Metoda znakowania naczyń krwionośnych u embrionów myszy

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest określenie wpływu konkretnych mutacji genetycznych na rozwój i strukturę naczyń krwionośnych. Osiąga się to poprzez jednoczesną dyssekcję zarodka oraz tkanek pozazarodkowych w celu przygotowania odpowiedniej próbki do iniekcji. Następnie do żyły twarzowej wstrzykuje się barwnik fluorescencyjny, aby oznakować nienaruszoną sieć naczyń.

Następnie zarodek jest przygotowywany do analizy. Na koniec wykonuje się preparaty całych organów lub przekroje znakowanych naczyń krwionośnych, aby obrazować trójwymiarową strukturę prawidłowych naczyń w oparciu o mikroskopię immunofluorescencyjną całych preparatów lub sekcji tkanek. Po raz pierwszy opracowałem tę metodę, gdy byłem zainteresowany ustaleniem punktu czasowego rozwoju, w którym naczynia obwodowe łączą się z grasicą w procesie angiogenezy.

Aby rozpocząć, należy przygotować FXI dextran lub GS L one I selectin B four w PBS w probówce typu eppendorf o pojemności 1,5 ml. Do FXI dextranu należy dodać 100 µL roztworu stokowego 1,25 mM fast green w PBS, a do GS L one I selectin B four 180 µL, tak aby roztwory miały widoczny niebieski kolor. Następnie probówkę należy ogrzać do 37 °C.

Wypreparuj zarodki w dniach od E 14.5 do E 18.5 wraz z workami żółtkowymi, pozostawiając nienaruszony szypuł pępowinowy. Przenieś zarodki do nowej płytki Petriego i zanurz je w PBS w temperaturze pokojowej. Następnie ustaw zarodek w taki sposób, aby uzyskać widok strzałkowy twarzy.

Następnie za pomocą pęsety do mikrosekcji delikatnie chwyć embrion za głowę. Używając igły 30 G, wstrzyknij 50 µL dekstranu FXI lub GS L one I selectin B four do żyły twarzowej, kierując igłę w stronę tyłu głowy. Gdy barwnik stanie się widoczny w żyle pępowinowej, wyjmij igłę i oddziel embrion od podłoża.

Przechowywać. Pozostawić zarodek w PBS w temperaturze pokojowej przez dwie do trzech minut, aby barwnik rozprzestrzenił się w całym organizmie zarodka. Po zakończeniu cyrkulacji barwnika w zarodku, pobrać próbki skóry z obszarów kończyn, grzbietu oraz brzucha.

Przemyj próbki skóry w zimnym PBS i utrwal je w 4% paraldehydzie w PBS przez dwie godziny. Następnie przemyj je trzykrotnie po 10 minut każdorazowo w czteromililitrowych probówkach z przejrzystego szkła, używając dwóch mililitrów zimnego PBS. Umieść próbki skóry na szkiełkach przedmiotowych, a następnie nanieś na każde szkiełko 100 µL medium montującego i przykryj szkiełkiem nakrywkowym.

Pozostaw preparaty do wyschnięcia w ciemności; następnie można przeprowadzić proces przejaśniania w BABB i późniejszą mikroskopię konfokalną w celu uzyskania obrazów unaczynienia skóry o wyższej rozdzielczości. Aby przygotować tkanki do kriosekcjonowania, zamroź szybko całe embriony w ciekłym azocie. Nałóż OCT na blok sekcyjny i zamocuj embrion.

Zamrożoną tkankę pociąć na sekcje o grubości 10 micron i zebrać na szkiełkach. Utwierdzić sekcje w acetonie przez pięć do 10 minut, a następnie przemyć je trzykrotnie w zimnym TBS, a potem w 10% Donkey serum w TBS w komorze wilgotnościowej. W temperaturze pokojowej dodać 100 microliters przeciwciała pierwszorzędowego do każdej sekcji.

W tym przykładzie stosujemy przeciwciało szczurze anty-US CD 31 do znakowania śródbłonka oraz kozie anty-US P-D-G-F-R beta do znakowania komórek okołonaczyniowych, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie przeciwciała na całym skrawku. Przykryć szkiełka indywidualnie dociętymi paskami parafilmu. Inkubować szkiełka od jednej godziny do całej nocy w komorze wilgotnościowej w temperaturze 4 °C.

Następnie należy przemyć skrawki trzykrotnie w zimnym TBS i inkubować z 100 µL odpowiednich przeciwciał wtórnych przez co najmniej 30 minut. Na koniec przemyć trzykrotnie w zimnym TBS, a następnie nałożyć na każdy preparat 100 µL medium montażowego i przykryć szkiełkiem.

Pozostawić preparaty do wyschnięcia w ciemności. W przypadku sekcjonowania wibratomem, wyciąć płaty grasicy z embrionów i wypłukać w zimnym PBS. Utrawić tkankę w 4% paraldehydzie w PBS w temperaturze pokojowej przez dwie godziny.

Po przemyciu próbek w PBS Triton X, napełnij mały plastikowy wkład 4% niskotopiącej agarozy w PBS. Zanurz próbki w agarozie w PBS, upewniając się, że tkanka styka się z dnem wkładu. Pozostaw agarozę do zastygnięcia na lodzie.

Następnie za pomocą żyletki odciąć nadmiar agrosu. Nałożyć klej na blok VIBRAM i przykleić do niego próbkę. Wlać zimny PBS do kąpieli wodnej Vibram, aż próbka i ostrze zostaną całkowicie zanurzone.

Ustaw prędkość i amplitudę. Amplituda powinna zostać zmniejszona. Jeśli przekroje ulegają rozpadnięciu z powodu zbyt silnego wytrząsania, wykonaj 50 przekrojów tkanki.

Następnie, używając pęsety, przenieś przekroje do zimnego PBS w 24-dołkowej mikropłytce. Zablokuj przekroje w 500 µL 10% surowicy oslej w PBS Triton X przez 30 minut. Po dodaniu przeciwciał pierwszorzędowych, takich jak anty-CD 31 i anty-P-D-G-F-R beta, inkubuj przez osiem godzin lub przez noc w przykrytej mikropłytce w temperaturze 4 °C. Następnie przemyj trzy razy w PBS Triton X w ciągu łącznie ośmiu godzin w temperaturze 4 °C.

Po ponownym blokowaniu przekrojów i inkubacji z przeciwciałami wtórnymi, przemyj próbki trzykrotnie w PBS Triton X w ciągu łącznie ośmiu godzin w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie ponownie utrwal próbki w 4%paraldehydzie w PBS przez 30 minut na lodzie i przemyj trzykrotnie w PBS Triton X w ciągu 30 minut na lodzie. Odwodnij próbki, stosując serię roztworów methanol PBS Triton X o rosnącym stężeniu, inkubując przez 10 minut na każdym etapie.

Następnie zastąp 100% methanol świeżym metanolem i inkubuj przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Umieść próbkę na szkiełku z wgłębieniem i pokryj ją roztworem BABB i metanolu w stosunku jeden do jednego. Inkubuj próbki przez 10 do 15 minut.

Następnie zastąp roztwór 100% BABB i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 10 do 15 minut lub do momentu przejaśnienia. Nałóż szkiełko nakrywkowe i uszczelnij dwiema lub trzema warstwami lakieru do paznokci. Pozostaw lakier do wyschnięcia w ciemności w temperaturze pokojowej.

Próbkę można przechowywać w temperaturze 4 °C, jednak obrazowanie należy przeprowadzić w ciągu 12 do 24 godzin. Wykonaj obrazy zamrożonych przekrojów o grubości 10 µm za pomocą mikroskopu konfokalnego, używając obiektywu Plan-Apochromat 20x 0,8 z liniami laserowymi 633 nm, 488 nm i 543 nm. Uzyskaj konfokalne sekcje Z o grubości 1 µm dla przekrojów w osadzie agarowym o grubości 50 µm, używając obiektywu Plan-Apochromat 10x 0,4 z liniami laserowymi 488 nm, 543 nm i 633 nm. Zrekonstruuj seryjne sekcje Z, używając oprogramowania do analizy obrazu Zeiss AIA vision 4.6 lub innego odpowiedniego programu. Wydajne znakowanie naczyń krwionośnych zarodka jest kluczowe dla oceny wad naczyń krwionośnych u myszy w okresie embrionalnym. Rysunki te przedstawiają specyficzne znakowanie naczyń krwionośnych grasicy w stadium E 16.5 oraz współznakowanie GS L1 i selektyny I.

B4 wstrzyknięte embriony z CD 31 oraz barwienie prawej i lewej komory. W eksperymentach tych zastosowano protokół B4 dla preparatów mrożonych GSL one I selectin. Przedstawiono tutaj znakowanie całego preparatu sieci naczyń krwionośnych skóry myszy w stadium E 16.5 po zastosowaniu tej procedury.

Można zastosować inne metody, takie jak wspólne znakowanie komórek zrębu i komórek krwi wraz z naczyniami krwionośnymi, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak: w jaki sposób komórki krwi i komórki zrębu oddziałują z naczyniami krwionośnymi w embrionie myszy w warunkach prawidłowych oraz patologicznych?