Name: Test aktywacji bazofili do badania mechanizmów IgE-zależnych w nadwrażliwości na leki (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 22 s
Description: Poznaj test aktywacji bazofili do wykrywania nadwrażliwości IgE-zależnej na leki. Ta metoda wykorzystuje sprzężenia lek-białko i cytometrię przepływową do diagnostyki alergii lekowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była finansowana z grantu P18820-B13 Austriackiego Funduszu Badań Naukowych (FWF).
Oświadczenie etyczne:
Badanie zostało zatwierdzone (PLUS_Ethik_090514) przez Komisję Etyczną ds. Eksperymentów z Udziałem Ludzi i/lub Zwierząt na Uniwersytecie w Salzburgu, zgodnie z Deklaracją Helsińską w rewizji z 1983 roku, a wszyscy uczestniczący pacjenci wyrazili pisemną świadomą zgodę.

1. Przygotowanie koniugatów leków
<ol>
 <li>Rozpuścić 10 mg DF w 1 ml dH2O w probówce reakcyjnej o pojemności 1,5 ml. W dalszej części procedury użyć 95 μl tego roztworu DF. Aby sprzęgnąć PP z HSA, rozpuścić 30,4 mg pochodnej PP (304 g/mol) w 500 μl 0,3 M wodorotlenku sodu (NaOH).</li>
 <li>Do 95 μl rozpuszczonego DF dodać 430,6 μl dH2O oraz 100 μl 0,5 M buforu z kwasem 2-(N-morfolino)etanosulfonowym (MES) o pH 6,5. Do próbki PP dodać 33,1 μl dH2O oraz 140 μl 2 M buforu MES o pH 2,9.</li>
 <li>Do próbki DF dodać 57,5 μl świeżo przygotowanego roztworu stokowego chlorku N-etylo-N'-(3-dimetylaminopropyl)karbodiimidu (EDC) rozpuszczonego w dH2O o stężeniu 100 mg/ml, lub 10 μl roztworu EDC do próbki PP. Próbki mieszać na wortexie przez 1 minutę.</li>
 <li>Do każdej próbki dodać 16,9 μl roztworu HSA o stężeniu 118 mg/ml.</li>
 <li>Inkubować próbki przez 2 godziny w temperaturze pokojowej przy wstrząsaniu z prędkością 300 obr./min.</li>
 <li>Próbki DF i PP dializować 3 krotnie przeciwko 2 litrom fosforanowo-buforowanej soli fizjologicznej (PBS) o pH 7,4 przez kilka godzin w każdym cyklu. Wszystkie etapy dializy przeprowadzać w temperaturze 4°C.</li>
 <li>Wirować próbkę przez 10 minut przy 14 000 x g i zebrać nadsącz zawierający DF lub PP sprzężony z HSA.</li>
 <li>Sprawdzić obecność białek w nadsączu, wykonując elektroforezę SDS-PAGE z użyciem żeli 12%. Nałożyć około 12 μg koniugatu HSA do jednego otworu żelu.</li>
</ol>
2. Wyznaczenie szybkości sprzęgania koniugatów leków (Ryc. 2)
<ol>
 <li>Do analizy szybkości sprzęgania koniugatów DF i PP metodą HPSEC należy użyć buforu fosforanowego sodu o stężeniu 100 mM i pH 6,5, zawierającego 150 mM NaCl i 0,05% azotku sodu. Należy zastosować kolumnę TSK-Gel-G2000SWXL o wymiarach 7,8 x 300 mm.</li>
 <li>Detekcję sygnałów należy przeprowadzić przy użyciu sprzężonego online systemu detektorów RI i UV.</li>
 <li>Należy przygotować próbkę wzorca HSA o stężeniu 1 mg/ml w dH2O. W celu kalibracji detektora należy wstrzyknąć 50 μl roztworu wzorca HSA.</li>
 <li>Należy obliczyć stałą RI kRI oraz stałą UV kUV dla detektora. Należy zastosować wzory areaRI=kRI*[(dn/dc)HSA*c(HSA)] oraz areaUV=kUV*[(dA/dc)HSA*c(HSA)], przyjmując wartości (dn/dc)HSA=0,185 oraz (dA/dc)HSA=0,5185.</li>
 <li>Należy przygotować wzorce pochodnych DF i PP do analizy HPSEC w taki sposób, aby można było łatwo wstrzyknąć ilości 5, 10 i 30 nmol obu wzorców.</li>
 <li>Należy obliczyć wartości średnie dla (dn/dc)drug i (dA/dc)drug dla obu wzorców. Dla DF wyznaczono wartość (dn/dc) wynoszącą 0,235 ± 0,010 oraz (dA/dc) wynoszącą 39,000 ± 0,493. Dla PP wyznaczono wartość (dn/dc) wynoszącą 0,328 ± 0,016 oraz (dA/dc) wynoszącą 53,155 ± 2,464.</li>
 <li>Należy wstrzyknąć koniugaty leków do układu HPSEC i wyznaczyć pola ich pików RI i UV.</li>
 <li>Stężenie DF, pochodnej PP oraz HSA należy obliczyć poprzez rozwiązanie układu dwóch równań areaRI=kRI*[(dn/dc)drug*c(drug)+(dn/dc)HSA*c(HSA)] oraz areaUV=kUV*[(dA/dc)drug*c(drug)+(dA/dc)HSA*c(HSA)] względem niewiadomych.</li>
</ol>
3. BAT z wykorzystaniem koniugatów leków
<ol>
 <li>Przygotować siedem probówek do cytometrii przepływowej i oznakować je w zależności od zawartości: kontrola niebarwiona, kontrola negatywna, kontrola pozytywna oraz konjugaty leku.</li>
 <li>Do probówek przeznaczonych dla kontroli niebarwionej i negatywnej pipetować 50 μl buforu do stymulacji B-CCR-STB (Flow2 CAST, Bühlmann Laboratories, Schönenbuch, CH). Jako kontrolę pozytywną zastosować 50 μl roztworu anty-FcεRI dostarczonego w zestawie Flow2 CAST. Do probówek przeznaczonych dla konjugatów leku dodać odpowiednie ilości roztworu konjugatu, tworząc szereg rozcieńczeń 1:10 od 0,02 do 20 μg/ml konjugatu DF i konjugatu PP (stężenia końcowe w objętości testu 200 μl). Eksperymenty miareczkowania należy przeprowadzić w celu ustalenia stężenia optymalnej aktywacji bazofilów dla każdej próbki pacjenta.</li>
 <li>Do każdej probówki dodać 100 μl buforu do stymulacji oraz 50 μl krwi pełnej pacjenta pobranej do EDTA. Próbki dokładnie wymieszać.</li>
 <li>Do każdej probówki pipetować 20 μl odczynnika barwiącego Flow2 CAST zawierającego przeciwciała anty-CCR3 znakowane fykoerytryną (PE) oraz przeciwciała anty-CD63 znakowane izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC) i ponownie wymieszać. Nie dodawać odczynnika barwiącego do próbki niebarwionej!</li>
 <li>Próbki inkubować przez 45 minut w kąpieli wodnej o temperaturze 37°C.</li>
 <li>Przerwać reakcję, inkubując na lodzie przez 5 minut.</li>
 <li>Zlizować erytrocyty, dodając 2,0 ml odczynnika lityzującego Flow2 CAST do każdej probówki i delikatnie mieszając na wstrząsarze vortex. Próbki inkubować w ciemności przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>Próbki wirować przez 5 minut przy 500 x g i ostrożnie odlać nadsącz.</li>
 <li>Resuspenderować komórki w 500 μl buforu do płukania Flow2 CAST i przechowywać na lodzie do czasu analizy cytometrycznej.</li>
 <li>Dostosować ustawienia napięcia cytometru przepływowego dla rozproszenia światła w przód i pod kątem (FSC, SSC) podczas akwizycji próbki niebarwionej.</li>
 <li>Z wykresem SSC-FSC wyznaczyć bramkę dla komórek zidentyfikowanych jako limfocyty i przenieść je na wykres SSC-PE. Bazofile są identyfikowane za pomocą przeciwciała anty-CCR3 znakowanego PE jako CCR3hi SSClo, a następnie należy wyznaczyć dla nich bramkę na wykresie FITC-PE. Przeciwciało anty-CD63 wykrywające aktywowane bazofile jest znakowane FITC.</li>
 <li>Ustawić punkt odcięcia (cut-off) na maksymalnie 2,5% bazofilów jako CD63hi w kontroli negatywnej. Próbkę uznaje się za pozytywną pod kątem aktywacji bazofilów, jeśli &gt;5% bazofilów to CD63hi, a średni indeks fluorescencji (MFI) próbki podzielony przez MFI kontroli negatywnej przekracza 2 (Rysunek 3).</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki:
Niniejszy eksperyment ocenia BAT jako pomocne narzędzie do wykrywania nadwrażliwości na leki zależnej od IgE. Konjugaty białkowe NLP są wykorzystywane do aktywacji bazofilów. Za pomocą HPSEC z detekcją RI i UV określono stan agregacji, stopień sprzęgania oraz efektywną wydajność konjugatów. Jak pokazuje Rysunek 4, 43,5% konjugatów DF pozostało w formie monomerycznej przy stopniu sprzęgania wynoszącym 5,0 DF/HSA. Dla agregatów określono stopień sprzęgania równy 9,5. Wykazano, że konjugat propypifenazonu składa się w 68,5% z monomerów o stopniu sprzęgania 21,2. Stopień sprzęgania agregatów wyniósł 27,9. Łącznie określony stopień sprzęgania dla konjugatów DF wyniósł 7,6 DF, a dla konjugatów PP 23,2.
BAT wykonany z użyciem koniugatów w zoptymalizowanych warunkach (stężenie koniugatów, czas stymulacji) pozwolił na zbadanie reakcji zależnych od IgE w nadwrażliwości na NLPZ. Jak pokazano na Rysunku 5, tylko koniugat PP był w stanie wywołać aktywację bazofili, co uwidoczniono poprzez zwiększoną ekspresję CD63 na powierzchni: aktywowanych zostało 20,6% bazofili, co charakteryzowało się przesunięciem logarytmicznym intensywności fluorescencji. MFI wzrosło 4,9-krotnie, z 386 (kontrola negatywna) do 1893. W przeciwieństwie do tego, przy użyciu koniugatu DF aktywowanych zostało tylko 3,1% bazofili, co znajdowało się poniżej wartości odcięcia 5%. Ponadto MFI wzrosło jedynie 1,1-krotnie (limit 2,0), z 197 (kontrola negatywna) do 210. O poprawności testu decydują: (i) &lt;5% aktywacji bazofili w kontroli negatywnej, (ii) przesunięcie logarytmiczne intensywności fluorescencji subpopulacji bazofili oraz (iii) &gt;50% aktywowanych bazofili (kontrola pozytywna).
<img alt="Proces koniugacji białek z użyciem EDC, MES i HSA wraz ze strukturami chemicznymi; schemat doświadczalny." src="/files/ftp_upload/3263/3263fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Sprzęganie pochodnych DF i PP z HSA. Po rozpuszczeniu leków dodaje się wodę, bufor MES oraz EDC (odczynnik sprzęgający). Próbki są mieszane w wortexie przez 1 minutę, po czym do roztworów leków pipetuje się HSA. W ciągu 2 godzin wstrząsania w temperaturze pokojowej leki wiążą się kowalencyjnie z HSA. W wyniku procesu mogą powstać monomery oraz agregaty.
<img alt="Chromatografia: obliczanie stałych, dn/dc, stężenia leku; zawiera wykresy i równania wzorów." src="/files/ftp_upload/3263/3263fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Obliczanie stopni sprzężenia. W pierwszej kolejności stałe kRI oraz kUV wyznaczane są. W związku z tym do systemu HPSEC wstrzykuje się standard HSA o znanym stężeniu. Dla HSA przyjęto wartości (dn/dc) oraz (dA/dc) wynoszące odpowiednio 0,185 i 0,518. 5Powierzchnie pików są wykorzystywane do obliczenia stałych. Po drugie, dla każdego leku wstrzykuje się trzy wzorce w celu wyznaczenia powierzchni RI i UV specyficznych dla leku i stężenia. Ponieważ kRI oraz kUV po wyznaczeniu stałych w poprzednich krokach, można obliczyć pochodne specyficzne dla leku (dn/dc) oraz (dA/dc). W trzecim etapie konjugaty lek-HSA są wstrzykiwane do układu HPSEC. Uzyskane powierzchnie pików są wykorzystywane do obliczenia stężeń leku i HSA w poszczególnych pikach poprzez rozwiązanie układu dwóch równań z dwiema niewiadomymi.
<img alt="Schemat cytometrii przepływowej; bramkowanie limfocytów i bazofilów, CCR3-PE, wykres FSC vs SSC, kontrola negatywna." src="/files/ftp_upload/3263/3263fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Bramkowanie bazofilów. Komórki zidentyfikowane jako limfocyty są bramkowane w oparciu o rozproszenie boczne względem rozproszenia przedniego (wykres SSC-FSC). Bazofile są identyfikowane jako populacja CCR3hi SSClo spośród bramkowanych limfocytów (wykres SSC-CCR3-PE). Bazofile są analizowane pod kątem aktywacji (CD63hi) na wykresie CD63-FITC-CCR3-PE. Kontrola negatywna służy do ustalenia punktu odcięcia, aby maksymalnie 2,5% bazofilów pozostało w populacji CD63hi.
<img alt="Schemat chromatografii wykluczania cząsteczkowego analizującej kompleksy białkowe, objętość retencji, PP/HSA, DF/HSA." src="/files/ftp_upload/3263/3263fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4. Wyznaczone stopnie sprzężenia koniugatów leku. Sygnały RI i UV wykazują dwa piki reprezentujące agregaty (eluujące przy niskiej objętości retencji) oraz monomery (eluujące przy wysokiej objętości retencji) koniugatów lek-HSA. Przedstawiono procentową zawartość monomerów i agregatów (wyznaczoną na podstawie sygnałów RI) oraz ich stopnie sprzężenia (n=1).
<img alt="Wykresy kropkowe cytometrii przepływowej; CD83-FITC vs CCR3-PE; poziomy aktywacji; DF-HSA, PP-HSA, kontrole." src="/files/ftp_upload/3263/3263fig5.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5. Test aktywacji bazofilów. Wyniki próbek aktywowanych koniugatami leków, kontroli negatywnych oraz kontroli pozytywnych przedstawiono na wykresach CD63-FITC-CCR3-PE (n=1).

<ol><li>Himly, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IgE-mediated+immediate-type+hypersensitivity+to+the+pyrazolone+drug+propyphenazone%5BTitle%5D)+AND+%22J+Allergy+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">IgE-mediated immediate-type hypersensitivity to the pyrazolone drug propyphenazone.</a> J Allergy Clin Immunol. 111, 882-888 (2003).</li>
<li>Demoly, P., Pichler, W., Pirmohamed, M., Romano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Important+questions+in+Allergy%3A+1--drug+allergy%2Fhypersensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Allergy%22%5BJournal%5D)">Important questions in Allergy: 1--drug allergy/hypersensitivity.</a> Allergy. 63, 616-619 (2008).</li>
<li>Ebo, D. G., Hagendorens, M. M., Bridts, C. H., Schuerwegh, A. J., Clerck, L. S., Stevens, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+analysis+of+in+vitro+activated+basophils%2C+specific+IgE+and+skin+tests+in+the+diagnosis+of+pollen-associated+food+allergy%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+B+%28Clinical+Cytometry%29%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric analysis of in vitro activated basophils, specific IgE and skin tests in the diagnosis of pollen-associated food allergy.</a> Cytometry Part B (Clinical Cytometry). 64B, (2005).</li>
<li>Harrer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diclofenac+hypersensitivity%3A+antibody+responses+to+the+parent+drug+and+relevant+metabolites%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Diclofenac hypersensitivity: antibody responses to the parent drug and relevant metabolites.</a> PLoS One. 5, e13707-e13707 (2010).</li>
<li>Wen, J., Arakawa, T., Philo, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size-exclusion+chromatography+with+on-line+light-scattering%2C+absorbance%2C+and+refractive+index+detectors+for+studying+proteins+and+their+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Size-exclusion chromatography with on-line light-scattering, absorbance, and refractive index detectors for studying proteins and their interactions.</a> Anal Biochem. 240, 155-166 (1996).</li>
<li>De Weck, A. L., Sanz, M. L., Gamboa, P. M., Aberer, W., Bienvenu, J., Blanca, M., Demoly, P., Ebo, D. G., Mayorga, L., Monneret, G., Sainte Laudy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+tests+based+on+human+basophils%3A+more+potentials+and+perspectives+than+pitfalls.+II.+Technical+issues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Investig+Allergol+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Diagnostic tests based on human basophils: more potentials and perspectives than pitfalls. II. Technical issues.</a> J Investig Allergol Clin Immunol. 18, 143-155 (2008).</li>
<li>Ebo, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-assisted+allergy+diagnosis%3A+current+applications+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Allergy%22%5BJournal%5D)">Flow-assisted allergy diagnosis: current applications and future perspectives.</a> Allergy. 61, 1028-1039 (2006).</li>
<li>Poulsen, L. K., Quan, S., Kragh, C., Platzer, M. H., Skov, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+basophil+granulocyte+in+allergic+reactions%3A+experimental+models+and+their+use+for+the+identification+of+drugs+with+effects+or+side+effects+on+basophils%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Med+Chem+-+Anti-inflammatory+%26+Anti-Allergy+Agents%22%5BJournal%5D)">The basophil granulocyte in allergic reactions: experimental models and their use for the identification of drugs with effects or side effects on basophils.</a> Curr Med Chem - Anti-inflammatory & Anti-Allergy Agents. 3, 167-180 (2004).</li>
<li>Sanz, M. L., Gamboa, P., de Weck, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+combined+test+with+flowcytometric+basophil+activation+and+determination+of+sulfidoleukotrienes+is+useful+for+in+vitro+diagnosis+of+hypersensitivity+to+aspirin+and+other+nonsteroidal+anti-inflammatory+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Arch+Allergy+Immunol%22%5BJournal%5D)">A new combined test with flowcytometric basophil activation and determination of sulfidoleukotrienes is useful for in vitro diagnosis of hypersensitivity to aspirin and other nonsteroidal anti-inflammatory drugs.</a> Int Arch Allergy Immunol. 136, 58-72 (2005).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

BAT jest dobrze ugruntowaną, choć nie stosowaną jeszcze rutynowo metodą diagnostyki chorób alergicznych zależnych od IgE 6,7. W przypadku nadwrażliwości na leki jej stosowalność jest jednak ograniczona, ponieważ związki o niskiej masie cząsteczkowej nie są w stanie sieciować receptorów IgE, co jest warunkiem koniecznym dla aktywacji bazofilów 8. Dlatego leki poddawane badaniu muszą zostać kowalencyjnie sprzężone z odpowiednimi białkami nośnikowymi (np. HSA). Co istotne, stopień sprzężenia (t.j. liczba cząsteczek leku na białko nośnikowe) musi być kontrolowany, aby zagwarantować aktywność immunologiczną (t.j. sieciowanie receptorów IgE) koniugatów. Teoretycznie dwa hapteny na jedną cząsteczkę nośnika powinny być wystarczające do sieciowania receptorów IgE, a wykazano, że już pięć cząsteczek DF na HSA wywołuje uwalnianie mediatorów w teście komórkowym4. Ustalono, że oba koniugaty, PP-HSA i DF-HSA, charakteryzują się wystarczająco wysokim stopniem sprzężenia (HPSEC) i są immunologicznie aktywne, co czyni je odpowiednimi odczynnikami do zastosowania w BAT. Kolejną kwestią może być rola metabolitów leku, ponieważ to metabolit, a nie lek macierzysty, może wywoływać reakcję nadwrażliwości. W przypadku DF możliwość ta została wcześniej szczegółowo oceniona z wykorzystaniem pięciu głównych metabolitów fazy I i jednego wariantu wiązania4. Ważnymi czynnikami w opanowaniu opisanej techniki są jakość próbki krwi (&lt;12 godzin od pobrania krwi, liczba wykrytych bazofilów &gt;500) oraz optymalizacja warunków stymulacji (czas, dawka). Ponadto należy zidentyfikować tzw. non-responders, którzy nie reagują nawet na kontrolę pozytywną (przeciwciało skierowane przeciwko receptorowi IgE). Dlatego kryteria walidacji muszą obejmować przeciwciało anty-FcεRI jako kontrolę pozytywną. Istotną zaletą stosowania koniugatów leków jest fakt, że wydają się one nietoksyczne w przeciwieństwie do czystych leków, co wykazano dla koniugatu DF-HSA poprzez kostymulację przeciwciałem anty-FcεRI w BAT4. Czyste DF wykazuje natomiast działanie cytotoksyczne w stężeniu 1.25 mg/ml, co powoduje problemy z interpretacją wyników BAT9. Ogólnie zaleca się badanie potencjalnej cytotoksyczności dla każdego nowo otrzymanego koniugatu leku.
W niniejszej pracy wykazaliśmy potencjał koniugatu PP-HSA zastosowanego w teście BAT do wykrywania nadwrażliwości zależnej od IgE. W przeciwieństwie do tego, nadwrażliwość na DF nie jest związana z IgE, co potwierdza brak aktywacji bazofilów w odpowiedzi na koniugat DF-HSA. Co istotne, w przypadku niepewności co do mechanizmu zależnego od IgE, koniugaty muszą zostać poddane ocenie aktywności immunologicznej w systemach testowych opartych na komórkach in vitro, co wykazano w przypadku DF4.
Wykorzystując opisany układ koniugowania leków o niskiej masie cząsteczkowej kowalencyjnie do odpowiednich białkowych cząsteczek nośników, można badać udział mechanizmu zależnego od IgE w licznych reakcjach nadwrażliwości na leki, w tym na antybiotyki, inne NLPZ, środki kontrastowe, leki rozluźniające mięśnie, środki znieczulające itp. W związku z tym BAT może stanowić uzupełnienie istniejących metod diagnostycznych (testy skórne, doustne próby prowokacyjne).

<table><tbody><tr><td>Kwas 2-(N-morfolino)etanosulfonowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3671</td><td>-</td></tr><tr><td>Kolumna TSK Gel&lt;sup&gt; &lt;/sup&gt;-G2000SWXL 7,8 x 300 mm</td><td>Tosoh Corp.</td><td>08540</td><td>-</td></tr><tr><td>BD FACSCanto II</td><td>BD Biosciences</td><td>338962</td><td>-</td></tr><tr><td>Wirówka nakładkowa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Sód diclofenak</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6899</td><td>-</td></tr><tr><td>EDTA-Vacutainer</td><td>BD Biosciences</td><td>368589</td><td>-</td></tr><tr><td>Zestaw Flow2 CAST</td><td>B&amp;#252;hlmann Laboratories</td><td>FK-CCR</td><td>Od 14 czerwca 2011 r. zestaw Flow2 CAST nazywa się Flow CAST</td></tr><tr><td>System HPLC HP1100</td><td>Hewlett-Packard</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td> Albumina surowicy ludzkiej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9511</td><td>-</td></tr><tr><td>Wirówka laboratoryjna</td><td>Eppendorf</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Wodorochlorek N-etylo-N&amp;rsquo;-(3-dimetyloaminopropyl)karbodiimidu (EDC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6383</td><td>-</td></tr><tr><td>Tabletki PBS</td><td>AppliChem</td><td>A9199</td><td>-</td></tr><tr><td>Pochodna propifenazonu</td><td>Uniwersytet w Salzburgu</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Mieszadło z wytrząsaniem</td><td>Eppendorf</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Azydek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8032</td><td>-</td></tr><tr><td>Chlorek sodu (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1679</td><td>-</td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>90421C</td><td>-</td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881</td><td>-</td></tr><tr><td>Fosforan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>342483</td><td>-</td></tr><tr><td>Trójstrefowy układ detektorów</td><td>Viscotek</td><td>TDA302</td><td>-</td></tr><tr><td>Osobisty BioVortex V-1 plus</td><td>Peqlab</td><td>90-V-1</td><td>-</td></tr><tr><td>Kąpiel wodna 1012</td><td>GFL</td><td>1012</td><td>-</td></tr></tbody></table>

test aktywacji bazofili w badaniu mechanizmów zależnych od ige w nadwrażliwości na leki

Basophil Activation Test for Investigation of IgE-Mediated Mechanisms in Drug Hypersensitivity

Reakcje nadwrażliwości na niesteroidowe leki przeciwzapalne (NLPZ), takie jak propifenazon (PP) i diklofenak (DF), mogą przejawiać się jako reakcje alergiczne typu I 1. W praktyce klinicznej diagnostyka nadwrażliwości na leki opiera się głównie na wywiadzie pacjenta, ponieważ testy skórne są niewiarygodne, a doustne próby prowokacyjne niosą ze sobą ryzyko zagrożenia życia pacjenta 2. W konsekwencji trudno jest uzyskać dowody na istnienie leżącego u podłoża patomechanizmu zależnego od IgE.
W niniejszej pracy przedstawiamy metodę in vitro opartą na wykorzystaniu ludzkich bazofili pochodzących od pacjentów z nadwrażliwością na leki, która naśladuje alergiczną reakcję efektorową in vivo. Ponieważ bazofile pacjentów z alergią na leki przenoszą cząsteczki IgE specyficzne dla leku wywołującego reakcję, ulegają one aktywacji w wyniku sieciowania receptorów IgE i uwalniają alergiczne cząsteczki efektorowe. Aktywację bazofili można monitorować poprzez oznaczenie zwiększonej ekspresji powierzchniowej CD63 przy użyciu cytometrii przepływowej 3.
W przypadku leków o niskiej masie cząsteczkowej koniugaty projektuje się w taki sposób, aby umożliwić sieciowanie receptorów IgE na bazofilach. Jak przedstawiono na Rysunku 1, dwa reprezentatywne NLPZ, PP i DF, są kowalencyjnie związane z ludzką albuminą surowiczą (HSA) poprzez grupę karboksylową reagującą z pierwszorzędową grupą aminową reszt lizyny. DF posiada wbudowaną grupę karboksylową i tym samym może być stosowany bezpośrednio 4, natomiast pochodna PP zawierająca grupę karboksylową musiała zostać zsyntetyzowana organochemicznie przed rozpoczęciem badania 1.
Stopień sprzęgania związków o niskiej masie cząsteczkowej z cząsteczką nośnika białkowego oraz ich rozkład przestrzenny są istotne dla zapewnienia sieciowania dwóch cząsteczek receptora IgE. Opisany tutaj protokół wykorzystuje wysokosprawną chromatografię wykluczania (HPSEC) wyposażoną w sekwencyjny system detekcji współczynnika załamania światła (RI) i ultrafioletu (UV) w celu określenia stopnia sprzęgania.
Ponieważ opisana metodologia może być zastosowana w przypadku innych leków, test aktywacji bazofilów (BAT) wykazuje potencjał do wykorzystania w określaniu mechanizmów zależnych od IgE w nadwrażliwości na leki. W niniejszym badaniu, za pomocą BAT, określamy nadwrażliwość na PP jako zależną od IgE, a nadwrażliwość na DF jako niezależną od IgE.

Test aktywacji bazofilów jest potężnym narzędziem do wykrywania alergii zależnych od IgE in vitro. W niniejszej pracy zoptymalizowany protokół testu aktywacji bazofilów został wykorzystany do badania nadwrażliwości na leki. Opisano metodę wydajnej produkcji kowalencyjnych koniugatów lek-białko oraz ich charakterystykę fizykochemiczną.

Test aktywacji bazofili w badaniu mechanizmów zależnych od IgE w nadwrażliwości na leki

Reakcje nadwrażliwości na niesteroidowe leki przeciwzapalne (NLPZ), takie jak propypifenazon (PP) i diklofenak (DF), mogą przejawiać się jako reakcje typu I...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest wykrycie nadwrażliwości na leki zapśredniczonej przez IgE za pomocą testu aktywacji bazofilów z wykorzystaniem dobrze scharakteryzowanych koniugatów białka nośnika leku haptyzowanego. Osiąga się to najpierw poprzez chemiczne powiązanie leku za pomocą wewnętrznej lub wprowadzonej organochemicznie grupy karboksylowej z resztami lizyny albuminy surowicy ludzkiej. Następnie koniugaty są charakteryzowane fizykochemicznie w celu określenia dokładnego stopnia sprzężenia poprzez przeprowadzenie wysokosprawnej chromatografii wykluczania rozmiarów (H-P-S-E-C) z sekwencyjną detekcją współczynnika załamania światła i detekcją w ultrafiolecie.Następnie dobrze scharakteryzowane koniugaty leków są wykorzystywane do stymulacji bazofili pobranych od dawców z nadwrażliwością na leki. Ostatecznie test aktywacji bazofili, czyli BAT, może być użyty do oceny mechanizmów zależnych od IgE w nadwrażliwości na leki. Nazywam się Michael Steiner i reprezentuję Grupę Badań nad Alergiami na Uniwersytecie w Salzburgu w Austrii.Dzisiaj chcielibyśmy przedstawić Państwu technikę umożliwiającą pomiar udziału swoistych dla leku przeciwciał IgE w reakcjach nadwrażliwości na leki. W niniejszym materiale prezentujemy procedurę na przykładzie dwóch powszechnie stosowanych przedstawicieli niesteroidowych leków przeciwzapalnych, a mianowicie propofolu i diklofenaku. Metoda ta ma jednak potencjał do wykorzystania w rutynowej diagnostyce natychmiastowych typów alergii polekowych.Ogólnie rzecz biorąc, należy dodać 10 µL świeżo przygotowanego roztworu stokowego chlorku N-etylo-N'-(3-dimetyloaminopropylo)karbodiimidu (EDC) do próbki propafenonu lub PP. Próbkę należy wymieszać w wstrząsarze wierzchłowym przez jedną minutę. Następnie do próbki dodaje się 16,9 µL roztworu albuminy surowicy ludzkiej (HSA) o stężeniu 118 mg/mL, a następnie inkubuje próbkę przez dwie godziny w temperaturze pokojowej przy wstrząsaniu z prędkością 300 obr./min.Po zakończeniu wstrząsania dializować próbki trzykrotnie przeciwko dwóm litrom PBS przez kilka godzin każdorazowo w temperaturze 4°C. Następnie wirować próbki przez 10 minut w temperaturze pokojowej z prędkością 14 000 ×g i zebrać supernatant S zawierający NSAIDs sprzężone z HSA. Sprawdzić zawartość białek w supernatancie, przeprowadzając elektroforezę SDS-PAGE z użyciem żeli 12%.Naniesienie około 12 µg koniugatu HSA do jednego otworu żelu w celu analizy szybkości sprzęgania koniugatów NLP za pomocą wysokosprawnej chromatografii wykluczania wielkościowej (HPSEC). Najpierw rozcieńcz próbkę wzorca HSA do stężenia 1 mg/mL w wodzie zdemineralizowanej. W celu kalibracji detektora wstrzyknij 50 µL roztworu wzorca HSA.Następnie, wykorzystując żel TSK o wymiarach 7,8 by 300 milimetrów, kolumnę G 2000 SSW XL oraz system detekcji z on-line sprzężonym detektorem współczynnika załamania światła (RI) i detektorem UV, oblicza się stałą RI (case sub RI) oraz stałą UV (K sub UV) dla detektora. Stosując te dwa wzory, należy przygotować w zdemineralizowanej wodzie rozcieńczenia wzorców pochodnych PP do analizy H-P-S-E-C w ilościach 5, 10 i 30 w celu ułatwienia wstrzykiwania, a następnie obliczyć wartości średnie dla DN by DC leku oraz DA by DC leku dla obu wzorców.Wykorzystując te dwie formuły, należy teraz wprowadzić koniugaty leku do H-P-S-E-C i wyznaczyć ich RI oraz obszary pików UV. Następnie, stosując te same dwa równania, należy obliczyć stężenie pochodnych PP oraz HSA dla próbek nieznanych. W pierwszej kolejności należy opisać siedem probówek do cytometrii przepływowej w zależności od ich zawartości: kontrola niebarwiona, kontrola negatywna, kontrola pozytywna oraz koniugaty leku.Następnie pipetujemy 50 µL buforu do stymulacji bazofili do probówek przeznaczonych dla kontroli niebarwionej i ujemnej. Do probówki z kontrolą dodatnią dodajemy 50 µL roztworu przeciwciał anty FC epsilon R one z zestawu flow two cast. Teraz do probówek z koniugatem leku dodajemy od 0,02 do 20 µg/mL koniugatu PP w serii rozcieńczeń od 1:1 do 1:10, a następnie do każdej probówki dodajemy 100 µL buforu do stymulacji i 50 µL pełnej krwi pacjenta pobranej do EDTA.Próbki należy starannie wymieszać. Następnie do każdej z probówek z koniugatem leku oraz probówek z kontrolą pozytywną i negatywną należy pipetować 20 µL odczynnika do barwienia Two cast, zawierającego przeciwciała anty-CCR3 znakowane PE oraz przeciwciała anty-CD63 znakowane ZI, a następnie wymieszać.Ponownie inkubuj próbki przez 45 minut w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Następnie, aby zatrzymać reakcję, umieść próbki na lodzie na pięć minut. W kolejnym kroku przeprowadź lizę erytrocytów, dodając do każdej probówki 2 mL odczynnika do lizy Flow-2.Inkubować próbki w ciemności przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Następnie wirować próbki przez pięć minut przy 500 ×g w temperaturze pokojowej w celu otrzymania osadu. Ostrożnie odlać nadsącz, zawiesić komórki ponownie w 500 µL buforu do mycia przed cytometrią przepływową i przechowywać próbki w lodzie do czasu przeprowadzenia analizy cytometrycznej.Użyj niebarwionej próbki do dostrojenia ustawień napięcia cytometru przepływowego. Następnie wyznacz bramkę dla komórek zidentyfikowanych jako limfocyty na wykresie rozrzutu bocznego i przedniego. Podobnie jak na zamieszczonej rycinie, bazofile są w pierwszej kolejności identyfikowane jako CCR3-high side scatter low.Podobnie jak na tym wykresie rozrzutu. Po bramkowaniu komórek na wykresie FIT EPE, aktywowane bazofile można dodatkowo zidentyfikować na podstawie ekspresji markerów CD 63 znakowanych FIT E. Po ustaleniu odcięcia na maksymalnym poziomie 2,5% bazofili jako CD 63 high w kontroli negatywnej, próbkę można uznać za pozytywną pod kątem aktywacji bazofili, jeśli więcej niż 5% bazofili wykazuje wysoką ekspresję CD 63 (CD 63 high), a MFI próbki podzielone przez MFI kontroli negatywnej przekracza wartość dwa.Metoda ta ocenia wykorzystanie BAT jako pomocnego narzędzia do wykrywania białek odpowiedzialnych za nadwrażliwość na leki zależną od IgE. Konjugaty NLP są wykorzystywane do aktywacji bazofilów przez H-P-S-E-C z detekcją agregacji za pomocą RI i UV. Stopień sprzęgania oraz efektywna wydajność konjugatów są określane zgodnie z przedstawionym na tej rycinie schematem.43,5% koniugatów DF pozostało w formie monomerów, natomiast stopień sprzęgania dla agregatów wyniósł 5,0 DF na HSA. Stopień sprzęgania wynoszący 9,5 został określony, jak przedstawiono tutaj. Wykazano, że koniugat PPP składa się w 68,5% z monomerów o stopniu sprzęgania wynoszącym 21,2.Stopień sprzężenia agregatów wyniósł 27,9. Łącznie wyznaczony stopień sprzężenia koniugatów DF wyniósł 7,6 df, a koniugatów PPP 23,2. BAT przeprowadzony z koniugatami w zoptymalizowanych warunkach umożliwia badanie reakcji zależnych od IgE w nadwrażliwości na NLPZ.Jak pokazano tutaj, tylko koniugat PP był w stanie wywołać aktywację bazofili, co zwizualizowano poprzez zwiększenie ekspresji powierzchniowej CD 63. Aktywowano 20,6% bazofili, co charakteryzowało się wzrostem intensywności fluorescencji, a MFI wzrosło 4,9-krotnie, z 386 dla kontroli negatywnej do 1893.W przeciwieństwie do tego, przy użyciu koniugatu DF aktywowano tylko 3,1% bazofilów, co było wartością poniżej progu 5%. Ponadto MFI wzrosło jedynie 1,1-krotnie, z 197 dla kontroli negatywnej do 210. Ważność testu potwierdza fakt, że aktywacja bazofilów w kontroli negatywnej była niższa niż 5%.Po drugie, przesunięcie o jedną logarytmiczną jednostkę intensywności fluorescencji w subpopulacji bazofilów oraz po trzecie, ponad 50% aktywowanych bazofilów dla kontroli dodatniej. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat przeprowadzania testów aktywacji bazofilów, a co najważniejsze, na temat tego, jak odróżnić reakcje nadwrażliwości na leki zależne od IgE od reakcji niezależnych od IgE. Ponadto powinni Państwo zrozumieć, w jaki sposób rozszerzyć zastosowanie testu aktywacji bazofilów w alergiach lekowych poza jego już ugruntowane wykorzystanie w alergiach na pyłki, pokarmy i jad owadów.

basophil-activation-test-for-investigation-ige-mediated-mechanisms

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Test aktywacji bazofilów do badania mechanizmów pośredniczych przez IgE w nadwrażliwości na leki

Eksperymentalne modele mysie astmy alergicznej oferują nowe możliwości badania patogenezy choroby oraz opracowywania nowych terapii. Modele te są odpowiednie do pomiaru czynników kontrolujących alergiczną odpowiedź immunologiczną, zapalenie dróg oddechowych i patofizjologię płuc.

Mysi model astmy indukowanej alergenem

W tym filmie opisujemy metodę in vitro do oceny potencjału alergicznego antygenu do wywołania degranulacji bazofilów. β-heksosaminidaza jest używana jako wskaźnik uwalniania chemicznego mediatora, a aktywność enzymatyczna β-heksosaminidazy jest mierzona za pomocą substratu fluorogenicznego.

Humanizowany test uwalniania enzymu mediatorowego: immunochemiczna metoda badania potencjału alergicznego antygenu testowego poprzez monitorowanie odpowiedzi degranulacji bazofili in vitro

W tym filmie pokazujemy test do oceny aktywacji bazofili w obecności testowego alergenu za pomocą cytometrii przepływowej.

Analiza aktywacji bazofili w obecności testowego alergenu za pomocą cytometrii przepływowej

Ten film demonstruje protokół wykrywania specyficznej dla surowicy immunoglobuliny E za pomocą systemu chemiluminescencji opartego na kartridżu mikroprzepływowym. IgE w surowicy oddziałują z odrębnymi alergenami unieruchomionymi w strefie reakcji wkładu, które są następnie wykrywane za pomocą przeciwciał anty-IgE sprzężonych z peroksydazą i substratu chemiluminescencyjnego, co pozwala na jednoczesne wykrywanie wielu IgE specyficznych dla alergenu.

Oparty na kartridżu mikroprzepływowym system wykrywania swoistej dla alergenu E immunoglobuliny E

Reakcje alergiczne, charakteryzujące się aktywacją komórek tucznych i bazofilów, są napędzane przez sieciowanie IgE i uwalnianie mediatorów prozapalnych. Ilościową ocenę reakcji alergicznych można uzyskać, stosując barwnik Evans Blue do monitorowania zmian przepuszczalności naczyń krwionośnych po prowokacji alergenem.

Pomiar miejscowej anafilaksji u myszy

Analiza in vitro rekombinacji przełączników klas u myszy jest trudna ze względu na cytofilne cząsteczki IgE związane z receptorami Fc na powierzchni komórek B.  Opisujemy metodę wykrywania IgE za pomocą rozszczepienia IgE związanego powierzchniowo za pośrednictwem trypsyny przed utrwaleniem i przepuszczalnością w celu barwienia fluorescencji cytoplazmatycznej.

Wykrywanie prawdziwych mysich komórek linii B z ekspresją IgE

Ta praca opisuje protokół, który wykorzystuje podejście komponentowe do badania wrażliwości na alergeny pyłków traw w kohorcie pacjentów z południowych Chin z alergicznym nieżytem nosa i/lub astmą.

Podejście diagnostyczne z rozdzielczością komponentową w badaniu alergenów pyłków traw u mieszkańców Chin z południa z alergicznym nieżytem nosa i/lub astmą

Ten artykuł przedstawia protokół wykrywania specyficznej dla surowicy immunoglobuliny E za pomocą mikroprzepływowego systemu chemiluminescencji opartego na kartridżu oraz ocenę jego przydatności w diagnostyce alergii.

Zastosowanie technologii mikroprzepływowej Biochip do wykrywania immunoglobuliny E (sIgE) swoistej dla alergenu w surowicy

Test aktywacji bazofili jest uzupełniającym testem diagnostycznym in vitro do oceny reakcji alergicznych zależnych od IgE, opartym na wykryciu aktywacji bazofili w obecności określonego bodźca poprzez pomiar markerów aktywacji za pomocą cytometrii przepływowej.

Test aktywacji bazofili do diagnozy alergii

Tutaj prezentujemy test uwalniania mediatora, wykorzystujący linię komórkową białaczki bazofilowej szczura transfekowaną ludzkim receptorem IgE, aby symulować degranulację komórek efektorowych zwykle obserwowaną w reakcjach alergicznych typu 1. Metoda ta bada aktywność biologiczną alergenów w sposób wysoce czuły, powtarzalny i dostosowany do potrzeb.

Humanizowany test uwalniania mediatora jako odczyt siły działania alergenów

Poznaj test aktywacji bazofili do wykrywania nadwrażliwości IgE-zależnej na leki. Ta metoda wykorzystuje sprzężenia lek-białko i cytometrię przepływową do diagnostyki alergii lekowych.

Test aktywacji bazofili w badaniu mechanizmów zależnych od IgE w nadwrażliwości na leki

Przeglądaj więcej filmów