Name: Zmiana kierunku i orientacji pola elektrycznego podczas aplikacji impulsów elektrycznych usprawnia transfer genów plazmidu in vitro (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 46 s
Description: Poznaj elektroporację z zmienną orientacją pola elektrycznego w celu zwiększenia efektywności transfekcji genowej w komórkach CHO. Ta metoda podwaja skuteczność transferu DNA bez wpływu na żywotność komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Niniejsza praca została sfinansowana przez Słowiańską Agencję Badawczą (projekt J2-9770, centrum infrastrukturalne IP-0510 oraz program P2-0249). Ten film stanowi materiał uzupełniający do warsztatów naukowych i kursu podyplomowego „Electroporation-based Technologies and Treatments”, zorganizowanych przez Wydział Elektrotechniki Uniwersytetu w Lublanie w Słowenii. Autorzy dziękują również Duši Hodžič za uprzejme udostępnienie plazmidowego DNA.

1. Hodowla komórek, przygotowanie plazmidów i buforów do eksperymentu
<ol>
 <li>W tym doświadczeniu wykorzystano komórki jajnika chomika syryjskiego (CHO-K1). Komórki hodowano w pożywce HAM-F12 (PAA) uzupełnionej o 2 mM L-glutaminy, 10% płatowej surowicy bydlęcej, 400 µl/l gentamycyny (wszystko od Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen, Niemcy) oraz 1 ml/l krystacyliny (Pliva, Zagrzeb, Chorwacja). Komórki inkubowano przez 24h w temperaturze 37°C w wilgotnej atmosferze z 5% CO2 w inkubatorze.</li>
 <li>Namnożyć plazmid pEGFP-N1 (Clontech Laboratories Inc., Mountain View, CA, USA) kodujący zielone białko fluorescencyjne (GFP) w szczepie Escherichia coli DH5α i wyizolować go za pomocą zestawu HiSpeed Plasmid Maxi Kit (Qiagen, Hilden, Niemcy). Stężenie DNA plazmidowego (plazmid rozpuszczony w buforze TE) należy oznaczyć spektrofotometrycznie przy 260 nm i potwierdzić za pomocą elektroforezy żelowej.</li>
 <li>Przygotować izoosmolarny bufor fosforanowy (10 mM Na2HPO4, 10 mM NaH2PO4, 1 mM MgCl2, 250 mM sacharozy, pH 7,4).</li>
 <li>W dniu eksperymentu przygotować zawiesinę komórkową poprzez trypsynizację z użyciem 0,25% roztworu trypsyny/EDTA (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen, Niemcy). Wirować komórki przez 5 min przy 1000 rpm (180 x g) w temperaturze 4°C (Sigma, Niemcy) i resuspender osad komórkowy w izoosmolarnym buforze fosforanowym do gęstości 5 × 106 komórek/ml.</li>
</ol>

2. Sprzęt sprzętowy
<ol>
 <li>Komórki są poddawane działaniu pola elektrycznego w końcówce pipety (Rysunek 1) z zintegrowanymi elektrodami podłączonymi do prototypowego generatora wysokiego napięcia. Geometria końcówki i elektrod umożliwia przyłożenie stosunkowo jednorodnego pola elektrycznego, a generator pozwala na dostarczenie impulsów elektrycznych w różnych kierunkach. Końcówka oraz generator zostały opracowane w Laboratorium Biocybernetyki na Wydziale Elektrotechniki Uniwersytetu w Lublanie 1.</li>
</ol>

<img src="/files/ftp_upload/3309/3309fig1.jpg" alt="Schemat elektroforezy kapilarnej przedstawiający układ rozdziału i szczegóły detektora w warunkach laboratoryjnych." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> Rysunek 1. Pionowy i poziomy (a) przekrój poprzeczny oraz fotografia (b) końcówki pipety z zintegrowanymi elektrodami. Na przekroju poprzecznym kolor szary oznacza obudowę plastikową, a czarny elektrody. Końcówka pipety z zintegrowanymi elektrodami składa się z czterech cylindrycznych elektrod prętowych. Elektrody wykonane są ze stali nierdzewnej; ich średnica wynosi 1.4 mm, sąsiednie elektrody są oddalone od siebie o 1 mm, a elektrody przeciwległe o 2 mm. Elektrody są wklejone do plastikowej końcówki równolegle, a ich długość robocza wynosi 30 mm 2.

3. Protokół elektrotransferu genów
<ol>
 <li>Dodaj plazmid pEGFP-N1 do zawiesiny komórkowej w stężeniu 10 μg/ml.</li>
 <li>Inkubuj mieszaninę przez 2-3 minuty w temperaturze pokojowej przed przyłożeniem impulsów elektrycznych.</li>
 <li>Odciągnij 100 µl zawiesiny komórkowej do końcówki pipety z zintegrowanymi elektrodami.</li>
 <li>Aby uzyskać najlepszą wydajność elektrototransferu genów i zachować żywotność komórek, należy zastosować optymalne parametry impulsów elektrycznych. W tym doświadczeniu do każdej próbki przyłożono serię 8 impulsów prostokątnych (każdy o czasie trwania 1 ms, amplitudzie 225 V i częstotliwości repetycji 1 Hz), używając prototypowego generatora wysokiego napięcia. Zastosowano dwa różne protokoły pola elektrycznego (Rysunek 2): w pierwszym protokole wszystkie impulsy są dostarczane w tym samym kierunku, natomiast w drugim impulsy są dostarczane poprzez naprzemienną zmianę kierunku i orientacji pola elektrycznego. Drugiego protokołu można użyć wyłącznie z odpowiednim generatorem impulsów, który umożliwia aplikację impulsów elektrycznych w różnych kierunkach.</li>
 <li>Bezpośrednio po przyłożeniu impulsów przenieś komórki z końcówki pipety do płytki 6-dołkowej i dodaj płodową surowicę cielęcą (FCS-Sigma, USA) (25% objętości próbki).</li>
 <li>Inkubuj komórki przez 5 min w temperaturze 37°C, aby umożliwić regenerację błony komórkowej.</li>
 <li>Dodaj 2 ml pożywki HAM-F12 do każdej próbki w dołku płytki i inkubuj komórki przez 24h w temperaturze 37°C w inkubatorze w nawilżonej atmosferze 5% CO2.</li>
</ol>

<img src="/files/ftp_upload/3309/3309fig2.jpg" alt="Schemat sterowania silnikiem krokowym, przedstawiający przebiegi fal 1-2 i 3-4 wraz ze wskaźnikami sekwencji kierunkowej." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> Rycina 2.Protokoły pola elektrycznego: (a) wszystkie impulsy są dostarczane w tym samym kierunku, (b) impulsy są dostarczane poprzez naprzemienną zmianę kierunku i orientacji pola elektrycznego.

4. Pozyskiwanie obrazów i określanie wydajności elektrootransferu genów
<ol>
 <li>Wydajność elektrottransferu genów określa się jako procent komórek wykazujących ekspresję GFP 24h po przyłożeniu impulsu.</li>
 <li>Komórki obserwuje się za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego (w naszym przypadku Zeiss 200, Axiovert, ZR Niemcy) ze światłem wzbudzenia o długości fali 488 nm generowanym przez system monochromatora (PolyChrome IV, Visitron, Niemcy), a emisję wykrywa się przy 507 nm. Obrazy rejestruje się za pomocą systemu obrazowania (MetaMorph imaging system, Visitron, Niemcy), jednak można również zastosować inne podobne oprogramowanie do akwizycji.</li>
 <li>Należy pobrać co najmniej pięć obrazów (kontrast fazowy i fluorescencja zielona) przy 20-krotnym powiększeniu obiektywu.</li>
 <li>Należy policzyć komórki na obrazie w kontraście fazowym oraz komórki wykazujące ekspresję GFP na obrazie z fluorescencją zieloną. Procentową wydajność elektrottransferu genów wyznacza się, dzieląc liczbę komórek wykazujących ekspresję GFP przez całkowitą liczbę komórek na każdym odpowiednim obrazie (Rysunek 3).</li>
</ol>

5. Reprezentatywne wyniki:
<img src="/files/ftp_upload/3309/3309fig3.jpg" alt="Wykres słupkowy wydajności elektrottransferu genów z porównaniem protokołów kierunkowości impulsów." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> Rysunek 3. Przedstawiono procent komórek wykazujących ekspresję GFP w przypadku dostarczenia wszystkich impulsów w tym samym kierunku oraz w przypadku dostarczenia impulsów poprzez naprzemienną zmianę kierunku i orientacji pola elektrycznego. Komórki poddano serii ośmiu impulsów o amplitudzie 225 V, czasie trwania 1 ms i częstotliwości powtórzeń 1 Hz. Wyniki uzyskano za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Każda wartość na wykresie reprezentuje średnią z trzech niezależnych eksperymentów ± odchylenie standardowe. Zmiana kierunku i orientacji pola elektrycznego powoduje wzrost procentowego udziału komórek wykazujących ekspresję GFP.

<ol><li>Rebersek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporator+with+automatic+change+of+electric+field+direction+improves+gene+electrotransfer+in-vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Eng+Online%22%5BJournal%5D)">Electroporator with automatic change of electric field direction improves gene electrotransfer in-vitro.</a> Biomed Eng Online. 6, 25-25 (2007).</li>
<li>Trontelj, K., Rebersek, M., Miklavcic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tip+electrode+chamber+for+small+volume+electroporation%2C+electrofusion%2C+and+gene+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Tip electrode chamber for small volume electroporation, electrofusion, and gene transfection.</a> 18, (2006).</li>
<li>Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+into+mouse+lyoma+cells+by+electroporation+in+high+electric+fields%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields.</a> EMBO J. 1, 841-841 (1982).</li>
<li>Daud, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+I+trial+of+interleukin-12+plasmid+electroporation+in+patients+with+metastatic+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Phase I trial of interleukin-12 plasmid electroporation in patients with metastatic melanoma.</a> J Clin Oncol. 26, 5896-5903 (2008).</li>
<li>Pavlin, M., Miklavcic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+conductivity+of+a+suspension+of+permeabilized+cells%3A+a+theoretical+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Effective conductivity of a suspension of permeabilized cells: a theoretical analysis.</a> Biophys J. 85, 719-729 (2003).</li>
<li>Xie, T., Sun, L., Zhao, H., Fuchs, J., Tsong, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+mechanisms+of+electric+field-induced+DNA+transfection.+IV.+Effects+of+DNA+topology+on+cell+uptake+and+transfection+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Study of mechanisms of electric field-induced DNA transfection. IV. Effects of DNA topology on cell uptake and transfection efficiency.</a> Biophys J. 63, 1026-1031 (1992).</li>
<li>Rols, M., Delteil, C., Serin, G., Teissie, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature+effects+on+electrotransfection+of+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Temperature effects on electrotransfection of mammalian cells.</a> Nucleic Acids Res. 22, 540-540 (1994).</li>
<li>Golzio, M., Teissie, J., Rols, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+synchronization+effect+on+mammalian+cell+permeabilization+and+gene+delivery+by+electric+field%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Cell synchronization effect on mammalian cell permeabilization and gene delivery by electric field.</a> Biochim Biophys Acta. 1563, 23-28 (2002).</li>
<li>Haberl, S., Miklavcic, D., Pavlin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Mg+ions+on+efficiency+of+gene+electrotransfer+and+on+cell+electropermeabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Bioelectrochemistry%22%5BJournal%5D)">Effect of Mg ions on efficiency of gene electrotransfer and on cell electropermeabilization.</a> Bioelectrochemistry. 79, 265-271 (2010).</li>
<li>Rols, M., Teissie, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electropermeabilization+of+mammalian+cells+to+macromolecules%3A+control+by+pulse+duration%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Electropermeabilization of mammalian cells to macromolecules: control by pulse duration.</a> Biophys J. 75, 1415-1423 (1998).</li>
<li>Kanduser, M., Miklavcic, D., Pavlin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+involved+in+gene+electrotransfer+using+high-and+low-voltage+pulses-An+in+vitro+study%5BTitle%5D)+AND+%22Bioelectrochemistry%22%5BJournal%5D)">Mechanisms involved in gene electrotransfer using high-and low-voltage pulses-An in vitro study.</a> Bioelectrochemistry. 74, 265-271 (2009).</li>
<li>Pavlin, M., Flisar, K., Kanduser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+electrophoresis+in+gene+electrotransfer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Membr+Biol%22%5BJournal%5D)">The role of electrophoresis in gene electrotransfer.</a> J Membr Biol. 236, 75-79 (2010).</li>
<li>Sersa, G., Cemazar, M., Semrov, D., Miklavcic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changing+electrode+orientation+improves+the+efficacy+of+electrochemotherapy+of+solid+tumors+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Bioelectrochem+Bioenerg%22%5BJournal%5D)">Changing electrode orientation improves the efficacy of electrochemotherapy of solid tumors in mice.</a> Bioelectrochem Bioenerg. 39, 61-66 (1996).</li>
<li>Faurie, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electro-mediated+gene+transfer+and+expression+are+controlled+by+the+life-time+of+DNA%2Fmembrane+complex+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gene+Med%22%5BJournal%5D)">Electro-mediated gene transfer and expression are controlled by the life-time of DNA/membrane complex formation.</a> J Gene Med. 12, 117-125 (2010).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Elektrotransfer genów to wszechstronna technika biotechnologiczna, która umożliwia wprowadzanie DNA do komórek poprzez aplikację krótkich impulsów elektrycznych o wysokim napięciu 3 i stanowi bezpieczniejszą alternatywę dla wektorów wirusowych ze względu na swoje bezpieczeństwo, skuteczność i łatwość zastosowania. Chociaż obecnie elektrotransfer genów jest szeroko stosowany do transfekcji wszystkich typów komórek, a zgłoszono już pierwszą fazę I badań klinicznych z wykorzystaniem tej metody 4, mecha...

<table><tbody><tr><td>HAM-F12</td><td>Laboratoria PAA</td><td>E15-016</td><td>pożywka hodowlana</td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>płodowa surowica bydlęca</td><td>Laboratoria PAA</td><td>A15-151</td><td></td></tr><tr><td>gentamycyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1397</td><td>antybiotyk</td></tr><tr><td>krystalina</td><td>Pliva</td><td>625110</td><td>antybiotyk</td></tr><tr><td>pEGFP-N1</td><td>Clontech Laboratories</td><td>6085-1</td><td>plazmidowe DNA</td></tr><tr><td>Zestaw do maksymalnej izolacji plazmidów HiSpeed Plasmid Maxi Kit</td><td>Qiagen</td><td>12662</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Merck &amp;amp; Co., Inc.</td><td>F640786 933</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>TKI Hrastnik</td><td>0795</td><td></td></tr><tr><td>MgCl₂&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-8266</td><td></td></tr><tr><td>sacharoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>16104</td><td></td></tr><tr><td>roztwór trypsyny/EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4174</td><td></td></tr><tr><td>końcówka do pipety</td><td>Wykonane na zamówienie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>generator impulsów elektrycznych</td><td>Wykonany na zamówienie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>płytka 6-dołkowa</td><td>Produkty z tworzyw sztucznych Techno</td><td>92406</td><td></td></tr><tr><td>probówka wirówkowa 15 ml</td><td>Produkty z tworzyw sztucznych Techno</td><td>91015</td><td></td></tr><tr><td>75 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; kolba hodowlana</td><td>Techno Plastic Products</td><td>90076</td><td></td></tr></tbody></table>

zmiana kierunku i orientacji pola elektrycznego podczas aplikacji impulsów elektrycznych poprawia transfer genów plazmidowych in vitro

Changing the Direction and Orientation of Electric Field During Electric Pulses Application Improves Plasmid Gene Transfer in vitro

Elektrotransfer genów to fizyczna metoda dostarczania genów do komórek poprzez zastosowanie krótkich i intensywnych impulsów elektrycznych, które powodują destabilizację błony komórkowej, czyniąc ją przepuszczalną dla małych cząsteczek i umożliwiając transfer dużych cząsteczek, takich jak DNA. Stanowi ona alternatywę dla wektorów wirusowych ze względu na swoje bezpieczeństwo, skuteczność i łatwość zastosowania. W elektrotransferze genów stosuje się różne protokoły impulsów elektrycznych w celu osiągnięcia maksymalnej transfekcji genów, z których jednym jest zmiana kierunku i orientacji pola elektrycznego podczas podawania impulsów. Zmiana kierunku i orientacji pola elektrycznego zwiększa obszar błony kompetentny dla wniknięcia DNA do komórki. W tym filmie demonstrujemy różnicę w skuteczności elektrotransferu genów w sytuacji, gdy wszystkie impulsy są podawane w tym samym kierunku, oraz gdy impulsy są podawane poprzez naprzemienną zmianę kierunku i orientacji pola elektrycznego. W tym celu wykorzystano końcówkę z zintegrowanymi elektrodami oraz prototypowy generator wysokiego napięcia, który umożliwia zmianę kierunku pola elektrycznego podczas aplikacji impulsu elektrycznego. Skuteczność elektrotransferu genów jest określana 24h po zastosowaniu impulsu jako liczba komórek wykazujących ekspresję zielonego białka fluorescencyjnego podzielona przez całkowitą liczbę komórek. Wyniki pokazują, że transfekcja genów zwiększa się, gdy orientacja pola elektrycznego podczas podawania impulsu elektrycznego ulega zmianie.

Transfekcja genów poprzez elektroporację ulega poprawie około dwukrotnej, gdy orientacja pola elektrycznego ulega zmianie podczas aplikacji impulsu, podczas gdy żywotność komórek nie zostaje naruszona. Wzrost wydajności transfekcji genów jest spowodowany zwiększeniem powierzchni błony, która staje się kompetentna do wnikania DNA do wnętrza komórki.

Zmiana kierunku i orientacji pola elektrycznego podczas aplikacji impulsów elektrycznych poprawia transfer genów plazmidowych in vitro

Elektrotransfer genów jest fizyczną metodą dostarczania genów do komórek poprzez przyłożenie krótkich i intensywnych impulsów elektrycznych, które powodują ...

Elektroporacja (transfer genów za pomocą elektrod) jest metodą fizyczną stosowaną do wprowadzania genów do komórek poprzez aplikację krótkich i intensywnych impulsów elektrycznych. W przypadku skutecznego transferu genowego proces obejmuje kilka etapów: tworzenie kompleksu między DNA a błoną komórkową, translokację DNA przez zdezorganizowaną błonę, transfer DNA z cytoplazmy do jądra komórkowego oraz ekspresję genu. W celu osiągnięcia maksymalnej wydajności transfekcji stosuje się różne protokoły impulsów elektrycznych.Jedną z tych metod jest zmiana orientacji pola elektrycznego podczas dostarczania impulsów. W tym filmie demonstrujemy różnicę w wydajności transferu genów przez elektrody w sytuacji, gdy wszystkie impulsy są dostarczane w tym samym kierunku, oraz gdy orientacja pola jest zmieniana. Eksperymenty z wykorzystaniem zmiany orientacji pola elektrycznego przeprowadzono na komórkach jajnika chomika chińskiego, CHOK1.Należy postępować zgodnie z poniższymi krokami: hodować komórki w kolbie z kulturą w inkubatorze przez 24 godziny. W dniu eksperymentu przygotować zawiesinę komórkową, stosując trypsynę w 0,25% roztworze EDTA, a następnie policzyć komórki. Wirować komórki przez pięć minut przy 1000 obr./min w temperaturze 4 °C i resuspender osady komórkowe w buforze fosforanowym ISO OSM Miller do gęstości 5 milionów komórek na mililitr. Następnie przenieść próbkę do odpowiedniej szalki. Komórki są poddawane działaniu pola elektrycznego w końcówce pipety z wbudowanymi elektrodami podłączonymi do prototypowego generatora wysokiego napięcia.Elektrody te umożliwiają przyłożenie względnie jednorodnego pola elektrycznego w różnych kierunkach. Końcówka oraz generator zostały opracowane w laboratorium wydziału Biocybernatyki i Inżynierii Elektrycznej Uniwersytetu w Luana. Dodaj plazmid E-G-F-P-N 1 do zawiesiny komórkowej o stężeniu 10 µg/ml.Dokładnie wymieszaj komórki z plazmidowym DNA i inkubuj mieszaninę przez dwie do trzech minut w temperaturze pokojowej przed przyłożeniem impulsów elektrycznych. Pobierz 100 µL zawiesiny komórkowej do końcówki pipety z zintegrowanymi elektrodami. W tym eksperymencie, przy użyciu prototypowego generatora wysokiego napięcia, przyłożono serię ośmiu impulsów prostokątnych; w pierwszym protokole zastosowano różne protokoły pola elektrycznego.Wszystkie impulsy są dostarczane w tym samym kierunku, natomiast w drugim protokole impulsy są dostarczane poprzez zmianę orientacji pola elektrycznego. Drugiego protokołu można używać wyłącznie z odpowiednim generatorem impulsów, który umożliwia aplikację impulsów elektrycznych w różnych kierunkach. Natychmiast po aplikacji impulsów przenieś komórki z końcówki pipety do płytek 6-dołkowych i dodaj płodową surowicę bydlęcą.25% objętości próbki inkubować komórki przez pięć minut w temperaturze 37 °C. Aby umożliwić uszczelnienie błony komórkowej, dodać do każdej próbki w studzience sześciopoczkowej dwa mililitry HAMF 12 i inkubować komórki przez 24 godziny w temperaturze 37 °C w inkubatorze w uwilgotnionej atmosferze 5% CO2. Wydajność elektrototransferu genów określa się jako procent komórek wykazujących ekspresję GFP 24 godziny po przyłożeniu impulsu.Komórki obserwuje się za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego w oprogramowaniu do akwizycji obrazu. Ustaw długość fali wzbudzenia na 488 nanometrów i wybierz odpowiedni filtr pasmowy dla obrazu w kolorze zielonym, aby wykryć komórki wykazujące ekspresję GFP. Pozyskaj co najmniej pięć obrazów w kontraście fazowym i fluorescencji zielonej przy 20-krotnym powiększeniu.Należy policzyć komórki na obrazach w kontraście fazowym oraz komórki wykazujące ekspresję GFP na obrazach w fluorescencji zielonej, a następnie wyznaczyć procentową wydajność elektrotansferu genów, dzieląc liczbę komórek wykazujących ekspresję GFP przez całkowitą liczbę komórek na każdym odpowiadającym sobie obrazie. Przedstawiono procent komórek wykazujących ekspresję GFP w przypadku, gdy wszystkie impulsy są podawane w tym samym kierunku, oraz gdy impulsy są podawane poprzez zmianę orientacji pola elektrycznego. W przypadku zmiany orientacji pola elektrycznego procent komórek wykazujących ekspresję GFP znacząco wzrasta.

changing-direction-orientation-electric-field-during-electric-pulses

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Zmiana kierunku i orientacji pola elektrycznego podczas stosowania impulsów elektrycznych poprawia transfer genów plasmidowych in vitro

Niniejsza procedura przedstawia sposób wykorzystania systemu do elektroporacji Gene Pulser MXcell w celu szybkiego i łatwego zidentyfikowania optymalnych warunków elektroporacji dla embrionalnych fibroblastów mysich (MEFs) lub innych komórek pierwotnych. W towarzyszącym filmie omówiono również kwestie związane z rozwiązywaniem problemów.

Wykorzystanie systemu elektroporacji Gene Pulser MXcell do wysokowydajnej transfekcji komórek pierwotnych

Źródło: Stefan, A. i wsp., Wieloaspektowe korzyści z koekspresji białek w Escherichia coli. J. Vis. Exp. (2015)Ten film przedstawia procedurę przekształcania Escherichia coli w plazmid przenoszący gen oporności na antybiotyki, w tym przygotowanie komórek, elektroporację, odzyskiwanie i selekcję transformantów.

Przygotowanie i przemiana bakterii za pomocą elektroporacji wysokonapięciowej

Ten film demonstruje technikę elektroporacji, która wprowadza plazmidowe DNA kodujące białka fluorescencyjne do prekursorów pierwotnych komórek ziarnistych móżdżku myszy.

Dostarczanie genów in vitro za pośrednictwem elektroporacji: technika impulsów elektrycznych do wprowadzania fluorescencyjnych plazmidów kodujących białko reporterowe do hodowanych komórek

Elektroporacja jest powszechnie stosowaną metodą wprowadzania DNA do bakterii w procesie znanym jako transformacja. Tradycyjne protokoły przygotowania ogniw elektrokompetentnych są czasochłonne i pracochłonne. W artykule opisano alternatywną, szybką i wydajną metodę przygotowania ogniw elektrokompetentnych, obecnie stosowaną przez niektóre laboratoria.

Szybki protokół przygotowania elektrokompetentnych Escherichia coli i Vibrio cholerae

Platforma elektroporacji wspomagana wirami mikroprzepływowymi została opracowana do sekwencyjnego dostarczania wielu cząsteczek do identycznych populacji komórek z precyzyjną i niezależną kontrolą dawkowania. Etap oczyszczania komórek docelowych w oparciu o rozmiar, poprzedzający elektroporację, przyczynił się do zwiększenia wydajności dostarczania molekularnego i żywotności komórek przetworzonych.

Mikroskalowy elektroporator wspomagany wirami do sekwencyjnego dostarczania molekularnego

Ten protokół opisuje wysokoprzepustową transfekcję plazmidową komórek ssaków na płytce 384-dołkowej przy użyciu technologii akustycznego wyrzucania kropel. Czasochłonne, podatne na błędy dozowanie i multipleksowanie DNA, ale także dozowanie odczynników do transfekcji, są sterowane programowo i wykonywane przez urządzenie nanodozujące. Komórki są następnie wysiewane w tych wstępnie wypełnionych studzienkach.

Wysokoprzepustowe multipleksowanie i transfekcja plazmidu DNA przy użyciu technologii akustycznego nanodozowania

Opracowaliśmy protokół transfekcji pierwotnych komórek ludzkiego nabłonka barwnikowego za pomocą elektroporacji za pomocą genu kodującego czynnik pochodzenia pigmentu (PEDF) za pomocą systemu transpozonów Śpiącej Królewny (SB). Udaną transfekcję wykazano za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy (qPCR), immunoblottingu i testu immunoenzymatycznego (ELISA).

Oparta na elektroporacji modyfikacja genetyczna pierwotnych ludzkich komórek nabłonka barwnikowego przy użyciu systemu transpozonów Sleeping Beauty

Ten protokół opisuje techniki mikrofabrykacji wymagane do zbudowania urządzenia do elektroporacji mikroprzepływowej typu lab-on-a-chip. Konfiguracja eksperymentalna wykonuje kontrolowane transfekcje na poziomie pojedynczej komórki w ciągłym przepływie i może być rozszerzona do wyższych przepustowości dzięki kontroli populacyjnej. Przedstawiono analizę pokazującą możliwość elektrycznego monitorowania stopnia przepuszczalności błony komórkowej w czasie rzeczywistym.

Wytwarzanie i działanie systemu mikroelektroporacji o ciągłym przepływie z detekcją przepuszczalności

Elektroporacja plazmidowego DNA w mięśniach szkieletowych jest realną metodą modulowania ekspresji genów bez naruszania kurczliwości mięśni u myszy.

Elektroporacja plazmidowego DNA do mięśni szkieletowych myszy

Opisano metodę propagacji ludzkich guzów siatkówczaka u myszy. Komórki nowotworowe są wstrzykiwane bezpośrednio do oczu myszy z niedoborem odporności. Guzy wtórne zostały pomyślnie wywołane z wykorzystaniem zarówno komórek pobranych bezpośrednio z ludzkich guzów, jak i hodowanych tumorsfer.

Ustanowienie i propagacja guzów retinoblastomy ludzkiej u myszy z niedoborem odporności

Poznaj elektroporację z zmienną orientacją pola elektrycznego w celu zwiększenia efektywności transfekcji genowej w komórkach CHO. Ta metoda podwaja skuteczność transferu DNA bez wpływu na żywotność komórek.

Zmiana kierunku i orientacji pola elektrycznego podczas aplikacji impulsów elektrycznych usprawnia transfer genów plazmidu in vitro (Wideo) | JoVE Journal

Zmiana kierunku i orientacji pola elektrycznego podczas aplikacji impulsów elektrycznych poprawia transfer genów plazmidowych in vitro

Przeglądaj więcej filmów