Name: Edycja genomu za pomocą niestandardowych nukleaz palca cynkowego CompoZr (ZFN) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-14T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Poznaj edycję genomu za pomocą niestandardowych nukleaz palca cynkowego CompoZr. Ta metoda umożliwia precyzyjne wprowadzanie mutacji w wybranych loci genomu w różnych typach komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Proces projektowania niestandardowych ZFN
<ol>
 <li>Aby przyspieszyć proces projektowania ZFN, badacz powinien dostarczyć:
 <ul>
 <li>Informacje o genie docelowym, takie jak nazwa genu, gatunek oraz numer adnotacji/identyfikacji genu.</li>
 <li>Jasno sformułowany ogólny cel eksperymentu (np. knockout lub knockin).</li>
 <li>Wszelkie specyficzne cechy genu docelowego, w tym nietypową strukturę genu, szczególną biologię związaną z locus genetycznym lub wszelkie regiony homologiczne w innych częściach genomu.</li>
 <li>Konkretny zakres sekwencji DNA, który ma być celem dla nukleaz z palcami cynkowymi.</li>
 </ul></li>
 <li>Zespół bioinformatyczny Sigma przeprowadza projektowanie ZFN in silico w celu opracowania wstępnych miejsc docelowych dla palców cynkowych.</li>
 <li>Wstępne miejsca docelowe ZFN są przekazywane konsultantowi technicznemu ds. ZFN. W przypadku bardziej złożonych technicznie projektów naukowiec z Sigma współpracuje z badaczami nad opracowaniem strategii projektu.</li>
 <li>Zespół bioinformatyczny Sigma przeprowadza analizę z wykorzystaniem algorytmów ZFN w celu wygenerowania projektów ZFN in silico. Obejmuje to przeszukiwanie całego genomu w poszukiwaniu miejsc poza celem (off-target), maskowanie powtórzeń oraz analizę SNP dla każdego potencjalnego miejsca docelowego ZFN.</li>
 <li>Dział bioinformatyki przekazuje badaczowi do wglądu najlepsze miejsca docelowe ZFN. Po zatwierdzeniu potencjalnych miejsc docelowych ZFN, informacje te są przekazywane zespołowi produkcji ZFN w celu rozpoczęcia procesu wytwarzania ZFN.</li>
</ol>
2. Produkcja niestandardowych ZFN
<ol>
 <li>Archiwum modułów palców cynkowych Sigma jest wykorzystywane do składania zatwierdzonych projektów ZFN. </li>
 <li>Każdy projekt ZFN jest składany i weryfikowany pod kątem sekwencji na wysokoprzepustowej platformie klonowania. </li>
 <li>Po zakończeniu produkcji wszystkich projektów ZFN, każdy ZFN jest przekazywany do walidacji. </li>
</ol>

3. Walidacja niestandardowych ZFN
<ol>
 <li> Projekty ZFN dla gatunków ludzkich, myszy, szczura lub linii CHO są walidowane w dobrze scharakteryzowanych liniach komórkowych dla każdego gatunku; w przypadku pozostałych organizmów lub typów komórek stosowany jest test oparty na drożdżach.</li>
 <li> Konstrukty ZFN są dostarczane do odpowiedniej linii komórkowej poprzez nukleofekcję, a następnie następuje ekspresja ZFN.</li>
 <li> DNA jest izolowane z puli komórek transfekowanych ZFN, a następnie przeprowadzana jest amplifikacja PCR regionu zainteresowania.</li>
 <li> Następnie produkt PCR poddawany jest analizie w teście Cel-1. W celu walidacji aktywności ZFN przeprowadzana jest elektroforeza żelowa produktu testu Cel-1.</li>
 <li> Projekt ZFN o najwyższej aktywności, potwierdzony testem Cel-1, jest przekazywany klientowi. ZFN są dostarczane w formie mRNA oraz plazmidowego DNA, wraz z primerami PCR do testu Cel-1 oraz genomowym DNA jako kontrolą pozytywną.</li>
</ol>
4. Dostarczanie zwalidowanych ZFN poprzez nukleofekcję
<ol>
 <li> Dzień przed nukleofekcją wysiać komórki w zagęszczeniu 2x105 komórek/ml. </li>
 <li> W dniu nukleofekcji wyjąć zestaw Cell Line Nucleofector Kit V i pozwolić mu ogrzać się do temperatury pokojowej.</li>
 <li> Dodać suplement do roztworu Nucleofection Solution V zgodnie z protokołem producenta. </li>
 <li> Policzyć komórki. Zagęszczenie komórek powinno wynosić od 2,5-5x105 komórek/ml. </li>
 <li> Napełnić płytkę 6-dołkową, wlewając do każdego dołka 2ml medium, a następnie wstępnie ogrzać w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C przez co najmniej 20 minut przed nukleofekcją. </li>
 <li> Odwirować 2x106 komórek na jedną transfekcję (łącznie 8x106) przy 200xg przez 5 minut. </li>
 <li> Przemyć komórki dwukrotnie 20 ml zrównoważonego roztworu soli Hanksa (HBSS). </li>
 <li> Przygotować probówki eksperymentalne: (patrz tabela w biuletynie technicznym Custom ZFN) </li>
 <li>Wyjąć z inkubatora płytkę 6-dołkową z medium z kroku (6.5). </li>
 <li>Resuspender komórki w 400 μl (100 μl/reakcja) roztworu Nucleofection Solution V. </li>
 <li> Kolejno, dla jednej reakcji na raz, dodać 100 μl komórek do każdej probówki zawierającej DNA lub mRNA. Przenieść mieszaninę do 2 mm kuwety do elektroporacji i przeprowadzić nukleofekcję w urządzeniu Nucleofector przy użyciu odpowiedniego programu. </li>
 <li> Natychmiast po nukleofekcji każdej próbki, za pomocą pipety transferowej dodać ~500 μl wstępnie ogrzanego medium z płytki 6-dołkowej z kroku (6.9) do kuwety. Następnie ostrożnie przenieść komórki z kuwety do pozostałego wstępnie ogrzanego medium w płytce 6-dołkowej. </li>
 <li> Zakończyć wszystkie reakcje i umieścić płytkę 6-dołkową z powrotem w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C. </li>
</ol>
5. Odzyskiwanie genomowego DNA po dostarczeniu ZFN
<ol>
 <li>płytka 6-dołkowa – nie należy zbierać wszystkich połączonych komórek. Ważne jest utrzymanie hodowli, aby dysponować komórkami do klonowania metodą rozcieńczeń do pojedynczych komórek po potwierdzeniu obecności produktów trawienia Cel-1. Od jednego do trzech dni po nukleofekcji należy zebrać komórki w celu przygotowania chromosomalnego DNA przy użyciu zestawu GenElute Mammalian Genomic DNA Miniprep Kit.</li>
</ol>
6. Analiza Cel-1
<ol>
 <li>Przeprowadź amplifikację PCR genomowego DNA z próbek transfekowanych ZFN oraz genomowego DNA kontroli pozytywnej dostarczonej w zestawie, używając dołączonych starterów. Reakcję PCR przeprowadza się zgodnie z następującymi warunkami: (patrz tabela w biuletynie technicznym Custom ZFN).</li>
 <li>Aby uzyskać heterodupleksy z homodupleksów PCR, pobierz 10 μl reakcji PCR z każdej próbki traktowanej ZFN oraz z kontroli i zastosuj następujący program w termocyklerze: 
 95 °C, 10 minut
 
 95 °C do 85 °C, -2 °C/sekundę
 
 85 °C do 25 °C, -0,1 °C/sekundę 
4 °C, bezterminowo </li>
 <li>Do każdej reakcji dodaj 1 μl wzmacniacza (enhancer) i 1 μl Nukleazy S (z Transgenomic, numer katalogowy 706025), a następnie inkubuj w temperaturze 42 °C przez 20-40 minut.</li>
 <li>Produkty trawienia rozdziel w żelu PAGE-TBE 10% z odpowiednimi markerami, takimi jak DirectLoad WideRange DNA Ladder (numer katalogowy D7058) (patrz wyniki w biuletynie technicznym Custom ZFN). </li>
 <li>Po wykryciu pozytywnego sygnału w populacjach traktowanych ZFN za pomocą testu cel-I, przystąp do izolacji i charakterystyki klonalnej. </li>
</ol>
7. Izolacja i charakterystyka klonalna
<ol>
 <li>Wyizoluj pojedyncze klony z próbek traktowanych ZFN standardowymi metodami, takimi jak FACS i klonowanie przez rozcieńczenia.</li>
 <li>Pozwól klonom na dostateczną ekspansję, a następnie wydziel odpowiednią frakcję komórek do pozyskania genomowego DNA, zamrażając pozostałe jako materiał bankowany.</li>
 <li>Wytnij genomowe DNA z klonów, używając starterów Cel-I, a następnie poddaj amplikon analizie testem Cel-I (z dodatkiem i bez dodatku WT DNA) lub alternatywnie wykorzystaj ten amplikon do bezpośredniego genotypowania.</li>
 <li>Przeprowadź genotypowanie preferowaną metodą w celu weryfikacji klonów kandydackich zidentyfikowanych jako posiadające edytowane allele.</li>
</ol>
8. Reprezentatywne wyniki
Przykład całego procesu CompoZr ZFN przedstawiono na Rysunku 2. ZFN są dostarczane do komórek, gdzie wiążą się i przecinają odpowiednią sekwencję DNA, co powoduje powstanie pęknięcia obu nici (DSB). Naturalny proces naprawczy, niehomologiczne łączenie końców (NHEJ), naprawia DSB. W niektórych przypadkach nieprawidłowe NHEJ prowadzi do delecji, insercji lub substytucji nukleotydów. Amplifikacja PCR wyizolowanego DNA genomowego prowadzi do tworzenia heterodupleksów między amplikonami typu dzikiego a zmodyfikowanymi po etapie denaturacji/odżalania reakcji PCR. Dodatek enzymu Cel-1 powoduje przecięcie wszelkich cząsteczek heterodupleksów. Wyniki analizy Cel-1 są rozdzielane za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (PAGE) w celu potwierdzenia cięcia przez ZFN. Rysunek 3 przedstawia schemat testu Cel-1 oraz oczekiwane wyniki.
Reprezentatywne wyniki dla Cel-1 przedstawiono na Rycina 4 i 5. Rycina 4 zawiera wyniki dla bardzo aktywnej pary ZFN (21%) w komórkach K562; Rycina 5 zawiera wyniki dla mniej aktywnej pary ZFN (2,4%) w komórkach K562. Aktywność ZFN jest potwierdzona na obu rycinach przez obecność dwóch fragmentów PCR poniżej rodzimego fragmentu PCR.
<img src="/files/ftp_upload/3304/3304fig1.jpg" alt="Proces edycji genów, działanie enzymu FokI na helisę DNA, schemat, miejsce cięcia DNA, analiza sekwencji." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Przedstawienie związanych nukleaz z palcami cynkowymi. ZFN to białka inżynieryjne składające się z domeny wiążącej DNA z palcami cynkowymi połączonej z domeną tnącą endonukleazy restrykcyjnej FokI. Po związaniu w formie heterodimeru ZFN wywołują pęknięcie obu nici w określonej przez użytkownika sekwencji DNA.
<img src="/files/ftp_upload/3304/3304fig2.jpg" alt="Schemat procesu edycji genów; od transfekcji do sekwencjonowania DNA poprzez test CEL-I i etapy klonowania." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Schemat procesu świadczenia usług niestandardowych ZFN. Graficzna reprezentacja procesu generowania genetycznie zmodyfikowanej linii komórkowej przy użyciu CompoZr ZFNs.
<img src="/files/ftp_upload/3304/3304fig3.jpg" alt="Schemat edycji genów ZFN; amplifikacja PCR, denaturacja DNA, trawienie enzymem Ce1, elektroforeza." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Schemat testu Cel-1 i jego wyników. A) Plazmid ZFN lub mRNA zostaje dostarczony do komórek. B) Wyekspresowane ZFN wiążą się z sekwencją docelową i przecinają ją, tworząc pęknięcie obu nici (DSB) w części komórek. C) Błędna naprawa niektórych DSB poprzez niehomologiczne łączenie końców prowadzi do insercji lub delecji nukleotydów. D) Genomiczne DNA jest izolowane z transfektowanej puli komórek i amplifikowane w obrębie locusu zainteresowania. E-F) Produkt PCR jest denaturowany i ponownie hybrydyzowany, co prowadzi do powstania heterodupleksów między amplikonami typu dzikiego a zmodyfikowanymi. G) Test z użyciem endonukleazy Cel-1 rozpoznającej niedopasowania prowadzi do rozcięcia cząsteczek heterodupleksu. H) Produkty trawienia enzymem Cel-1 są rozdzielane za pomocą PAGE. Obserwowany stosunek produktu rozcięcia do pasma wyjściowego, wyznaczony za pomocą oprogramowania ImageJ, wskazuje frakcję przeciętą i wydajność ZFN.
<img src="/files/ftp_upload/3304/3304fig4.jpg" alt="Schemat elektroforezy żelu DNA, przedstawiający analizę aktywności ZFN z wykresami i obliczeniami wykonanymi w programie ImageJ." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 4"> 
Rysunek 4. Wyniki Cel-1 dla 21% aktywnych ZFN. Oprogramowanie ImageJ jest dostępne pod adresem: <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a>.
<img src="/files/ftp_upload/3304/3304fig5.jpg" alt="Elektroforeza żelowa PCR; analiza wykresów w programie ImageJ; niedopasowanie fragmentu DNA; schemat obliczania aktywności ZFN." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5. Wyniki Cel-1 dla 2,4% aktywnych ZFN. Oprogramowanie ImageJ jest dostępne pod adresem: <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a>.

<ol><li>Kim, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+restriction+enzymes%3A+zinc+finger+fusions+to+FokI+cleavage+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Hybrid restriction enzymes: zinc finger fusions to FokI cleavage domain.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 1156-1160 (1996).</li>
<li>Urnov, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+endogenous+human+gene+correction+using+designed+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Highly efficient endogenous human gene correction using designed zinc-finger nucleases.</a> Nature. 435, 646-651 (2005).</li>
<li>Moehle, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+addition+into+a+specified+location+in+the+human+genome+using+designed+zinc+finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Targeted gene addition into a specified location in the human genome using designed zinc finger nucleases.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 3055-3060 (2007).</li>
<li>Meyer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+targeting+by+homologous+recombination+in+mouse+zygotes+mediated+by+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Gene targeting by homologous recombination in mouse zygotes mediated by zinc-finger nucleases.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 15022(2010).</li>
<li>Geurts, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockout+rats+via+microinjection+of+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Knockout rats via microinjection of zinc-finger nucleases.</a> Science. 325, 433(2009).</li>
<li>Meng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+inactivation+in+zebrafish+using+engineered+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Targeted gene inactivation in zebrafish using engineered zinc-finger nucleases.</a> Nat. Biotechnol. 26, 695-701 (2008).</li>
<li>Young, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+targeted+gene+disruption+in+the+soma+and+germ+line+of+the+frog+Xenopus+tropicalis+using+engineered+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Efficient targeted gene disruption in the soma and germ line of the frog Xenopus tropicalis using engineered zinc-finger nucleases.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , Forthcoming (2011).</li>
<li>Wanatabe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockout+of+exogenous+EGFP+gene+in+porcine+somatic+cells+using+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Knockout of exogenous EGFP gene in porcine somatic cells using zinc-finger nucleases.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 402, 14-18 (2010).</li>
<li>Santiago, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+knockout+in+mammalian+cells+by+using+engineered+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Targeted gene knockout in mammalian cells by using engineered zinc-finger nucleases.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5809-5814 (2008).</li>
<li>Lui, P. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+triple-gene+knockout+mammalian+cell+line+using+engineered+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Generation of a triple-gene knockout mammalian cell line using engineered zinc-finger nucleases.</a> Biotechnol. Bioeng. 106, 97-105 (2010).</li>
<li>Moehle, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+addition+into+a+specified+location+in+the+human+genome+using+designed+zinc+finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Targeted gene addition into a specified location in the human genome using designed zinc finger nucleases.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 3055-3060 (2007).</li>
<li>Doyon, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+cold+shock+enhances+zinc-finger+nuclease+mediated+gene+disruption%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Transient cold shock enhances zinc-finger nuclease mediated gene disruption.</a> Nat. Methods. 7, 459-460 (2010).</li>
</ol>

Badacze mogą przekazywać komórki lub zwierzęta zmodyfikowane za pomocą ZFN współpracownikom na podstawie standardowej umowy licencyjnej na badania (Research License Agreement). W takim przypadku firma Sigma prosi o zawarcie umowy o przekazaniu materiałów (material transfer agreement) pomiędzy firmą Sigma, klientem ZFN a ich współpracownikiem. Licencja badawcza jest dostępna pod adresem: <a href="http://www.sigma.com/zfn" target="_blank">http://www.sigma.com/zfn</a>.
W przypadku potencjalnego zastosowania komercyjnego z wykorzystaniem komórek zmodyfikowanych za pomocą ZFN, firma Sigma wymaga ustanowienia licencji komercyjnej.
Produkcja i bezpłatny dostęp do tego artykułu są sponsorowane przez Sigma, Inc.

Po wyizolowaniu komórek zmodyfikowanych za pomocą ZFN posiadają one trwałe i dziedziczne modyfikacje DNA. Umożliwia to generowanie stabilnie zmodyfikowanych linii komórkowych lub hodowlę zwierząt z pożądanymi modyfikacjami genetycznymi w celu prowadzenia badań. Custom ZFN firmy CompoZr stanowią niezawodną metodę edycji genomu w szerokim zakresie typów komórek. Publikacje dotyczące udanej edycji genomu za pomocą ZFN obejmują między innymi ludzkie linie komórkowe oraz modele badawcze myszy, szczura, danio-ostrobramowego, żaby, świni oraz CHO.3,4,5,6,7,8,9 Zdolność do wywołania pęknięcia dwuniciowego w pożądanym miejscu docelowym w określonym typie komórek jest zapewniona, gdy ZFN zostaną prawidłowo wprowadzone do komórki. Możliwe jest również przeprowadzanie sekwencyjnych modyfikacji palcami cynkowymi w komórce, aby uzyskać więcej niż jedną modyfikację genetyczną w obrębie jednej komórki.10 Możliwość wyboru specyficznej sekwencji docelowej i modyfikacji wyłącznie tego konkretnego locus jest głównym czynnikiem umożliwiającym wprowadzanie wielu modyfikacji.
Certyfikat analizy CompoZr Custom ZFN jest generowany przy użyciu tych samych odczynników, które znajdują się w zestawie, co zapewnia, że wszystkie komponenty zestawu zostały dokładnie zwalidowane w celu zagwarantowania sukcesu użytkownika. Poniżej przedstawiono krytyczne etapy całego przebiegu pracy:
Klonowanie komórek
Zdolność do izolacji i namnażania danej linii komórkowej powinna zostać przetestowana przed rozpoczęciem jakichkolwiek eksperymentów z użyciem ZFN. Pojedyncze komórki powinny zostać wyizolowane i namnożone, aby upewnić się, że możliwe jest uzyskanie populacji pochodzącej z jednego klonu. Niektóre linie komórkowe są oporne na ten proces; w takim przypadku pomocne mogą okazać się techniki takie jak wzbogacanie klonów poddanych edycji lub hodowla w pożywce warunkowanej.
Wydajność dostarczania
Optymalizacja wydajności dostarczania jest niezbędna przed wprowadzeniem ZFN. Można zastosować wiele metod, w tym transfekcję opartą na lipidach, elektroporację oraz nukleofekcję. Idealna metoda dostarczania to taka, która zapewnia najbardziej optymalny balans pomiędzy wydajnością dostarczania a przeżywalnością komórek. Ilościowe określenie tej wydajności można przeprowadzić poprzez dostarczenie plazmidu kontrolnego GFP i wykonanie pomiaru za pomocą inspekcji wizualnej lub FACS 24-48 h po dostarczeniu.
Analiza Cel-I
Niezbędne jest przeprowadzenie analizy Cel-I równolegle z odpowiednimi kontrolami, aby upewnić się, że parametry PCR, trawienia i elektroforezy nie wpłyną na interpretację eksperymentu z ZFN. Każdy zestaw zawiera kontrolne DNA genomiczne, które służy do stworzenia obrazu Cel-I w certyfikacie analizy. Amplifikacja kontrolnego DNA z zastosowaniem dostarczonych starterów, a następnie analiza Cel-I, umożliwi użytkownikowi porównanie wyników z obrazem zamieszczonym w certyfikacie analizy (CofA) i wyizolowanie wszelkich potencjalnych nieefektywności w tym aspekcie eksperymentu. Należy również uwzględnić odpowiednią kontrolę negatywną, taką jak próbka typu mock lub próbka komórek traktowanych GFP, aby umożliwić identyfikację wszelkich niespecyficznych produktów cięcia.
Analiza jakościowa/ilościowa pojedynczych klonów komórkowych
Po zastosowaniu ZFN i klonowaniu pojedynczych komórek, populacje komórek można przesiewać pod kątem edycji w interesującym badacza locus za pomocą szeregu metod. W celu zidentyfikowania klonów kandydatów do dalszego genotypowania można przeprowadzić test Cel-I na DNA genomicznym z klonów. Ważne jest, aby przed przeprowadzeniem trawienia Cel-I dodać do amplikonów z próbek amplikon WT w stosunku 1:1, ponieważ klony mutanty homozygotyczne będą zawierać jednorodne cząsteczki, co przełoży się na negatywny wynik testu Cel-I. Alternatywną metodą przesiewania tych klonów kandydatów jest zaprojektowanie jednego starteru PCR wiążącego się bezpośrednio w miejscu docelowym ZFN. Przy zastosowaniu wraz z jednym ze starterów kontrolnych, negatywny wynik testu wskazuje na utratę sekwencji WT. Klon heterozygotyczny zawierający co najmniej jeden allel WT wygeneruje sygnał PCR, lecz można go odróżnić od klonów w pełni WT poprzez przeprowadzenie PCR w formie SYBR qPCR.
Po zidentyfikowaniu potencjalnych klonów za pomocą powyższych metod, można przeprowadzić ich genotypowanie standardową pirosekwencją, sekwencjonowaniem głębokim lub innymi metodami sekwencjonowania. W przypadku wszystkich metod sekwencjonowania należy wytworzyć amplikon z klonalnego DNA genomicznego. W tradycyjnej pirosekwencji allele można rozdzielić poprzez klonowanie TA produktu PCR i sekwencjonowanie poszczególnych kolonii. W przypadku takich metod jak sekwencjonowanie głębokie krok ten nie jest konieczny.
Naprawa kierowana homologią (HDR)
Niniejszy protokół przedstawia metodę wyciszania genów za pomocą ZFN z wykorzystaniem mechanizmu NHEJ. Integracja transgenów może być również przeprowadzona poprzez wprowadzenie plazmidu donora z ramionami homologii flankującymi miejsce cięcia ZFN.11 W takim przypadku pęknięcie dwuniciowe utworzone przez ZFN jest naprawiane przez HDR zamiast NHEJ. Integrację transgenów kierowaną przez HDR można potwierdzić, stosując metody podobne do procedur opisanych w niniejszym protokole.
Rozwiązywanie problemów
Dostarczanie ZFN
Dostarczanie i ekspresja ZFN – proces dostarczania można kontrolować poprzez wprowadzenie plazmidu GFP lub innego podobnego plazmidu w celu wizualizacji i/lub kwantyfikacji. Niską ekspresję wynikającą z niekompatybilności promotora z badanym typem komórek można zniwelować, dostarczając ZFN w formie mRNA. Dodatkowo, w celu dalszego zwiększenia skuteczności ZFN w komórkach, można zastosować metodę szoku termicznego (cold shock).12 W przypadku użycia mRNA niezbędne jest przemycie komórek przed dostarczaniem, aby upewnić się, że wszystkie pochodzące z surowicy RNazy zostały usunięte. Zaleca się również rozmrażanie mRNA na lodzie i dodawanie go do komórek w ostatniej możliwej chwili, aby zminimalizować ryzyko degradacji.
test Cel-I
Podstawą testu Cel-I jest specyficzna i obfita amplifikacja interesującego locus. W przypadku zaobserwowania niespecyficznych produktów amplifikacji należy zastosować standardowe procedury rozwiązywania problemów z PCR w celu zwiększenia specyficzności, takie jak optymalizacja ilości matrycy, stężenia starterów oraz parametrów cykliczności. Należy przeprowadzić analizę PAGE zamiast standardowej elektroforezy w żelu agarozowym, ponieważ ta druga metoda nie zapewnia odpowiedniej rozdzielczości i czułości. Warunki trawienia Cel-I mogą być również optymalizowane, jeśli nie zaobserwowano produktu trawienia lub występuje nadmierne rozmycie prążków. W celu poprawy tych aspektów można przeprowadzić miareczkowanie ilości nukleazy Cel-1 i/lub czasu trawienia.

<table><tbody><tr><td>Nukleaza S (enzym Cel-1)</td><td>Transgenomic</td><td>706025</td><td></td></tr><tr><td>System Expand High Fidelity PCR</td><td>Roche Group</td><td>03 300 242 001</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw Cell Line Nucleofector Kit V</td><td>Lonza Inc.</td><td>VCA-1003</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw GenElute HP Endotoxin-Free Plasmid Maxiprep</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>NA0400</td><td></td></tr></tbody></table>

edycja genomu przy użyciu niestandardowych nukleaz z palcami cynkowymi (zfn) compozr

Genome Editing with CompoZr Custom Zinc Finger Nucleases (ZFNs)

Edycja genomu to potężna technika, która może być wykorzystana do wyjaśnienia funkcji genów oraz genetycznych podstaw chorób. Tradycyjne metody edycji genów, takie jak mutogeneza chemiczna czy losowa integracja sekwencji DNA, wprowadzają niekontrolowane zmiany genetyczne w sposób mało wydajny i wymagają włączenia niepożądanych sekwencji syntetycznych lub zastosowania nietypowych warunków hodowli, co może zaburzyć analizę biologiczną. W przeciwieństwie do nich, przejściowa ekspresja ZFN w komórce umożliwia precyzyjną, dziedziczną edycję genów przy wysokiej wydajności, bez konieczności podawania substancji chemicznych czy integracji syntetycznych transgenów.
Nukleazy z palcem cynkowym (ZFN) to enzymy, które wiążą i przecinają określone sekwencje dwuniciowego DNA (dsDNA). Funkcjonalna jednostka CompoZr ZFN składa się z dwóch pojedynczych białek monomerycznych, które wiążą „półwitrynę” DNA o długości około 15-18 nukleotydów (patrz Rysunek 1). Gdy dwa monomery ZFN „trafią” w swoje sąsiednie miejsca docelowe, domeny tnące DNA dimeryzują, powodując pęknięcie obu nici (DSB) w DNA.1 Wprowadzenie indukowanych przez ZFN pęknięć DSB w genomie stanowi podstawę do wysoce wydajnej edycji genomu. Niedoskonała naprawa pęknięć DSB w komórce poprzez szlak naprawy DNA poprzez niespecyficzne łączenie końców (NHEJ) może prowadzić do powstania niewielkich insercji i delecji (indeli). Powstanie indeli w sekwencji kodującej gen komórki może skutkować przesunięciem ramki odczytu i następczym funkcjonalnym wyłączeniem locusu genu z wysoką wydajnością.2 Choć niniejszy protokół opisuje zastosowanie ZFN do stworzenia knockoutu genu, integracja transgenów może być również przeprowadzona poprzez naprawę kierowaną homolgią w miejscu cięcia ZFN.
Usługa CompoZr Custom ZFN stanowi systematyczne, kompleksowe i dobrze scharakteryzowane podejście do celowanej edycji genów dla społeczności naukowej z wykorzystaniem technologii ZFN. Naukowcy z firmy Sigma ściśle współpracują z badaczami, aby 1) przeprowadzić analizę wstępną, obejmującą badanie struktury odpowiedniego genu, jego biologii oraz systemu modelowego zgodnie z celami projektu, 2) wykorzystać tę wiedzę do opracowania właściwej strategii celowania, 3) a następnie zaprojektować, zbudować i funkcjonalnie zwalidować ZFN pod kątem aktywności w odpowiedniej linii komórkowej. Badacz otrzymuje genomiczne DNA kontroli dodatniej i startery, a także gotowe do użycia odczynniki ZFN dostarczone w formie plazmidowego DNA oraz mRNA transkrybowanego in vitro. Odczynniki te mogą być następnie dostarczone w celu transientnej ekspresji w wybranej przez badacza linii lub typie komórek. Próbki są następnie testowane pod kątem edycji genów w interesującym locus za pomocą standardowych technik biologii molekularnej, w tym amplifikacji PCR, trawienia enzymatycznego i elektroforezy. Po wykryciu pozytywnego sygnału edycji genów w początkowej populacji, komórki są klonowane metodą pojedynczych komórek i genotypowane w celu identyfikacji klonów/alleli mutantowych.

Usługa CompoZr Custom Zinc-Finger Nuclease (ZFN) umożliwia precyzyjną edycję genomu w dowolnym organizmie lub linii komórkowej w dowolnym locus zdefiniowanym przez użytkownika. Niniejszy artykuł opisuje proces projektowania, produkcji, walidacji i wdrażania usługi CompoZr Custom ZFN.

Edycja genomu przy użyciu niestandardowych nukleaz z palcami cynkowymi (ZFN) CompoZr

Edycja genomu to potężna technika, która może być wykorzystywana do wyjaśniania funkcji genów oraz genetycznych podstaw chorób. Tradycyjne metody edycji genów, takie jak...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wykorzystanie specjalnie zaprojektowanej nukleazy z palcem cynkowym (ZFN), aby wprowadzić mutację zaburzającą w specyficznym locus, co w efekcie pozwoli na stworzenie linii komórkowej z nokautem. Jest to osiągane poprzez wstępną analizę sekwencji DNA genu docelowego za pomocą algorytmu composer w celu wygenerowania projektów insco ZFN. Nukleazy ZFN są następnie montowane, wprowadzane do komórek poprzez nuklefekcję, a następnie poddawane przesiewaniu pod kątem aktywności w ich odpowiednich miejscach docelowych w genie w celu wygenerowania linii komórkowej z nokautem.Wybrany typ komórek poddaje się najpierw działaniu aktywnego ZFN. Następnie populację tę rozdziela się na pojedyncze komórki. Na koniec populacje klonalne są namnażane w celu przeprowadzenia dodatkowej charakterystyki genotypowej. Klony z dysrupcyjnymi zdarzeniami niehomologicznego łączenia końców w miejscu docelowym mogą być dalej badane w kontekście funkcjonalnego nokautu genu.Ostatecznie, do potwierdzenia obserwowanych zmian w fenotypie komórkowym wynikających z modyfikacji genetycznej za pomocą ZFN niezbędna jest charakterystyka genetyczna, w tym test one assay oraz sekwencjonowanie DNA. Główną zaletą nukleaz z palcami cynkowymi w stosunku do istniejących metod, takich jak tradycyjna rekombinacja homologiczna, jest fakt, że edycja genów umożliwiona przez ZFN pozwala badaczom na wprowadzanie specyficznych i przewidywalnych modyfikacji genetycznych bez konieczności selekcji.Obejmuje to nokauty genów, modyfikacje genów oraz integracje genów. Proces projektowania ZFN rozpoczyna się od uproszczonych badań bioinformatycznych, które koncentrują się na identyfikacji unikalnych regionów sekwencji zawierających odpowiednią liczbę i jakość motywów wiążących palców cynkowych, które sprzyjają przeprowadzeniu nokautu genu. Jasno określona strategia eksperymentalna znacznie ułatwi ten proces, podobnie jak informacje na temat genu docelowego, takie jak nietypowa struktura genu, specyfika biologiczna związana z locus genetycznym oraz wszelkie regiony homologiczne w innych częściach genomu.W przypadku bardziej złożonych projektów naukowiec z firmy Sigma będzie ściśle współpracować z badaczami. Białka ZFN są projektowane in silico, a następnie przewiduje się miejsca poza docelowe w całym genomie. Dla każdego potencjalnego miejsca docelowego ZFN przeprowadza się również analizę maskowania sekwencji powtarzalnych oraz analizę polimorfizmów pojedynczych nukleotydów (SNP).Przed produkcją ZFN przeprowadza się analizę najlepszych miejsc docelowych dla ZFN. Badacze często zadają pytanie: czy ZFN będą odpowiednie dla mojego projektu? Aby najlepiej odpowiedzieć na to pytanie, należy wziąć pod uwagę kilka kluczowych kwestii.Czy potrafisz efektywnie dostarczyć i wyexpronować typową kasetę ekspresyjną w wybranym typie komórek? Czy jesteś w stanie wyizolować, a następnie namnożyć klony pojedynczych komórek? I wreszcie, czy wyłączenie wybranego genu ma szkodliwy wpływ na wzrost lub żywotność komórek?Odpowiedzi na te pytania mogą, choć nie muszą, w ścisły sposób determinować wykonalność projektu. Pozwalają one jednak ocenić, jak łatwy lub trudny może być dany projekt, lub mogą rzucić światło na konkretne aspekty przepływu pracy, które są kluczowe dla sukcesu. Firma Sigma wykorzystuje swoje archiwum modułów palców cynkowych do montażu zatwierdzonych projektów ZFN.Każdy projekt ZFN jest montowany i weryfikowany sekwencyjnie na wysokoprzepustowej platformie klonowania. Następnie ZF NS są dostarczane w formie plazmidowego DNA do odpowiedniej, dobrze scharakteryzowanej linii komórkowej, gdzie ulegają wystarczającej ekspresji w ciągu 24 do 48 godzin. Następnie z każdej puli komórek traktowanych ZFN izoluje się DNA genomowe, po czym przeprowadza amplifikację PCR miejsca docelowego ZFN.Przeprowadza się test jednej komórki (cell one assay) na produktach PCR, a aktywność ZFN ocenia się za pomocą elektroforezy żelowej. Dostarczany jest projekt ZFN o najwyższej aktywności. Dodatkowo dołączono genomowe DNA kontroli pozytywnej wraz z primerami do PCR w celu odtworzenia wyników przedstawionych w certyfikacie analizy.Aby rozpocząć eksperyment z ZFN, należy wysiać komórki w gęstości 200 000 komórek na mililitr w dniu poprzedzającym nukleofekcję. Następnego dnia należy policzyć komórki i kontynuować procedurę. Jeśli ich gęstość mieści się w przedziale od 250 do 500 000 komórek na mililitr, należy przygotować roztwór do nukleofekcji odpowiedni dla stosowanej linii komórkowej, zgodnie z protokołem producenta.Następnie należy napełnić płytkę sześciodołkową dwiema mililitrami medium na dołek i ogrzać płytkę w inkubatorze przez co najmniej 20 minut. Odwirować 2 miliony komórek na jedną nukleofekcję. Usunąć nadosad i delikatnie resuspender komórki w 10 mililitrach HBSS. Następnie powtórzyć procedurę płukania jeszcze raz lub dwa razy; ZFN dostarczone w formie mRNA zazwyczaj dają wyższą częstotliwość edycji genów niż te same ZFN dostarczone w formie plazmidowego DNA.Jednakże dostarczanie ZF NS w formie mRNA wymaga podjęcia kilku dodatkowych środków ostrożności w celu uniknięcia degradacji. Po pierwsze, należy przemyć komórki od dwiema do trzech dużych objętości PBS lub HBSS, aby usunąć RNA pochodzące z surowicy. Ponadto mRNA należy przez cały czas trwania eksperymentu przechowywać w lodzie.Na koniec należy dodać mRNA do komórek w ostatniej możliwej chwili, aby uniknąć jego degradacji. Następnie należy przygotować probówki eksperymentalne zgodnie z tabelą w dedykowanym biuletynie technicznym ZFN. Dla każdej transfekcji należy resuspendować komórki w 100 µL roztworu do nukleofekcji V. Przygotowujemy jedną reakcję na raz.Do każdej probówki zawierającej DNA lub mRNA należy dodać 100 µL komórek. Następnie każdą mieszaninę przenosi się do kuwety do elektroporacji o szerokości 2 mm. Komórki poddaje się nuklefekcji przy użyciu odpowiedniego programu, przeprowadzając zabieg niezwłocznie po przeniesieniu każdej próbki.Za pomocą pipety transferowej dodaj 0,5 mL ogrzanego medium z dołka przygotowanej płytki 6-dołkowej. Ostrożnie przenieś komórki z powrotem do pozostałego medium. W tym dołku dokończ wszystkie reakcje, a następnie umieść płytkę z powrotem w inkubatorze na okres od jednego do trzech dni.Po nukleoporacji wyizoluj DNA genomowe, używając zestawu genal loop mammalian genomic DNA mini prep kit, bez konieczności zbierania wszystkich połączonych komórek. Następnie, wykorzystując dołączone startery, przeprowadź reakcję PCR w celu amplifikacji DNA genomowego z próbek transfekowanych ZFN oraz z dołączonego do zestawu pozytywnego kontrolnego DNA genomowego.Każdy produkt PCR poddaj trawieniu, dodając 1 µL enhancera oraz 1 µL nukleazy S. Inkubuj próbki w temperaturze 42 °C przez 20 do 40 minut. Następnie przeprowadź elektroforezę produktów trawienia na 10% żelu TBE z odpowiednimi markerami, takimi jak direct load wide range DNA ladder, po przeprowadzeniu klonowania pojedynczych komórek próbek traktowanych ZFN i doprowadzeniu do wystarczającej ekspansji klonów.Zabierz część komórek w celu izolacji genomicznego DNA, kontynuuj hodowlę pozostałych komórek lub zamroź je jako materiał bankowany. Powiel genomiczne DNA przy użyciu starterów cell one i przeanalizuj produkt za pomocą testu cell one z dodatkiem amplikonu typu dzikiego w stosunku jeden do jednego oraz bez niego. Alternatywnie, wykorzystaj ten amplikon, aby przejść bezpośrednio do genotypowania kandydackich klonów poprzez sekwencjonowanie lub inne preferowane metody.W tym przykładzie do oszacowania aktywności pary ZF NS w komórkach K 5 62 wykorzystano test cell one. Ścieżka glan reprezentuje kontrolę pozytywną, a ścieżka Z pokazuje produkty cięcia, na podstawie których oszacowano częstotliwość niedopasowanych fragmentów PCR; na podstawie tych danych aktywność ZF N oceniono na 21%, co jest wartością bardzo wysoką. Tutaj przedstawiamy aktywność innej pary Z fns.Ta para ZFN była znacznie mniej aktywna niż druga, ale wciąż skuteczna. Szacuje się, że spowodowała powstanie indeli w 2,4% populacji komórek. Niektóre z bardziej krytycznych parametrów dotyczących pracy z ZF X obejmują optymalizację dostarczania oraz ekspresji w danym typie komórek.Dzięki optymalizacji tych parametrów można znacznie zmniejszyć ilość czasu i wysiłku potrzebnych do wyizolowania nokautu genu. Klony Z fns stanowią bardzo precyzyjne narzędzie do ukierunkowanej edycji genomu, jeśli są używane prawidłowo i w odpowiednim kontekście. Mogą one zapewnić naukowcom bardzo szybki i wydajny sposób badania biologii niemal każdego produktu genowego lub szlaku sygnałowego.

genome-editing-with-compozr-custom-zinc-finger-nucleases-zfns

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Edycja genomu z użyciem niestandardowych nukleaz z cynkowymi palcami CompoZr (ZFN)

Ten film demonstruje technikę edycji genomu w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych (hPSC) za pomocą nukleazy palca cynkowego. Ponieważ hPSC mogą być potencjalnie różnicowane w różne typy komórek, technologia ta jest pomocna w badaniach patologicznych i farmakologicznych in vitro w sposób specyficzny dla pacjenta.

Edycja genomu oparta na nukleazie palca cynkowego: technika modyfikacji genomu w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych za pomocą dwuniciowego mechanizmu naprawy zależnego od homologii

Designerskie nukleazy, takie jak nukleazy palców cynkowych (ZFN) i aktywatory transkrypcji podobne do efektorów (TALENs) mogą być używane do modyfikacji genomu mysich zarodków preimplantacyjnych poprzez aktywowanie zarówno szlaku niehomologicznego łączenia końców (NHEJ), jak i homologicznej rekombinacji (HR). Postępy te umożliwiają szybkie generowanie myszy z precyzyjnymi modyfikacjami genetycznymi.

Inżynieria genomu myszy przy użyciu nukleaz projektanta

Reporterowe linie komórkowe oferują sposób na wizualizację, śledzenie i izolowanie interesujących komórek z heterogenicznych populacji. Jednak celowanie w geny za pomocą konwencjonalnej rekombinacji homologicznej w ludzkich embrionalnych komórkach macierzystych jest wyjątkowo nieefektywne. W tym miejscu opisujemy celowanie w locus czynnika transkrypcyjnego PITX3 specyficznego dla OUN za pomocą EGFP przy użyciu rekombinacji homologicznej wzmocnionej nukleazą palca cynkowego.

Ukierunkowanie genów na nukleazę palca cynkowego w ludzkich embrionalnych komórkach macierzystych

Edycja genomu ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) może być przeprowadzona szybko i efektywnie. Przedstawiono tutaj solidną procedurę eksperymentalną inżynierii genetycznej hPSC, której przykładem jest edycja locus AAVS1 w celu ekspresji EGFP i wprowadzenia oporności na antybiotyki.

Opracowanie ludzkich pluripotencjalnych linii komórek macierzystych z edytowanym genomem: od ukierunkowania do izolacji

Ukierunkowana edycja genomu w systemie modelowym Danio rerio (danio pręgowany) została znacznie ułatwiona dzięki pojawieniu się metod opartych na CRISPR. W niniejszym artykule opisujemy uproszczony, solidny protokół generowania i identyfikacji nonsensownych alleli pochodzących z CRISPR, który obejmuje test mobilności heterodupleksowej i identyfikację mutacji przy użyciu sekwencjonowania nowej generacji.

Wydajna produkcja i identyfikacja nokautów genów generowanych przez CRISPR/Cas9 w systemie modelowym Danio rerio

Celem tego protokołu jest umożliwienie bezproblemowej edycji genomu C. elegans za pomocą CRISPR/Cas9 przy użyciu złożonych kompleksów rybonukleoproteinowych i markera co-CRISPR dpy-10 do badań przesiewowych. Protokół ten może być stosowany do dokonywania różnych modyfikacji genetycznych u C. elegans, w tym insercji, delecji, wymiany genów i podstawiania kodonów.

Edycja CRISPR/Cas9 genu rbm-3.2 C. elegans przy użyciu markera przesiewowego dpy-10 Co-CRISPR i złożonych kompleksów rybonukleoproteinowych.

Ten protokół opisuje podejście ułatwiające precyzyjną edycję w zarodkach danio pręgowanego przy użyciu technologii CRISPR-Cas9. Przedstawiono proces fenotypowania, aby zademonstrować możliwość zastosowania tych technik do modelowania wariantu genu związanego z zespołem wydłużonego odstępu QT.

Precyzyjne edycje Knock-In za pośrednictwem CRISPR-Cas9 w sercach danio pręgowanego

Technologie CRISPR-Cas zrewolucjonizowały dziedzinę edycji genomu. Jednak znalezienie i wyizolowanie pożądanej edycji linii zarodkowej pozostaje głównym wąskim gardłem. Dlatego protokół ten opisuje solidną metodę szybkiego badania przesiewowego nasienia danio pręgowanego wstrzykniętego za pomocą F0 CRISPR pod kątem edycji linii zarodkowej przy użyciu standardowych technik PCR, trawienia restrykcyjnego i elektroforezy żelowej.

Badania przesiewowe plemników w celu szybkiej izolacji zmian linii zarodkowej u danio pręgowanego

Ten protokół opisuje, jak przeprowadzić efektywną edycję zasady adeninowej bez ograniczeń PAM, aby zbudować precyzyjny model choroby danio pręgowanego za pomocą zSpRY-ABE8e.

Wydajna edycja bazy bez PAM do modelowania chorób genetycznych człowieka u danio pręgowanego za pomocą zSpRY-ABE8e

W tym miejscu opisujemy protokół generowania matczynego mutanta, który łączy stabilną linię knock-in zpc: cas9 z dostarczaniem kaset ekspresyjnych sgRNA za pośrednictwem Tol2.

Generowanie matczynych mutantów przy użyciu zpc:cas9 Knock-in Danio pręgowanego

Poznaj edycję genomu za pomocą niestandardowych nukleaz palca cynkowego CompoZr. Ta metoda umożliwia precyzyjne wprowadzanie mutacji w wybranych loci genomu w różnych typach komórek.

Edycja genomu przy użyciu niestandardowych nukleaz z palcami cynkowymi (ZFN) CompoZr

Przeglądaj więcej filmów