Projekt cyklicznego bioreaktora ciśnieniowego do badania ex vivo zastawek aorty serca

Ogólnym celem tej procedury jest określenie biologicznej odpowiedzi tkanki lub komórek zastawki aortalnej serca na cykliczne ciśnienie. Osiąga się to poprzez najpierw wyizolowanie tkanki zastawki z serc o słabym znaku i inkubację ich w pożywce do hodowli tkankowej przez noc. Drugim krokiem procedury jest upewnienie się, że system ciśnieniowy jest skalibrowany. Następny.

Tkanka lub komórki zastawki są umieszczane w układzie ciśnieniowym. Komorę umieszcza się w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza i uruchamia się cykliczny reżim ciśnienia na żądany okres czasu z żądaną wielkością i częstotliwością. Na koniec tkanka jest usuwana z systemu w celu analizy biologicznej.

Ostatecznie można uzyskać wyniki, które pokazują, jak podwyższone ciśnienie wpływa na ekspresję genów i białek za pomocą PCR w czasie rzeczywistym, Western blotting lub mikroskopii. Główną zaletą tej techniki jest to, że jesteśmy w stanie oddzielić efekty nacisku mechanicznego od innych sił mechanicznych i stymulantów biochemicznych. Jest to przewaga nad innymi technikami, takimi jak modele zwierzęce, chociaż może to pomóc nam zrozumieć, w jaki sposób siły mechaniczne wpłynęły na biologię i patogenezę zastawek serca.

Może być również używany do opracowywania konstruktów inżynierii tkankowej. Zademonstrowanie nam tej procedury jest teraz zabawkowym losem. Doktorant w moim laboratorium Aby przygotować tkankę do ucisku.

W badaniach pobiera się zastawki aortalne od dorosłych samic świń ważących nie więcej niż 120 funtów bezpośrednio po śmierci. Umyj zawory dwukrotnie sterylnym PBS, a następnie umieść na lodzie i przetransportuj do laboratorium. Wszystkie kolejne kroki powinny być wykonywane w sterylnych warunkach.

Upewnij się, że ulotki nie wykazują żadnych oznak zwyrodnienia, rozdarcia lub zwapnienia. Usuń ulotki z korzenia aorty, przecinając jedną trzecią odległości od pierścienia. Umieść ulotki w indywidualnych studzienkach na płytce sześciodołkowej i inkubuj z trzema mililitrami DMEM uzupełnionym 1% antybiotykowym roztworem przeciwgrzybiczym i 10% płodową surowicą bydlęcą przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.

Ten system ciśnieniowy jest wykonany na zamówienie i został zaprojektowany do badania mechanobiologicznych skutków cyklicznego ciśnienia na tkankę zastawki aortalnej. Aby korzystać z systemu, zaloguj się do komputera i otwórz program lab view. Sprawdź, czy sprężone powietrze jest podłączone do systemu i otwórz dopływ powietrza do pełnej prędkości.

Włącz wzmacniacz sygnału. Upewnij się, że odczyt napięcia wynosi 0,00. Dostosuj w razie potrzeby.

Interfejs widoku laboratorium ma przełącznik oznaczony rekordem testowym z przełącznikiem ustawionym na test. Kliknij przycisk oznaczony dopływ powietrza, aby otworzyć elektrozawór wlotowy. Za pomocą regulatora ciśnienia gazu należy zwiększyć ciśnienie w komorze sprężonym powietrzem o wartości jednego PS. Odczytałem ciśnienie w komorze za pomocą manometru cyfrowego znajdującego się na tylnej płycie końcowej komory.

Gdy ciśnienie się wyrówna, zapisz odczyt napięcia ze wzmacniacza sygnału. Powtórz dla 2, 3, 4 i pięciu PSI. Następnie skonstruuj krzywą kalibracyjną ciśnienia w funkcji napięcia.

Przelicz ciśnienie z PSI na milimetry słupa rtęci. Umieść równanie z wykresu w kodzie programu do wyświetlania laboratorium. Zdejmij aluminiową płytę przednią z komory ciśnieniowej i spryskaj komorę 70% etanolem.

Umieścić sześciodołkową płytkę zawierającą próbki ulotki w komorze i założyć przednią płytkę końcową. Upewnij się, że uszczelka jest szczelna, ręcznie dokręcając nakrętki znajdujące się na czterech prętach gwintowanych. Umieść komorę ciśnieniową w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Wprowadź czas, przez jaki system przełącza się między wejściem a wyjściem sprężonego powietrza. Powinny one być ustawione na 0,6 sekundy i 0,4 sekundy, aby naśladować odpowiednio warunki rozkurczowe i skurczowe z częstotliwością jednego herca. Następnie wprowadź ścieżkę do pliku danych w widoku laboratorium.

Kliknij przycisk Uruchom i przełącz przełącznik rekordu testowego na nagrywanie. Sprawdź, czy ciśnienie jest na żądanym poziomie, korzystając z wykresu w interfejsie widoku laboratorium. W razie potrzeby wyreguluj ciśnienie za pomocą regulatora ciśnienia gazu.

Po zakończeniu eksperymentu kliknij stop w widoku laboratoryjnym i wyłącz dopływ powietrza oraz otwórz zawór wydechowy w komorze ciśnieniowej. Na koniec wyjmij system ciśnieniowy z inkubatora. Następnie wyjmij przednią płytkę końcową z komory i wyjmij płytkę sześciodołkową.

Próbki mogą być teraz analizowane pod kątem ekspresji genów, ekspresji białek, histologii i właściwości mechanicznych, które reprezentują formy fal ciśnienia o normalnym i podwyższonym ciśnieniu. Warunki uzyskane z systemu są pokazane tutaj w warunkach in vivo. Podczas rozkurczu występuje różnica ciśnień między lewą komorą a aortą wstępującą, która umożliwia zastawce aortalnej pozostanie zamkniętą w normalnych warunkach fizjologicznych.

To ciśnienie przezzastawkowe wynosi 80 milimetrów słupa rtęci. Jednak w pierwszym i drugim etapie nadciśnienia ciśnienie międzyzastawkowe może wzrosnąć odpowiednio do 90 i 100 milimetrów słupa rtęci. System ciśnieniowy jest w stanie symulować maksymalne ciśnienie przezzastawkowe obserwowane w normie 10, w warunkach nadciśnienia pierwszego i drugiego stopnia.

Poniżej przedstawiono reprezentatywne formy fal ciśnienia w warunkach normalnego i podwyższonego ciśnienia uzyskane z układu. Tak więc, postępując zgodnie z tą procedurą, jesteśmy w stanie wykonać inne metody, takie jak PCR i Western blot oraz mikroskopia na ulotkach. Pomaga nam to zrozumieć zmiany w ekspresji genów i syntezie białek, a także pomaga nam zrozumieć mechano transdukcję w zastawkach serca.

Technika ta okazała się bardzo przydatna, pomagając nam zrozumieć biologię mechaniczną i mechanizmy choroby, a także była w stanie lub może pomóc nam w przyszłości zrozumieć zmiany zachodzące w innych tkankach, które mogą ulegać zmianom ciśnienia in vivo.