Name: Obrazowanie wykrywania feromonów w preparatach do ostrego plastra tkanki lemieszowo-nosowej myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-06T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: Poznaj metodę obrazowania wapnia w preparatach ostrego plastra tkanki lemieszowo-nosowej myszy. Technika ta umożliwia obserwację aktywności neuronów w odpowiedzi na feromony in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Pragniemy szczególnie podziękować Monique Nenniger Tosato za doskonałe wsparcie techniczne, a także Jean-Yves Chatton za rady naukowe oraz platformie obrazowania CIF UNIL za udostępnienie sprzętu mikroskopowego. Finansowanie zostało zapewnione przez Szwajcarską Narodową Fundację Naukową (Swiss National Science Foundation).

1. Disekcja VNO myszy
<ol>
	<li>Należy użyć myszy dorosłych. Ponieważ wykrywanie feromonów jest zaangażowane w wiele modalności, dokładne rozróżnienie między szczepami, genotypami, płciami i wiekiem jest istotne i wpłynie na wyniki. W tym przypadku wybrano dorosłe myszy VG30, które były wcześniej wykorzystywane do identyfikacji pary receptor-feromon (2-heptanon-V1rb2)31 (Rys. 1A).</li>
	<li>Przed rozpoczęciem sekcji należy przygotować świeży, zimny sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy (ACSF; NaCl 118 mM, NaHCO3 25 mM, D-glukoza 10 mM, KCl 2 mM, MgCl2 2 mM, NaH2PO4 1,2 mM, CaCl2 2 mM; pH 7,4) nasycony oksykarbonem (95% O2 : 5% CO2). W tym celu należy zmieszać wszystkie składniki ACSF z wyjątkiem CaCl2. Roztwór należy nasycić poprzez bezpośrednie przepuszczanie przez niego oksykarbonu. Na koniec należy dodać CaCl2 i uzupełnić ddH20 do pożądanej objętości. Roztwór ACSF należy przechowywać w lodzie do momentu użycia.</li>
	<li>Eutanazję myszy należy przeprowadzić preferencyjnie poprzez zwichnięcie szyi lub inhalację CO2 bezpośrednio przed eksperymentem.</li>
	<li>Należy odciąć głowę myszy. Umieścić ją pod mikroskopem sekcyjnym w zimnym ACSF, który jest stale napowietrzany oksykarbonem.</li>
	<li>Należy odciąć dolną szczękę i ustawić głowę tak, aby uwidocznić podniebienie (Rys. 1B).</li>
	<li>Za pomocą mikronozycyc naciąć poziomo górną część podniebienia (Rys. 1B) i usunąć błonę podniebienną za pomocą mikropincety sekcyjnej. Odsłoniętą jamę należy nawodnić i oczyścić za pomocą ACSF (Rys. 1C).</li>
	<li>Należy przeciąć górną i dolną część przegrody nosowej (Rys. 1C). Ostrożnie wyekstrahować przegrodę nosową zawierającą VNO i umieścić ją bezpośrednio w ACSF w lodzie (Rys. 1D).</li>
	<li>Za pomocą mikropincety sekcyjnej rozdzielić pionowo dwie części VNO i ostrożnie usunąć chrzęstną torebkę VNO (Rys. 1E). Należy upewnić się, że wszystkie fragmenty chrzęstne zostały usunięte.</li>
</ol>
2. Przygotowanie skrawków tkanki VNO
Przygotowanie skrawków tkanki VNO opisane w tej sekcji 2) służy głównie do badań obrazowania wapnia. Skrawki VNO mogą być również wykorzystywane do immunohistochemii na skrawkach swobodnych w celu weryfikacji integralności strukturalnej tkanki (patrz sekcja 3 protokołu).
<ol>
	<li>Przygotuj agar niskotopliwy (3% w standardowym PBS) oraz stanowisko pracy. Będą potrzebne: ACSF, mikrotom wraz z podstawkami, pęsety mikrochirurgiczne, formy do zatapiania (22 x 22 x 20 mm), chusteczki precyzyjne, pędzelki, płytki do hodowli tkankowej, klej cyjanoakrylowy, lód oraz termometr.</li>
	<li>Wypełnij formę do zatapiania 3% agarem niskotopliwym. Przed pionowym umieszczeniem krótko osuszonych VNO (Ryc. 2A>) w celu uzyskania przekrojów czołowych, upewnij się, że temperatura nie przekracza 41°C.</li>
	<li>Umieść formę do zatapiania na lodzie na 1 min, aż do stężenia, a następnie oddziel ją od bloku agaru. Przytnij blok agaru do kształtu piramidy i przyklej go do podstawki mikrotomu (Ryc. 2B>).</li>
	<li>Wykonaj czołowe przekroje VNO za pomocą mikrotomu, przy prędkości 0,5 mm/s, amplitudzie 0,7 mm i grubości 100 μm w zimnym ACSF; zbieraj skrawki tkanki pędzelkiem, a następnie umieść je w płytce do hodowli tkankowej wypełnionej zimnym ACSF.</li>
	<li>Jeśli Twoje skrawki wykazują fluorescencję endogenną, np. GFP (w neuronach z celowanym genem), można je wyselekcjonować pod fluorescencyjnym stereomikroskopem (Ryc. 2C>).</li>
</ol>
3. Immunohistochemia na wolnopłynących skrawkach VNO
Celem niniejszej procedury jest weryfikacja integralności plastrów tkanki VNO uzyskanych w sekcji 2). Acetylowana tubulina jest markerem mikrotubul/cytoszkieletu ekspresjonowanym w dendrytach i mikrokosmkach neuronów sensorycznych VNO. W przypadku eksperymentów z obrazowaniem wapnia należy przejść bezpośrednio do sekcji 4) protokołu. Metoda immunohistochemicznego barwienia pływających plastrów VNO może zostać dostosowana do oceny ekspresji dowolnego białka zainteresowania. W tym celu zalecamy utrwalenie VNO przez 1h w 4°C w roztworze utrwalającym (paraformaldehyd 4% w PBS, pH 7.6) po punkcie 1.7) protokołu oraz stosowanie od tego momentu PBS o pH 7.6 zamiast roztworu ACSF.
<ol>
	<li>W płytce do hodowli tkankowej utrwalić wybrane skrawki w roztworze utrwalającym (paraformaldehyd 4% w PBS, pH 7,6) przez 1h w temperaturze 4°C.</li>
	<li>Blokować skrawki tkanek przez noc w temperaturze 4°C w roztworze PBS zawierającym NGS (normalne surowicze kozie) 10% oraz triton X-100 w stężeniu 0,5%.</li>
	<li>Inkubować skrawki z przeciwciałem pierwszorzędowym (anty-acetylowana tubulina, mysie, 1:2000) przez 16h w temperaturze pokojowej (RT) w roztworze PBS zawierającym NGS 5% i Triton X-100 w stężeniu 0,25%.</li>
	<li>Przemyć 3 razy po 5 minut roztworem PBS zawierającym NGS 2%.</li>
	<li>Inkubować w ciemności z przeciwciałem wtórnym (cy5- sprzężone przeciwciała kozie anty-mysie, 1:200) w roztworze PBS zawierającym NGS 2% przez 1h w temperaturze RT.</li>
	<li>Przemyć 3 razy po 5 minut roztworem PBS zawierającym NGS 2%, PBS NGS 1% oraz samym PBS.</li>
	<li>Zamontować skrawki w fluorescencyjnym medium montującym (z DAPI lub bez), umieszczając je w centrum stref ograniczonych hydrofobowo (używając pisaka hydrofobowego), a następnie przykryć skrawki szkiełkami nakrywkowymi.</li>
	<li>Przeprowadzić obserwacje i akwizycję obrazów za pomocą mikroskopii konfokalnej oraz oprogramowania umożliwiającego rekonstrukcje 3D (Rys. 2D-F).</li>
</ol>
4. Obrazowanie wapnia w skrawkach VNO
<ol>
	<li>Następujące procedury będą przeprowadzane w ciemności. Inkubować skrawki VNO przez 1h w 37°C w roztworze ładującym składającym się z zimnego ACSF z Fura-2AM (7 μM; roztwór stokowy 1 mM w DMSO) oraz pluronikiem 0,1% (w/v; roztwór stokowy 20% w ddH2O).</li>
	<li>Przechowywać załadowane skrawki na lodzie w warunkach oksykarbonacji do momentu użycia. Załadowane skrawki można przechowywać przez 3-4h.</li>
	<li>Za pomocą pędzelka umieścić załadowane skrawki w komorze perfuzyjnej zawierającej ACSF i unieruchomić je za pomocą kotwicy do skrawków tkankowych (Rys. 3A).</li>
	<li>Umieścić komorę perfuzyjną na stoliku mikroskopu do obrazowania wapnia (Rys. 3B) i stale perfundować oksykarbonowanym ACSF w RT. Temperaturę można dostosować za pomocą bipolarnego kontrolera temperatury.</li>
	<li>Obserwacje załadowanych skrawków VNO (Rys. 3C-E) przeprowadza się za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego z obiektywem 25x lub 63x i kamerą CooL SNAP-HQ. Oświetlenie odbywa się sekwencyjnie (340/380 nm) za pomocą polychromatora i jest rejestrowane z częstotliwością 5Hz. Filtrowana emisja odbywa się przy 510 nm. Zmiany stosunku wapnia wewnątrzkomórkowego (ΔF = 340 nm/380 nm) są monitorowane za pomocą odpowiedniego oprogramowania.</li>
	<li>Chemostymulację należy dobrać zgodnie z celem eksperymentalnym. W tym przypadku przeprowadzane są perfuzje ACSF zawierającego mieszankę feromonów (izobutyloamina, 2-heptanon, 4-heptanon, 2-heptanol, octan pentylu, dimetylopirazyna, α/β-farnezen, 10-6 M), 2-heptanon (10-6 M) lub świeżo zebranym moczem myszy samców i samic (1:1) (1:100)32. Perfuzyjny podaż ATP (125 μM) jest stosowana jako test żywotności na koniec eksperymentów (Rys. 3F) i powinna wykazać odsetek żywych neuronów wynoszący około 80%. W tych warunkach skrawki można wykorzystywać do 2 godzin.</li>
	<li>Subpopulacje neuronów sensorycznych znakowane GFP są wizualizowane poprzez specyficzne oświetlenie (tutaj neurony wykazujące ekspresję V1rb2) i mogą być precyzyjnie analizowane (Rys. 3G-I).</li>
</ol>
5. Reprezentatywne wyniki:
Aby stworzyć funkcjonalny test do badania wielu szlaków transdukcji zachodzących w VNO myszy lub zidentyfikować nowe pary feromon-receptor, wykorzystujemy linię myszy VG (Rys. 1A). W tej linii jeden z 240 receptorów V1R, receptor V1Rb2, jest znakowany GFP, co umożliwia łatwą wizualizację konkretnej subpopulacji neuronów sensorycznych narządu jamistego. Po ekstrakcji i sekcji VNO (Rys. 1E), przygotowujemy świeże skrawki VNO (Rys. 2C). Część z nich utrwalamy, aby sprawdzić i potwierdzić integralność tkankową preparatu poprzez wykonanie barwień immunohistochemicznych przeciwko białku tubulinie acetylowanej (Rys. 2D-F). Pozostała część skrawków jest wykorzystywana do eksperymentów z obrazowaniem wapnia. W tym celu skrawki są obciążane Fura-2AM (Rys. 3C-E), a wewnątrzkomórkowy poziom wapnia w każdym neuronie jest monitorowany jako stosunek ΔF (Rys. 3F). Żywotność neuronów jest oceniana poprzez perfuzję ATP (125 μM), po której oczekuje się szybkiego i przejściowego wzrostu stosunku ΔF (Rys. 3F). Ponieważ mocz jest głównym źródłem feromonów, perfuzja świeżo pobranego moczu mysiego (1:100) służy jako kontrola endogenna. Wywołuje ona przejściowe zmiany poziomu wapnia w około 50% rejestrowanych neuronów (komórka 1 i 2, Rys. 3F). Przy oświetleniu GFP widoczne są neurony pozytywne pod kątem V1Rb2, a perfuzja jego znanego ligandu feromonowego, 2-heptanonu, inicjuje aktywację komórkową (komórka 1, Rys. 3I). Co ciekawe, aktywacje neuronalne są również obserwowalne w części neuronów, które nie wykazują ekspresji receptora V1Rb2 (neurony negatywne pod kątem GFP) (komórka 2, Rys. 3I), co demonstruje złożoność kodowania feromonów w VNO.
<img alt="Anatomia narządu jamnika u myszy (VNO); tkanki wypreparowane przedstawione na schematach B-E do badań strukturalnych." src="/files/ftp_upload/3311/3311fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Preparacja narządu jamnika u myszy. (A) Mysz z linii VG. (B) Po eutanazji myszy cała głowa zostaje umieszczona pod mikroskopem stereoskopowym, a żuchwa zostaje usunięta w celu uwidocznienia podniebienia. Wykonuje się niewielkie poziome nacięcie (czarna przerywana linia). (C) Po usunięciu podniebienia przegrodę nosową wyścieloną VNO przecina się w górnej i dolnej części (białe przerywane linie), aby ułatwić ekstrakcję VNO. (D) VNO zostaje umieszczone w roztworze ACSF i rozdzielone (wstawka: widok przy większym powiększeniu obu części). (E) Chrzęstna torebka VNO zostaje delikatnie usunięta, a VNO pozbawiony torebki chrzęstnej jest wykorzystywany w dalszych eksperymentach. Paski skali: B-E, 1 mm.
<img alt="Przygotowanie agaru do mikroskopii; obejmuje przygotowanie agaru, próbkę VNO oraz wyniki obrazowania fluorescencyjnego." src="/files/ftp_upload/3311/3311fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Przygotowanie ostrych skrawków narządu jamistego nosa (VNO) myszy i integralność tkankowa. (A) VNO myszy jest osadzone pionowo w 3% roztworze agaru. Temperatura agaru musi być niższa niż 41°C. (B) Blok agaru jest wycinany w kształcie piramidy, a skrawki VNO o grubości 100 μm (czarna przerywana linia) są przygotowywane w ACSF. (C) Skrawki VNO można selekcjonować pod fluorescencyjnym stereomikroskopem w celu wizualizacji specyficznej populacji znakowanych neuronów sensorycznych. (D-F) Integralność tkankową można ocenić za pomocą immunobarwień przeciwko białku tubulinie acetylowanej; obraz przy większym powiększeniu neuronów celowanych w gen V1rb2 wykazuje doskonałą konserwację preparatu. Można zaobserwować neurony z długimi dendrytami sięgającymi powierzchni światła (E), a także ekspresję białka strukturalnego w guzkach dendrytycznych i mikrokosmkach (F). Paski skali wynoszą: B, 5 mm; C, 60 μm; D, 40 μm; E-F, 20 μm.
<img alt="Układ obrazowania termicznego i fluorescencji komórkowej dla odpowiedzi na ATP; analiza FURA 380 nm i wykresy danych." src="/files/ftp_upload/3311/3311fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Obrazowanie wapnia i detekcja feromonów w ostrych skrawkach tkanki narządu Jacobsona. (A) Po fazie ładowania Fura-2AM, skrawki VNO są umieszczane w komorze perfuzyjnej i utrzymywane za pomocą dostosowanego kotwiczenia (widok o dużym powiększeniu). (B) Eksperymenty są przeprowadzane w ciemności, a skrawki VNO są stale perfundowane ACSF w RT za pomocą systemu próżniowego. Temperaturę można dobrać za pomocą systemu kontroli temperatury składającego się z bipolarnego elementu Peltiera i sondy termicznej. Ten konkretny eksperyment został przeprowadzony w RT. (C-E) Skrawki VNO są widoczne w kontraście fazowym Hoffmana (C, Hv) lub przy oświetleniu Fura 380 nm przed (D) i w trakcie aktywacji neuronalnej (E, tutaj z ATP). (F) Żywotność neuronów jest oceniana poprzez perfuzję ATP (125 μM). Tutaj chemostymulacja jest przeprowadzana za pomocą moczu (Urine, 1:100) lub mieszaniny feromonów mysich (mix ph., 10-6 M) przy stałej prędkości przepływu 165 ml/h. Wewnątrzkomórkowe poziomy wapnia (ΔF) mogą być rejestrowane indywidualnie dla każdej komórki (Komórka 1 do 3). (G) Neuron V1Rb2 jest wizualizowany w oświetleniu GFP (1). (H) Pokazano ładowanie tego neuronu (1), jak i neuronu niewykazującego ekspresji V1rb2 (2). (I) Neuron V1rb2 jest w stanie odpowiedzieć na 2-heptanon wzrostem wewnątrzkomórkowego poziomu wapnia. Ten konkretny neuron niewykazujący ekspresji V1rb2 również odpowiada na 2-heptanon (komórka 2). Paski skali: C-E, 20 μm; G-H, 15 μm; ΔF = 340 nm / 380 nm. (F i I) Czas trwania aplikacji bodźca jest zaznaczony paskami pod każdym śladem. Dowolna skala kolorystyczna reprezentuje intensywność fluorescencji.

<ol><li>Karlson, P., Lüscher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%22Pheromones%22+a+new+term+for+a+class+of+biologically+active+substances%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">"Pheromones" a new term for a class of biologically active substances.</a> Nature. 183, 55-56 (1959).</li>
<li>Cavaggioni, A., Mucignat-Caretta, C., Redaelli, M., Zagotto, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+scent+of+urine+spots+of+male+mice%2C+Mus+musculus%3A+Changes+in+chemical+composition+over+time%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">The scent of urine spots of male mice, Mus musculus: Changes in chemical composition over time.</a> Rapid Commun. Mass Spectrom. 20, 3741-3746 (2006).</li>
<li>Novotny, M., Harvey, S., Jemiolo, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemistry+of+male+dominance+in+the+house+mouse%2C+Mus+domesticus%5BTitle%5D)+AND+%22Experientia%22%5BJournal%5D)">Chemistry of male dominance in the house mouse, Mus domesticus.</a> Experientia. 46, 109-113 (1990).</li>
<li>Leinders-Zufall, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+pheromone+detection+by+mammalian+vomeronasal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive pheromone detection by mammalian vomeronasal neurons.</a> Nature. 405, 792-796 (2000).</li>
<li>Leinders-Zufall, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MHC+class+I+peptides+as+chemosensory+signals+in+the+vomeronasal+organ%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">MHC class I peptides as chemosensory signals in the vomeronasal organ.</a> Science. 306, 1033-1037 (2004).</li>
<li>Leinders-Zufall, T., Ishii, T., Mombaerts, P., Zufall, F., Boehm, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+requirements+for+the+activation+of+vomeronasal+sensory+neurons+by+MHC+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Structural requirements for the activation of vomeronasal sensory neurons by MHC peptides.</a> Nat. Neurosci. 12, 1551-1558 (2009).</li>
<li>Jemiolo, B., Xie, T. M., Novotny, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Socio-sexual+olfactory+preference+in+female+mice%3A+attractiveness+of+synthetic+chemosignals%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Behav%22%5BJournal%5D)">Socio-sexual olfactory preference in female mice: attractiveness of synthetic chemosignals.</a> Physiol. Behav. 50, 1119-1122 (1991).</li>
<li>Achiraman, S., Archunan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+urinary+volatiles+in+Swiss+male+mice+%28Mus+musculus%29%3A+bioassay+of+identified+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biosci%22%5BJournal%5D)">Characterization of urinary volatiles in Swiss male mice (Mus musculus): bioassay of identified compounds.</a> J. Biosci. 27, 679-686 (2002).</li>
<li>Dulac, C., Torello, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+detection+of+pheromone+signals+in+mammals%3A+from+genes+to+behaviour%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Molecular detection of pheromone signals in mammals: from genes to behaviour.</a> Nat. Rev. Neurosci. 4, 551-562 (2003).</li>
<li>Brennan, P. A., Zufall, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pheromonal+communication+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pheromonal communication in vertebrates.</a> Nature. 444, 308-315 (2006).</li>
<li>Mondor, E. B., Roitberg, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inclusive+fitness+benefits+of+scent-marking+predators%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Biol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Inclusive fitness benefits of scent-marking predators.</a> Proc. Biol. Sci. 271, Suppl 5. 341-343 (2004).</li>
<li>Holy, T. E., Dulac, C., Meister, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responses+of+vomeronasal+neurons+to+natural+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Responses of vomeronasal neurons to natural stimuli.</a> Science. 289, 1569-1572 (2000).</li>
<li>Keverne, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Vomeronasal+Organ%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The Vomeronasal Organ.</a> Science. 286, 716-720 (1999).</li>
<li>Weiler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postnatal+development+of+the+rat+vomeronasal+organ%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Senses%22%5BJournal%5D)">Postnatal development of the rat vomeronasal organ.</a> Chem. Senses. 30, Suppl 1. 127-128 (2005).</li>
<li>Zufall, F., Kelliher, K. R., Leinders-Zufall, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pheromone+detection+by+mammalian+vomeronasal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.+Res.+Tech%22%5BJournal%5D)">Pheromone detection by mammalian vomeronasal neurons.</a> Microsc. Res. Tech. 58, 251-260 (2002).</li>
<li>Ciges, M., Labella, T., Gayoso, M., Sanchez, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructure+of+the+organ+of+Jacobson+and+comparative+study+with+olfactory+mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22Acta.+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Ultrastructure of the organ of Jacobson and comparative study with olfactory mucosa.</a> Acta. Otolaryngol. 83, 47-58 (1977).</li>
<li>Munger, S. D., Leinders-Zufall, T., Zufall, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subsystem+organization+of+the+mammalian+sense+of+smell%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Subsystem organization of the mammalian sense of smell.</a> Annu. Rev. Physiol. 71, 115-140 (2009).</li>
<li>Mombaerts, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+and+ligands+for+odorant%2C+vomeronasal+and+taste+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genes and ligands for odorant, vomeronasal and taste receptors.</a> Nat. Rev. Neurosci. 5, 263-278 (2004).</li>
<li>Ryba, N. J. P., Tirindelli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+multigene+family+of+putative+pheromone+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A new multigene family of putative pheromone receptors.</a> Cell. 19, 371-379 (1997).</li>
<li>Matsunami, H., Buck, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multigene+family+encoding+a+diverse+array+of+putative+pheromone+receptors+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A multigene family encoding a diverse array of putative pheromone receptors in mammals.</a> Cell. 90, 775-784 (1997).</li>
<li>Herrada, G., Dulac, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+family+of+putative+pheromone+receptors+in+mammals+with+a+topographycally+organized+and+sexually+dimorphic+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A novel family of putative pheromone receptors in mammals with a topographycally organized and sexually dimorphic distribution.</a> Cell. 90, 763-773 (1997).</li>
<li>Dulac, C., Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+family+of+genes+encoding+putative+pheromone+receptors+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A novel family of genes encoding putative pheromone receptors in mammals.</a> Cell. 83, 195-206 (1995).</li>
<li>Young, J. M., Massa, H. F., Hsu, L., Trask, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extreme+variability+among+mammalian+V1R+gene+families%5BTitle%5D)+AND+%22Genome.+Res%22%5BJournal%5D)">Extreme variability among mammalian V1R gene families.</a> Genome. Res. 20, 10-18 (2009).</li>
<li>Yang, H., Shi, P., Zhang, Y. P., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Composition+and+evolution+of+the+V2r+vomeronasal+receptor+gene+repertoire+in+mice+and+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">Composition and evolution of the V2r vomeronasal receptor gene repertoire in mice and rats.</a> Genomics. 86, 306-315 (2005).</li>
<li>Levai, O., Feistel, T., Breer, H., Strotmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+in+the+vomeronasal+organ+express+odorant+receptors+but+project+to+the+accessory+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Cells in the vomeronasal organ express odorant receptors but project to the accessory olfactory bulb.</a> J. Comp. Neurol. 498, 476-490 (2006).</li>
<li>Riviere, S., Challet, L., Fluegge, D., Spehr, M., Rodriguez, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formyl+peptide+receptor-like+proteins+are+a+novel+family+of+vomeronasal+chemosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Formyl peptide receptor-like proteins are a novel family of vomeronasal chemosensors.</a> Nature. 459, 574-577 (2009).</li>
<li>Liberles, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formyl+peptide+receptors+are+candidate+chemosensory+receptors+in+the+vomeronasal+organ%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Formyl peptide receptors are candidate chemosensory receptors in the vomeronasal organ.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 9842-9847 (2009).</li>
<li>Liman, E. R., Corey, D. P., Dulac, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRP2%3A+A+candidate+transduction+channel+for+mammalian+pheromone+sensory+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">TRP2: A candidate transduction channel for mammalian pheromone sensory signaling.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 5791-5796 (1999).</li>
<li>Kelliher, K. R., Spehr, M., Li, X. H., Zufall, F., Leinders-Zufall, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pheromonal+recognition+memory+induced+by+TRPC2-independent+vomeronasal+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Pheromonal recognition memory induced by TRPC2-independent vomeronasal sensing.</a> Eur. J. Neurosci. 23, 3385-3390 (2006).</li>
<li>Rodriguez, I., Feinstein, P., Mombaerts, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variable+patterns+of+axonal+projections+of+sensory+neurons+in+the+mouse+vomeronasal+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Variable patterns of axonal projections of sensory neurons in the mouse vomeronasal system.</a> Cell. 97, 199-208 (1999).</li>
<li>Boschat, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pheromone+detection+mediated+by+a+V1r+vomeronasal+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Pheromone detection mediated by a V1r vomeronasal receptor.</a> Nature. Neuroscience. 5, 1261-1262 (2002).</li>
<li>Brechbühl, J., Klaey, M., Broillet, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Grueneberg+ganglion+cells+mediate+alarm+pheromone+detection+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Grueneberg ganglion cells mediate alarm pheromone detection in mice.</a> Science. 321, 1092-1095 (2008).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Przedstawiona tutaj metoda obrazowania wapnia umożliwia rejestrację odpowiedzi feromonowych neuronów VNO myszy w preparacie zacutego skrawka. Dzięki temu podejściu, przy pewnej praktyce, proces od preparacji zwierzęcia po uzyskanie neuronów vomeronasalnych jest łatwo osiągalny i zapewnia długotrwałą żywotność tkanki. Pozwala to na prowadzenie czasochłonnych eksperymentów, takich jak badania farmakologiczne czy analiza kodowania feromonowego. Dzięki tej technice fizjologicznej można specyficznie analizować zarówno duże populacje, jak i precyzyjne subpopulacje neuronalne. Ponadto metodę tę można łatwo dostosować do podejść immunohistochemicznych lub eksperymentów opartych na innych barwnikach wapniowych. Zastosowanie tych połączonych metodologii z pewnością pozwoli na identyfikację nowych ligandów feromonowych dla wielu osieroconych chemoreceptorów eksprymowanych w narządzie vomeronasalnym myszy.

<table><tbody><tr><td>Roztwór soli sodowej 5&amp;rsquo;-trifosforanu adenozyny (ATP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6559-25UMO</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7002-100G</td><td>Preferowany do immunohistochemii</td></tr><tr><td>Agar (niskotopliwy)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0701-25G</td><td>Preferowany do obrazowania wapnia</td></tr><tr><td>Bipolarny kontroler temperatury CL-100</td><td>Warner Instruments</td><td>W64-0352</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny</td><td>Leica Microsystems</td><td>SP5 AOBS</td><td></td></tr><tr><td>Cy5-AffiniPure przeciwmysia IgG z kozy</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-175-071</td><td>Chronić przed światłem</td></tr><tr><td>DMSO (siarczek dimetylu)</td><td>Merck &amp;amp; Co., Inc.</td><td>317275-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Formy do zatapiania, Peel-A-Way</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>18646A-1</td><td> 22 x 22 x 20 mm</td></tr><tr><td>Fluorescencyjne medium montażowe (Vectashield z DAPI, 10 ml)</td><td>Rectolab</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>FURA-2AM</td><td>Teflabs</td><td>0103</td><td>Chronić przed światłem</td></tr><tr><td>Glisseal N (smar próżniowy, 60 g)</td><td>Borer Chemie</td><td>Glisseal N</td><td></td></tr><tr><td>Duża komora pomiarowa z kąpielą (RC-26G)</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0235</td><td></td></tr><tr><td>MetaFluor (oprogramowanie do obrazowania wapnia; v.7.6.5.0)</td><td>Visitron Systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Monoklonalne przeciwciało przeciw tubulinie acetylowanej, mysie</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6793-.2ML</td><td></td></tr><tr><td>Normalne surowica kozia (NGS, 10 ml)</td><td>Interchim</td><td>UP379030</td><td></td></tr><tr><td>Platforma dla komór (P-1)</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0277</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127, 2 g</td><td>Invitrogen</td><td>P-6867</td><td></td></tr><tr><td>Roti Coll (butelka dozująca, 10 g)</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>0258.1</td><td></td></tr><tr><td>Podwójny przepływowy podgrzewacz/chłodnica roztworów SC-20</td><td>Warner Instruments</td><td>W64-0353</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt do skrawków (SHD-26GKIT)</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0266</td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop fluorescencyjny</td><td>Leica Microsystems</td><td>MZ16FA</td><td></td></tr><tr><td>Super PAP PEN (pisak hydrofobowy)</td><td>Pelco International</td><td>22309</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fluka</td><td>93420-250ML</td><td></td></tr><tr><td>Wibracyjny mikrotom nożowy VT 1200S</td><td>Leica Microsystems</td><td>14048142066</td><td></td></tr><tr><td>Szybki system polichromatora VisiChrome</td><td>Visitron Systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wizualizacja danych 3D (Imaris; v.6.3.1)</td><td>Bitplane Scientific Software</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

obrazowanie detekcji feromonów w preparacie cienkich przekrojów tkanki organu vomeronasalnego myszy

Imaging Pheromone Sensing in a Mouse Vomeronasal Acute Tissue Slice Preparation

Peter Karlson i Martin Lüscher po raz pierwszy użyli terminu feromon w 1959 roku1, aby opisać substancje chemiczne wykorzystywane w komunikacji wewnątrzgatunkowej. Feromony to lotne lub nielotne krótkotrwałe cząsteczki2, wydzielane i/lub zawarte w płynach biologicznych3,4, takich jak mocz, który jest znany jako główne źródło feromonów3. Komunikacja feromonowa bierze udział w wielu kluczowych modalnościach zwierzęcych, takich jak interakcje między krewnymi5,6, organizacje hierarchiczne3 oraz interakcje seksualne7,8, a w konsekwencji jest bezpośrednio skorelowana z przetrwaniem danego gatunku9,10,11. U myszy zdolność wykrywania feromonów jest pośredniczona głównie przez narząd vomeronasalny (VNO)10,12, strukturę parzystą znajdującą się u podstawy jamy nosowej i zamkniętą w chrzęstnej torebce. Każdy VNO ma kształt rurkowaty z światłem13,14, co umożliwia kontakt z zewnętrznym światem chemicznym. Neuroepithelium sensoryczne składa się głównie z dwubiegunowych neuronów sensorycznych vomeronasalnych (VSNs)15. Każdy VSN wysyła pojedyncze dendryt do światła, kończące się dużym guzowatym zakończeniem dendrytycznym z do 100 mikrokosmków biorących udział w detekcji chemicznej16. Występuje wiele subpopulacji VSNs. Są one zróżnicowane pod względem ekspresji chemoreceptorów, a tym samym prawdopodobnie pod względem rozpoznawanych ligandów17,18. Dwie główne rodziny receptorów vomeronasalnych, V1Rs i V2Rs19,20,21,22, składają się odpowiednio z 24023 i 12024 członków i są ekspresjonowane w oddzielnych warstwach neuroepithelium. W VSNs ekspresjonowane są również receptory węchowe (ORs)25 oraz receptory peptydów formylowanych (FPRs)26,27.
Nie wiadomo, czy te subpopulacje neuronalne wykorzystują te same szlaki sygnalizacyjne downstream do wykrywania feromonów. Mimo kluczowej roli kanału przepuszczalnego dla wapnia (TRPC2) obecnego w mikrokosmkach dojrzałych neuronów28, sugerowano istnienie kanałów transdukcyjnych niezależnych od TRPC26,29. Ze względu na dużą liczbę subpopulacji neuronalnych oraz specyficzną morfologię narządu, badania farmakologiczne i fizjologiczne elementów sygnalizacyjnych obecnych w VNO są złożone.
W niniejszej pracy prezentujemy metodę przygotowania ostrych skrawków tkanek VNO myszy do przeprowadzenia badań obrazowania wapnia. To podejście fizjologiczne umożliwia obserwację – w naturalnym środowisku żywej tkanki – ogólnych lub poszczególnych subpopulacji VSN, które uprzednio napełniono barwnikiem wapnia Fura-2AM. Metoda ta jest również dogodna do badania dowolnego receptora feromonowego znakowanego GFP i może być dostosowana do użycia innych fluorescencyjnych sond wapniowych. Jako przykład wykorzystujemy tutaj linię myszy VG30, w której translacja receptora feromonowego V1rb2 jest powiązana z ekspresją GFP za pomocą strategii policistronowej.

U myszy zdolność wykrywania feromonów jest zapośredniczona głównie przez narząd vomeronasalny (VNO). W niniejszej pracy opisano przygotowanie ostrych skrawków tkanki VNO do obrazowania wapnia. To podejście fizjologiczne umożliwia obserwację subpopulacji i/lub pojedynczych neuronów w żywej tkance i jest wygodne w procesie identyfikacji receptorów i ligandów.

Obrazowanie detekcji feromonów w preparacie cienkich przekrojów tkanki organu vomeronasalnego myszy

Peter Karlson i Martin Lüscher po raz pierwszy użyli terminu feromon w 1959 roku, aby opisać substancje chemiczne wykorzystywane do komunikacji wewnątrzgatunkowej. ...

Ogólnym celem tej procedury jest przygotowanie świeżych skrawków tkanki narządu nosowego RO lub VNO myszy w celu przeprowadzenia eksperymentów obrazowania wapnia w subpopulacjach i/lub pojedynczych neuronach w żywej tkance. Osiąga się to poprzez najpierw wyekstrahowanie VNO z nosa myszy, a następnie mikrodysekcję z torebki chrzęstnej pod mikroskopem stereoskopowym w zimnym A CSF. Następnie wyizolowany VNO jest ustawiany pionowo w bloku agarowym, a za pomocą mikrotomu wykonuje się świeże koronalne skrawki tkanki w celu weryfikacji integralności tkanki.Kilka przekrojów poddano analizie pod mikroskopem konfokalnym po przeprowadzeniu immunohistochemii. Pozostałe przekroje obciążono barwnikiem wrażliwym na jony wapnia, a następnie przeprowadzono perfuzję domniemanymi ligandami feromonowymi, obserwując aktywację neuronów za pomocą obrazowania wapniowego. Metoda ta może pomóc w rozwiązaniu kluczowych problemów w dziedzinie węchu.Na przykład w narządzie węchowym romo wykazuje się ekspresję setek receptorów feromonowych, lecz dla bardzo niewielu z nich zidentyfikowano ligandy. Receptory feromonowe są bardzo trudne do ekspresji w systemach heterologicznych. Konieczne było opracowanie wydajnego testu in vivo w celu przypisania konkretnych feromonów do odpowiednich receptorów.Możemy wykorzystać myszy transgeniczne, w których specyficzna subpopulacja neuronów wykazuje ekspresję nieznanych receptorów i może być zidentyfikowana dzięki ekspresji GFP. Niniejszy test można również wykorzystać do farmakologicznego badania kanałów jonowych i enzymów uczestniczących w kaskadzie transdukcji Fairmont w celu zademonstrowania procedury. Dzisiaj pomogą nam Julian i Fabian, dwaj badacze z mojego laboratorium, przed rozpoczęciem sekcji.Przygotuj świeży, zimny, sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy, A CSF nasycony oxy carb, łącząc wszystkie składniki z wyjątkiem chlorku wapnia. Nasyć roztwór poprzez bezpośrednie przedmuchiwanie go oxy carb. Następnie dodaj chlorek wapnia i uzupełnij objętość do pożądanej wartości za pomocą wody dwukrotnie destylowanej.Przechowywać roztwór A CSF w lodzie do momentu użycia. Po uśmierceniu i dekapitacji dorosłej myszy przygotować szalkę Petriego z zimnym, stale natlenionym i nasyconym dwutlenkiem węgla roztworem A CSF. Po usunięciu żuchwy umieścić głowę myszy w szalce Petriego.Ustaw głowę myszy pod mikroskopem stereoskopowym, aby zwizualizować podniebienie. Następnie wykonaj nacięcie poziome w górnej części podniebienia za pomocą mikronozyczek, a następnie usuń błonę podniebienia za pomocą mikropincety anatomicznej. Nawodnij i oczyść odsłoniętą jamę za pomocą A CSF.Odetnij górną i dolną część przegrody nosowej. Następnie delikatnie wyciągnij przegrodę nosową zawierającą VNO i umieść ją pionowo bezpośrednio w czystym A CSF. Rozdziel dwie części VNO za pomocą pęsety mikrodisekcyjnej.Zidentyfikuj chrząstkową torebkę VNO, a następnie delikatnie ją usuń, upewniając się, że wszystkie fragmenty chrząstki zostały usunięte. Tutaj wskazano wyizolowany VNO, fragmenty chrząstki oraz nieprzeprowadzony zabieg sekcji VNO; najpierw przygotuj 3% niskotopiący agar, a następnie przygotuj stanowisko pracy z niezbędnymi narzędziami. Wypełnij formę do zatapiania agarem i upewnij się, że temperatura jest niższa niż 41 °C przed zanurzeniem wypreparowanego VNO. Ustaw tkankę pionowo, aby uzyskać przekroje wieńcowe.Umieść formę do zatapiania w lodzie na jedną minutę, aż agar stężeje. Po minucie wyjmij blok agaru, wytnij go w kształt parametaliczny, a następnie przyklej do uchwytu mikrotomu. Wykonaj koronalne przekroje VNO za pomocą mikrotomu z prędkością 0,5 millimeters per second, amplitudą 0,7 millimeters i grubością 100 micrometers w zimnym CSF.Zbierz plasterki tkanki za pomocą pędzelka i umieść je w płytce do hodowli tkanek wypełnionej zimnym A CSF, aby zweryfikować integralność strukturalną zebranych plasterków tkanki; można je następnie utrwalić i poddać barwieniu immunohistochemicznemu w celu wykazania komponentów cytoszkieletu lub innych białek zainteresowania. W tym przypadku barwienie immunocytochemiczne przeciwko acetylowanej tubulinie w kolorze fioletowym wykazuje integralność strukturalną plasterka tkanki. Ponadto obserwacja specyficznej populacji neuronów, w których konkretny receptor feromonowy został oznakowany GFP, ukazuje zachowaną morfologię neuronalną; pracując w ciemni, można zaobserwować neurony z małymi, owalnymi ciałami komórkowymi i długimi dendrytami sięgającymi powierzchni światła, kończącymi się mikrokosmkami.Inkubuj skrawki VNO w roztworze ładującym z zimnego A CSF z siedmioma mikromolarnymi URA 2:00 AM i 0,1%onic przez jedną godzinę w temperaturze 37 stopni celsius. Po godzinie przechowuj załadowane skrawki na lodzie w warunkach oxy carbonation aż do momentu użycia. Użyj pędzla, aby umieścić załadowane skrawki w komorze perfuzyjnej zawierającej A CSF, a następnie zabezpiecz skrawki za pomocą kotwicy do skrawków tkankowych.Umieść komorę perfuzyjną na stoliku mikroskopu w układzie do obrazowania wapnia i prowadź ciągłą perfuzję utlenionym, nasyconym węglanami A CSF w temperaturze pokojowej. Obserwuj załadowane skrawki VNO, korzystając z długości fal fluorescencji odpowiadających barwnikowi, co w przypadku four O 2:00 AM wynosi od 340 do 380 nanometrów. Użyj odpowiedniego oprogramowania do rejestracji zmian stosunku wapnia wewnątrzkomórkowego. Do wywołania chemostymulacji niezbędny jest system perfuzyjny.Przedstawiono tutaj przekrój wieńcowy tkanki vno myszy, w której subpopulacja neuronów wykazująca ekspresję receptora feromonu V1R2 wykazuje również ekspresję GFP, poddaną immunobarwieniu przeciwko acetylowanej tubulinie, zaznaczonej kolorem fioletowym. Powiększenia przekroju wykazują zachowanie integralności tkanki. Widoczne są neurony z długimi dendrytami sięgające powierzchni światła, a ekspresję białka strukturalnego można dostrzec w guzkach dendrytycznych i mikrokosmkach służących do obrazowania wapnia.Przekroje tkanek załadowane FU są najpierw wizualizowane przy użyciu kontrastu fazowego Hoffmana w celu zlokalizowania pola zainteresowania, zaczynając od naczynia krwionośnego (pierwsza biała strzałka); obserwator powoli przesuwa się w stronę światła naczynia (druga biała strzałka) oraz obszaru neuroepitelialnego. Owalne ciało komórkowe neuronu nosowego RO. Trzecią białą strzałkę można zidentyfikować po długim i cienkim dendrycie.Czwarta biała strzałka wskazuje do wnętrza światła, czyli neuronalny guzek dendrytyczny. Piąta biała strzałka wskazuje mikrokosmki w kontakcie z komórkami obciążonymi feromonami RA; tutaj pokazano, że są one następnie sekwencyjnie naświetlane przy 340 i 380 nanometrach, a ten stosunek długości fali fluorescencji odpowiada wewnątrzkomórkowym zmianom poziomu wapnia w wybranych neuronach, oznaczonych czarnymi, czerwonymi i niebieskimi okręgami. ATP jest wykorzystywane do określenia żywotności neuronów.Należy zwrócić uwagę na zakres odpowiedzi wapniowych wykazanych przez trzy wybrane neurony oraz na fakt, że neuron numer dwa (zaznaczony czerwonym kółkiem) nie reaguje na TP, w związku z czym zostanie on wykluczony z dalszej analizy. Następnie przeprowadza się stymulację chemiczną przy użyciu moczu oraz mieszaniny feromonów mysich, badając głębsze warstwy skrawka tkanki. Można zlokalizować subpopulację neuronów wykazujących ekspresję zarówno GFP, jak i receptora V1RR2.Tutaj przedstawiono neuron wykazujący ekspresję zarówno GFP, jak i receptora V1RB2, obok neuronu niewykazującego ekspresji V1RB2. Obie komórki zostały załadowane barwnikiem URA-2:00 AM, a neuron wykazujący ekspresję V1RB2 wykazuje skok poziomu wapnia w odpowiedzi na perfuzję liganda receptora, 2-hepnonu. Co ciekawe, neuron niewykazujący ekspresji V1RB2 również reaguje na 2-hepnon, co demonstruje złożoność kodowania feromonów w VNO.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak wyizolować i mikrodysektować mózg myszy w celu przygotowania świeżych skrawków tkanki. Protokół ten można również dostosować do badań fizjologicznych z wykorzystaniem alternatywnych barwników wapniowych i konfiguracji mikroskopowych. Powodzenia w przeprowadzeniu eksperymentu.

imaging-pheromone-sensing-mouse-vomeronasal-acute-tissue-slice

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Obrazowanie sensoryczne feromonów w przygotowaniu ostrego przekroju tkanki wodorowęglowej myszy

Rejestracje za pomocą macierzy mikroelektrod (MEA) stanowią metodę badania aktywności elektrycznej dużych populacji neuronów. W niniejszym materiale przedstawiamy szczegóły przygotowania MEA do rejestracji sygnałów z nabłonka womeronasalnego myszy przy jednoczesnej stymulacji tkanki.

Rejestracje z macierzy wieloelektrodowej nabłonka narządu Jacobsona

Narząd jamistnokaczkowy (VNO) wykrywa wewnątrzgatunkowe sygnały chemiczne, które przekazują informacje społeczne i rozrodcze. Przeprowadziliśmy eksperymenty obrazowania Ca2+ z wykorzystaniem myszy transgenicznych wykazujących ekspresję G-CaMP2 w tkance VNO. Podejście to pozwala nam analizować złożone wzorce odpowiedzi neuronów jamistnokaczkowych na liczne bodźce feromonowe.

Obrazowanie odpowiedzi neuronalnych w preparatach skrawków narządu jamistego wyrażających genetycznie kodowany czujnik wapnia

Ten film przedstawia izolację mysiego narządu lemieszowo-nosowego (VNO) i przygotowanie tkanek do cięcia wibratomem. Sekcje służą do scharakteryzowania biofizycznych i fizjologicznych atrybutów określonej grupy neuronów czuciowych.

Przygotowanie mysiego narządu lemieszowo-nosowego do przekroju wibratomu

Ten film demonstruje elektrofizjologiczny zapis węchowych neuronów czuciowych (OSN) u myszy przy użyciu techniki perforowanego patch-clamp. Nabłonek węchowy, zawierający OSN z receptorami zapachowymi znakowanymi fluoroforem, jest izolowany od myszy i umieszczany w komorze rejestracyjnej. Pipeta rejestrująca jest zaciśnięta na dendrytycznym pokrętle OSN, a nystatyna w pipecie perforuje membranę, tworząc połączenie elektryczne z komórką. Na koniec za pomocą kolejnej pipety dostarcza się...

Perforowany zapis węchowych neuronów czuciowych u myszy

Wideo z protokołem opisuje tworzenie klamry do rejestracji elektrofizjologicznej z całych komórek z neuronów czuciowych narządu lemieszowo-nosowego (VNO) u myszy. Koronalny wycinek VNO z fluorescencyjnie znakowanymi neuronami czuciowymi umieszcza się w konfiguracji rejestracyjnej. Znakowany neuron jest łatany pipetą rejestrującą w konfiguracji całej komórki w celu zapisu elektrofizjologicznego w odpowiedzi na bodźce chemiczne.

Ustanowienie klamry krosowej dla całej komórki do zapisu elektrofizjologicznego z neuronów czuciowych lemieszowo-nosowych

The mammalian nose is a multi-functional organ with intricate internal structures.  The nasal cavity is lined with various epithelia such as olfactory, ...

Skuteczna ręczna metoda odkostniania w celu przygotowania nienaruszonej tkanki nosowej myszy z zachowaną organizacją anatomiczną

Dodatkowa opuszka węchowa myszy (AOB) była trudna do zbadania w kontekście kodowania sensorycznego. Tutaj demonstrujemy sekcję, w wyniku której powstaje preparat ex vivo, w którym neurony AOB pozostają funkcjonalnie połączone ze swoimi obwodowymi wejściami, ułatwiając badania nad przetwarzaniem informacji o mysich feromonach i kairomonach.

Ex vivo Preparaty nienaruszonego narządu lemieszowo-nosowego i dodatkowej opuszki węchowej

Analiza fizjologicznych właściwości węchowych neuronów czuciowych nadal napotyka na techniczne ograniczenia. Tutaj rejestrujemy je przez perforowany patch-clamp w nienaruszonym preparowaniu nabłonka węchowego u myszy ukierunkowanych na geny. Technika ta pozwala na scharakteryzowanie właściwości błony i odpowiedzi na określone ligandy neuronów wyrażających określone receptory węchowe.

Perforowany zapis patch-clamp węchowych węchowych neuronów czuciowych myszy w nienaruszonym neuroepithelium: analiza funkcjonalna neuronów wyrażających zidentyfikowany receptor zapachowy

Tutaj opisujemy fizjologiczne podejście, które pozwala na identyfikację i dogłębną analizę zdefiniowanej populacji neuronów czuciowych w ostrych wycinkach tkanki koronalnej mysiego narządu lemieszowo-nosowego za pomocą nagrań z całych komórek.

Dogłębna analiza fizjologiczna zdefiniowanych populacji komórek w ostrych wycinkach tkanek mysiego narządu lemieszowo-nosowego

W tym artykule przedstawiono uproszczony protokół rozwarstwiania i dysocjacji mysiego nabłonka węchowego w celu sekwencjonowania jednojądrowego RNA.

Szybka dyssekcja i dysocjacja nabłonka węchowego myszy w celu uzyskania zawiesin jednojądrowych

Poznaj metodę obrazowania wapnia w preparatach ostrego plastra tkanki lemieszowo-nosowej myszy. Technika ta umożliwia obserwację aktywności neuronów w odpowiedzi na feromony in vivo.

Obrazowanie detekcji feromonów w preparacie cienkich przekrojów tkanki organu vomeronasalnego myszy

Przeglądaj więcej filmów