Przesiew genomowy w celu identyfikacji celów miRNA z wykorzystaniem biblioteki MISSION Target ID

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest przeprowadzenie wysokoprzepustowego przesiewu całego genomu w poszukiwaniu celów mikroRNA z wykorzystaniem biblioteki target ID. Jest to osiągane poprzez transfekcję komórek plazmidem bibliotecznym. Po transfekcji genomowego zbioru klonowanych cDNA następuje selekcja stabilnych linii komórkowych.

Następnie ustabilizowane komórki biblioteczne poddaje się transfekcji konstruktem ekspresyjnym mikroRNA, aby umożliwić koekspresję celu mikroRNA i tymidynowej kinazy. Na tym etapie gancyklowir jest wykorzystywany do selekcji komórek wykazujących ekspresję specyficznych celów mikroRNA poprzez selekcję negatywną przeciwko ekspresji tymidynowej kinazy. Następnie cDNA zawierające miejsca wiązania celów mikroRNA poddaje się amplifikacji PCR z wykorzystaniem starterów amplifikacyjnych ID celu w celu sekwencjonowania i identyfikacji celów w bibliotece mikroRNA.

Ostatecznie otrzymuje się wyniki pozwalające zidentyfikować specyficzne cele mikroRNA w komórkach na podstawie analizy głębokiego sekwencjonowania. Biblioteka ID celów misji została zaprojektowana, aby pomóc w odkrywaniu i identyfikowaniu genów będących celami mikroRNA. Poniżej przedstawiamy sposób jej wykorzystania oraz zastosowania.

Przed rozpoczęciem niniejszego protokołu należy wybrać linię komórkową, która nie wykazuje ekspresji lub wykazuje niski poziom ekspresji analizowanego receptora IRA, a następnie namnożyć komórki, aby uzyskać około 2 × 10⁷ komórek przy 80% konfluencji. Po trypsynizacji przenieść komórki do sterylnej probówki z zakrętką o objętości 15 ml i odwirować je przy 200 ×g przez 5 minut. Po usunięciu medium resuspendować osad komórkowy w celu przemycia, ponownie odwirować komórki i powtórzyć proces płukania po raz drugi.

W międzyczasie przygotuj odpowiednią liczbę probówek o pojemności 0,5 mililitra dla każdej transfekcji, dodając do każdej probówki dwie mikrogramy biblioteki docelowego ID. Następnie resuspenduj osad komórkowy w probówce 15 mililitrów, używając 600 mikrolitrów roztworu maxim Nucle affection na jedną transfekcję. Wykonuj reakcje pojedynczo.

Dodaj 100 µL komórek do porcji, a następnie dwa mikrogramy plazmidu, mieszając roztwór końcówką pipety. Przenieś każdą mieszaninę do cuwety efektora jądrowego. Włóż jedną cuwetę do urządzenia efektora jądrowego i uruchom zoptymalizowany program odpowiedni dla danej linii komórkowej.

Następnie napełnij pipetę transferową podgrzanym wcześniej medium. Odessaj przetransfekowane komórki tą samą pipetą i przenieś je do pojedynczej studni wcześniej przygotowanej płytki 6-dołkowej. Powtórz ten proces dla każdej infekcji jądrowej NU zgodnie z protokołem infekcji jądrowej NU.

Przenieś komórki z powrotem do komory wzrostowej na inkubację nocną, a następnie na kolejny dzień. Wymień medium i pozwól komórkom regenerować się przez okres od trzech do pięciu dni. Po regeneracji komórek usuń medium i dodaj medium kompletne zawierające odpowiedni poziom eozyny, aby wyselekcjonować stabilną integrację i ekspresję białka fuzyjnego TKZO.

Stężenie eozyny można określić wcześniej zgodnie z opisem w tekście. Monitorować selekcję eozynową komórek poprzez ocenę żywotności komórkowej. Pożywkę z eozyną należy wymieniać na świeżą co dwa do trzech dni.

Po osiągnięciu konfluencji w płytce sześciodołkowej należy przeprowadzić pasaż i namnożyć komórki w większych kolbach. Wykonuje się analizę krzywej przeżywalności (kill curve), aby ustalić minimalną dawkę letalną dla odczynników selekcyjnych stosowanych w badaniu. Aby uniknąć niepożądanych odpowiedzi fenotypowych podczas wyznaczania krzywych przeżywalności, należy najpierw wysiać komórki do każdego dołka płytki 96-dołkowej zawierającej 120 µL świeżej pożywki, a następnie przejść do kolejnych etapów następnego dnia.

Dodaj lek do wybranych studzienek. Antybiotyki G 418 lub puromycinę stosuje się w celu selekcji integracji konstruktu ekspresyjnego miRNA, natomiast acyklowir służy do selekcji negatywnej względem ekspresji tymidynowej kinazy. W trakcie inkubacji co dwa dni oceniaj żywotność komórek dla każdego stężenia leku. Wymieniaj medium zawierające odczynnik selekcyjny co trzy dni.

Po określeniu stężeń leków, dla danego typu komórek i eksperymentu należy zastosować minimalne stężenie odczynnika selekcyjnego, które wywołuje całkowity śmierć komórek po żądanym czasie. W celu przygotowania do transfekcji należy hodować i namnażać komórki docelowej biblioteki ID, aby uzyskać 2 × 10⁷ komórek. Trypsynizację należy przeprowadzić, gdy konfluencja komórek przekracza 80%.

Przenieś komórki do sterylnej probówki z nakrętką o pojemności 15 ml i odwiruj przy 200 ×g przez pięć minut. Usuń medium i dwukrotnie przemyj osad komórkowy w sposób opisany wcześniej. Następnie, dla każdej transfekcji, dodaj dwie mikrogramy plazmidu ekspresyjnego MIRA do probówki o pojemności 0,5 ml.

Przeprowadź nukleową transfekcję mRNA do komórek biblioteki, stosując tę samą metodę, która była użyta do transfekcji biblioteki docelowej ID. Po tym, jak komórki regenerowały się przez trzy do pięciu dni, wymień medium na medium kompletne zawierające odpowiedni poziom antybiotyku, ustalony na podstawie testu krzywej przeżywalności.

Monitorować komórki pod kątem selekcji antybiotykowej, wymieniając pożywkę na pożywkę z dodatkiem antybiotyku co dwa do trzech dni. Po osiągnięciu pełnej konfluencji w płytce sześciodołkowej, przeprowadzić pasaż całej puli i namnożyć komórki w większych kolbach. Podobnie jak poprzednio, wymienić pożywkę na świeżą pożywkę zawierającą odpowiednie stężenia GCV i antybiotyku.

Monitoruj komórki pod kątem ekspresji kinazy tymydynowej oraz ekspresji mRNA poprzez ocenę żywotności komórek, a następnie namnażaj przeżyłe komórki w obecności GCV i antybiotyku. Następnie przygotuj DNA genomowe z komórek wyselekcjonowanych za pomocą GCV. Przeprowadź amplifikację PCR wstawek z wyselekcjonowanej biblioteki przy użyciu starterów z zestawu i podklonuj je zgodnie z opisem w protokole pisemnym.

Następnie można przeprowadzić reakcje sekwencjonowania z wykorzystaniem starterów amplifikacyjnych. W ostatnim kroku zidentyfikowano geny docelowe poprzez dopasowanie blast sekwencji do transkryptomu ludzkiego w przypadku znanych transkryptów oraz do genomu ludzkiego w przypadku nowych transkryptów. Konstrukt wykazujący ekspresję mere 3 73 został stabilnie przetransfekowany do biblioteki MC seven i wyselekcjonowany w pożywce zawierającej gancyklowir w celu wzbogacenia populacji komórek wykazujących ekspresję celów mere 3 73.

GCV nie wywiera żadnego wpływu na komórki MCF 7 bez biblioteki, ponieważ nie wykazują one ekspresji tymidynowej kinazy. Z drugiej strony, komórki biblioteczne C 7 wykazują ekspresję tymidynowej kinazy, lecz nie zostają całkowicie zabite przez gancyklowir w stężeniu 8 lub 16 µM, co potwierdza pobieranie błękitu brylantowego przez żywe komórki. Niemniej jednak komórki biblioteczne przestają rosnąć w obecności GCV, o czym świadczy kolor barwnika czerwieni fenolowej w ich pożywce.

Zatrzymane komórki nie zakwaszają swojego medium, a kolor pozostaje czerwonawy. Zamiast zmiany na pomarańczowy, z przeżywających komórek wyizolowano żółte sekwencje docelowe. Następnie przeprowadzono amplifikację PCR i sekwencjonowanie.

Uzyskano prawie 12 milionów odczytów cDNA, które zmapowano do prawie 12 000 unikalnych genów. Spośród tych unikalnych genów 234 uznano za wiarygodne trafienia ze względu na częstotliwość występowania i specyficzność dla mere 3 73. Wstępne porównanie wykazało, że 10 z unikalnych genów zidentyfikowanych za pomocą biblioteki ID celu znajduje się również na liście wcześniej zidentyfikowanych celów mere 3 73 w bazie tar base.

W związku z tym te 10 celów prawdopodobnie stanowi istotne cele dla 3 73 i są one obecnie charakteryzowane w celu eksperymentalnej walidacji wybranych wyników. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat sposobu wykorzystania biblioteki identyfikatorów celów misji do przeprowadzenia wysokoprzepustowego screeningu całego genomu w poszukiwaniu genów docelowych dla mikroRNA.