Wykorzystanie modelu EpiAirway do charakteryzowania długoterminowych interakcji gospodarz-patogen
September 2nd, 2011
Ta metoda pozwala na scharakteryzowanie rozszerzonej kokultury bakteryjnej z EpiAirways, pierwotną ludzką tkanką nabłonka oddechowego wyhodowaną na granicy powietrze-ciecz, biologicznie istotny model in vitro. Podejście to można zastosować w przypadku każdego drobnoustroju, który jest podatny na długotrwałą kokulturę.
Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest przeprowadzenie długoterminowej kohodowli nietypizalnej Hemophilus influenza lub NTHI z pierwotnymi ludzkimi tkankami nabłonka oddechowego przy użyciu modelu epi dróg oddechowych. Osiąga się to poprzez zaszczepienie powierzchni wierzchołkowej NTHI, aby umożliwić bakteriom przyleganie do tkanek i wnikanie do nich w drugim etapie. Wkładki są myte co 24 godziny wstępnie ciepłym DPBS, aby naśladować normalny przepływ śluzu i usunąć produkty przemiany materii mucyny i wszelkie zanieczyszczenia komórkowe.
Następnie tkanki są pobierane w żądanym punkcie czasowym i określa się przeżycie całkowitej liczby komórek związanych lub zinternalizowanych NTHI. Wreszcie, dzięki tej metodzie, można ocenić specyficzne dla szczepu cechy przetrwania NTHI w tkankach w czasie w oparciu o liczbę żywotnych bakterii. Chociaż ta metoda może zapewnić wgląd w długotrwałe infekcje hemophilus influenza, których nie można opisać.
Może być również stosowany w badaniach nad innymi ludzkimi patogenami, takimi jak Moraxella Alis, wykazując, że ta procedura zostanie przeprowadzona przez dr Doina jako stażystkę podoktorską w moim laboratorium. Wyjmij płytkę transportową z opakowania i przygotuj się do rozpoczęcia eksperymentu. Spryskaj płytkę transportową 70% etanolem i umieść płytkę w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
Podać jeden mililitr o czterech stopniach Celsjusza, epi drogi oddechowe, pożywkę konserwacyjną do każdej studzienki na płytce sześciodołkowej. Następnie po usunięciu taśmy należy otworzyć płytkę i zdjąć gazę zakrywającą wkłady dróg oddechowych epi. Wykonując ruch skręcający, użyj pęsety, aby uwolnić wkładkę z aros.
W razie potrzeby umieść wkładkę w jednym z dołków płytki sześciodołkowej. Użyj sterylnego bawełnianego wacika, aby ostrożnie usunąć aros z wkładu, unikając dotykania membrany. Upewnij się, że pod wkładkami nie są uwięzione pęcherzyki powietrza.
A następnie umieść sześciodołkową płytkę w inkubatorze. Wkładki należy myć codziennie w następujący sposób, podgrzać DPBS wapniem i magnezem i napełnić końcówkę DPBS. Następnie za pomocą sterylnych kleszczyków nabierz wkładkę, delikatnie odpipetuj 200 mikrolitrów wstępnie ogrzanego DPBS na tkankę.
Następnie rozbujaj wkładkę, aby równomiernie rozprowadzić DPBS bez dotykania tkanki. Następnie przechyl wkładkę pod kątem i przyłóż końcówkę pipety P 1000 do plastikowego pierścienia, który przytrzymuje membranę na dnie wkładu. Następnie ostrożnie odessać roztwór buforowy i umieścić roztwór w probówce kriogenicznej do późniejszego badania.
Na koniec odessać podstawowe podłoże podtrzymujące i zastąpić je jednym mililitrem świeżej pożywki. Podgrzej więcej DPBS z wapniem i magnezem. Dodaj trzy mililitry wstępnie podgrzanego DPBS do 15-mililitrowej probówki, a następnie ponownie zawieś pojedyncze kolonie grypy lub NTHI wyhodowane przez noc na agarze czekoladowym w probówce.
Teraz energicznie wiruj rurkę przez co najmniej 10 sekund, a następnie zmierz gęstość optyczną. Kontynuuj dodawanie pojedynczych kolonii NTHI, aż stężenie bakterii osiągnie OD 600 nanometrów około 0,7. Następnie umyj każdą wkładkę do dróg oddechowych EPI wstępnie ciepłym DPBS, tak jak poprzednio, a następnie dodaj 28 mikrolitrów zawiesiny bakteryjnej na wierzchołkową powierzchnię każdej wkładki.
Unikanie inokulacji podstawowych pożywek podtrzymujących. Następnie umieść płytkę z powrotem w inkubatorze, aby najpierw określić ilościowo NTHI, a następnie wysuszyć na powierzchni płytki agarowe z czekoladą. Następnie seryjnie rozcieńczyć inokulum NTHI za pomocą sterylnego PBS z 0,1% żelatyną lub PBSG.
Upuść 10 mikrolitrów podwielokrotności inokulum na płytki, a następnie inkubuj płytki przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla. Następnego dnia określ CFU na mililitr, licząc rozcieńczenie, które ma od 15 do 30 różnych kolonii w każdej kropli, i obliczając z powrotem do twojego rzeczywistego żywotnego inokulum NTHI, aby zebrać wszystkie bakterie związane z komórkami. Trzykrotnie spłukać wierzchołkową powierzchnię dróg oddechowych epi 200 mikrolitrami DPBS bez wapnia i magnezu.
Następnie przechylić wkładkę i wypłukać wszelkie pozostałe media konserwacyjne z błony podstawnej. Umieść umytą wkładkę na świeżej płytce sześciodołkowej i dodaj 250 mikrolitrów sterylnego, 1% roztworu saponin na wierzchołkową powierzchnię każdej tkanki. Umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze na 10 minut podczas inkubacji.
Ustawić probówki do seryjnego rozcieńczania, napełniając każdą probówkę rozcieńczającą 900 mikrolitrami PBSG. Następnie wyszoruj tkankę z membrany za pomocą końcówki pipety P 1000, wykonując ruchy w przód iw tył, a następnie ruchem okrężnym, aby usunąć tkankę z krawędzi wkładki. Następnie, używając sterylnej końcówki do pipety P 1000 o dużym otworze, umieść zawiesinę w pustej probówce o pojemności 1,5 mililitra.
Teraz dodaj 250 mikrolitrów DPBS na wierzchołkową powierzchnię wkładki, a następnie zbadaj wkładkę za pomocą mikroskopu kontrastowego z odwróconymi fazami, aby określić, czy pozostała jakaś tkanka do pobrania. Dodaj zawiesinę do rurki einor i energicznie uzupełnij 500 mikrolitrami DPBS. Wirować zawiesinę komórek przez jedną minutę.
Następnie za pomocą sterylnej strzykawki o pojemności jednego mililitra wyposażonej w igłę o rozmiarze 26. Odessać zawiesinę do strzykawki przez igłę. Powoli przepuścić zawiesinę przez igłę trzy razy, uważając, aby nie powstały pęcherzyki.
Następnie energicznie wiruj zawiesinę przez kolejną minutę. Następnie za pomocą końcówki do pipety o dużym otworze przenieś 100 mikrolitrów zawiesiny do pierwszej probówki rozcieńczającej. Energicznie obracaj probówkę przez pięć sekund, a następnie przygotuj od jednej do 10 seryjnych kropli rozcieńczenia na płytkach z agarem czekoladowym.
Następnie inkubuj płytki przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla, aby uzyskać żywotną liczbę bakterii w celu zebrania zinternalizowanych bakterii. Umyj każdą wkładkę tylko trzy razy 200 mikrolitrami DPBS. Zastąp podstawową pożywkę podtrzymującą pożywką zawierającą 100 mikrogramów na mililitr siarczanu gentamycyny, a następnie dodaj 300 mikrolitrów pożywki konserwacyjnej zawierającej gentamycynę na powierzchnię wierzchołkową.
Umieść wkładki z powrotem w inkubatorze na jedną godzinę, podczas gdy wkładki są w inkubacji, wstępnie podgrzej trochę DPBS. Następnie usunąć z powierzchni wierzchołkowej pożywkę konserwacyjną zawierającą gentamycynę. Następnie dokładnie umyj powierzchnię wierzchołkową i błonę podstawną wkładek za pomocą wstępnie rozgrzanego DPBS.
Na koniec powtórz procedurę szorowania i zbierania, którą właśnie zademonstrowano, przed wykonaniem seryjnych rozcieńczeń i posiewu zinternalizowanych bakterii na tym rysunku. Porównanie obrazów ze skaningowego mikroskopu elektronowego niezakażonych tkanek dróg oddechowych epi po lewej stronie z pięciodniowymi tkankami dróg oddechowych zakażonych NTHI po prawej. Można zauważyć, że długotrwała kohodowla z NTHI nie powoduje znacznego uszkodzenia tkanek wierzchołkowych, co podkreśla użyteczność modelu epi dróg oddechowych.
Tutaj pokazano wykres przedstawiający liczbę NTHI zinternalizowanych w czasie podczas kokultury epi dróg oddechowych. Szczep R 2 8 6 6 inokulowano w ilości około 10 razy siódmej jtk na insert. Następnie zebrano zinternalizowane bakterie i policzono je w każdym wskazanym punkcie czasowym.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprowadzić długoterminową kohodowlę NTHI z pierwotnymi hormonalnymi tkankami oddechowymi przy użyciu modelu A PRE.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ta metoda pozwala na charakteryzację rozszerzonej kokultury bakterii z EpiAirways, biologicznie istotnym modelem in vitro wykorzystującym pierwotne ludzkie tkanki nabłonkowe dróg oddechowych. Podejście to może być wykorzystane z dowolnym mikrobe'm nadającym się do długotrwałej kokultury.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Mikrobiologia
- Biologia dróg oddechowych
- Modele in vitro
Tło
- Nierozpoznawalny Haemophilus influenzae (NTHI) jest znaczącym patogenem w infekcjach dróg oddechowych.
- Zrozumienie interakcji bakterii z nabłonkami dróg oddechowych jest kluczowe dla opracowywania terapii.
- Model EpiAirways naśladuje ludzkie środowisko dróg oddechowych.
- Długotrwałe badania kokultur mogą dostarczyć wglądu w przetrwanie i zachowanie bakterii.
Cel badania
- Przeprowadzenie długotrwałej kokultury NTHI z pierwotnymi ludzkimi nabłonkami dróg oddechowych.
- Ocenienie przetrwania NTHI w tkankach przez określony czas.
- Ocenienie cech przetrwania NTHI specyficznych dla szczepu.
Stosowane metody
- Inokulacja powierzchni apikalnej tkanek nabłonkowych NTHI.
- Co 24 godziny mycie wkładów z podgrzanym DPBS w celu naśladowania przepływu śluzu.
- Zbiór tkanek w wybranych punktach czasowych dla analizy.
- Oznaczanie przetrwania całkowicie skojarzonych z komórkami lub internalizowanych NTHI.
Główne wyniki
- Uzyskano wgląd w długotrwałe infekcje NTHI.
- Do oceny cech przetrwania NTHI użyto liczby żyjących bakterii.
- Metoda wykazała zdolność do oceny zachowania bakterii w odpowiednim modelu.
- Wyniki mogą pomóc w przyszłych badaniach nad infekcjami dróg oddechowych.
Wnioski
- Ta metoda dostarcza cennego narzędzia do badania kokultury bakterii z ludzkimi tkankami dróg oddechowych.
- Zwiększa zrozumienie interakcji NTHI z komórkami nabłonkowymi.
- Podejście to można zaadaptować do innych mikroorganizmów w podobnych badaniach.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
The EpiAirway model enables long-term co-culture of respiratory pathogens with primary human epithelial tissues, addressing a critical gap in preclinical infection modeling. This approach supports mechanistic de-risking of host-pathogen interactions and improves predictive confidence in early-stage antimicrobial target validation. By maintaining tissue integrity and physiological relevance over extended periods, it enhances translational continuity from discovery to preclinical development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through quantification of cell-associated and internalized bacteria over time.
- Operational Value: Supports functional target validation by assessing strain-specific survival characteristics in a human-relevant system.
- Scientific Value: Facilitates biological de-risking by modeling chronic infection phenotypes not supported by submerged cultures.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides quantitative dependent variable measurements (CFU counts) for evaluating antimicrobial efficacy and bacterial persistence.
- Operational Value: Enables assay standardization through daily washing with pre-warmed DPBS to mimic mucociliary clearance and reduce variability.
- Scientific Value: Supports screening readiness by allowing mucin production and cytokine profiling as secondary readouts for host response.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Uses disease-relevant system (normal human tracheo-bronchial cells) to improve translational biomarker alignment for respiratory infections.
- Operational Value: Ensures continuity from discovery through preclinical work by maintaining tissue structure and function during long-term co-culture.
- Scientific Value: Enables risk-adjusted advancement decisions by characterizing long-term host-pathogen interactions without significant apical tissue damage.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early target validation to preclinical efficacy testing, particularly for respiratory antimicrobial development.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling longitudinal tracking of bacterial adherence, invasion, and survival.
- Screening: Delivers assay readiness and reproducibility via standardized inoculum preparation (OD 600 nm ~0.7) and serial dilution plating for viable bacterial counts.
- Analytics: Generates quantitative readouts (CFU/mL) that allow comparison of strain-specific survival and evaluation of intervention effects.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through use of primary human tissues that retain cytokine production and mucin secretion capabilities.
- Enterprise Reuse: Represents a reusable platform adaptable to other respiratory pathogens (e.g., Moraxella catarrhalis) beyond NTHi.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through reduction of mechanistic ambiguity in chronic infection models.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via antibiotic-free conditions and defined washing protocols.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions by identifying compounds that reduce bacterial internalization or persistence over time.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization based on longitudinal infection dynamics rather than acute cytotoxicity endpoints.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary tissue handling and biosafety level 2 practices for co-culture of bacteria and human cells.
- Dependent on specialized inserts and air-liquid interface culture systems (e.g., MatTek EpiAirway).
- Necessitates cross-team standardization of inoculum preparation, washing frequency, and harvesting procedures.
- Adaptation considerations include validation of pathogen compatibility with mucociliary clearance mimicry and tissue integrity over time.
- Practical limitation: Extended co-culture increases contamination risk, requiring strict aseptic technique in shared biosafety cabinets.
