Rejestracja wielkoskalowych zespołów neuronalnych za pomocą sond krzemowych u znieczulonego szczura
19 października 2011
Opisane zostaną zewnątrzkomórkowe rejestracje aktywności neuronalnej z wykorzystaniem sond krzemowych u znieczulonego szczura. Technika ta pozwala na pozyskiwanie informacji z wielu obszarów mózgu od ponad 100 neuronów jednocześnie. Dostarcza ona informacji z rozdzielczością pojedynczych komórek na temat dynamiki zespołów neuronalnych w wielu obwodach lokalnych.
Ogólnym celem niniejszej procedury jest opis ostrego, wielkoskalowego zapisu neuronalnego z lewej i prawej kory somatosensorycznej kończyn przednich, przeprowadzonego jednocześnie u znieczulonego szczura przy użyciu sondy krzemowej. Cel ten jest realizowany poprzez uprzednie znieczulenie zwierzęcia uretanem, a następnie umieszczenie szczura w aparacie stereotaktycznym w celu wykonania nacięcia czaszki o długości od dwóch do trzech centymetrów. Drugim krokiem jest umieszczenie śrub uziemiającej i referencyjnej.
Następnie wykonuje się dwie kraniotomie nad korą somatosensoryczną i usuwa oponę twardą. Ostatnim krokiem jest ostrożne wprowadzenie sond silikonowych do mózgu i powolne opuszczanie ich do pożądanej obszaru. Procedura ta umożliwia rejestrację lokalnych potencjałów polowych oraz aktywności impulsowej kilkudziesięciu neuronów.
Główną zaletą tej techniki jest to, że sondy silikonowe pozwalają na rejestrację z dużej liczby miejsc pomiarowych. Co więcej, wiele miejsc pomiarowych można rozmieścić w odległościach liczonych w milimetrach, co umożliwia jednoczesną rejestrację z wielu kolumn korowych lub z wielu warstw w obrębie jednej kolumny korowej. Co istotne, geometrycznie precyzyjny rozkład miejsc pomiarowych pozwala na badanie relacji przestrzennych między populacjami neuronów.
Niniejsza metoda może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny neuronauki, takie jak rola aktywności populacji neuronalnych w plastyczności pamięci, kodowaniu bodźców oraz podejmowaniu decyzji, a także sposób, w jaki na te interakcje neuronalne wpływają różne leki. Aby rozpocząć procedurę, znieczul szczura izofluranem w stężeniu od 3% do 4%, a następnie utrzymuj stężenie 2%, aby zapobiec stresowi zwierzęcia wywołanemu zastrzykiem. Następnie wstrzyknij dożylnie 7,5 ml/kg 20% roztworu uretanu, dzieląc tę dawkę na cztery aplikacje oddzielone od siebie odstępami wynoszącymi około 30 minut.
Następnie należy oczyścić sondy silikonowe wodą destylowaną pod mikroskopem. Sondy należy oznaczyć markerem fluorescencyjnym w celu wyznaczenia ich pozycji w analizie histologicznej. Procedurę tę należy zawsze przeprowadzać pod mikroskopem, aby upewnić się, że sondy nie uległy uszkodzeniu ani wygięciu.
Następnie należy ogolić sierść wzdłuż miejsca nacięcia. Potem należy zastosować maść do obu oczu. Podaje się 5 mg/ml Dexamethasone podskórnie w celu zmniejszenia stanu zapalnego mózgu.
W tym momencie unieruchom zwierzę w aparacie stereotaksycznym. Następnie przygotuj pole operacyjne w sposób antyseptyczny, używając mydła z chlorheksydyną i etanolu. Przed wykonaniem nacięcia podaj lidokainę i epinefrynę podskórnie w miejscu nacięcia w celu znieczulenia miejscowego oraz zmniejszenia potencjalnego ryzyka krwawienia. Następnie wykonaj dwucentymetrowe nacięcie wzdłuż linii środkowej skóry głowy i odsunie skórę.
Aby odsłonić czaszkę, oddziel skórę i tkanki podskórne grzbietu od powięzi za pomocą tępej dyssekcji, a krwawienie opanuj przy użyciu wosku kostnego. Następnie wywierć dwa otwory w kości potylicznej czaszki. W otworach zamocuj małe śruby, które posłużą jako elektrody uziemiające i referencyjne.
Śruba referencyjna musi stykać się z oponą twardą. Następnie należy wykonać dwie kraniotomie o średnicy od jednego do dwóch milimetrów w współrzędnych odpowiadających korze somatosensorycznej kończyny przedniej.
W razie potrzeby podczas kraniotomii należy użyć sprężonego powietrza do usunięcia pyłu kostnego, aby zapobiec nagrzewaniu się czaszki w wyniku wiercenia. Należy zakroplić roztwór soli fizjologicznej. Następnie należy zbudować niewielką barierę z żywicy akrylowej wokół obu otworów kraniotomii, aby utrzymać PBS na powierzchni odsłoniętej opony twardej i zapobiec jej wysychaniu.
Przez cały czas trwania eksperymentu stale aplikuj PBS. Następnie użyj dwóch igieł o rozmiarze 30,5 G z zagiętymi końcówkami, aby usunąć oponę twardą z obu kraniotomii. W tym momencie umieść końcówki sondy silikonowej tak, aby stykały się z oponą miękką.
Następnie powoli wprowadzaj sondy krzemowe, upewniając się, że ich trzpienie mogą zostać wstawione do mózgu bez oporu i wygięcia. Ostrożnie opuszczaj sondy, aż dotrą do pożądanych obszarów rejestracji. W razie potrzeby dodaj krople PBS na wierzch kraniotomii, aby zapobiec wysychaniu tkanki.
Przedstawiono tutaj reprezentatywny zapis elektrofizjologiczny lokalnego potencjału polowego z okresu 500 milisekund z jednej tetrody. Przykład kształtu fali kolca znajduje się na dołączonym wstawieniu. Poniżej przedstawiono przykłady dwuwymiarowych widoków klastrów jednostek uzyskanych z jednej tetrody.
Każdy klaster reprezentuje impulsy pochodzące z jednego neuronu. Przedstawiono tutaj uśrednione kształty fal impulsów z reprezentatywnych jednostek z każdego z czterech kanałów pojedynczej tetrody. Na tym wykresie przedstawiono energię kształtu fali zarejestrowanych impulsów w czasie.
Należy zauważyć, że stosunkowo stała wartość energii dla każdej jednostki wskazuje na stabilny zapis w wyświetlonym okresie. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo być w stanie przeprowadzić rejestrację za pomocą sondy krzemowej w wielu obszarach mózgu z ponad stu neuronów jednocześnie. Osiąga się to poprzez wykonanie następujących kroków: znieczulenie zwierzęcia, umieszczenie śrub referencyjnych i uziemiających, wykonanie kraniotomii, usunięcie opony twardej, a na koniec wprowadzenie sond do pożądanego obszaru rejestracji.
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje procedurę ostrego, wielkoskalowego rejestrowania aktywności neuronów z kory somatosensorycznej przedniej kończyny znieczulonych szczurów przy użyciu sond krzemowych. Technika ta umożliwia jednoczesne rejestrowanie sygnałów z ponad 100 neuronów w wielu obszarach mózgu, co pozwala na uzyskanie informacji na temat dynamiki i interakcji neuronalnych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neurobiologia
- Elektrofizjologia
- Dynamika neuronalna
Wstęp
- Sondy krzemowe umożliwiają wysokogęstościowe rejestracje z wielu neuronów.
- Zrozumienie aktywności populacji neuronalnych jest kluczowe dla uzyskania wiedzy na temat pamięci, kodowania i podejmowania decyzji.
- Techniki rejestracji mogą być pod wpływem różnych czynników, w tym anestezji i precyzji chirurgicznej.
- Rejestracje wielkoskalowe mogą ujawnić zależności przestrzenne między populacjami neuronalnymi.
Cel badania
- Zaprezentowanie metody rejestracji aktywności neuronalnej w korze somatosensorycznej.
- Zbadanie, w jaki sposób oddziaływania neuronalne wpływają na funkcje poznawcze.
- Przedstawienie szczegółowego protokołu dla badaczy zainteresowanych badaniami elektrofizjologicznymi.
Zastosowane metody
- Znieczulenie szczura uretanem i izofluranem.
- Umieszczenie zwierzęcia w aparacie stereotaksycznym w celu przeprowadzenia precyzyjnego zabiegu chirurgicznego.
- Wykonanie kraniotomii i wprowadzenie sond krzemowych do kory mózgowej.
- Rejestracja potencjałów polowych oraz aktywności impulsowej neuronów.
Główne wyniki
- Pomyślne rejestracje z wielu neuronów w różnych warstwach kory mózgowej.
- Wykazana stabilność rejestracji w czasie.
- Przedstawione przykłady danych elektrofizjologicznych zebranych podczas procedury.
- Wskazano zalety stosowania sond krzemowych w wielkoskalowych rejestracjach.
Wnioski
- Metoda ta pozwala na kompleksową analizę aktywności neuronalnej.
- Może ona pomóc w odpowiedzi na istotne pytania z zakresu neuronauki dotyczące interakcji neuronalnych.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tej technice w celu zgłębienia różnych zjawisk neurologicznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Rejestracje z wykorzystaniem wielokanałowych sond krzemowych w korze mózgu znieczulonych szczurów umożliwiają wysokorozdzielcze mapowanie aktywności zespołów neuronalnych, co wspiera mechanistyczne ograniczanie ryzyka oraz walidację celów w badaniach nad nowymi lekami neuropsychiatrycznymi. Podejście to dostarcza ilościowych, rozdzielczych przestrzennie danych, które są kluczowe dla oceny efektów działania leków na poziomie obwodów neuronalnych oraz dla podejmowania decyzji dotyczących portfela projektów na wczesnym etapie rozwoju. Skalowalność i powtarzalność tej metody pozycjonują ją jako fundamentalne narzędzie w badaniach i rozwoju w obszarze translacyjnej neuronauki.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia badanie funkcji obwodów neuronalnych oraz modulacji indukowanej lekami na poziomie populacyjnym.
- Wspiera biologiczną redukcję ryzyka poprzez wyjaśnianie relacji przestrzennych i funkcjonalnych między podtypami neuronów.
- Dostarcza ilościowych dowodów na zaangażowanie celu oraz pozwala na testowanie hipotez mechanistycznych.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Ułatwia przygotowanie zwalidowanych układów neuronalnych do przesiewowego badania związków oraz opracowywania testów elektrofizjologicznych.
- Zapewnia zestandaryzowane, powtarzalne rejestracje wielokanałowe, umożliwiając rzetelne porównania między różnymi warunkami eksperymentalnymi.
- Umożliwia wysokoprzepustową ocenę wpływu związków na aktywność zespołów neuronalnych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodny z modelami istotnymi dla danej choroby poprzez rejestrację biomarkerów na poziomie obwodów oraz punktów końcowych funkcji.
- Wspiera ciągłość procesu od etapu odkrywania po walidację przedkliniczną, umożliwiając analizy międzywarunkowe i międzyregionalne.
- Dostarcza danych prognostycznych dla rozwoju związków neuroaktywnych z uwzględnieniem oceny ryzyka.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ta metoda rejestracji za pomocą sondy krzemowej wpisuje się w ciąg od odkrycia do fazy przedklinicznej, łącząc wczesne badania mechanistyczne z rozwojem biomarkerów translacyjnych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków poprzez mapowanie aktywności neuronalnej na poziomie zespołowym.
- Przesiewanie: Zapewnia gotowe do analizy, powtarzalne rejestracje neuronalne do oceny związków.
- Analityka: Generuje ilościowe dane dotyczące potencjałów czynnościowych i potencjałów polowych do statystycznego porównania grup eksperymentalnych.
- Badania translacyjne: Umożliwia dopasowanie przedklinicznych sygnatur neuronalnych do punktów końcowych istotnych dla choroby.
- Wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje skalowalną, wielokrotnego użytku platformę dla wieloprojektowych działań badawczo-rozwojowych w obszarze neurofarmakologii.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celów w obrębie ośrodkowego układu nerwowego (CNS).
- Wartość operacyjna: Dostarcza ustandaryzowanych, skalowalnych i powtarzalnych danych neuronalnych pomiędzy badaniami.
- Wartość strategiczna: Ułatwia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu projektu (go/no-go) i zwiększa efektywność kapitałową poprzez dostarczanie rzetelnych danych na wczesnym etapie.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój aktywów neuroaktywnych.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie elektrofizjologii in vivo oraz chirurgii stereotaksycznej.
- Wymaga dostępu do wysokogęstościowych sond krzemowych oraz wielokanałowych systemów rejestracyjnych.
- Konieczna jest rygorystyczna standaryzacja protokołów chirurgicznych i analitycznych pomiędzy zespołami.
- Adaptacja do innych obszarów mózgu lub modeli chorób może wymagać optymalizacji protokołu.
- Potencjalne ograniczenia obejmują uwarunkowania związane z preparacją ostrą oraz wpływ anestezji na aktywność neuronów.
