Obrazowanie detekcji feromonów w preparacie cienkich przekrojów tkanki organu vomeronasalnego myszy

Ogólnym celem tej procedury jest przygotowanie ostrych skrawków tkanek narządu węchowego RO lub VNO myszy w celu przeprowadzenia eksperymentów z obrazowaniem wapnia w subpopulacjach lub pojedynczych neuronach w żywej tkance. Osiąga się to poprzez najpierw wyekstrahowanie VNO z nosa myszy, a następnie mikrodysekcję narządu z jego chrząstkowej torebki pod mikroskopem stereoskopowym w zimnym A CSF. Następnie wyizolowany VNO jest ustawiany pionowo w bloku agarowym, a za pomocą mikrotomu wykonuje się ostre koronalne skrawki tkanki w celu weryfikacji jej integralności.

Po przeprowadzeniu immunohistochemii pod mikroskopem konfokalnym analizowanych jest kilka plastrów. Pozostałe plastry są nasycane barwnikiem wrażliwym na wapń, a następnie poddawane perfuzji domniemanymi ligandami feromonowymi, przy czym aktywację neuronalną obserwuje się za pomocą obrazowania wapniowego. Metoda ta może pomóc w rozwiązaniu kluczowych problemów w dziedzinie węchu.

Na przykład w narządzie węchowym romo wykazuje się ekspresję setek receptorów feromonowych, lecz dla niewielu z nich zidentyfikowano ligandy. Receptory feromonowe są bardzo trudne do ekspresji w systemach heterologicznych. Musieliśmy opracować wydajny test in vivo, aby przypisać konkretne feromony do specyficznych receptorów.

Możemy wykorzystać myszy transgeniczne, w których specyficzna subpopulacja neuronów wykazuje ekspresję nieznanych receptorów i może zostać zidentyfikowana dzięki ekspresji GFP. Niniejszy test można również wykorzystać do farmakologicznego badania kanałów jonowych i enzymów uczestniczących w kaskadzie transdukcji Fairmont w celu zademonstrowania procedury. Dziś pomogą nam Julian i Fabian, dwóch badaczy z mojego laboratorium, przed rozpoczęciem sekcji.

Przygotuj świeży, zimny, sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy, A CSF nasycony oxy carb, łącząc wszystkie składniki z wyjątkiem chlorku wapnia. Nasyć roztwór poprzez bezpośrednie przedmuchiwanie go oxy carb. Następnie dodaj chlorek wapnia i doprowadź do pożądanej objętości za pomocą wody dwukrotnie destylowanej.

Roztwór A CSF należy przechowywać w lodzie do momentu użycia. Po eutanazji i dekapitacji dorosłej myszy, należy przygotować szalkę Petriego z zimnym, stale natlenionym i nasyconym dwutlenkiem węgla roztworem A CSF. Po usunięciu żuchwy, należy umieścić głowę myszy w szalce Petriego.

Ustabilizuj głowę myszy pod mikroskopem stereoskopowym, aby uwidocznić podniebienie. Następnie, za pomocą mikronurzyc, wykonaj poziome nacięcie w górnej części podniebienia, a potem usuń błonę podniebienną przy użyciu mikro pęsety anatomicznej. Nawodnij i oczyść odsłoniętą jamę za pomocą A CSF.

Odetnij górną i dolną część przegrody nosowej. Następnie ostrożnie wyjmij przegrodę nosową zawierającą VNO i umieść ją pionowo bezpośrednio w czystym A CSF. Rozdziel dwie części VNO, używając mikro pęsety sekcyjnej.

Zidentyfikuj chrzęstną torebkę VNO, a następnie ostrożnie ją usuń, upewniając się, że wszystkie fragmenty chrzęstne zostały usunięte. Tutaj wskazano wyizolowany VNO, fragmenty chrzęstne oraz nieprzecięty VNO. Najpierw przygotuj 3% niskotopiącą agarozę, a następnie przygotuj stanowisko pracy z niezbędnymi narzędzami. Wypełnij formę do zatapiania agarozą i przed zanurzeniem wypreparowanego VNO upewnij się, że temperatura jest niższa niż 41°C. Umieść tkankę pionowo, aby uzyskać przekroje w płaszczyźnie czołowej.

Umieść formę do zatapiania na lodzie na jedną minutę, aż agar stężeje. Po minucie wyjmij blok agaru, przytnij go do kształtu parametalnego, a następnie przyklej go do uchwytu mikrotomu. Wykonaj koronalne skrawki VNO za pomocą mikrotomu z prędkością 0,5 mm/s, amplitudą 0,7 mm i grubością 100 µm w zimnym płynie CSF.

Zbierz plastry tkanki za pomocą pędzelka i umieść je w płytce do hodowli tkanek wypełnionej zimnym A CSF, aby zweryfikować integralność strukturalną zebranych plastrów tkanki; można je następnie utrwalić, a potem przeprowadzić immunobarwienie na komponenty cytoszkieletu lub inne interesujące białka. W tym przypadku immunobarwienie przeciwko acetylowanej tubulinie w kolorze fioletowym wykazuje integralność strukturalną plastra tkanki. Ponadto obserwacja specyficznej populacji neuronów, w której konkretny receptor feromonowy został znakowany GFP, pokazuje zachowaną morfologię neuronalną; pracując w ciemni, można zaobserwować neurony z małymi, owalnymi ciałami komórkowymi i długimi dendrytami sięgającymi powierzchni światła, kończącymi się mikrokosmkami.

Inkubować skrawki VNO w roztworze obciążającym składającym się z zimnego A CSF z 7 µM URA 2:00 AM i 0,1% onic przez jedną godzinę w temperaturze 37°C. Po godzinie przechowywać obciążone skrawki na lodzie w warunkach oksykarbonacji do momentu użycia. Za pomocą pędzla umieścić obciążone skrawki w komorze perfuzyjnej zawierającej A CSF i zabezpieczyć je za pomocą uchwytu do skrawków tkankowych.

Umieść komorę perfuzyjną na stole mikroskopu w układzie do obrazowania wapnia i prowadź ciągłą perfuzję utlenionym, nasyconym węglanami płynem A CSF w temperaturze pokojowej. Obserwuj naładowane skrawki VNO, wykorzystując długości fal fluorescencji odpowiadające barwnikowi, które dla 4O2-AM wynoszą od 340 do 380 nanometrów. Użyj odpowiedniego oprogramowania do rejestracji zmian stosunku wapnia wewnątrzkomórkowego. System perfuzyjny jest niezbędny do wywołania chemostymulacji.

Przedstawiono tutaj przekrój koronalny tkanki vno myszy, w której subpopulacja neuronów wykazująca ekspresję receptora feromonu V1R2 wykazuje również ekspresję GFP, poddaną barwieniu immunologicznemu przeciwko acetylowanej tubulinie, zaznaczonej kolorem fioletowym. Powiększenia przekroju demonstrują zachowanie integralności tkanki. Widoczne są neurony z długimi dendrytami sięgającymi powierzchni światła, a ekspresję białka strukturalnego można zaobserwować w guzkach dendrytycznych i mikrokosmkach służących do obrazowania wapniowego.

Przezcięcia tkanek obciążone FU są najpierw wizualizowane przy użyciu kontrastu fazowego Hoffmana w celu zlokalizowania obszaru zainteresowania, zaczynając od naczynia krwionośnego (pierwsza biała strzałka); obserwator powoli przesuwa się w kierunku światła naczynia (druga biała strzałka) oraz regionu neuroepithelialnego. Owalne ciało komórkowe neuronu nosowego RO. Trzecią białą strzałką można zidentyfikować jego długi i cienki akson.

Czwarta biała strzałka skierowana do światła naczynia wskazuje neuronalny guzek dendrytyczny. Piąta biała strzałka wskazuje mikrokosmki w kontakcie z komórkami załadowanymi feromonami RA; pokazano tutaj, że są one sekwencyjnie naświetlane przy 340 nm i 380 nm, a stosunek długości fal fluorescencyjnych odpowiada zmianom poziomu wapnia wewnątrzkomórkowego w wybranych neuronach, oznaczonych czarnymi, czerwonymi i niebieskimi okręgami. Do określenia żywotności neuronów wykorzystano ATP.

Zwróć uwagę na zakres odpowiedzi wapniowych wykazanych przez trzy wybrane neurony oraz na fakt, że neuron numer dwa (czerwone koło) nie reaguje na TP, w związku z czym zostanie on odrzucony z dalszej analizy. Następnie przeprowadza się stymulację chemiczną przy użyciu zarówno moczu, jak i mieszanki feromonów mysich, badając głębsze warstwy skrawka tkanki. Można zlokalizować subpopulację neuronów wykazujących ekspresję zarówno GFP, jak i receptora V1RR2.

Tutaj przedstawiono neuron wykazujący ekspresję zarówno GFP, jak i receptora V1RB2, obok neuronu niewykazującego ekspresji V1RB2. Obie komórki zostały załadowane barwnikiem URA 2:00 AM, a neuron wykazujący ekspresję V1RB2 wykazuje skok poziomu wapnia w odpowiedzi na perfuzję liganda tego receptora, 2-heptanonu. Co ciekawe, neuron niewykazujący ekspresji V1RB2 również reaguje na 2-heptanon, co demonstruje złożoność kodowania feromonów w VNO.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak wyizolować i mikrodysekcyjnie przygotować organ mar myszy w celu wykonania preparacji ostrych skrawków tkanki. Protokół ten można również dostosować do badań fizjologicznych z wykorzystaniem alternatywnych barwników wapniowych i innych konfiguracji mikroskopowych. Powodzenia w eksperymencie.