Name: Nagrywanie wielkoskalowych zespołów neuronalnych za pomocą sond krzemowych u znieczulonego szczura (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 45 s
Description: Poznaj metodę nagrywania aktywności neuronalnej w korze somatosensorycznej szczura przy użyciu sond krzemowych. Technika umożliwia jednoczesne rejestrowanie ponad stu neuronów w wielu obszarach mózgu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była wspierana przez NSERC oraz AHFMR. Autorzy dziękują Mariam Alaverdashvili i Amanda Mauthe-Kaddoura za uwagi do rękopisu, a także Hiroe Yamazaki za pomoc w przygotowaniu do operacji.

1. Przygotowanie do zabiegu
<ol>
	<li>Zanurzyć szczura w narkozie, stosując odpowiedni rodzaj i dawkę środków znieczulających. W tym przypadku stosujemy uretan (1,5 g/kg, Sigma-Aldrich Co., St. Luis, MO) – przygotowany jako roztwór 20% poprzez rozpuszczenie 20 g uretanu w 10 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanowo (PBS), co oznacza, że zwierzę otrzyma dojamieniowo (IP) 7,5 ml/kg roztworu uretanu. Ze względu na krzywą dawka-odpowiedź, całkowitą dawkę uretanu podzielono na cztery aplikacje, z których każda jest oddzielona przerwą wynoszącą około 30 minut. Przed dwiema pierwszymi aplikacjami uretanu zwierzę jest znieczulane izofluranem podawanym w stężeniu 3-4% (tlen z przepływem 2 litry na minutę) i utrzymywanym na poziomie 2% (tlen do 2 litry na minutę), aby zapobiec stresowi zwierzęcia podczas wstrzykiwania. W trakcie operacji, w razie potrzeby, można zastosować dodatkową dawkę izofluranu (stężenie 2% przez 2 minuty).</li>
	<li>Ogolić futro wzdłuż miejsca nacięcia (grzbietowa strona głowy), aby upewnić się, że sierść nie zanieczyści rany i że wokół miejsca nacięcia można zdezynfekować wystarczająco duży obszar.</li>
	<li>Przygotować pole operacyjne antyseptycznie, używając organicznego jodu lub mydła z chlorheksydyną oraz środków antyseptycznych (etanolu).</li>
	<li>Przygotować sondy krzemowe (NeuroNexus Technologies, Ann Arbor, MI). Sondy można dezynfekować za pomocą 70% etanolu, a następnie płukać wodą destylowaną. W razie potrzeby sondy można oznaczyć markerem fluorescencyjnym przygotowanym antyseptycznie (np. Dye I, Invitrogen Co.), aby później ujawnić pozycję sondy w analizie histologicznej. W tym celu używamy małego i bardzo miękkiego pędzla, delikatnie dotykając tyłu sondy krzemowej barwnikiem. Procedura ta powinna być zawsze wykonywana pod mikroskopem, aby upewnić się, że sonda nie zostanie uszkodzona ani wygięta. Zawsze należy sprawdzać, czy barwnik nie blokuje żadnego z kanałów. Wszelkie pozostałości barwnika na sondzie można później usunąć alkoholem, a następnie wypłukać wodą.</li>
	<li>Pielęgnacja elektrod krzemowych: Ze względu na niewielki rozmiar sondy krzemowe są delikatne i niezwykle podatne na złamania, nawet przy zachowaniu znacznej ostrożności. Dlatego zalecamy stałe monitorowanie potencjalnych zagrożeń, takich jak: (i) przechowywanie sond w odpowiednio wyznaczonym pudełku; (ii) zapobieganie uderzeniom lub upuszczeniu sond podczas ich przenoszenia; (iii) upewnienie się, że manipulatory stereotaktyczne są dobrze zamocowane, aby zapobiec wypadkom; (iv) podczas rejestracji do sond mogą przywierać otaczające tkanki i/lub krew. Dlatego ważne jest zachowanie ostrożności podczas wyjmowania sond po zakończeniu rejestracji. Zdecydowanie zaleca się stosowanie stałego przepływu PBS lub roztworu soli fizjologicznej; (v) zawsze należy czyścić sondy po rejestracji. Do czyszczenia sond zdecydowanie zaleca się zanurzenie ich na kilka minut w płynnym enzymatycznym środku czyszczącym (Boston, Bausch &amp; Lomb). Zawsze należy płukać sondy wodą destylowaną i odkładać je do dedykowanego pudełka. W naszym doświadczeniu odpowiednia pielęgnacja sond krzemowych zapewnia dobrą jakość rejestracji przez ponad 10 eksperymentów. Jeśli kanał „stanie się szumny” podczas użytkowania, należy go wykluczyć z późniejszych analiz. Stwierdziliśmy, że przesłuchy między kanałami są minimalne; zatem szumiący kanał zazwyczaj ma niewielki wpływ na sygnał w innych kanałach.</li>
</ol>
2. Operacja
<ol>
	<li>Przed jakimikolwiek manipulacjami chirurgicznymi na powierzchnię oka należy nanieść maść do oczu.</li>
	<li>Podaj Deksametazon 5 mg/ml podskórnie w celu zmniejszenia stanu zapalnego mózgu.</li>
	<li>Zwierzę należy unieruchomić w aparacie stereotaktycznym przez cały czas trwania operacji.</li>
	<li>Przed wykonaniem nacięcia w miejscu nacięcia podaj podskórnie Lidokainę HCl 2% z Epinefryną (2-4 mg/kg rozcieńczone do roztworu 0,5%), aby zredukować potencjalne ryzyko krwawienia rany oraz w celu znieczulenia miejscowego.</li>
	<li>Wykonaj nacięcie o długości 2 cm wzdłuż linii środkowej skóry głowy i przesuń skórę bocznie, aby odsłonić powierzchnię czaszki.</li>
	<li>Oczyść grzbietową część skóry głowy z powięzi za pomocątępej dyssekcji i opanuj krwawienie za pomocą mikrokauteryzacji lub wosku kostnego.</li>
	<li>Wywierć dwa otwory na małe śruby w kości potylicznej czaszki w celu uziemienia zwierzęcia i ustanowienia punktu odniesienia. Śruba referencyjna musi stykać się z oponą twardą. Aby zredukować szumy elektryczne podczas rejestracji, zaleca się, aby śruby były przez cały czas wilgotne. W tym celu można zbudować niewielką barierę akrylową wokół śrub lub pokryć śruby agarem.</li>
	<li>Wykonaj kraniotomię o średnicy 1-2 mm w współrzędnych odpowiadających obszarom korowym i/lub podkorowym zainteresowania 5. W razie potrzeby podczas kraniotomii (wiercenia otworu) używaj sprężonego powietrza do usuwania pyłu kostnego. Zapobiegaj nagrzewaniu się czaszki podczas wiercenia, aplikując krople PBS. Jeśli jest to konieczne do wprowadzenia drugiej sondy, wykonaj drugą kraniotomię. W tym filmie prezentujemy rejestrację z dwóch obszarów korowych jednocześnie, dlatego wykonano dwie kraniotomie.</li>
	<li>Zbuduj niewielką barierę z żywicy akrylowej (np.: Lang Dental Manufacturing, Co., Inc., Wheeting, IL) wokół obu kraniotomii, aby utrzymać PBS na odsłoniętej oponie twardej i zapobiec jej wysychaniu. Aplikuj PBS w sposób ciągły przez cały czas trwania eksperymentu.</li>
	<li>Otwórz oponę twardą w obu miejscach kraniotomii. Do tej manipulacji można użyć dwóch igieł (rozmiar 30 ½ G) zagiętymi końcówkami (tworzącymi haczyk).</li>
	<li>Przymocuj złącze sond krzemowych do manipulatorów stereotaktycznych. Złącza są mocowane do słupka, aby trzpienie sond były idealnie równoległe do manipulatora stereotaktycznego. Jest to kluczowe dla zachowania stabilności rejestracji i uniknięcia uszkodzenia sond.</li>
	<li>Połącz śrubę referencyjną z pinem referencyjnym sondy krzemowej. Aby zredukować szumy elektryczne, śruby uziemiające muszą być połączone z: i) masą wtyczki sondy; ii) masą obudowy urządzenia rejestrującego; oraz iii) aparatem stereotaktycznym.</li>
	<li>Umieść końcówkę sond krzemowych tak, aby stykała się z oponą miękką.</li>
	<li>Powoli wprowadzaj sondy krzemowe i upewnij się, że trzpienie sond krzemowych (Ryc. 1 i 2) mogą zostać wprowadzone do mózgu bez oporu lub wyginania.</li>
	<li>Ostrożnie obniżaj sondy, aż dotrą do pożądanego obszaru rejestracji. W razie potrzeby dodawaj krople PBS na wierzch kraniotomii, aby uniknąć wysychania tkanki.</li>
	<li>Ponieważ znieczulenie uretanem powinno być stosowane wyłącznie w procedurach terminalnych, zwierzę poddaje się eutanazji poprzez wtryśnięcie do jamy otrzewnowej co najmniej 20 mg/kg pentobarbitalu sodowego rozcieńczonego do stężenia nie wyższego niż 60 mg/ml. Następnie wykonuje się dekapitację zwierzęcia.</li>
</ol>
3. Reprezentatywne wyniki:
Reprezentatywne zapisy potencjałów polowych oraz aktywności impulsowej przedstawiono na rysunku 3A. Po przeprowadzeniu sortowania impulsów (rozróżnianiu impulsów pochodzących z różnych neuronów; Rys. 3B,C; 6, 7, 8) zapisy z sondy krzemowej umożliwiają badanie aktywności populacji neuronalnych zaangażowanych m.in. w następujące procesy: pamięć i podejmowanie decyzji 9, plastyczność 10, kodowanie bodźców 11, aktywność spontaniczną 12 oraz efekty działania różnych leków 13.
<img alt="Układ do rejestracji aktywności neuronalnej z zastosowaniem sond krzemowych; schemat przedstawiający drogi neuronalne, konstrukcję sondy oraz miejsce jej umieszczenia." src="/files/ftp_upload/3282/3282fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. A. Przykład sondy krzemowej z jednym ramieniem nałożony na montaż zrekonstruowanych neuronów (dzięki uprzejmości S. Sakaty) 14). B. Przykład sondy z konfiguracją tetrodową na każdym z 8 ramion. C. Schemat czaszki szczura. Zielone pola wyznaczają zakres kraniotomii nad prawą i lewą korą somatosensoryczną.
<img alt="Eksperyment neurobiologiczny; operacja mózgu myszy, elektrody monitorujące aktywność neuronalną, układ badawczy." src="/files/ftp_upload/3282/3282fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Przykład eksperymentu z sondami krzemowymi wprowadzonymi do przedczołowej kory mózgowej i hipokampa. Krople PBS pokrywają otwór trepanacyjny, aby chronić odsłoniętą tkankę mózgową przed wysychaniem. Dwie śruby umieszczone nad móżdżkiem zostaną podłączone odpowiednio do uziemienia i elektrody referencyjnej.
<img alt="Analiza wielokanałowych widm absorpcji przejściowej; wykres przedstawiający korelację energii i ewolucję czasową." src="/files/ftp_upload/3282/3282fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. A. Rysunek przedstawia 50 ms reprezentatywnego zapisu elektrofizjologicznego potencjału polowego (LFP) z jednej tetrody (uwaga: ujemne napięcie naniesiono w górę osi rzędnych). Wstawka przedstawia przebieg pojedynczego kolca (spike). B. Dwuwymiarowe rzuty klastrów jednostek w przestrzeni cech z jednej tetrody. Każdy klaster reprezentuje impulsy pochodzące z pojedynczej jednostki (neuronu). C. Średnie przebiegi impulsów z reprezentatywnych jednostek (oznaczonych kolorami) dla każdego z czterech miejsc rejestracji z jednej tetrody. D. Energia kształtu fali (związana z amplitudą) zarejestrowanych impulsów w czasie. Należy zwrócić uwagę na stosunkowo stałe wartości energii dla każdej jednostki; wskazuje to na stabilność rejestracji w trakcie wyświetlanego okresu.

<ol><li>Buzsaki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+recording+of+neuronal+ensembles%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Large-scale recording of neuronal ensembles.</a> Nat. Neurosci. 7, 446-451 (2004).</li>
<li>Kipke, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+neurotechnologies+for+chronic+neural+interfaces%3A+new+horizons+and+clinical+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Advanced neurotechnologies for chronic neural interfaces: new horizons and clinical opportunities.</a> J. Neurosci. 28, 11830-11838 (2008).</li>
<li>Csicsvari, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+parallel+recording+of+unit+and+local+field+potentials+with+silicon-based+electrodes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Massively parallel recording of unit and local field potentials with silicon-based electrodes.</a> J. Neurophysiol. 90, 1314-1323 (2003).</li>
<li>Bartho, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+neocortical+principal+cells+and+interneurons+by+network+interactions+and+extracellular+features%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of neocortical principal cells and interneurons by network interactions and extracellular features.</a> J. Neurophysiol. 92, 600-608 (2004).</li>
<li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+rat+brain%3A+in+stereotaxic+coordinates%22">The rat brain: in stereotaxic coordinates</a>. , 4th Edition, Academic Press. San Diego. (1998).</li>
<li>Lewicki, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+methods+for+spike+sorting%3A+the+detection+and+classification+of+neural+action+potentials%5BTitle%5D)+AND+%22Network%22%5BJournal%5D)">A review of methods for spike sorting: the detection and classification of neural action potentials.</a> Network. 9, R53-R78 (1998).</li>
<li>Harris, K. D., Henze, D. A., Csicsvari, J., Hirase, H., Buzsaki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accuracy+of+tetrode+spike+separation+as+determined+by+simultaneous+intracellular+and+extracellular+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Accuracy of tetrode spike separation as determined by simultaneous intracellular and extracellular measurements.</a> J. Neurophysiol. 84, 401-414 (2000).</li>
<li>Luczak, A., Narayanan, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+representation--analyzing+single-unit+activity+in+extracellularly+recorded+neuronal+data+without+spike+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Spectral representation--analyzing single-unit activity in extracellularly recorded neuronal data without spike sorting.</a> J. Neurosci. Methods. 144, 53-61 (2005).</li>
<li>Pastalkova, E., Itskov, V., Amarasingham, A., Buzsaki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Internally+generated+cell+assembly+sequences+in+the+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Internally generated cell assembly sequences in the rat hippocampus.</a> Science. 321, 1322-1327 (2008).</li>
<li>Fujisawa, S., Amarasingham, A., Harrison, M. T., Buzsaki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavior-dependent+short-term+assembly+dynamics+in+the+medial+prefrontal+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Behavior-dependent short-term assembly dynamics in the medial prefrontal cortex.</a> Nat Neurosci. 11, 823-833 (2008).</li>
<li>Harris, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+do+neurons+work+together%3F+Lessons+from+auditory+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Hear.+Res%22%5BJournal%5D)">How do neurons work together? Lessons from auditory cortex.</a> Hear. Res. 271, 37-53 (2011).</li>
<li>Luczak, A., Bartho, P., Marguet, S. L., Buzsaki, G., Harris, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+structure+of+neocortical+spontaneous+activity+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Sequential structure of neocortical spontaneous activity in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 347-352 (2007).</li>
<li>Robbe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cannabinoids+reveal+importance+of+spike+timing+coordination+in+hippocampal+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cannabinoids reveal importance of spike timing coordination in hippocampal function.</a> Nat. Neurosci. 9, 1526-1533 (2006).</li>
<li>Sakata, S., Harris, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminar+structure+of+spontaneous+and+sensory-evoked+population+activity+in+auditory+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Laminar structure of spontaneous and sensory-evoked population activity in auditory cortex.</a> Neuron. 64, 404-418 (2009).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Niniejszy artykuł demonstruje sposób wykorzystania krzemowych macierzy elektrod do rejestracji aktywności z dużej populacji neuronów (&gt;100) w wielu obszarach kory mózgowej jednocześnie. Aby zapewnić powodzenie zabiegu chirurgicznego oraz rejestracji, należy wziąć pod uwagę następujące kwestie:

<ol>
<li>Wprowadzanie sond do pożądanego obszaru: Wprowadzanie sond do tkanki mózgowej może spowodować znaczne uszkodzenia, co z kolei może skutkować niską jakością zarejestrowanych jednostek. Aby uniknąć tego problemu, zaleca się następujące działania: (i) wprowadzanie sond pod pewnym kątem (zalecany kąt 10 stopni), co pozwala zredukować uszkodzenia dendrytów rejestrowanych neuronów; (ii) po wprowadzeniu sond do tkanki mózgowej, początkowo obniża się je z większą prędkością (około 50 do 100 mikronów na 10-30 s), aż znajdą się w pobliżu pożądanego obszaru rejestracji. Gdy sondy znajdują się około 200 mikronów od obszaru docelowego, pozycję koryguje się wolniej (około 10 mikronów co 2 lub 3 minuty).</li>

<li>Stabilizacja rejestracji: Gdy sondy znajdują się w wyznaczonym obszarze i zostanie wykryta znaczna aktywność (wyraźne impulsy w większości kanałów), zaleca się odczekanie około 30 minut przed rozpoczęciem rejestracji. Pozwoli to tkance mózgowej na mechaniczną stabilizację po wprowadzeniu sond i zapewni stabilniejszy zapis.</li>

<li>Pulsacja mózgu: Okazyjnie może wystąpić pulsacja mózgu, która może znacząco obniżyć jakość rejestracji. Mała kraniotomia (wystarczająca przestrzeń, aby zmieścić sondę) może zredukować pulsację mózgu w obszarze rejestracji. W razie potrzeby można wykonać nakłucie cysterny wielkiej (cisterna magna), co zmniejsza ciśnienie płynu mózgowo-rdzeniowego oraz ogranicza obrzęk i pulsację.</li>

<li>Konfiguracja sondy krzemowej: Sondy krzemowe mogą mieć różne kształty i konfiguracje miejsc rejestracji. Mogą się one różnić na przykład liczbą trzpieni, ich długością i grubością oraz rozmieszczeniem miejsc rejestracji (np. konfiguracja tetrodowa versus liniowa; patrz:
www.neuronexustech.com). Wybór konkretnej konfiguracji sondy zależy od pytania badawczego, na które należy odpowiedzieć. Na przykład, jeśli celem jest rejestracja populacji neuronów w wielu lokalizacjach w jednej konkretnej warstwie (jak przedstawiono w tych rejestracjach), najlepszym wyborem jest użycie sondy z ośmioma trzpieniami w konfiguracji tetrodowej. Pozwala to na rejestrację wielu pojedynczych jednostek w każdej tetrodzie i próbkowanie ośmiu lokalizacji w zakresie 1.4 mm. W innym przypadku, jeśli celem jest badanie propagacji aktywności przez warstwy kory, najlepszym wyborem byłaby sonda z jednym trzpieniem z regularnie rozmieszczonymi miejscami rejestracji wzdłuż tego trzpienia, co umożliwia jednoczesną rejestrację w wielu warstwach kory 14.</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Uretan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bufor fosforanowo-solny (PBS)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Izofluran</td><td>Benson Medical Instruments</td><td>02241315</td><td></td></tr><tr><td>Sondy krzemowe </td><td>NeuroNexus Technologies</td><td>A 4 X 2 - Tet - 5mm - 150 - 200 &amp;#8211; 312</td><td></td></tr><tr><td>Barwnik I (DiIC18)&lt;sub&gt;18&lt;/sub&gt;(3))</td><td>Invitrogen</td><td>617830</td><td></td></tr><tr><td>Deksametazon 5</td><td>V&amp;eacute;toquinol</td><td>0A0640B</td><td></td></tr><tr><td>Maść do oczu</td><td>V&amp;eacute;tokinol</td><td>005165414</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek lidokainy 2% z epinefryną </td><td>Bimeda-MTC</td><td>00141984</td><td></td></tr><tr><td>Stereotaksometr</td><td>Kopf Instruments</td><td>1430-B</td><td></td></tr><tr><td>Manipulator i uchwyt elektrody</td><td>Kopf Instruments</td><td>960</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyty do uszu szczurów</td><td>Kopf Instruments</td><td>1955</td><td></td></tr><tr><td>Adaptor szczurzy</td><td>Kopf Instruments</td><td>920</td><td></td></tr><tr><td>Maska anestezjologiczna</td><td>Kopf Instruments</td><td>906</td><td></td></tr><tr><td>Skalpel</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-9843</td><td></td></tr><tr><td>Ostrza skalpela</td><td>Paragon</td><td>0086</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki do mikrodysekcji </td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5910</td><td></td></tr><tr><td>Śruby</td><td>Gould Pasteners Limited</td><td>14084701</td><td></td></tr><tr><td>Kleszczyki hemostatyczne</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-7130 RS-7211</td><td></td></tr><tr><td>30&amp;frac12; igły o określonej średnicy (gauge)</td><td>BD Biosciences</td><td>305115</td><td></td></tr><tr><td>Sterowanie mikrosilnikiem</td><td>Wstęp</td><td>HP4-917</td><td></td></tr><tr><td>Pęseta anatomiczna</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5237</td><td></td></tr><tr><td>Wosk kostny</td><td>Lukens</td><td>M263500</td><td></td></tr><tr><td>Butla ze sprężonym powietrzem</td><td>Falcon BD</td><td>50-10521C</td><td></td></tr><tr><td>Środek czyszczący enzymatyczny </td><td>Bausch and Lomb</td><td>BAUSCH497628</td><td></td></tr><tr><td>Woda destylowana </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Proszek akrylowy stomatologiczny</td><td>Lang Dental</td><td>1220</td><td></td></tr><tr><td>Płyn akrylowy stomatologiczny</td><td>Lang Dental</td><td>1404</td><td></td></tr><tr><td>System Digital Lynx SX</td><td>Neuralynx Inc.</td><td>4SX-Z400</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie Cheeta</td><td>Neuralynx Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Przewody z krokodylkami </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

rejestracja wielkoskalowych zespołów neuronalnych za pomocą sond krzemowych u znieczulonego szczura

Recording Large-scale Neuronal Ensembles with Silicon Probes in the Anesthetized Rat

Elektrofizjologiczne rejestracje na dużą skalę z zespołów neuronalnych stwarzają możliwość zbadania, w jaki sposób mózg organizuje szeroką gamę zachowań na podstawie aktywności impulsowej swoich neuronów. Jedną z najskuteczniejszych metod monitorowania aktywności impulsowej dużej liczby neuronów w wielu lokalnych obwodach neuronalnych jednocześnie jest zastosowanie krzemowych mat elektrod1-3.
Potencjały czynnościowe powodują znaczne zmiany napięcia przezbłonowego w okolicy ciał komórek. Sygnały wyjściowe te można mierzyć, umieszczając przewodnik w bliskim sąsiedztwie neuronu. Jeśli w pobliżu końcówki znajduje się wiele aktywnych (generujących impulsy) neuronów, elektroda rejestruje połączony sygnał od wszystkich z nich, przy czym wkład pojedynczego neuronu jest ważony przez jego „odległość elektryczną”. Sondy krzemowe są idealnymi elektrodami rejestrującymi do monitorowania wielu neuronów ze względu na dużą liczbę miejsc rejestracji (+64) oraz małą objętość. Co więcej, wiele miejsc może być rozmieszczonych na odcinku kilku milimetrów, co pozwala na jednoczesną rejestrację aktywności neuronalnej w różnych warstwach kory lub w wielu kolumnach korowych (Rys. 1). Co istotne, geometrycznie precyzyjny rozkład miejsc rejestracji pozwala również na określenie relacji przestrzennych odizolowanych pojedynczych neuronów4. W niniejszej pracy opisujemy metodę ostrej, wielkoskalowej rejestracji neuronalnej z lewej i prawej kory somatosensorycznej przedniej kończyny jednocześnie u znieczulonego szczura z wykorzystaniem sond krzemowych (Rys. 2).

Opisane zostaną zewnątrzkomórkowe rejestracje aktywności neuronalnej z wykorzystaniem sond krzemowych u znieczulonego szczura. Technika ta pozwala na pozyskiwanie informacji z wielu obszarów mózgu od ponad 100 neuronów jednocześnie. Dostarcza ona informacji z rozdzielczością pojedynczych komórek na temat dynamiki zespołów neuronalnych w wielu obwodach lokalnych.

Rejestracja wielkoskalowych zespołów neuronalnych za pomocą sond krzemowych u znieczulonego szczura

Elektrofizjologiczne rejestracje wielkoskalowe z zespołów neuronalnych stwarzają możliwość zbadania, w jaki sposób mózg koordynuje szeroką gamę...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest opis ostrego, wielkoskalowego zapisu neuronalnego z lewej i prawej kory somatosensorycznej kończyn przednich, przeprowadzonego jednocześnie u znieczulonego szczura przy użyciu sondy krzemowej. Cel ten jest realizowany poprzez uprzednie znieczulenie zwierzęcia uretanem, a następnie umieszczenie szczura w aparacie stereotaktycznym w celu wykonania nacięcia czaszki o długości od dwóch do trzech centymetrów. Drugim krokiem jest umieszczenie śrub uziemiającej i referencyjnej.Następnie wykonuje się dwie kraniotomie nad korą somatosensoryczną i usuwa oponę twardą. Ostatnim krokiem jest ostrożne wprowadzenie sond silikonowych do mózgu i powolne opuszczanie ich do pożądanej obszaru. Procedura ta umożliwia rejestrację lokalnych potencjałów polowych oraz aktywności impulsowej kilkudziesięciu neuronów.Główną zaletą tej techniki jest to, że sondy silikonowe pozwalają na rejestrację z dużej liczby miejsc pomiarowych. Co więcej, wiele miejsc pomiarowych można rozmieścić w odległościach liczonych w milimetrach, co umożliwia jednoczesną rejestrację z wielu kolumn korowych lub z wielu warstw w obrębie jednej kolumny korowej. Co istotne, geometrycznie precyzyjny rozkład miejsc pomiarowych pozwala na badanie relacji przestrzennych między populacjami neuronów.Niniejsza metoda może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny neuronauki, takie jak rola aktywności populacji neuronalnych w plastyczności pamięci, kodowaniu bodźców oraz podejmowaniu decyzji, a także sposób, w jaki na te interakcje neuronalne wpływają różne leki. Aby rozpocząć procedurę, znieczul szczura izofluranem w stężeniu od 3% do 4%, a następnie utrzymuj stężenie 2%, aby zapobiec stresowi zwierzęcia wywołanemu zastrzykiem. Następnie wstrzyknij dożylnie 7,5 ml/kg 20% roztworu uretanu, dzieląc tę dawkę na cztery aplikacje oddzielone od siebie odstępami wynoszącymi około 30 minut.Następnie należy oczyścić sondy silikonowe wodą destylowaną pod mikroskopem. Sondy należy oznaczyć markerem fluorescencyjnym w celu wyznaczenia ich pozycji w analizie histologicznej. Procedurę tę należy zawsze przeprowadzać pod mikroskopem, aby upewnić się, że sondy nie uległy uszkodzeniu ani wygięciu.Następnie należy ogolić sierść wzdłuż miejsca nacięcia. Potem należy zastosować maść do obu oczu. Podaje się 5 mg/ml Dexamethasone podskórnie w celu zmniejszenia stanu zapalnego mózgu.W tym momencie unieruchom zwierzę w aparacie stereotaksycznym. Następnie przygotuj pole operacyjne w sposób antyseptyczny, używając mydła z chlorheksydyną i etanolu. Przed wykonaniem nacięcia podaj lidokainę i epinefrynę podskórnie w miejscu nacięcia w celu znieczulenia miejscowego oraz zmniejszenia potencjalnego ryzyka krwawienia. Następnie wykonaj dwucentymetrowe nacięcie wzdłuż linii środkowej skóry głowy i odsunie skórę.Aby odsłonić czaszkę, oddziel skórę i tkanki podskórne grzbietu od powięzi za pomocą tępej dyssekcji, a krwawienie opanuj przy użyciu wosku kostnego. Następnie wywierć dwa otwory w kości potylicznej czaszki. W otworach zamocuj małe śruby, które posłużą jako elektrody uziemiające i referencyjne.Śruba referencyjna musi stykać się z oponą twardą. Następnie należy wykonać dwie kraniotomie o średnicy od jednego do dwóch milimetrów w współrzędnych odpowiadających korze somatosensorycznej kończyny przedniej.W razie potrzeby podczas kraniotomii należy użyć sprężonego powietrza do usunięcia pyłu kostnego, aby zapobiec nagrzewaniu się czaszki w wyniku wiercenia. Należy zakroplić roztwór soli fizjologicznej. Następnie należy zbudować niewielką barierę z żywicy akrylowej wokół obu otworów kraniotomii, aby utrzymać PBS na powierzchni odsłoniętej opony twardej i zapobiec jej wysychaniu.Przez cały czas trwania eksperymentu stale aplikuj PBS. Następnie użyj dwóch igieł o rozmiarze 30,5 G z zagiętymi końcówkami, aby usunąć oponę twardą z obu kraniotomii. W tym momencie umieść końcówki sondy silikonowej tak, aby stykały się z oponą miękką.Następnie powoli wprowadzaj sondy krzemowe, upewniając się, że ich trzpienie mogą zostać wstawione do mózgu bez oporu i wygięcia. Ostrożnie opuszczaj sondy, aż dotrą do pożądanych obszarów rejestracji. W razie potrzeby dodaj krople PBS na wierzch kraniotomii, aby zapobiec wysychaniu tkanki.Przedstawiono tutaj reprezentatywny zapis elektrofizjologiczny lokalnego potencjału polowego z okresu 500 milisekund z jednej tetrody. Przykład kształtu fali kolca znajduje się na dołączonym wstawieniu. Poniżej przedstawiono przykłady dwuwymiarowych widoków klastrów jednostek uzyskanych z jednej tetrody.Każdy klaster reprezentuje impulsy pochodzące z jednego neuronu. Przedstawiono tutaj uśrednione kształty fal impulsów z reprezentatywnych jednostek z każdego z czterech kanałów pojedynczej tetrody. Na tym wykresie przedstawiono energię kształtu fali zarejestrowanych impulsów w czasie.Należy zauważyć, że stosunkowo stała wartość energii dla każdej jednostki wskazuje na stabilny zapis w wyświetlonym okresie. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo być w stanie przeprowadzić rejestrację za pomocą sondy krzemowej w wielu obszarach mózgu z ponad stu neuronów jednocześnie. Osiąga się to poprzez wykonanie następujących kroków: znieczulenie zwierzęcia, umieszczenie śrub referencyjnych i uziemiających, wykonanie kraniotomii, usunięcie opony twardej, a na koniec wprowadzenie sond do pożądanego obszaru rejestracji.

recording-large-scale-neuronal-ensembles-with-silicon-probes

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Rejestrowanie dużych zespołów neuronów za pomocą sond krzemoorganowych u anestetyzowanej szczurzy

Opisujemy metody wielkoskalowej rejestracji wielu pojedynczych jednostek oraz lokalnych potencjałów polowych u gryzoni podczas zachowań, z wykorzystaniem sond krzemowych. Procesy wykonania napędu, mocowania sondy do napędu oraz implantacji sondy zostały przedstawione w wystarczających szczegółach, aby umożliwić łatwą replikację.

Wielkoskalowa rejestracja neuronów za pomocą ruchomych sond krzemowych u gryzoni podczas zachowań

Ten film demonstruje szczegółową procedurę przygotowania znieczulonego szczura do elektrofizjologicznych zapisów aktywności mózgu z wielu miejsc. Skóra głowy jest preparowana w celu uzyskania dostępu do czaszki, a otwory są wiercone w precyzyjnych miejscach, aby zainstalować i zabezpieczyć elektrody. Elektrody wolframowe są następnie umieszczane w docelowym miejscu w celu zarejestrowania danych.

Elektrofizjologiczne zapisy in vivo aktywności mózgu z wielu miejsc u szczurów

Ten film przedstawia protokół wszczepienia wielozębowej liniowej sondy krzemowej do mózgu myszy w celu pomiaru lokalnych potencjałów pola. Procedura polega na przymocowaniu sondy do jednostki stereotaktycznej, ustawieniu jej dokładnie nad docelowym obszarem mózgu, wprowadzeniu jej do mózgu i zabezpieczeniu cementem dentystycznym. Po implantacji zespół zabezpieczany jest obudową. Po powrocie do zdrowia konfiguracja pozwala na rejestrowanie lokalnych potencjałów pola, zapewniając wgląd w...

Rejestrowanie aktywności elektrycznej mózgu u zachowujących się myszy za pomocą liniowych sond krzemowych z wieloma zębami

Źródło: Moore, J. D., et al. Juxtacellular Monitoring and Localization of Single Neurons within Sub-cortical Brain Structures of Alert, Head-restricted Rats. J. Vis. Exp. (2015)Ten film pokazuje metodę zestawiania nagrań komórkowych i barwienia u skrępowanego, przytomnego szczura. Zabieg polega na rejestrowaniu sygnałów z neuronów i wstrzykiwaniu barwnika w celu precyzyjnej lokalizacji miejsca zapisu. Technika ta pozwala na dokładne odwzorowanie aktywności neuronalnej na anatomiczną strukturę...

Zapis i barwienie Juxtacellular w celu precyzyjnego mapowania aktywności neuronalnej u obudzonego szczura 

Wszczepianie zorganizowanych układów mikroprzewodów do użycia w jednojednostkowych zapisach elektrofizjologicznych stanowi szereg wyzwań technicznych. Opisano również metody wykonywania tej techniki i niezbędny sprzęt. Omówiono również korzystne wykorzystanie zorganizowanych układów mikroprzewodów do nagrywania z różnych podregionów neuronowych o wysokiej selektywności przestrzennej.

Procedura wszczepiania zorganizowanych układów mikroprzewodów do nagrań pojedynczych jednostek u obudzonych, zachowujących się zwierząt

Ten protokół opisuje projektowanie i chirurgiczne wszczepienie mechanizmu krępującego głowę do monitorowania aktywności neuronalnej w podkorowych strukturach mózgu u szczurów czujnych.  Wyznacza procedury izolowania pojedynczych neuronów w konfiguracji przyściennej i skutecznego identyfikowania ich lokalizacji anatomicznych.

Monitorowanie i lokalizacja pojedynczych neuronów w podkorowych strukturach mózgu czujnych, skrępowanych głową szczurów

Wprowadzono bezprzewodowy, dwukierunkowy system do wielokanałowych zapisów neuronowych i stymulacji u swobodnie zachowujących się szczurów. System jest lekki i kompaktowy, dzięki czemu ma minimalny wpływ na repertuar behawioralny zwierzęcia. Co więcej, ten dwukierunkowy system zapewnia wyrafinowane narzędzie do oceny związków przyczynowo-skutkowych między wzorcami aktywacji mózgu a zachowaniem.

Bezprzewodowy, dwukierunkowy interfejs do rejestrowania in vivo i stymulacji aktywności neuronalnej u swobodnie zachowujących się szczurów

Opisujemy różne etapy wszczepiania przewlekłych sond silikonowych i rejestrowania komórek miejsca u myszy, które biegają z głową na bieżni wzbogaconej o wskazówki.

Wszczepienie przewlekłych sond krzemowych i zapis komórek miejsca hipokampa we wzbogaconym aparacie bieżni

Ten protokół opisuje rejestrację lokalnych potencjałów pola za pomocą wielozębowych liniowych sond krzemowych. Konwersja sygnałów za pomocą analizy gęstości źródła prądu pozwala na rekonstrukcję lokalnej aktywności elektrycznej w hipokampie myszy. Dzięki tej technice można badać ograniczone przestrzennie oscylacje mózgu u swobodnie poruszających się myszy.

Rejestrowanie przestrzennie ograniczonych oscylacji w hipokampie zachowujących się myszy

Opisujemy tutaj metodę wytwarzania matryc mikroelektrod Ti3C2 MXene i wykorzystywania ich do rejestracji neuronowej in vivo.

Produkcja matryc mikroelektrod Ti3C2 MXene do rejestracji neuronowej in vivo

Tutaj przedstawiamy lekki, opłacalny system implantacji sond dla przewlekłej elektrofizjologii u gryzoni, zoptymalizowany pod kątem łatwości użycia, odzyskiwania sondy, wszechstronności eksperymentalnej oraz zgodności z zachowaniem.

Implant DREAM: lekki, modułowy i opłacalny system implantów do przewlekłej elektrofizjologii u myszy zamocowanych na głowie i swobodnie zachowujących się

Poznaj metodę nagrywania aktywności neuronalnej w korze somatosensorycznej szczura przy użyciu sond krzemowych. Technika umożliwia jednoczesne rejestrowanie ponad stu neuronów w wielu obszarach mózgu.

Rejestracja wielkoskalowych zespołów neuronalnych za pomocą sond krzemowych u znieczulonego szczura

Przeglądaj więcej filmów