Zmiana kierunku i orientacji pola elektrycznego podczas aplikacji impulsów elektrycznych poprawia transfer genów plazmidowych in vitro
12 września 2011
Transfekcja genów poprzez elektroporację ulega poprawie około dwukrotnej, gdy orientacja pola elektrycznego ulega zmianie podczas aplikacji impulsu, podczas gdy żywotność komórek nie zostaje naruszona. Wzrost wydajności transfekcji genów jest spowodowany zwiększeniem powierzchni błony, która staje się kompetentna do wnikania DNA do wnętrza komórki.
Elektroporacja (transfer genów za pomocą elektrod) jest metodą fizyczną stosowaną do wprowadzania genów do komórek poprzez aplikację krótkich i intensywnych impulsów elektrycznych. W przypadku skutecznego transferu genowego proces obejmuje kilka etapów: tworzenie kompleksu między DNA a błoną komórkową, translokację DNA przez zdezorganizowaną błonę, transfer DNA z cytoplazmy do jądra komórkowego oraz ekspresję genu. W celu osiągnięcia maksymalnej wydajności transfekcji stosuje się różne protokoły impulsów elektrycznych.
Jedną z tych metod jest zmiana orientacji pola elektrycznego podczas dostarczania impulsów. W tym filmie demonstrujemy różnicę w wydajności transferu genów przez elektrody w sytuacji, gdy wszystkie impulsy są dostarczane w tym samym kierunku, oraz gdy orientacja pola jest zmieniana. Eksperymenty z wykorzystaniem zmiany orientacji pola elektrycznego przeprowadzono na komórkach jajnika chomika chińskiego, CHOK1.
Należy postępować zgodnie z poniższymi krokami: hodować komórki w kolbie z kulturą w inkubatorze przez 24 godziny. W dniu eksperymentu przygotować zawiesinę komórkową, stosując trypsynę w 0,25% roztworze EDTA, a następnie policzyć komórki. Wirować komórki przez pięć minut przy 1000 obr./min w temperaturze 4 °C i resuspender osady komórkowe w buforze fosforanowym ISO OSM Miller do gęstości 5 milionów komórek na mililitr. Następnie przenieść próbkę do odpowiedniej szalki. Komórki są poddawane działaniu pola elektrycznego w końcówce pipety z wbudowanymi elektrodami podłączonymi do prototypowego generatora wysokiego napięcia.
Elektrody te umożliwiają przyłożenie względnie jednorodnego pola elektrycznego w różnych kierunkach. Końcówka oraz generator zostały opracowane w laboratorium wydziału Biocybernatyki i Inżynierii Elektrycznej Uniwersytetu w Luana. Dodaj plazmid E-G-F-P-N 1 do zawiesiny komórkowej o stężeniu 10 µg/ml.
Dokładnie wymieszaj komórki z plazmidowym DNA i inkubuj mieszaninę przez dwie do trzech minut w temperaturze pokojowej przed przyłożeniem impulsów elektrycznych. Pobierz 100 µL zawiesiny komórkowej do końcówki pipety z zintegrowanymi elektrodami. W tym eksperymencie, przy użyciu prototypowego generatora wysokiego napięcia, przyłożono serię ośmiu impulsów prostokątnych; w pierwszym protokole zastosowano różne protokoły pola elektrycznego.
Wszystkie impulsy są dostarczane w tym samym kierunku, natomiast w drugim protokole impulsy są dostarczane poprzez zmianę orientacji pola elektrycznego. Drugiego protokołu można używać wyłącznie z odpowiednim generatorem impulsów, który umożliwia aplikację impulsów elektrycznych w różnych kierunkach. Natychmiast po aplikacji impulsów przenieś komórki z końcówki pipety do płytek 6-dołkowych i dodaj płodową surowicę bydlęcą.
25% objętości próbki inkubować komórki przez pięć minut w temperaturze 37 °C. Aby umożliwić uszczelnienie błony komórkowej, dodać do każdej próbki w studzience sześciopoczkowej dwa mililitry HAMF 12 i inkubować komórki przez 24 godziny w temperaturze 37 °C w inkubatorze w uwilgotnionej atmosferze 5% CO2. Wydajność elektrototransferu genów określa się jako procent komórek wykazujących ekspresję GFP 24 godziny po przyłożeniu impulsu.
Komórki obserwuje się za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego w oprogramowaniu do akwizycji obrazu. Ustaw długość fali wzbudzenia na 488 nanometrów i wybierz odpowiedni filtr pasmowy dla obrazu w kolorze zielonym, aby wykryć komórki wykazujące ekspresję GFP. Pozyskaj co najmniej pięć obrazów w kontraście fazowym i fluorescencji zielonej przy 20-krotnym powiększeniu.
Należy policzyć komórki na obrazach w kontraście fazowym oraz komórki wykazujące ekspresję GFP na obrazach w fluorescencji zielonej, a następnie wyznaczyć procentową wydajność elektrotansferu genów, dzieląc liczbę komórek wykazujących ekspresję GFP przez całkowitą liczbę komórek na każdym odpowiadającym sobie obrazie. Przedstawiono procent komórek wykazujących ekspresję GFP w przypadku, gdy wszystkie impulsy są podawane w tym samym kierunku, oraz gdy impulsy są podawane poprzez zmianę orientacji pola elektrycznego. W przypadku zmiany orientacji pola elektrycznego procent komórek wykazujących ekspresję GFP znacząco wzrasta.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie analizuje transfekcję genów za pomocą elektroporacji, zwracając szczególną uwagę na wpływ orientacji pola elektrycznego na wydajność transfekcji. Wyniki wskazują, że zmiana kierunku pola elektrycznego podczas aplikowania impulsów może dwukrotnie zwiększyć wskaźniki transfekcji genów bez pogorszenia żywotności komórek.
Kluczowe komponenty badania
Dziedzina nauki
- Terapia genowa
- Biologia komórki
- Techniki elektroporacji
Wprowadzenie
- Transfer genów za pomocą elektrod jest metodą dostarczania genów do komórek.
- Polega on na przykładaniu krótkich, intensywnych impulsów elektrycznych w celu ułatwienia wnikania DNA.
- Skuteczna transfekcja wymaga, aby DNA przekroczyło błonę komórkową i przedostało się do jądra komórkowego.
- Różne protokoły impulsów elektrycznych mogą zwiększyć wydajność transfekcji.
Cel badania
- Ocena wpływu orientacji pola elektrycznego na wydajność transfekcji genów.
- Określenie, czy zmiana orientacji wpływa na żywotność komórek.
- Zaprezentowanie procesu na przykładzie komórek jajnika chomika syryjskiego (CHO).
Zastosowane metody
- Aplikacja impulsów elektrycznych do komórek CHO.
- Porównanie wydajności transfekcji przy różnych orientacjach pola elektrycznego.
- Ocena żywotności komórek po transfekcji.
- Analiza wnikania DNA do komórek i następującej po nim ekspresji genów.
Główne wyniki
- Wydajność transfekcji genów wzrosła około dwukrotnie dzięki zmianie orientacji pola elektrycznego.
- Nie zaobserwowano istotnego wpływu na żywotność komórek.
- Zwiększona powierzchnia błony przyczyniła się do usprawnionego wnikania DNA.
- Wykazano skuteczność różnych protokołów impulsów elektrycznych.
Wnioski
- Zmiana orientacji pola elektrycznego podczas aplikacji impulsu znacząco zwiększa efektywność transfekcji genów.
- Metoda ta może zostać zoptymalizowana bez pogarszania stanu zdrowia komórek.
- Dalsze badania mogą obejmować analizę dodatkowych protokołów w celu usprawnienia dostarczania genów.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Optymalizacja orientacji pola elektrycznego podczas elektroporacji zwiększa wydajność transferu genów plazmidowych, oferując niewirusową strategię poprawy uzysku transfekcji w procesach walidacji celów i identyfikacji wiodących cząsteczek na wczesnych etapach. Podejście to wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez zwiększenie wnikania DNA dzięki rozszerzonej kompetencji błonowej bez naruszania żywotności komórek, co poprawia pewność prognostyczną w modelach przedklinicznych. Metoda ta umożliwia powtarzalne i skalowalne dostarczanie genów do rozwoju testów oraz zastosowań w przesiewach fenotypowych w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Zwiększa powierzchnię błony zdolną do przyjęcia DNA, co poprawia wydajność transfekcji i wspiera funkcjonalną walidację celu w badaniach nad ekspresją białek rekombinowanych.
- Wartość operacyjna: Umożliwia spójne dostarczanie plazmidów do populacji komórek, redukując zmienność w początkowej fazie testowania hipotez i wyjaśniania szlaków sygnałowych.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Zapewnia ilościowe odczyty wydajności transferu genów oparte na fluorescencji, kompatybilne z platformami do wysokoprzepustowych analiz obrazowych (high-content screening).
- Wartość operacyjna: Standaryzuje parametry elektroporacji dzięki zintegrowanym końcówkom elektrod i programowalnym generatorom impulsów, co poprawia powtarzalność analiz w różnych laboratoriach.
- Wartość strategiczna: Wspiera skalowalne przygotowanie transfektowanych linii komórkowych do dalszych badań nad zaangażowaniem celu i analiz biomarkerów.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Pozwala zachować żywotność komórek po transfekcji, umożliwiając prowadzenie długofalowych badań nad ekspresją genów i efektami fenotypowymi w systemach istotnych dla przebiegu chorób.
- Wartość operacyjna: Ułatwia generowanie stabilnych lub przejściowo transfekowanych modeli przedklinicznych z użyciem komórek CHO, które są powszechnie stosowanym gospodarzem w produkcji leków biologicznych i analizie szlaków sygnałowych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków, od walidacji celu po identyfikację związku wiodącego, gdzie wydajne dostarczanie genów jest niezbędne do oceny funkcji celu i modulowania szlaków w modelach komórkowych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez poprzez umożliwienie niezawodnej nadekspresji lub wyciszania interesujących genów w komórkach ssaków.
- Przesiewanie: Dostarcza znormalizowane, ilościowe wyniki transfekcji, które pozwalają na porównanie konstruktów genetycznych lub elementów regulacyjnych.
- Analityka: Generuje procentowe wskaźniki wydajności (komórki GFP+/wszystkie komórki), które umożliwiają statystyczne porównanie protokołów impulsowych.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość przedkliniczną poprzez otrzymywanie żywotnych, transfektowanych komórek odpowiednich do dalszej walidacji w modelach 3D lub systemach kokultur.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Stanowi reużywalną możliwość elektroporacji, którą można zastosować w wielu projektach wymagających dostarczenia plazmidów do linii komórkowych przylegających lub zawiesinowych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną wyników dostarczania genów poprzez poprawę wydajności transfekcji dzięki biofizycznej optymalizacji parametrów impulsów.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność i standaryzację procedur transferu genów poprzez zdefiniowane pociągi impulsów i kontrolę orientacji pola.
- Wartość strategiczna: Redukuje ryzyko biologiczne w walidacji celów poprzez zapewnienie wystarczającej ekspresji transgenu do oceny fenotypowej, co minimalizuje liczbę wyników fałszywie ujemnych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów genetycznych z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o osiągalne poziomy ekspresji w testach komórkowych.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest biegłość w hodowli komórek ssaków, przygotowaniu plazmidów oraz mikroskopii fluorescencyjnej w celu oceny wydajności transfekcji.
- Metoda zależy od dostępu do generatorów impulsów wysokiego napięcia z możliwością programowania zmian orientacji pola elektrycznego oraz kompatybilnych końcówek z zintegrowanymi elektrodami.
- Konieczna jest standaryzacja parametrów impulsu (napięcie, czas trwania, liczba) oraz gęstości komórek we wszystkich eksperymentach w celu zapewnienia porównywalności wyników.
- Wymagana jest optymalizacja stosunku DNA do liczby komórek oraz czasów inkubacji, aby zrównoważyć wydajność transfekcji z poziomem stresu komórkowego.
- Metoda jest ograniczona do linii komórkowych adherentnych lub w zawiesinie, które są podatne na elektroporację; w przypadku komórek pierwotnych lub wrażliwych może być konieczne zastosowanie alternatywnych metod dostarczania.
