Name: Metoda oznaczania naczyń krwionośnych u myszy embrionalnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: Poznaj metodę oznaczania naczyń krwionośnych u myszy embrionalnych poprzez wstrzyknięcie fluorescencyjnego barwnika do żyły twarzowej. Technika ta umożliwia wizualizację trójwymiarowej struktury układu naczyniowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Niniejsza praca była wspierana przez granty nr R01AI055001 oraz R01AI082127 z NIAID przyznane NRM oraz stypendium doktoranckie SREB Dissertation Fellowship Award przyznane JLB.

1. Iniekcje do żyły twarzowej z zastosowaniem dekstranu znakowanego fluoresceiną oraz lektyny GSL I-isolectin B4 w celu znakowania naczyń krwionośnych zarodka
<ol>
	<li>Przygotować FITC-dekstran (50ug/mL) w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) lub GSL 1 - izolektynę B4 (20ug/200uL) w PBS w probówce Eppendorfa o pojemności 1,5mL i ogrzać do 37°C. Dodać 100uL roztwoku zapasu 1,25mM Fast Green/PBS do roztworu FITC-dekstranu (objętość całkowita 1mL) oraz 180uL roztwoku zapasu 1,25mM Fast Green/PBS do GSL 1 - izolektyny B4 (objętość całkowita 200uL), tak aby roztwór stał się widocznie niebieski.</li>
	<li>Wypreparować zarodki w stadium E14.5-E18.5 wraz z woreczkiem żółtkowym, pozostawiając nienaruszony szypuł allantois (tętnicę i żyłę pępowinową).</li>
	<li>Przenieść zarodki do nowej szalki Petriego (60 X 15 mm) i zanurzyć je w PBS w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Ułożyć zarodek tak, aby uzyskać widok strzałkowy głowy/twarzy. Użyć mikro-pincety do delikatnego uchwycenia zarodka za głowę.</li>
	<li>Za pomocą igły 30G wstrzyknąć 50uL FITC-dekstranu (50ug/mL) lub GSL 1 - izolektyny B4 (20ug w 200uL PBS) do żyły twarzowej, kierując igłę w stronę tyłu głowy.</li>
	<li>Gdy barwnik stanie się widoczny w żyle pępowinowej, usunąć igłę i oddzielić zarodek od szypułu allantois (tętnicy i żyły pępowinowej).</li>
	<li>Po wstrzyknięciach pozostawić zarodek w PBS w temperaturze pokojowej na 2-3 minuty, aby barwnik mógł rozprzestrzenić się w całym organizmie zarodka.</li>
</ol>
2. Analiza całoprzestrzenna unaczynienia skóry
<ol>
	<li>Po dopuszczeniu do krążenia barwnika w całym embrionie, należy pobrać próbki skóry z obszarów kończyn, grzbietu, brzucha itp. 8,9.</li>
	<li>Próbkę skóry należy przemyć zimnym PBS, a następnie utrwalić w 4% PFA/PBS przez 2 godziny 8,9. Próbkę przemywa się 3 razy przez 10 minut każdorazowo w 4mL przezroczystej probówce z 2mL zimnego PBS.</li>
	<li>Próbkę skóry należy umieścić na szkiełku przedmiotowym, dodać 100 μl medium montażowego do każdego szkiełka i nakryć szkiełkiem nakrywkowym.</li>
	<li>Pozostawić szkiełka do wyschnięcia w ciemnym miejscu przechowywania.</li>
	<li>Przejść do Kroku 2 w sekcji „Pozyskiwanie obrazów”.</li>
</ol>
3. Wielokolorowe znakowanie naczyń krwionośnych oraz komórek okołonaczyniowych grasicy i serca do skrawków mrożonych (Kontynuacja z Sekcji 1, Krok 7)
<ol>
	<li>Cały embrion poddać szybkiemu zamrożeniu („flash freeze”) w ciekłym azocie. Embriony można przechowywać w temperaturze -80°C do czasu analizy.</li>
	<li>Alternatywnie, wypreparować grasicę, przepłukać w PBS w temperaturze 4°C i utrwalić w 2 mL 4% Paraformaldehydu (PFA)/PBS przez 2 godziny. Przemyć 3 razy przez 10 minut w zimnym PBS, umieścić grasice w OCT, zamrozić i przechowywać do czasu użycia w -80°C.</li>
	<li>Do kriosekcjonowania nanieść OCT na blok do sekcji i zamocować embrion lub wypreparowane organy/tkanki do cięcia.</li>
	<li>Zamrożoną tkankę pociąć na sekcje o grubości 10 μm i zebrać na szkiełkach.</li>
	<li>Sekcje utrwalić w acetonie przez 5-10 minut. Przemyć 3 razy w zimnym TBS.</li>
	<li>Zablokować w 10% surowicy osła/TBS w komorze wilgotnościowej w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Inkubować sekcje przez 1 godzinę do całej nocy z 100 μl przeciwciał pierwszorzędowych w komorze wilgotnościowej w 4°C: w tym przykładzie zastosowano szczurze przeciwciała anty-mysie CD31 (1:100) do znakowania śródbłonka oraz kozie przeciwciała anty-mysie PDGFR-β (1:100) do znakowania komórek okołonaczyniowych. Wskazane jest przykrycie szkiełek indywidualnie dociętymi paskami Parafilmu, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie przeciwciał na całej sekcji.</li>
	<li>Po inkubacji z przeciwciałami pierwszorzędowymi przemyć sekcje 3 razy w zimnym TBS. Inkubować z 100 μl odpowiednich przeciwciał drugorzędowych przez minimum 30 minut.</li>
	<li>Przemyć 3 razy w zimnym TBS. Dodać 100 μl medium montażowego na każde szkiełko i nałożyć szkiełko nakrywkę.</li>
	<li>Pozostawić szkiełka do wyschnięcia w ciemnym miejscu przechowywania.</li>
	<li>Przejść do sekcji „Pozyskiwanie obrazów”.</li>
</ol>
4. Wielobarwne znakowanie naczyń krwionośnych grasicy i komórek okołonaczyniowych dla przekrojów wykonanych w wibratomie (Kontynuacja z Sekcji 1, Krok 7)
<ol>
	<li>Wypreparować płaty grasicy z zarodka i przepłukać w zimnym PBS.</li>
	<li>Utrwalić grasicę w 4% PFA/PBS w temperaturze pokojowej przez 2 godziny.</li>
	<li>Przemyć 3 razy przez 10 minut w PBS-Triton X (0.15%), umieścić grasice w małym plastikowym wkładzie i zanurzyć w 4% agarozie o niskiej temperaturze topnienia/PBS (˜4°C). Grasica powinna stykać się z dnem wkładu.</li>
	<li>Pozostawić agarozę do stężenia na lodzie (3-5 minut). Za pomocą żyletki odciąć nadmiar agarozy. Nałożyć klej na blok wibratomu i przytwierdzić próbkę do bloku.</li>
	<li>Dolać zimny PBS do kąpieli wodnej wibratomu, aż próbka i ostrze zostaną zanurzone.</li>
	<li>Ustawić prędkość i amplitudę (wysoka amplituda i niska-umiarkowana prędkość są idealne dla miękkich przekrojów grasicy). Amplitudę należy zmniejszyć, jeśli skrawki ulegają rozpadowi z powodu zbyt silnych wibracji.</li>
	<li>Wyciąć skrawki o grubości 50 um.</li>
	<li>Za pomocą pędzelka zebrać skrawki do mikropłytki 24-dołkowej z zimnym PBS.</li>
	<li>Zablokować skrawki w 500 μl 10% surowicy osła w PBS-Triton X (0.15%) przez 30 minut.</li>
	<li>Inkubować skrawki przez 8 godzin lub przez noc z przeciwciałem pierwszorzędowym, takim jak anty-CD31 i anty-PDGFR-β, w zakrytej mikropłytce 24-dołkowej.</li>
	<li>Przemyć 3 razy w PBS-Triton X (0.15%) w ciągu łącznie 8 godzin w 4°C.</li>
	<li>Zablokować skrawki w 10% surowicy osła w PBS-Triton X (0.15%) przez 30 minut.</li>
	<li>Inkubować skrawki przez 8 godzin lub przez noc w 4°C z odpowiednimi przeciwciałami wtórnymi.</li>
	<li>Przemyć 3 razy w PBS-Triton X (0.15%) w ciągu łącznie 8 godzin w 4°C.</li>
	<li>Ponownie utrwalić próbki w 4% PFA/PBS przez 30 minut na lodzie.</li>
	<li>Przemyć 3 razy w PBS-Triton X (0.15%) przez 30 minut na lodzie.</li>
	<li>Odwodnić próbki w serii roztworów MeOH/PBS-Triton X o rosnącym stężeniu: 25% MeOH, 50% MeOH, 75% MeOH oraz 100% MeOH przez 10 minut na każdym etapie. Po 10 minutach zastąpić 100% MeOH świeżym MeOH i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>W szklanym naczyniu zmieszać BABB (alkohol benzylowy:benzoesan benzylu) w stosunku 1:2. Połączyć BABB z MeOH do uzyskania końcowego stężenia 50% BABB i 50% MeOH. Inkubować próbkę w BABB:MeOH przez 10-15 minut.</li>
	<li>Przenieść próbkę do szklanego naczynia z 100% BABB i inkubować przez 10-15 minut lub do momentu przejaśnienia w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Wypełnić szkiełko z wgłębieniem (głębokość 0.7mm) świeżym 100% BABB i przenieść próbkę na bok. Nałożyć szkiełko nakrywkowe (Nr 1.5) i uszczelnić 2-3 warstwami lakieru do paznokci. Pozostawić lakier do utwardzenia w ciemności w temperaturze pokojowej, a następnie przechowywać próbkę w 4°C. 
	Uwaga: Szkiełka muszą być całkowicie uszczelnione przed obrazowaniem konfokalnym. Obrazowanie powinno zostać przeprowadzone w ciągu 12-24 godzin, ponieważ barwniki fluorescencyjne mogą blaknąć w BABB.</li>
	<li>Przejść do sekcji „Pozyskiwanie obrazów”.</li>
</ol>
5. Akwizycja obrazów
<ol>
	<li>Wykonaj obrazy mrożonych skrawków o grubości 10 μm za pomocą mikroskopu konfokalnego, używając obiektywu Plan-Apochromat 20X/0.8 (512 X 512 Pixels) z liniami laserowymi 488- (FITC-dekstran/GSL 1 - izolektyna B4), 543- oraz 633-nm.</li>
	<li>Uzyskaj konfokalne przekroje Z całej skóry (whole mount) oraz skrawków o grubości 50 μm zatopionych w agarozie, używając obiektywu Plan-Apochromat 10X/0.4 (512 X 512 Pixels) z liniami laserowymi 488- (FITC-dekstran/GSL 1 - izolektyna B4), 543- oraz 633-nm. Seryjne przekroje Z należy zbierać sekwencyjnie co 1 mikron dla każdego z kanałów.</li>
	<li>Zrekonstruuj seryjne przekroje Z przy użyciu oprogramowania Zeiss Axiovision 4.6 lub innego oprogramowania do analizy obrazu.</li>
</ol>
6. Reprezentatywne wyniki:
Efektywne znakowanie naczyń krwionośnych zarodka jest kluczowe dla oceny wad naczyń krwionośnych u myszy w okresie embrionalnym. Rysunek 1 przedstawia specyficzne znakowanie naczyń krwionośnych grasicy na etapie E16,5 (1A-B) oraz współznakowanie z CD31 (1B), a także barwienie odpowiednio prawej i lewej komory serca (1E-F). W doświadczeniach tych zastosowano protokół GSL I-isolectin B4 dla skrawków mrożonych, opisany w sekcjach 1, 3 i 5. Znakowanie całego preparatu sieci naczyń krwionośnych skóry myszy na etapie E16,5, z zastosowaniem protokołów opisanych w sekcjach 1, 2 i 5, przedstawiono na Rysunku 1C-D.
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna markerów naczyniowych; izolektyna B4 GSL1, dekstran FITC CD31; struktura komórkowa." src="/files/ftp_upload/3267/3267fig1.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Rycina 1"> 
Legenda do ryciny 1. Iniekcje FITC GSL I - izolektyny B4 do żyły twarzowej embrionów myszy w stadium E16.5. a. Przekrój kriostatyczny zarodkowego tymusu po iniekcji. b. Nałożenie obrazów (merge) współoznakowania CD31 z izolektyną B4. c. i d. Preparat całego organu (whole-mount) naczyń skórnych zarodka po iniekcji. e. i f. Przekrój kriostatyczny zarodkowego serca e. (prawą komorę) f. (lewą komorę) po iniekcji.

<ol><li>Cuddihy, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF-mediated+cross-talk+within+the+neonatal+murine+thymus%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">VEGF-mediated cross-talk within the neonatal murine thymus.</a> Blood. 113, 2723-2731 (2009).</li>
<li>Muller, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+targeting+of+VEGF-A+in+thymus+epithelium+disrupts+thymus+blood+vessel+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Gene targeting of VEGF-A in thymus epithelium disrupts thymus blood vessel architecture.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102, 10587-10592 (2005).</li>
<li>Muller, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+crest+origin+of+perivascular+mesenchyme+in+the+adult+thymus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Neural crest origin of perivascular mesenchyme in the adult thymus.</a> J. Immunol. 180, 5344-5351 (2008).</li>
<li>Foster, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+neural+crest-derived+cells+in+the+embryonic+and+adult+thymus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Contribution of neural crest-derived cells in the embryonic and adult thymus.</a> J. Immunol. 180, 3183-3189 (2008).</li>
<li>Liu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordination+between+CCR7-+and+CCR9-mediated+chemokine+signals+in+prevascular+fetal+thymus+colonization%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Coordination between CCR7- and CCR9-mediated chemokine signals in prevascular fetal thymus colonization.</a> Blood. 108, 2531-2539 (2006).</li>
<li>Lavine, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+growth+factor+signals+regulate+a+wave+of+Hedgehog+activation+that+is+essential+for+coronary+vascular+development%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Fibroblast growth factor signals regulate a wave of Hedgehog activation that is essential for coronary vascular development.</a> Genes Dev. 20, 1651-1666 (2006).</li>
<li>Lavine, K. J., Kovacs, A., Ornitz, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog+signaling+is+critical+for+maintenance+of+the+adult+coronary+vasculature+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Hedgehog signaling is critical for maintenance of the adult coronary vasculature in mice.</a> J. Clin Invest. 118, 2404-2414 (2008).</li>
<li>Mukouyama, Y. S., Gerber, H. P., Ferrara, N., Gu, C., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+nerve-derived+VEGF+promotes+arterial+differentiation+via+neuropilin+1-mediated+positive+feedback%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Peripheral nerve-derived VEGF promotes arterial differentiation via neuropilin 1-mediated positive feedback.</a> Development. 132, 941-952 (2005).</li>
<li>Mukouyama, Y. S., Shin, D., Britsch, S., Taniguchi, M., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+nerves+determine+the+pattern+of+arterial+differentiation+and+blood+vessel+branching+in+the+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Sensory nerves determine the pattern of arterial differentiation and blood vessel branching in the skin.</a> Cell. 109, 693-705 (2002).</li>
<li>Murphy, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+Notch4+signaling+induces+hallmarks+of+brain+arteriovenous+malformations+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Endothelial Notch4 signaling induces hallmarks of brain arteriovenous malformations in mice.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 10901-10906 (2008).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Barwienie całych preparatów (whole-mount) oraz barwienie PECAM-1 (CD31) na przekrojach to konwencjonalne metody znakowania naczyń krwionośnych u embrionów myszy. Metody te wymagają zastosowania bezpośredniej i/lub pośredniej immunofluorescencji oraz detergentów do permeabilizacji tkanki mysiej, co okazuje się procesem dość czasochłonne. W niniejszym protokole zastosowaliśmy wstrzyknięcia do żyły twarzowej FITC-dekstranu lub izolektyny B4 w celu bezpośredniego znakowania naczyń krwionośnych embrionu, co eliminu...

<table><tbody><tr><td>dekstran FITC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FD150S-1G</td><td></td></tr><tr><td>Izolektyna B GSL 1 znakowana fluoresceiną&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Vector Laboratories</td><td>FL-1201</td><td></td></tr><tr><td>Fast Green</td><td>MP Biomedicals</td><td>195178</td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>Fluka</td><td>76240</td><td></td></tr><tr><td>Surowica z płodu bydlęcego</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11550</td><td></td></tr><tr><td>Optimal Cutting Temperature Compound (O.C.T.</td><td>VWR international</td><td>25608-930</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>JT Baker</td><td>9006-33</td><td></td></tr><tr><td>Surowica osia osiołka</td><td>Jackson</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało szczurze przeciwko mysiemu CD31,</td><td>BD Biosciences</td><td>558736</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało kozie przeciwko mysiemu PDGFR-&amp;#946;</td><td>R&amp;R&D Systems</td><td>AF1042</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało osioła przeciwko szczuremu CD31 Alexa 647 (Invitrogen) </td><td>Biolegend</td><td>102516</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało osiołkowe przeciwko kozim Alexa 594 (Invitrogen)</td><td>Invitrogen</td><td>A11058</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X-100</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza niskotopliwa/PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9414-25G</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A413-4</td><td></td></tr><tr><td>Alkohol benzylowy</td><td>Acros Organics</td><td>148390010</td><td></td></tr><tr><td>Benzozan benzylu</td><td>Acros Organics</td><td>105860010</td><td></td></tr><tr><td>Slajdy dotyczące depresji</td><td>Fisher Scientific</td><td>S175201</td><td></td></tr><tr><td>Fluorogel </td><td>Nauki o Mikroskopii Elektronowej</td><td>17985-10</td><td></td></tr><tr><td>szkiełko cover glass (22X22)-1.5</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>152222</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny Zeiss LSM 510 Meta</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinceta do mikrodyssekcji </td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5135</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm No. OM992</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-374-16</td><td></td></tr><tr><td>mikropłytki 12- i 24-dołkowe</td><td>Evergreen Scientific</td><td>222-8044-01F</td><td></td></tr><tr><td>Przedmioty szkiełka Superfrost/Plus</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>przezroczyste fiolki 4 ml</td><td>Krajowa Firma Naukowa</td><td>B7800-2</td><td></td></tr></tbody></table>

metoda znakowania naczyń krwionośnych u embrionów myszy

A Method for Labeling Vasculature in Embryonic Mice

Utworzenie funkcjonalnej sieci naczyń krwionośnych jest kluczowym elementem organogenezy i jest niezbędne do optymalnego funkcjonowania narządu. Na przykład w grasicy prawidłowy proces tworzenia i rozmieszczenia naczyń krwionośnych jest niezbędny dla wniknięcia tymocytów do narządu oraz wyjścia dojrzałych limfocytów T do obwodu. Przestrzenny układ naczyń krwionośnych w grasicy zależy od sygnałów pochodzących z lokalnego mikrośrodowiska, a mianowicie z komórek nabłonkowych grasicy (TEC). Kilka niedawnych doniesień sugeruje, że zaburzenia tych sygnałów prowadzą do wad naczyń krwionośnych grasicy 1,2. Wcześniejsze badania opisały techniki stosowane do znakowania naczyń krwionośnych grasicy u noworodków i osobników dorosłych 1,2. Przedstawiamy tutaj technikę znakowania naczyń krwionośnych w embrionalnej grasicy. Metoda ta łączy zastosowanie iniekcji do żyły twarzowej z użyciem dekstranu-FITC lub lektyny z Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia I (GSL 1 – izolektyna B4) oraz barwienia przeciwciałem anty-CD31 w celu identyfikacji struktur naczyniowych grasicy i przeciwciałem anty-PDGFR-β do znakowania okołonaczyniowej mezenchymy grasicy 3-5. Przedstawiono również możliwość zastosowania krioprzekrojów lub przekrojów wykonanych za pomocą wibrotomu. Protokół ten może być wykorzystany do identyfikacji wad naczyniowych grasicy, co jest kluczowe dla zdefiniowania roli cząsteczek pochodzących z TEC w tworzeniu naczyń krwionośnych grasicy. Ponieważ metoda ta znakuje cały układ naczyniowy, może być ona również stosowana do analizy sieci naczyniowych w wielu narządach i tkankach embrionu, w tym w skórze i sercu 6-10.

Niniejszy artykuł opisuje metodę znakowania naczyń krwionośnych w skórze zarodkowej i grasicy.

Metoda znakowania naczyń krwionośnych u embrionów myszy

Uformowanie funkcjonalnej sieci naczyń krwionośnych jest kluczowym elementem organogenezy i jest niezbędne dla optymalnego funkcjonowania narządów. Na przykład w...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest określenie wpływu konkretnych mutacji genetycznych na rozwój i strukturę naczyń krwionośnych. Osiąga się to poprzez jednoczesną dyssekcję zarodka oraz tkanek pozazarodkowych w celu przygotowania odpowiedniej próbki do iniekcji. Następnie do żyły twarzowej wstrzykuje się barwnik fluorescencyjny, aby oznakować nienaruszoną sieć naczyń.Następnie zarodek jest przygotowywany do analizy. Na koniec wykonuje się preparaty całych organów lub przekroje znakowanych naczyń krwionośnych, aby obrazować trójwymiarową strukturę prawidłowych naczyń w oparciu o mikroskopię immunofluorescencyjną całych preparatów lub sekcji tkanek. Po raz pierwszy opracowałem tę metodę, gdy byłem zainteresowany ustaleniem punktu czasowego rozwoju, w którym naczynia obwodowe łączą się z grasicą w procesie angiogenezy.Aby rozpocząć, należy przygotować FXI dextran lub GS L one I selectin B four w PBS w probówce typu eppendorf o pojemności 1,5 ml. Do FXI dextranu należy dodać 100 µL roztworu stokowego 1,25 mM fast green w PBS, a do GS L one I selectin B four 180 µL, tak aby roztwory miały widoczny niebieski kolor. Następnie probówkę należy ogrzać do 37 °C.Wypreparuj zarodki w dn

a-method-for-labeling-vasculature-in-embryonic-mice

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Metoda oznaczania naczyń krwionośnych u myszy embrionalnych

Przedstawiamy metodę immunohistochemii całego preparatu oraz konfokalnej mikroskopii skaningowej z wielokrotnym znakowaniem w celu analizy tworzenia złożonej sieci naczyniowej w skórze kończyny zarodka myszy.

Analiza immunohistochemiczna całego preparatu dla naczyń krwionośnych skóry kończyny zarodkowej: model systemowy do badania morfogenezy rozgałęzień naczyniowych w zarodku

Mysia siatkówka noworodka dostarcza dobrze scharakteryzowanego fizjologicznego modelu angiogenezy, który pozwala na badanie ról różnych genów lub leków modulujących angiogenezę w kontekście in vivo. Barwienie immunofluorescencyjne w celu dokładnej wizualizacji splotu naczyniowego ma kluczowe znaczenie dla powodzenia tego typu badań.

Barwienie immunofluorescencyjne siatkówki noworodka myszy w celu zbadania angiogenezy in vivo

Opisujemy szereg metod wstrzykiwania barwników, wektorów DNA, wirusów i komórek w celu monitorowania zarówno losu komórek, jak i fenotypu endogennych i szczepionych komórek pochodzących z komórek embrionalnych lub pluripotencjalnych w embrionalnych zarodkach myszy w dniu embrionalnym (E)9.5 i późniejszych etapach rozwoju.

Znakowanie i wstrzykiwanie komórek w rozwijających się embrionalnych sercach myszy

Ten protokół opisuje technikę oceny zmian w unaczynieniu matki podczas ciąży u myszy. Za pomocą metod stereologicznych ocenia się ilościowo przebudowę dziesiętnych tętnic spiralnych, a wyniki potwierdza się jakościowo za pomocą immunohistochemii.

Ocena przebudowy naczyń krwionośnych matki w czasie ciąży w macicy myszy

Ten protokół demonstruje metodę opartą na fluorescencji do wizualizacji układu naczyniowego i ilościowego określenia jego złożoności u Xenopus tropicalis. Naczynia krwionośne można obrazować kilka minut po wstrzyknięciu barwnika fluorescencyjnego do bijącego serca zarodka po manipulacjach genetycznych i/lub farmakologicznych w celu zbadania rozwoju układu sercowo-naczyniowego in vivo.

Wizualizacja i analiza ilościowa angiogenezy embrionalnej u Xenopus tropicalis

Ta praca demonstruje nowatorskie podejście do oceny proliferacji, różnicowania i potencjału tworzenia naczyń krwionośnych komórek macierzystych śródbłonka (VESCs) poprzez przeszczep poduszeczki tłuszczowej sutka, a następnie przygotowanie całej tkanki do obserwacji mikroskopowej. Przedstawiono również strategię śledzenia linii w celu zbadania zachowania VESC in vivo.

Nowatorska technika przeszczepu poduszeczki tłuszczowej sutka w celu wizualizacji wytwarzania naczyń krwionośnych śródbłonka

Badanie echokardiograficzne jest często stosowane u myszy. W tym celu opracowano drogie urządzenia ultrasonograficzne o wysokiej rozdzielczości. Protokół ten opisuje niedrogą procedurę echokardiograficzną połączoną z histologicznymi analizami morfometrycznymi w celu określenia morfologii serca.

Echokardiograficzne i histologiczne badanie morfologii serca u myszy

Prezentujemy protokoły do badania rozwoju serca myszy za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej na pełnych zarodkach myszy wypreparowanych z komorowych specyficznych dla komór MLC-2v-tdPomidorowych myszy reporterowych. Metoda ta pozwala nam bezpośrednio uwidocznić każdy etap powstawania komory podczas rozwoju serca myszy bez pracochłonnych metod histochemicznych.

Analiza rozwoju komory serca podczas embriogenezy myszy z wykorzystaniem epifluorescencji całej góry

Artykuł opisuje szybki protokół oznaczania naczyń krwionośnych u ryby teleost za pomocą perfuzji serca DiI rozcieńczonego w utrwalacza, używając medaka (Oryzias latipes) jako modelu i skupiając się na tkance mózgu i przysadki mózgowej.

Znakowanie naczyń krwionośnych w mózgu teleostowym i przysadce mózgowej za pomocą perfuzji serca z utrwalaczem DiI

Pokazujemy chemiczne indukowanie dużego rozszerzenia naczyń krwionośnych u myszy jako model do badania dysfunkcji naczyń mózgowych, który może być wykorzystany do modelowania demencji naczyniowej i choroby Alzheimera. Demonstrujemy również wizualizację układu naczyniowego poprzez wstrzykiwanie mieszanki kauczuku silikonowego i zapewnianie jasnych wizualnych wskazówek dotyczących pomiaru zmian wielkości naczyń krwionośnych.

Wizualne podejście do wywoływania dolichoektazji u myszy w celu modelowania dysfunkcji naczyń mózgowych za pośrednictwem dużych naczyń krwionośnych

Ten protokół wprowadza szybką metodę ilościowego trójwymiarowego obrazowania naczyń krwionośnych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z użyciem arkusza świetlnego. Skuteczność metody wykazano przy użyciu systemu tętnic łukowatych gardła w modelu zarodka pisklęcia, z siłami hemodynamicznymi określonymi ilościowo za pomocą obliczeniowej dynamiki płynów.

Szybkie obrazowanie naczyń krwionośnych małych zwierząt w całej rozdzielczości do badań ilościowych

Poznaj metodę oznaczania naczyń krwionośnych u myszy embrionalnych poprzez wstrzyknięcie fluorescencyjnego barwnika do żyły twarzowej. Technika ta umożliwia wizualizację trójwymiarowej struktury układu naczyniowego.

Metoda znakowania naczyń krwionośnych u embrionów myszy

Przeglądaj więcej filmów