Name: Badanie przesiewowe całego genomu dla celów miRNA przy użyciu biblioteki MISSION Target ID (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-06T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: Poznaj metodę przesiewowego badania całego genomu dla celów miRNA przy użyciu biblioteki MISSION Target ID. Technika ta umożliwia identyfikację genów docelowych mikroRNA w liniach komórkowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy całemu zespołowi odpowiedzialnemu za opracowanie biblioteki Sigma Life Science Mission Target ID, w szczególności Kevinowi Gutshallowi za znalezienie technologii i wynegocjowanie warunków licencyjnych oraz Heather Holemon za wsparcie i udział w owocnych dyskusjach dotyczących rozwiązywania problemów. Dziękujemy również dr. Joopowi Gäkenowi z King’s College London za bezpłatne udostępnienie niepublikowanych wyników i sugestii oraz Qaziemu Hamidowi z RxBiosciences za przygotowanie wysokiej jakości partii cDNA i wytrwałość w procesie klonowania. Chcielibyśmy również podziękować Nan Lin i Scottowi Bahr z SAFC za przeprowadzenie analiz macierzy cDNA oraz analizę danych.
MISSION jest zarejestrowanym znakiem towarowym Sigma-Aldrich Biotechnology L.P.

<ol><li>Target ID Library Technical Bulletin, Catalog # MREH01. [Internet]. , Sigma Aldrich. St Louis. Available from:
		
	 <a target="_blank" href="http://www.sigma-aldrich.com">http://www.sigma-aldrich.com</a> (2012).</li>
<li>Huang, Q., Gumireddy, K., Schrier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microRNAs+miR-373+and+miR-520c+promote+tumour+invasion+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The microRNAs miR-373 and miR-520c promote tumour invasion and metastasis.</a> Nat. Cell Biol. 10 (2), 202-210 (2008).</li>
<li>Lichner, Z., Pall, E., Kerekes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+miR-290-295+cluster+promotes+pluripotency+maintenance+by+regulating+cell+cycle+phase+distribution+in+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">The miR-290-295 cluster promotes pluripotency maintenance by regulating cell cycle phase distribution in mouse embryonic stem cells.</a> Differentiation. 81 (1), 11-24 (2011).</li>
<li>Subramanyam, D., Lamouille, S., Judson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+targets+of+miR-302+and+miR-372+promote+reprogramming+of+human+fibroblasts+to+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Multiple targets of miR-302 and miR-372 promote reprogramming of human fibroblasts to induced pluripotent stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 29 (5), 443-448 (2001).</li>
<li>Lim, L. P., Lau, N. C., Garrett-Engele, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+analysis+shows+that+some+microRNAs+downregulate+large+numbers+of+target+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Microarray analysis shows that some microRNAs downregulate large numbers of target mRNAs.</a> Nature. 433 (7027), 769-773 (2005).</li>
<li>Huntzinger, E., Izaurralde, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+silencing+by+microRNAs%3A+contributions+of+translational+repression+and+mRNA+decay%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Gene silencing by microRNAs: contributions of translational repression and mRNA decay.</a> Nat. Rev. Genet. 12 (2), 99-110 (2011).</li>
<li>Thomas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Desperately+seeking+microRNA+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struc.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Desperately seeking microRNA targets.</a> Nat. Struc. Mol. Biol. 17 (10), 1169-1174 (2010).</li>
<li>Baek, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+microRNAs+on+protein+output%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The impact of microRNAs on protein output.</a> Nature. 455 (7209), 71-71 (2008).</li>
<li>Guo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+microRNAs+predominantly+act+to+decrease+target+mRNA+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mammalian microRNAs predominantly act to decrease target mRNA levels.</a> Nature. 466 (3708), 835-840 (2010).</li>
<li>Ma, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+invasion+and+metastasis+initiated+my+microRNA-10b+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tumour invasion and metastasis initiated my microRNA-10b in breast cancer.</a> Nature. 449 (7163), 682-688 (2007).</li>
<li>Visone, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+miR-221+and+miR-222%2C+both+overexpressed+in+human+thyroid+papillary+carcinomas%2C+regulate+p27Kip1+protein+levels+and+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine-Related+Cancer%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs miR-221 and miR-222, both overexpressed in human thyroid papillary carcinomas, regulate p27Kip1 protein levels and cell cycle.</a> Endocrine-Related Cancer. 14 (3), 791-798 (2007).</li>
<li>Lu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-21+promotes+cell+transformation+by+targeting+the+programmed+cell+death+4+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-21 promotes cell transformation by targeting the programmed cell death 4 gene.</a> Oncogene. 27 (31), 4373-4379 (2008).</li>
<li>Guo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+noncoding+RNA%2C+miR-126%2C+suppresses+the+growth+of+neoplastic+cells+by+targeting+phosphatidylinositol+3-kinase+signaling+and+is+frequently+lost+in+colon+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Chrom.+Cancer%22%5BJournal%5D)">The noncoding RNA, miR-126, suppresses the growth of neoplastic cells by targeting phosphatidylinositol 3-kinase signaling and is frequently lost in colon cancers.</a> Genes Chrom. Cancer. 47 (11), 939-946 (2008).</li>
<li>Yamakuchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-34a+repression+of+SIRT1+regulates+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">miR-34a repression of SIRT1 regulates apoptosis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (36), 13421-13426 (2008).</li>
<li>Wickramasinghe, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estradiol+downregulates+miR-21+expression+and+increases+miR-21+target+gene+expression+in+MCF-7+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acid+Res%22%5BJournal%5D)">Estradiol downregulates miR-21 expression and increases miR-21 target gene expression in MCF-7 breast cancer cells.</a> Nucleic Acid Res. 37 (8), 2584-2595 Forthcoming.</li>
<li>Ciaudo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+dynamic+and+sex-specific+expression+of+microRNAs+during+early+ES+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Highly dynamic and sex-specific expression of microRNAs during early ES cell differentiation.</a> PLoS Genetics. 5, e1000620(2009).</li>
<li>Vallejo, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+Notch+signaling+by+the+conserved+miR-8%2F200+microRNA+family+in+development+and+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Targeting Notch signaling by the conserved miR-8/200 microRNA family in development and cancer cells.</a> EMBO J. 30 (4), 756-769 (2011).</li>
<li>Jafarifar, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repression+of+VEGFA+by+CA-rich+element-binding+microRNAs+is+modulated+by+hnRNAP%5BTitle%5D)+AND+%22L.+EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Repression of VEGFA by CA-rich element-binding microRNAs is modulated by hnRNAP.</a> L. EMBO J. 30 (7), 1324-1334 (2011).</li>
<li>Clancy, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA+isoform+diversity+can+obscure+detection+of+miRNA-mediated+control+of+translation%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">mRNA isoform diversity can obscure detection of miRNA-mediated control of translation.</a> RNA. 17 (6), 1025-1033 (2011).</li>
</ol>

Autorzy deklarują powiązania finansowe z podmiotami komercyjnymi, które mają interes w przedłożonej pracy.

mikroRNA to RNA o długości 20-24 nukleotydów, które regulują ekspresję genów potranskrypcyjnie poprzez hamowanie translacji mRNA, a często także poprzez destabilizację docelowego mRNA (przegląd w [6]). Pojedyncze miRNA może regulować kilkaset cząsteczek mRNA, kontrolując w ten sposób odpowiedź komórki na sygnały rozwojowe i środowiskowe. Identyfikacja i walidacja docelowych mRNA jest niezbędna do określenia roli i funkcji miRNA w tych szlakach. Identyfikacja celów nie jest jednak prosta, ponieważ u zwierząt miRNA i ich miejsca docelowe nie są w pełni komplementarne. Region „seed” (ziarna), obejmujący zasady od 2 do 7 od końca 5′ miRNA, jest zazwyczaj komplementarny do jego celów. Istnieje jednak wiele wyjątków od reguły seed, a parowanie zasad w dalszej części sekwencji może kompensować niedoskonałe dopasowanie regionu seed. Opracowano szereg algorytmów komputerowych do przewidywania celów miRNA w oparciu o dopasowanie seed i kompensację downstream, strukturę i pozycję celu, konserwację sekwencji oraz różne inne parametry zaobserwowane dla eksperymentalnie zwalidowanych celów (przegląd w [7]). Chociaż przewidywania in silico są wygodne i pozwalają zidentyfikować wiele prawidłowych celów miRNA, większość przewidzianych genów nie przechodzi testów walidacji eksperymentalnej, a wiele rzeczywistych celów nie zostaje przewidzianych. Co więcej, ponieważ algorytmy komputerowe opierają się na wcześniej określonych cechach celów, nie pozwalają one na odkrycie celów odbiegających od tego, co jest już znane.

Liczne systemy eksperymentalne zostały z powodzeniem wykorzystane do identyfikacji lub odkrywania funkcjonalnych celów miRNA w żywych komórkach. Te globalne metody przesiewowe obejmują mikromacierze i sekwencjonowanie RNA, ko-immunoprecypitację RNA (RIP) oraz znakowanie stabilnymi izotopami aminokwasów w hodowli komórkowej (SILAC), która jest metodą proteomiczną (przegląd w [7]). Każda z metod ma swoje zalety i wady. Ponieważ celowanie miRNA często destabilizuje mRNA i prowadzi do jego degradacji, spadek lub wzrost poziomu mRNA po wprowadzeniu odpowiednio mimika lub inhibitora miRNA może pozwolić na identyfikację celów miRNA. Ten spadek lub wzrost poziomu mRNA jest łatwo wykrywany za pomocą mikromacierzy lub głębokiego sekwencjonowania. Choć metody detekcji mRNA są prostsze i bardziej czułe niż metody detekcji białek, detekcja mRNA nie wykryje żadnych celów miRNA, które nie ulegają degradacji. Niedawne raporty z laboratorium Bartella, porównujące wyniki celów miRNA z detekcji RNA z wynikami uzyskanymi za pomocą SILAC [8] lub profilowania rybosomalnego [9], wskazują, że ssacze miRNA działają głównie poprzez redukcję poziomów mRNA celu. Jednak wiele innych laboratoriów pracujących z poszczególnymi celami miRNA wykryło zmianę poziomu białka przy braku zmian poziomu mRNA. Raporty o zjawiskach, które wydają się być regulacją translacyjną bez wykrywalnej utraty mRNA, obejmują: miR-10b w odniesieniu do HOXD10 [10], miR221/222 w odniesieniu do p27kip1 [11], miR-21 w odniesieniu do Pdcd4 [12], miR-126 w odniesieniu do p85β [13], miR-34 w odniesieniu do SIRT1 [14], miR-21 w odniesieniu do PTEN [15], miR-302d w odniesieniu do Arid4b [16], miR-200c w odniesieniu do JAG1 [17] oraz miR-299, 297, 567 i 609 w odniesieniu do VEGFA [18]. Ponadto Clancy i wsp. [19] niedawno donieśli, że regulacja translacyjna przez let-7 została wykryta tylko wtedy, gdy selektywnie wykrywano poszczególne izoformy mRNA zawierające miejsce wiązania let-7. To ostatnie sugeruje, że przynajmniej w niektórych przypadkach regulacja translacyjna może zostać pominięta w profilu złożonym – tzn. gdy wszystkie izoformy mRNA są wykrywane jako jedno mRNA – co ma miejsce w wielu analizach z użyciem mikromacierzy i sekwencjonowania. Ko-immunoprecypitacja kompleksów miRNA-mRNA za pośrednictwem argonaute (zazwyczaj ago2) lub innego białka stowarzyszonego (immunoprecypitacja RNA, czyli RIP) pozwoli na wyizolowanie celów miRNA niezależnie od mechanizmu regulacji. Dodatkowo RIP wykrywa endogenne i prawdopodobnie istotne biologicznie interakcje. Jednak nie wiadomo, czy wszystkie interakcje miRNA-mRNA są funkcjonalne, a RIP pomija wszelkie cele mRNA, które wiążą się tylko przejściowo lub są szybko degradowane. Ponadto konkretne pary miRNA-mRNA muszą być wnioskowane bioinformatycznie, ponieważ wszystkie pary miRNA-mRNA są ko-precypitowane razem. Wreszcie SILAC bezpośrednio identyfikuje końcowy produkt regulacji miRNA, czyli samo białko, ale jest mało czuły, a zatem pomija rzadkie białka i niewielkie zmiany krotności w poziomach białek.

W obliczu ograniczeń obecnych metod identyfikacji celów miRNA, uznaliśmy, że konieczne jest wprowadzenie dodatkowego testu globalnego do identyfikacji funkcjonalnych celów miRNA poprzez alternatywny mechanizm. Aby zaspokoić tę potrzebę, licencjonowaliśmy technologię opracowaną przez Joopa Gakena i Azima Mohameda z King’s College London. Ich wynalazkiem jest białko fuzyjne o podwójnej selektywności, a konkretnie fuzja kinazy tymydynowej z zeocyną, regulowana przez bibliotekę cDNA potencjalnych sekwencji docelowych miRNA w jej regionie 3′UTR. Komórki stabilnie przetransfekowane i wykazujące ekspresję konstruktów TKzeo-cDNA mogą być selekcjonowane za pomocą zeocyny, co przedstawiono na Rys. 2. Po ekspresji interesującego nas miRNA, jego cele można wyselekcjonować za pomocą gancyklowiru, co zilustrowano na Rys. 3. Gancyklowir zabija komórki wykazujące ekspresję kinazy tymydynowej, czyli wszystkie komórki wykazujące ekspresję TKzeo-cDNA, które nie posiadają celu dla interesującego nas miRNA. Docelowe cDNA można wyizolować poprzez amplifikację PCR DNA z komórek, które przeżyły działanie gancyklowiru, przy użyciu starterów flankujących cDNA, a następnie przeprowadzić sekwencjonowanie produktów PCR w celu zidentyfikowania celów. 

Opracowaliśmy technologię King’s College w nowe narzędzie do globalnej identyfikacji i odkrywania funkcjonalnych celów ludzkiego miRNA – bibliotekę MISSION Target ID. Dzięki bibliotece Target ID użytkownicy mogą izolować cele miRNA poprzez serię transfekcji kultur komórek ssaków i etapów selekcji lekiem. Biblioteka jest kompleksowa i zawiera od 66% do 79% ludzkich genów. Wstępne wyniki wskazują, że z biblioteki MISSION Target ID można izolować zarówno cele odkryte wcześniej, jak i nowe.

Mimo że protokół jest dość obszerny, korzystanie z biblioteki Target ID wymaga standardowych technik biologii molekularnej – hodowli komórek ssaczych, transfekcji, selekcji lekowej, PCR oraz sekwencjonowania – i w związku z tym powinno być w zasięgu możliwości większości biologów. Sugerujemy, aby zwrócić należytą uwagę na właściwy projekt eksperymentalny, optymalizację warunków hodowli oraz, co najważniejsze, wstępne przetestowanie każdego nowego typu komórek w celu ustalenia optymalnych stężeń leków do etapów selekcji (krzywe przeżywalności/kill-curves), aby zapewnić sukces przy użyciu biblioteki Target ID.

Podobnie jak w przypadku wszystkich metod identyfikacji celów miRNA, zdecydowanie zaleca się, aby cele zidentyfikowane poprzez przeszukiwanie biblioteki Target ID zostały zwalidowane za pomocą drugiej metody, takiej jak mikromacierze, qRT-PCR, test reporterowy (np. lucyferazowy) lub analiza Western.

<table><tbody><tr><td>JumpStart REDTaq ReadyMix</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/P0982?lang=en&amp;amp;region=US&amp;amp;cm_mmc=affiliate-_-JOVE-_-video-_-target_id" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sigma-Aldrich</a></td><td>P0982</td><td> </td></tr><tr><td>&lt;a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/G2536?lang=en&amp;amp;region=US&amp;amp;cm_mmc=affiliate-_-JOVE-_-video-_-target_id" target="_blank"&gt;Gancyklowir&lt;/a&gt;</td><td>&lt;a href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank"&gt;Sigma-Aldrich&lt;/a&gt;</td><td>&lt;a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/G2536?lang=en&amp;amp;region=US&amp;amp;cm_mmc=affiliate-_-JOVE-_-video-_-target_id" target="_blank"&gt;G2536&lt;/a&gt;</td><td> </td></tr><tr><td>G418</td><td>&lt;a href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank"&gt;Sigma-Aldrich&lt;/a&gt;</td><td>G8168</td><td> </td></tr><tr><td>Puromycyna</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/P9620?lang=en&amp;amp;region=US&amp;amp;cm_mmc=affiliate-_-JOVE-_-video-_-target_id" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sigma-Aldrich</a></td><td>P9620</td><td> </td></tr><tr><td>Topo TA</td><td>Invitrogen</td><td>KNM450-01</td><td> </td></tr><tr><td>GenElute Mammalian Genomic DNA Miniprep Kit</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/g1n10?lang=en&amp;amp;region=US&amp;amp;cm_mmc=affiliate-_-JOVE-_-video-_-target_id" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sigma-Aldrich</a></td><td>G1N10</td><td> </td></tr><tr><td>Zestaw do nukleofekcji specyficzny dla komórek</td><td>Lonza Inc.</td><td></td><td> </td></tr><tr><td>Nukleofektor</td><td>Lonza Inc.</td><td>AAD-101</td><td> </td></tr><tr><td>Zeocyna</td><td>Invitrogen</td><td>&lt;a href="http://products.invitrogen.com/ivgn/en/US/adirect/invitrogen?cmd=catProductDetail&amp;amp;productID=R2501"&gt;R250-01&lt;/a&gt;</td><td> </td></tr><tr><td>&lt;a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/mreh01?lang=en&amp;amp;region=US&amp;amp;cm_mmc=affiliate-_-JOVE-_-video-_-target_id" target="_blank"&gt;Biblioteka Target ID&lt;/a&gt;</td><td>&lt;a href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank"&gt;Sigma-Aldrich&lt;/a&gt;</td><td>&lt;a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/mreh01?lang=en&amp;amp;region=US&amp;amp;cm_mmc=affiliate-_-JOVE-_-video-_-target_id" target="_blank"&gt;MREH01&lt;/a&gt;</td><td></td></tr></tbody></table>

przesiew genomowy w celu identyfikacji celów mirna z wykorzystaniem biblioteki mission target id

Genome-wide Screen for miRNA Targets Using the MISSION Target ID Library

Biblioteka Target ID została zaprojektowana w celu wspierania wykrywania i identyfikacji celów dla mikroRNA (miRNA). Biblioteka Target ID jest plazmidową, genomową biblioteką cDNA, w której klony znajdują się w obszarze 3'UTR poniżej białka fuzyjnego do podwójnej selekcji, kinazy tymidynowej-zeocyny (TKzeo). Pierwsza runda selekcji służy do wyłonienia stabilnych transformantów, po czym następuje wprowadzenie interesującego miRNA, a na koniec selekcja cDNA zawierających cel dla tego miRNA. Wyselekcjonowane cDNA są identyfikowane poprzez sekwencjonowanie (szczegóły oraz schemat działania biblioteki Target ID przedstawiono na rysunku 1-3).
Aby zapewnić szeroki zakres pokrycia ludzkiego transkryptomu, cDNA biblioteki Target ID wygenerowano poprzez priming oligo-dT, wykorzystując pulę całkowitego RNA przygotowaną z wielu ludzkich tkanek i linii komórkowych. Uzyskane cDNA mają wielkość od 0,5 do 4 kb, przy średniej wielkości 1,2 kb, i zostały sklonowane do plazmidu z podwójną selekcją p3΄TKzeo (mapę plazmidu przedstawiono na Rysunku 4). Geny docelowe reprezentowane w bibliotece można znaleźć na stronie internetowej Sigma-Aldrich. Wyniki sekwencjonowania Illumina (Tabela 3) wykazują, że biblioteka obejmuje 16 922 z 21 518 unikalnych genów w UCSC RefGene (79%) lub 14 000 genów z 10 lub więcej odczytami (66%).

Biblioteka Target ID jest opartą na plazmidach, genomową kolekcją klonowanego cDNA, służącą do identyfikacji celów miRNA. W niniejszym materiale prezentujemy sposób jej użycia i zastosowania.

Przesiew genomowy w celu identyfikacji celów miRNA z wykorzystaniem biblioteki MISSION Target ID

Biblioteka Target ID została zaprojektowana, aby wspomagać odkrywanie i identyfikację celów mikroRNA (miRNA). Biblioteka Target ID opiera się na plazmidach, ...

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest przeprowadzenie wysokoprzepustowego przesiewu całego genomu w poszukiwaniu celów mikroRNA z wykorzystaniem biblioteki target ID. Jest to osiągane poprzez transfekcję komórek plazmidem bibliotecznym. Po transfekcji genomowego zbioru klonowanych cDNA następuje selekcja stabilnych linii komórkowych.Następnie ustabilizowane komórki biblioteczne poddaje się transfekcji konstruktem ekspresyjnym mikroRNA, aby umożliwić koekspresję celu mikroRNA i tymidynowej kinazy. Na tym etapie gancyklowir jest wykorzystywany do selekcji komórek wykazujących ekspresję specyficznych celów mikroRNA poprzez selekcję negatywną przeciwko ekspresji tymidynowej kinazy. Następnie cDNA zawierające miejsca wiązania celów mikroRNA poddaje się amplifikacji PCR z wykorzystaniem starterów amplifikacyjnych ID celu w celu sekwencjonowania i identyfikacji celów w bibliotece mikroRNA.Ostatecznie otrzymuje się wyniki pozwalające zidentyfikować specyficzne cele mikroRNA w komórkach na podstawie analizy głębokiego sekwencjonowania. Biblioteka ID celów misji została zaprojektowana, aby pomóc w odkrywaniu i identyfikowaniu genów będących celami mikroRNA. Poniżej przedstawiamy sposób jej wykorzystania oraz zastosowania.Przed rozpoczęciem niniejszego protokołu należy wybrać linię komórkową, która nie wykazuje ekspresji lub wykazuje niski poziom ekspresji analizowanego receptora IRA, a następnie namnożyć komórki, aby uzyskać około 2 × 10⁷ komórek przy 80% konfluencji. Po trypsynizacji przenieść komórki do sterylnej probówki z zakrętką o objętości 15 ml i odwirować je przy 200 ×g przez 5 minut. Po usunięciu medium resuspendować osad komórkowy w celu przemycia, ponownie odwirować komórki i powtórzyć proces płukania po raz drugi.W międzyczasie przygotuj odpowiednią liczbę probówek o pojemności 0,5 mililitra dla każdej transfekcji, dodając do każdej probówki dwie mikrogramy biblioteki docelowego ID. Następnie resuspenduj osad komórkowy w probówce 15 mililitrów, używając 600 mikrolitrów roztworu maxim Nucle affection na jedną transfekcję. Wykonuj reakcje pojedynczo.Dodaj 100 µL komórek do porcji, a następnie dwa mikrogramy plazmidu, mieszając roztwór końcówką pipety. Przenieś każdą mieszaninę do cuwety efektora jądrowego. Włóż jedną cuwetę do urządzenia efektora jądrowego i uruchom zoptymalizowany program odpowiedni dla danej linii komórkowej.Następnie napełnij pipetę transferową podgrzanym wcześniej medium. Odessaj przetransfekowane komórki tą samą pipetą i przenieś je do pojedynczej studni wcześniej przygotowanej płytki 6-dołkowej. Powtórz ten proces dla każdej infekcji jądrowej NU zgodnie z protokołem infekcji jądrowej NU.Przenieś komórki z powrotem do komory wzrostowej na inkubację nocną, a następnie na kolejny dzień. Wymień medium i pozwól komórkom regenerować się przez okres od trzech do pięciu dni. Po regeneracji komórek usuń medium i dodaj medium kompletne zawierające odpowiedni poziom eozyny, aby wyselekcjonować stabilną integrację i ekspresję białka fuzyjnego TKZO.Stężenie eozyny można określić wcześniej zgodnie z opisem w tekście. Monitorować selekcję eozynową komórek poprzez ocenę żywotności komórkowej. Pożywkę z eozyną należy wymieniać na świeżą co dwa do trzech dni.Po osiągnięciu konfluencji w płytce sześciodołkowej należy przeprowadzić pasaż i namnożyć komórki w większych kolbach. Wykonuje się analizę krzywej przeżywalności (kill curve), aby ustalić minimalną dawkę letalną dla odczynników selekcyjnych stosowanych w badaniu. Aby uniknąć niepożądanych odpowiedzi fenotypowych podczas wyznaczania krzywych przeżywalności, należy najpierw wysiać komórki do każdego dołka płytki 96-dołkowej zawierającej 120 µL świeżej pożywki, a następnie przejść do kolejnych etapów następnego dnia.Dodaj lek do wybranych studzienek. Antybiotyki G 418 lub puromycinę stosuje się w celu selekcji integracji konstruktu ekspresyjnego miRNA, natomiast acyklowir służy do selekcji negatywnej względem ekspresji tymidynowej kinazy. W trakcie inkubacji co dwa dni oceniaj żywotność komórek dla każdego stężenia leku. Wymieniaj medium zawierające odczynnik selekcyjny co trzy dni.Po określeniu stężeń leków, dla danego typu komórek i eksperymentu należy zastosować minimalne stężenie odczynnika selekcyjnego, które wywołuje całkowity śmierć komórek po żądanym czasie. W celu przygotowania do transfekcji należy hodować i namnażać komórki docelowej biblioteki ID, aby uzyskać 2 × 10⁷ komórek. Trypsynizację należy przeprowadzić, gdy konfluencja komórek przekracza 80%.Przenieś komórki do sterylnej probówki z nakrętką o pojemności 15 ml i odwiruj przy 200 ×g przez pięć minut. Usuń medium i dwukrotnie przemyj osad komórkowy w sposób opisany wcześniej. Następnie, dla każdej transfekcji, dodaj dwie mikrogramy plazmidu ekspresyjnego MIRA do probówki o pojemności 0,5 ml.Przeprowadź nukleową transfekcję mRNA do komórek biblioteki, stosując tę samą metodę, która była użyta do transfekcji biblioteki docelowej ID. Po tym, jak komórki regenerowały się przez trzy do pięciu dni, wymień medium na medium kompletne zawierające odpowiedni poziom antybiotyku, ustalony na podstawie testu krzywej przeżywalności.Monitorować komórki pod kątem selekcji antybiotykowej, wymieniając pożywkę na pożywkę z dodatkiem antybiotyku co dwa do trzech dni. Po osiągnięciu pełnej konfluencji w płytce sześciodołkowej, przeprowadzić pasaż całej puli i namnożyć komórki w większych kolbach. Podobnie jak poprzednio, wymienić pożywkę na świeżą pożywkę zawierającą odpowiednie stężenia GCV i antybiotyku.Monitoruj komórki pod kątem ekspresji kinazy tymydynowej oraz ekspresji mRNA poprzez ocenę żywotności komórek, a następnie namnażaj przeżyłe komórki w obecności GCV i antybiotyku. Następnie przygotuj DNA genomowe z komórek wyselekcjonowanych za pomocą GCV. Przeprowadź amplifikację PCR wstawek z wyselekcjonowanej biblioteki przy użyciu starterów z zestawu i podklonuj je zgodnie z opisem w protokole pisemnym.Następnie można przeprowadzić reakcje sekwencjonowania z wykorzystaniem starterów amplifikacyjnych. W ostatnim kroku zidentyfikowano geny docelowe poprzez dopasowanie blast sekwencji do transkryptomu ludzkiego w przypadku znanych transkryptów oraz do genomu ludzkiego w przypadku nowych transkryptów. Konstrukt wykazujący ekspresję mere 3 73 został stabilnie przetransfekowany do biblioteki MC seven i wyselekcjonowany w pożywce zawierającej gancyklowir w celu wzbogacenia populacji komórek wykazujących ekspresję celów mere 3 73.GCV nie wywiera żadnego wpływu na komórki MCF 7 bez biblioteki, ponieważ nie wykazują one ekspresji tymidynowej kinazy. Z drugiej strony, komórki biblioteczne C 7 wykazują ekspresję tymidynowej kinazy, lecz nie zostają całkowicie zabite przez gancyklowir w stężeniu 8 lub 16 µM, co potwierdza pobieranie błękitu brylantowego przez żywe komórki. Niemniej jednak komórki biblioteczne przestają rosnąć w obecności GCV, o czym świadczy kolor barwnika czerwieni fenolowej w ich pożywce.Zatrzymane komórki nie zakwaszają swojego medium, a kolor pozostaje czerwonawy. Zamiast zmiany na pomarańczowy, z przeżywających komórek wyizolowano żółte sekwencje docelowe. Następnie przeprowadzono amplifikację PCR i sekwencjonowanie.Uzyskano prawie 12 milionów odczytów cDNA, które zmapowano do prawie 12 000 unikalnych genów. Spośród tych unikalnych genów 234 uznano za wiarygodne trafienia ze względu na częstotliwość występowania i specyficzność dla mere 3 73. Wstępne porównanie wykazało, że 10 z unikalnych genów zidentyfikowanych za pomocą biblioteki ID celu znajduje się również na liście wcześniej zidentyfikowanych celów mere 3 73 w bazie tar base.W związku z tym te 10 celów prawdopodobnie stanowi istotne cele dla 3 73 i są one obecnie charakteryzowane w celu eksperymentalnej walidacji wybranych wyników. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat sposobu wykorzystania biblioteki identyfikatorów celów misji do przeprowadzenia wysokoprzepustowego screeningu całego genomu w poszukiwaniu genów docelowych dla mikroRNA.

genome-wide-screen-for-mirna-targets-using-mission-target-id

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Przesiewowe badanie genomowe dla celów miRNA z wykorzystaniem biblioteki identyfikatorów docelowych MISSION Target ID

W niniejszej pracy wykorzystujemy ludzką bibliotekę esiRNA w badaniu wysokoprzepustowym w celu identyfikacji genów zaangażowanych w podział komórki. Przedstawiamy sposób przygotowania i przeprowadzenia przesiewu esiRNA, a także metodę analizy i walidacji uzyskanych wyników.

MISSION esiRNA do przesiewania RNAi w komórkach ssaków

MikroRNA (miRNA) są istotnymi regulatorami ekspresji genów i wykazano, że odgrywają one rolę w licznych procesach biologicznych. Aby lepiej zrozumieć interakcje miRNA-UTR, stworzyliśmy obejmującą cały genom kolekcję reporterów lucyferazy 3' UTR, połączonych z nowym genem lucyferazy i odczynnikiem analitycznym, systemem LightSwitch.

Identyfikacja celów ludzkich mikroRNA za pomocą systemu testowego LightSwitch Luciferase z wykorzystaniem konstruktów reporterowych 3'UTR oraz mimiku mikroRNA w komórkach adherentnych

Tutaj opisujemy komórkowy test genu reporterowego jako cenne narzędzie do badania bibliotek chemicznych pod kątem związków modulujących mechanizmy kontroli potranskrypcyjnej wywieranej przez 3' UTR.

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe pod kątem chemicznych modulatorów genów regulowanych potranskrypcyjnie

Luminescencyjna identyfikacja elementów funkcjonalnych w nieulegających translacji regionach 3' (3'UTR) (3'LIFE) to technika identyfikacji funkcjonalnej regulacji w 3'UTR przez miRNA lub inne czynniki regulacyjne. Protokół ten wykorzystuje metodologię o wysokiej przepustowości, taką jak transfekcja 96-dołkowa i testy lucyferazy, do badania przesiewowego setek domniemanych interakcji pod kątem represji funkcjonalnej.

Wykrywanie celów miRNA w trybie wysokoprzepustowym za pomocą testu 3'LIFE

Identyfikacja nowych celów leków, które przechodzą od testów przedklinicznych do badań na ludziach, jest priorytetem naukowym. W tym celu opisujemy tutaj podejście genomiki funkcjonalnej do badania wpływu wyczerpania genów na sferoidy linii komórek nowotworowych, które bardziej odpowiednio modelują nowotwory u ludzi in vivo.

Wykorzystanie badań przesiewowych genomiki funkcjonalnej do identyfikacji potencjalnie nowych celów leków w hodowlach sferoidalnych komórek nowotworowych

Ten raport opisuje szybką i niezawodną metodę walidacji celów mRNA komórkowych miRNA. Metoda wykorzystuje syntetyczne biotynylowane miRNA oparte na zablokowanych kwasach nukleinowych (LNA) do wychwytywania docelowego mRNA. Następnie kulki magnetyczne pokryte streptawidyną są wykorzystywane do ściągania docelowego mRNA w celu ilościowego oznaczania w reakcji łańcuchowej polimerazy qPCR.

Test pulldown na bazie biotyny do walidacji celów mRNA komórkowych miRNA

Opisany tutaj jest protokół charakteryzujący moduły biologicznie synergicznych miRNA i ich łączenie w krótkie transgeny, co pozwala na jednoczesną nadekspresję dla zastosowań terapii genowej.

Charakterystyka funkcjonalnie powiązanych miRNA w glejaku i ich inżynieria w sztuczne klastry do terapii genowej

Prezentujemy nowy i w pełni zautomatyzowany potok miRNA, mirMachine, który 1) może dokładniej identyfikować znane i nowe miRNA oraz 2) jest w pełni zautomatyzowany i swobodnie dostępny. Użytkownicy mogą teraz wykonać krótki skrypt przesyłania, aby uruchomić w pełni zautomatyzowany potok mirMachine.

mirMachine: punkt kompleksowej obsługi adnotacji miRNA roślin

Ten protokół opisuje wysokoprzepustowy proces edycji genów CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) do analizy sieci klastrów mikroRNA, który pozwala na szybkie wygenerowanie panelu genetycznie zmodyfikowanych linii komórkowych zawierających unikalne kombinacje delecji członków klastra miRNA o wielkości 35 kb w jednym eksperymencie.

Narzędzie do edycji genów CRISPR do analizy sieci klastrów mikroRNA

Opracowaliśmy międzygatunkowe porównawcze podejście onkogenomiczne, wykorzystując analizy genomiczne i funkcjonalne badania genomowe do identyfikacji i porównania celów terapeutycznych w nowotworach powstających w genetycznie modyfikowanych modelach mysich i odpowiadającym im typie nowotworu ludzkiego.

Profilowanie genetyczne i badania przesiewowe w skali genomu w celu identyfikacji celów terapeutycznych w mysich modelach złośliwego guza osłonki nerwów obwodowych

Protokół opisuje tandemowy test hybrydyzacji immunofluorescencji z tkanką formalinowo-zafiksowaną w parafinę, mającą na celu jednoczesne wykrywanie i ilościowe mikroRNA oraz multipleksowane białka.

Amplifikacja i rozpoznawanie mikroRNA poprzez hybrydyzację in situ z użyciem kwasów nukleinowych z zamkniętymi nukleinami jako nowatorska metoda wykrywania i ilościowania

Poznaj metodę przesiewowego badania całego genomu dla celów miRNA przy użyciu biblioteki MISSION Target ID. Technika ta umożliwia identyfikację genów docelowych mikroRNA w liniach komórkowych.

Przesiew genomowy w celu identyfikacji celów miRNA z wykorzystaniem biblioteki MISSION Target ID

Przeglądaj więcej filmów