Test aktywacji bazofili w badaniu mechanizmów zależnych od IgE w nadwrażliwości na leki

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest wykrycie nadwrażliwości na leki zapśredniczonej przez IgE za pomocą testu aktywacji bazofilów z wykorzystaniem dobrze scharakteryzowanych koniugatów białka nośnika leku haptyzowanego. Osiąga się to najpierw poprzez chemiczne powiązanie leku za pomocą wewnętrznej lub wprowadzonej organochemicznie grupy karboksylowej z resztami lizyny albuminy surowicy ludzkiej. Następnie koniugaty są charakteryzowane fizykochemicznie w celu określenia dokładnego stopnia sprzężenia poprzez przeprowadzenie wysokosprawnej chromatografii wykluczania rozmiarów (H-P-S-E-C) z sekwencyjną detekcją współczynnika załamania światła i detekcją w ultrafiolecie.

Następnie dobrze scharakteryzowane koniugaty leków są wykorzystywane do stymulacji bazofili pobranych od dawców z nadwrażliwością na leki. Ostatecznie test aktywacji bazofili, czyli BAT, może być użyty do oceny mechanizmów zależnych od IgE w nadwrażliwości na leki. Nazywam się Michael Steiner i reprezentuję Grupę Badań nad Alergiami na Uniwersytecie w Salzburgu w Austrii.

Dzisiaj chcielibyśmy przedstawić Państwu technikę umożliwiającą pomiar udziału swoistych dla leku przeciwciał IgE w reakcjach nadwrażliwości na leki. W niniejszym materiale prezentujemy procedurę na przykładzie dwóch powszechnie stosowanych przedstawicieli niesteroidowych leków przeciwzapalnych, a mianowicie propofolu i diklofenaku. Metoda ta ma jednak potencjał do wykorzystania w rutynowej diagnostyce natychmiastowych typów alergii polekowych.

Ogólnie rzecz biorąc, należy dodać 10 µL świeżo przygotowanego roztworu stokowego chlorku N-etylo-N'-(3-dimetyloaminopropylo)karbodiimidu (EDC) do próbki propafenonu lub PP. Próbkę należy wymieszać w wstrząsarze wierzchłowym przez jedną minutę. Następnie do próbki dodaje się 16,9 µL roztworu albuminy surowicy ludzkiej (HSA) o stężeniu 118 mg/mL, a następnie inkubuje próbkę przez dwie godziny w temperaturze pokojowej przy wstrząsaniu z prędkością 300 obr./min.

Po zakończeniu wstrząsania dializować próbki trzykrotnie przeciwko dwóm litrom PBS przez kilka godzin każdorazowo w temperaturze 4°C. Następnie wirować próbki przez 10 minut w temperaturze pokojowej z prędkością 14 000 ×g i zebrać supernatant S zawierający NSAIDs sprzężone z HSA. Sprawdzić zawartość białek w supernatancie, przeprowadzając elektroforezę SDS-PAGE z użyciem żeli 12%.

Naniesienie około 12 µg koniugatu HSA do jednego otworu żelu w celu analizy szybkości sprzęgania koniugatów NLP za pomocą wysokosprawnej chromatografii wykluczania wielkościowej (HPSEC). Najpierw rozcieńcz próbkę wzorca HSA do stężenia 1 mg/mL w wodzie zdemineralizowanej. W celu kalibracji detektora wstrzyknij 50 µL roztworu wzorca HSA.

Następnie, wykorzystując żel TSK o wymiarach 7,8 by 300 milimetrów, kolumnę G 2000 SSW XL oraz system detekcji z on-line sprzężonym detektorem współczynnika załamania światła (RI) i detektorem UV, oblicza się stałą RI (case sub RI) oraz stałą UV (K sub UV) dla detektora. Stosując te dwa wzory, należy przygotować w zdemineralizowanej wodzie rozcieńczenia wzorców pochodnych PP do analizy H-P-S-E-C w ilościach 5, 10 i 30 w celu ułatwienia wstrzykiwania, a następnie obliczyć wartości średnie dla DN by DC leku oraz DA by DC leku dla obu wzorców.

Wykorzystując te dwie formuły, należy teraz wprowadzić koniugaty leku do H-P-S-E-C i wyznaczyć ich RI oraz obszary pików UV. Następnie, stosując te same dwa równania, należy obliczyć stężenie pochodnych PP oraz HSA dla próbek nieznanych. W pierwszej kolejności należy opisać siedem probówek do cytometrii przepływowej w zależności od ich zawartości: kontrola niebarwiona, kontrola negatywna, kontrola pozytywna oraz koniugaty leku.

Następnie pipetujemy 50 µL buforu do stymulacji bazofili do probówek przeznaczonych dla kontroli niebarwionej i ujemnej. Do probówki z kontrolą dodatnią dodajemy 50 µL roztworu przeciwciał anty FC epsilon R one z zestawu flow two cast. Teraz do probówek z koniugatem leku dodajemy od 0,02 do 20 µg/mL koniugatu PP w serii rozcieńczeń od 1:1 do 1:10, a następnie do każdej probówki dodajemy 100 µL buforu do stymulacji i 50 µL pełnej krwi pacjenta pobranej do EDTA.

Próbki należy starannie wymieszać. Następnie do każdej z probówek z koniugatem leku oraz probówek z kontrolą pozytywną i negatywną należy pipetować 20 µL odczynnika do barwienia Two cast, zawierającego przeciwciała anty-CCR3 znakowane PE oraz przeciwciała anty-CD63 znakowane ZI, a następnie wymieszać.

Ponownie inkubuj próbki przez 45 minut w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Następnie, aby zatrzymać reakcję, umieść próbki na lodzie na pięć minut. W kolejnym kroku przeprowadź lizę erytrocytów, dodając do każdej probówki 2 mL odczynnika do lizy Flow-2.

Inkubować próbki w ciemności przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Następnie wirować próbki przez pięć minut przy 500 ×g w temperaturze pokojowej w celu otrzymania osadu. Ostrożnie odlać nadsącz, zawiesić komórki ponownie w 500 µL buforu do mycia przed cytometrią przepływową i przechowywać próbki w lodzie do czasu przeprowadzenia analizy cytometrycznej.

Użyj niebarwionej próbki do dostrojenia ustawień napięcia cytometru przepływowego. Następnie wyznacz bramkę dla komórek zidentyfikowanych jako limfocyty na wykresie rozrzutu bocznego i przedniego. Podobnie jak na zamieszczonej rycinie, bazofile są w pierwszej kolejności identyfikowane jako CCR3-high side scatter low.

Podobnie jak na tym wykresie rozrzutu. Po bramkowaniu komórek na wykresie FIT EPE, aktywowane bazofile można dodatkowo zidentyfikować na podstawie ekspresji markerów CD 63 znakowanych FIT E. Po ustaleniu odcięcia na maksymalnym poziomie 2,5% bazofili jako CD 63 high w kontroli negatywnej, próbkę można uznać za pozytywną pod kątem aktywacji bazofili, jeśli więcej niż 5% bazofili wykazuje wysoką ekspresję CD 63 (CD 63 high), a MFI próbki podzielone przez MFI kontroli negatywnej przekracza wartość dwa.

Metoda ta ocenia wykorzystanie BAT jako pomocnego narzędzia do wykrywania białek odpowiedzialnych za nadwrażliwość na leki zależną od IgE. Konjugaty NLP są wykorzystywane do aktywacji bazofilów przez H-P-S-E-C z detekcją agregacji za pomocą RI i UV. Stopień sprzęgania oraz efektywna wydajność konjugatów są określane zgodnie z przedstawionym na tej rycinie schematem.

43,5% koniugatów DF pozostało w formie monomerów, natomiast stopień sprzęgania dla agregatów wyniósł 5,0 DF na HSA. Stopień sprzęgania wynoszący 9,5 został określony, jak przedstawiono tutaj. Wykazano, że koniugat PPP składa się w 68,5% z monomerów o stopniu sprzęgania wynoszącym 21,2.

Stopień sprzężenia agregatów wyniósł 27,9. Łącznie wyznaczony stopień sprzężenia koniugatów DF wyniósł 7,6 df, a koniugatów PPP 23,2. BAT przeprowadzony z koniugatami w zoptymalizowanych warunkach umożliwia badanie reakcji zależnych od IgE w nadwrażliwości na NLPZ.

Jak pokazano tutaj, tylko koniugat PP był w stanie wywołać aktywację bazofili, co zwizualizowano poprzez zwiększenie ekspresji powierzchniowej CD 63. Aktywowano 20,6% bazofili, co charakteryzowało się wzrostem intensywności fluorescencji, a MFI wzrosło 4,9-krotnie, z 386 dla kontroli negatywnej do 1893.

W przeciwieństwie do tego, przy użyciu koniugatu DF aktywowano tylko 3,1% bazofilów, co było wartością poniżej progu 5%. Ponadto MFI wzrosło jedynie 1,1-krotnie, z 197 dla kontroli negatywnej do 210. Ważność testu potwierdza fakt, że aktywacja bazofilów w kontroli negatywnej była niższa niż 5%.

Po drugie, przesunięcie o jedną logarytmiczną jednostkę intensywności fluorescencji w subpopulacji bazofilów oraz po trzecie, ponad 50% aktywowanych bazofilów dla kontroli dodatniej. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat przeprowadzania testów aktywacji bazofilów, a co najważniejsze, na temat tego, jak odróżnić reakcje nadwrażliwości na leki zależne od IgE od reakcji niezależnych od IgE. Ponadto powinni Państwo zrozumieć, w jaki sposób rozszerzyć zastosowanie testu aktywacji bazofilów w alergiach lekowych poza jego już ugruntowane wykorzystanie w alergiach na pyłki, pokarmy i jad owadów.