uzupełnij do 500 µL DPBS, energicznie mieszając. Podwiruj zawiesinę komórkową w wibratorze (vortex) przez jedną minutę.

Następnie, używając sterylnej strzykawki o pojemności 1 ml z igłą 26 G, odessać zawiesinę do strzykawki przez igłę. Powoli przepuścić zawiesinę przez igłę trzy razy, uważając, aby nie wytworzyć pęcherzyków powietrza.

Następnie energicznie wymieszaj zawiesinę w wir器ku (vortex) przez kolejną minutę. Dalej, używając końcówki do pipety o szerokim otworze, przenieś 100 µL zawiesiny do pierwszej probówki z roztworem rozcieńczającym. Energicznie wymieszaj zawartość probówki w wir器ku przez pięć sekund, a następnie wykonaj seryjne rozcieńczenia od 1:10 i nanieś kropelkowo rozcieńczenia na płytki z agar czekoladowy.

Następnie inkubuj płytki przez noc w temperaturze 37 °C w 5% CO2, aby uzyskać liczbę żywych bakterii i zebrać bakterie zinternalizowane. Przelej każdy insert trzykrotnie 200 µL DPBS. Wymień podłoże podtrzymujące w komorze dolnej na podłoże zawierające 100 µg/mL siarczanu gentamycyny, a następnie dodaj 300 µL podłoża podtrzymującego z gentamycyną na powierzchnię apikalną.

Przenieś wkłady z powrotem do inkubatora na jedną godzinę; podczas inkubacji wkładów podgrzej DPBS. Następnie usuń z powierzchni apikalnej podłoże utrzymujące zawierające gentamycynę. W dalszej kolejności dokładnie wypłucz powierzchnię apikalną oraz błonę bazalną wkładów, używając podgrzanego DPBS.

Na koniec powtórz zaprezentowaną przed chwilą procedurę szorowania i odzyskiwania bakterii przed wykonaniem rozcieńczeń seryjnych i wysiewem zinternalizowanych bakterii przedstawionych na tej rycinie. Porównując obrazy z transmisyjnego mikroskopu elektronowego niezinfekowanych tkanek nabłonkowych dróg oddechowych po lewej stronie z tkanek nabłonkowych dróg oddechowych zainfekowanych NTHI przez pięć dni po prawej stronie, można zauważyć, że długotrwała kokultura z NTHI nie powoduje znacznych uszkodzeń tkanek apikalnych, co podkreśla użyteczność modelu nabłonkowego dróg oddechowych.

Przedstawiono wykres obrazujący liczbę zinternalizowanych NTHI w czasie podczas współhodowli nabłonka dróg oddechowych. Szczep R 2 8 6 6 wprowadzono w ilości około 1 × 10⁷ CFU na wkładkę. Następnie zinternalizowane bakterie odzyskano i przeliczono w każdym wskazanym punkcie czasowym.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak przeprowadzić długoterminową kokulturę NTHI z pierwotnymi hormonalnymi tkankami oddechowymi przy użyciu modelu A PRE.