Name: Projekt cyklicznego bioreaktora ciśnieniowego do badania ex vivo zastawek aorty serca (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: Poznaj metodę badania tkanki zastawki aortalnej w cyklicznym bioreaktorze ciśnieniowym. Technika pozwala analizować odpowiedź biologiczną na zmienne warunki mechaniczne w kontrolowanym środowisku.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy są wdzięczni Shad Schipke i Danielowi Chesserowi za pomoc w projektowaniu i wykonaniu układu oraz Valtresie Myles za pomoc w przygotowaniu rękopisu.

1.	Pobranie i przygotowanie tkanek
<ol>
<li>Zastawek aorty należy pobrać od dorosłych świń o masie nieprzekraczającej 120 lbs niezwłocznie po śmierci zwierzęcia.</li>
<li>Zastawki należy dwukrotnie przemyć sterylnym roztworem soli fizjologicznej w buforze fosforanowym (PBS) i przetransportować do laboratorium w lodzie.</li>
<li>Wszystkie kolejne etapy powinny być przeprowadzane w warunkach sterylnych.</li>
<li>Należy upewnić się, że płatki zastawek nie wykazują oznak degeneracji, pęknięć ani zwapnień. Płatki należy oddzielić od pierścienia aorty, przecinając tkankę w odległości 1/3 od pierścienia.</li>
<li>Płatki należy umieścić w poszczególnych dołkach płytki 6-dołkowej i inkubować przez noc w 3ml pożywki DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) uzupełnionej o 1% roztwór antybiotyków i środków przeciwgrzybiczych oraz 10% płodowej surowicy bydlęcej w temperaturze 37°C i 5% CO2.</li>
<li>Alternatywnie można wysiać wyizolowane komórki na 6-dołkowe płytki hodowlane i wykorzystać je w urządzeniu do badania ciśnienia. Izolację komórek śródbłonka i komórek śródmiąższowych zastawek można przeprowadzić zgodnie z wcześniej opisaną procedurą13, 14.</li>
</ol>
2. Badania ciśnieniowe
<ol>
<li>W celu zbadania mechanobiologicznych efektów cyklicznego ciśnienia na tkankę zastawki aorty zaprojektowano specjalistyczny układ ciśnieniowy15.</li>
<li>Zaloguj się do komputera i uruchom program labVIEW (Rycina 1).</li>
<li>Kalibracja:<ol>
<li>Przed przystąpieniem do eksperymentów układ należy odpowiednio skalibrować.</li>
<li>Podłącz zasilacz do płytki obwodowej. Zapewnia to zasilanie elektrozaworów sterujących przepływem powietrza do komory i z niej.</li>
<li>Upewnij się, że sprężone powietrze jest podłączone do układu i otwórz dopływ powietrza do pełnej prędkości.</li>
<li>Włącz wzmacniacz sygnałowy. Upewnij się, że odczyt napięcia wynosi 0.00. W razie potrzeby dokonaj regulacji.</li>
<li>Interfejs labVIEW posiada przełącznik oznaczony jako „TEST/RECORD”. Upewnij się, że przełącznik jest ustawiony na „TEST”. Kliknij przycisk oznaczony jako „Air Supply”, aby otworzyć wlotowy elektrozawór.</li>
<li>Za pomocą regulatora ciśnienia gazu zwiększ ciśnienie w komorze sprężonym powietrzem do 1 PSI. Ciśnienie w komorze można odczytać z cyfrowego manometru znajdującego się na tylnej płycie końcowej komory. Po wyrównaniu ciśnienia zapisz odczyt napięcia ze wzmacniacza sygnałowego. Powtórz czynność dla 2, 3, 4 i 5 PSI.</li>
<li>Wykreśl krzywą kalibracyjną ciśnienia w funkcji napięcia. Ciśnienie należy przeliczyć z PSI na mmHg. Równanie uzyskane z wykresu można wprowadzić do kodu programu labVIEW.</li>
</ol>
</li>
<li>Zdejmij aluminiową płytę przednią z komory ciśnieniowej i spryskaj komorę 70% etanolem. Pozostaw na minimum 10 minut, aby pozostałości oparów etanolu odparowały.</li>
<li>Umieść płytkę sześciodołkową zawierającą próbki płatków w komorze i zamontuj przednią płytę końcową. Upewnij się, że uszczelnienie jest szczelne, dokręcając ręcznie nakrętki znajdujące się na czterech prętach gwintowanych (umieszczonych w każdym rogu płyty końcowej). Umieść komorę ciśnieniową w inkubatorze w temperaturze 37°C. Schemat komory ciśnieniowej przedstawiono na rycinie 2.</li>
<li>Interfejs poprosi użytkownika o podanie czasu cykli między dopływem a odpływem sprężonego powietrza. Wartości te należy ustawić odpowiednio na 0.6s i 0.4s, aby odwzorować warunki rozkurczowe i skurczowe przy częstotliwości 1Hz. Użytkownik powinien również wprowadzić ścieżkę do pliku danych.</li>
<li>W programie labVIEW kliknij „run” i przełącz przełącznik „TEST/RECORD” na „RECORD”.</li>
<li>Upewnij się, że ciśnienie znajduje się na pożądanym poziomie, korzystając z wykresu w interfejsie labVIEW. Ciśnienie można regulować za pomocą regulatora ciśnienia gazu.</li>
<li>Uruchom program na żądany czas.</li>
<li>Po zakończeniu eksperymentu kliknij przycisk stop w programie labVIEW, wyłącz dopływ powietrza i otwórz zawór spustowy w komorze ciśnieniowej.</li>
<li>Zdejmij przednią płytę końcową z komory i wyjmij płytkę sześciodołkową z próbkami. Próbki mogą być teraz analizowane pod kątem ekspresji genów, ekspresji białek, histologii, właściwości mechanicznych itp.</li>
</ol>
3. Reprezentatywne wyniki: 
Układ ciśnieniowy jest w stanie symulować maksymalne ciśnienia transwalwularne obserwowane w warunkach normotensyjnych oraz w nadciśnieniu stopnia I i stopnia II. Jednakże układ nie był w stanie odwzorować gradientu ciśnienia skurczowego, który in vivo wynosi w zasadzie zero. Częstotliwość jest utrzymywana na poziomie 1Hz, przy czasie wlotu powietrza wynoszącym 0,6s i czasie wylotu 0,4s. Reprezentatywne przebiegi ciśnienia dla warunków ciśnienia prawidłowego i podwyższonego, uzyskane z układu, przedstawiono na rysunku 3.
<img src="/files/ftp_upload/3316/3316fig1.jpg" alt="Interfejs akwizycji danych z czujnikiem ciśnienia, monitorem dopływu powietrza i wykresem kontrolnym eksperymentu." data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Rycina 1"> Rycina 1: Zrzut ekranu interfejsu LabVIEW.
<img src="/files/ftp_upload/3316/3316fig2.jpg" alt="Równowaga statyczna; schemat montażu belki konstrukcyjnej; śruby i projekt ramy." data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Rysunek 2"> Rysunek 2: Schematyczny rysunek komory ciśnieniowej A. Widok izometryczny komory ciśnieniowej; B. Widok boczny komory ciśnieniowej; C. Widok z góry komory ciśnieniowej.
<img src="/files/ftp_upload/3316/3316fig3.jpg" alt="Wykresy ciśnienia krwi w funkcji czasu, pokazujące wahania ciśnienia w ciągu 6 sekund w trzech różnych próbach." data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Rycina 3"> Rycina 3: Wykres symulacji ciśnienia w komorze ciśnieniowej w warunkach (A) normotensyjnych, (B) nadciśnienia stopnia I oraz (C) nadciśnienia stopnia II.

<ol><li>Freeman, R. V., Otto, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectrum+of+calcific+aortic+valve+disease%3A+pathogenesis%2C+disease+progression%2C+and+treatment+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Spectrum of calcific aortic valve disease: pathogenesis, disease progression, and treatment strategies.</a> Circulation. 111, 3316-3326 (2005).</li>
<li>Robicsek, F., Thubrikar, M. J., Fokin, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cause+of+degenerative+disease+of+the+trileaflet+aortic+valve%3A+review+of+subject+and+presentation+of+a+new+theory%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Thorac+Surg%22%5BJournal%5D)">Cause of degenerative disease of the trileaflet aortic valve: review of subject and presentation of a new theory.</a> Ann Thorac Surg. 73, 1346-1354 (2002).</li>
<li>Thubrikar, M. J., Aouad, J., Nolan, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+calcific+deposits+in+operatively+excised+stenotic+or+purely+regurgitant+aortic+valves+and+their+relation+to+mechanical+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Patterns of calcific deposits in operatively excised stenotic or purely regurgitant aortic valves and their relation to mechanical stress.</a> Am J Cardiol. 58, 304-308 (1986).</li>
<li>Agno, F. S., Chinali, M., Bella, J. N., Liu, J. E., Arnett, D. K., Kitzman, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aortic+valve+sclerosis+is+associated+with+preclinical+cardiovascular+disease+in+hypertensive+adults%3A+the+Hypertension+Genetic+Epidemiology+Network+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hypertens%22%5BJournal%5D)">Aortic valve sclerosis is associated with preclinical cardiovascular disease in hypertensive adults: the Hypertension Genetic Epidemiology Network study.</a> J Hypertens. 23, 867-8673 (2005).</li>
<li>Cawley, P. J., Otto, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevention+of+calcific+aortic+valve+stenosis+-+fact+or+fiction%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Prevention of calcific aortic valve stenosis - fact or fiction.</a> Annals of Medicine. 41, 100-108 (2009).</li>
<li>Durst, C. A., Grande-Allen, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+physical+characterization+of+a+synchronous+multivalve+aortic+valve+culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Design and physical characterization of a synchronous multivalve aortic valve culture system.</a> Ann Biomed Eng. 38, 319-3125 (2010).</li>
<li>Engelmayr, G. C., Soletti, L., Vigmostad, S. C., Budilarto, S. G., Federspiel, W. J., Chandran, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+flex-stretch-flow+bioreactor+for+the+study+of+engineered+heart+valve+tissue+mechanobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">A novel flex-stretch-flow bioreactor for the study of engineered heart valve tissue mechanobiology.</a> Ann Biomed Eng. 36, 700-712 (2008).</li>
<li>Sucosky, P., Padala, M., Elhammali, A., Balachandran, K., Jo, H., Yoganathan, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+an+ex+vivo+culture+system+to+investigate+the+effects+of+shear+stress+on+cardiovascular+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech+Eng%22%5BJournal%5D)">Design of an ex vivo culture system to investigate the effects of shear stress on cardiovascular tissue.</a> J Biomech Eng. 130, 035001-03 (2008).</li>
<li>Syedain, Z. H., Tranquillo, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+cyclic+stretch+bioreactor+for+tissue-engineered+heart+valves%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Controlled cyclic stretch bioreactor for tissue-engineered heart valves.</a> Biomaterials. 30, 4078-4084 (2009).</li>
<li>Lagana, K., Moretti, M., Dubini, G., Raimondi, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+bioreactor+for+the+controlled+application+of+complex+mechanical+stimuli+for+cartilage+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Inst+Mech+Eng+H%22%5BJournal%5D)">A new bioreactor for the controlled application of complex mechanical stimuli for cartilage tissue engineering.</a> Proc Inst Mech Eng H. 222, 705-715 (2008).</li>
<li>Wartella, K. A., Wayne, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioreactor+for+biaxial+mechanical+stimulation+to+tissue+engineered+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech+Eng%22%5BJournal%5D)">Bioreactor for biaxial mechanical stimulation to tissue engineered constructs.</a> J Biomech Eng. 131, 044501-044501 (2009).</li>
<li>Wallis, M. C., Yeger, H., Cartwright, L., Shou, Z., Radisic, M., Haig, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feasibility+study+of+a+novel+urinary+bladder+bioreactor%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Feasibility study of a novel urinary bladder bioreactor.</a> Tissue Eng Part A. 14, 339-348 (2008).</li>
<li>Butcher, J. T., Nerem, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Valvular+endothelial+cells+regulate+the+phenotype+of+interstitial+cells+in+co-culture%3A+effects+of+steady+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Valvular endothelial cells regulate the phenotype of interstitial cells in co-culture: effects of steady shear stress.</a> Tissue Eng. 12, 905-915 (2006).</li>
<li>Metzler, S. A., Pregonero, C. A., Butcher, J. T., Burgess, S. C., Warnock, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+Strain+Regulates+Pro-Inflammatory+Protein+Expression+in+Porcine+Aortic+Valve+Endothelial+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Heart+Valve+Dis%22%5BJournal%5D)">Cyclic Strain Regulates Pro-Inflammatory Protein Expression in Porcine Aortic Valve Endothelial Cells.</a> J Heart Valve Dis. 17, 571-578 (2008).</li>
<li>Schipke, K. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSchipke%2C+KJ+%22Design+of+a+cyclic+pressure+bioreactor+for+the+ex+vivo+study+of+aortic+heart+valve+mechanobiology%22">Design of a cyclic pressure bioreactor for the ex vivo study of aortic heart valve mechanobiology</a>. , Mississippi State University. Mississippi State. (2008).</li>
<li>Smith, K. E., Metzler, S. A., Warnock, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+strain+inhibits+acute+pro-inflammatory+gene+expression+in+aortic+valve+interstitial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomechanics+and+Modeling+in+Mechanobiology%22%5BJournal%5D)">Cyclic strain inhibits acute pro-inflammatory gene expression in aortic valve interstitial cells.</a> Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. , (2009).</li>
<li>Warnock, J. N., Burgess, S. C., Shack, A., Yoganathan, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+immediate-early+gene+responses+to+elevated+pressure+in+porcine+aortic+valve+interstitial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Heart+Valve+Dis%22%5BJournal%5D)">Differential immediate-early gene responses to elevated pressure in porcine aortic valve interstitial cells.</a> J Heart Valve Dis. 15, 34-41 (2006).</li>
<li>Brathwaite, D., Weissman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+new+onset+of+atrial+arrhythmias+following+major+noncardiothoracic+surgery+is+associated+with+increased+mortality%5BTitle%5D)+AND+%22Chest%22%5BJournal%5D)">The new onset of atrial arrhythmias following major noncardiothoracic surgery is associated with increased mortality.</a> Chest. 114, 462-468 (1998).</li>
<li>Walsh, S. R., Oates, J. E., Anderson, J. A., Blair, S. D., Makin, C. A., Walsh, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postoperative+arrhythmias+in+colorectal+surgical+patients%3A+incidence+and+clinical+correlates%5BTitle%5D)+AND+%22Colorectal+Dis%22%5BJournal%5D)">Postoperative arrhythmias in colorectal surgical patients: incidence and clinical correlates.</a> Colorectal Dis. 8, 212-216 (2006).</li>
<li>Walsh, S. R., Tang, T., Gaunt, M. E., Schneider, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+arrhythmias+after+non-cardiothoracic+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22BMJ%22%5BJournal%5D)">New arrhythmias after non-cardiothoracic surgery.</a> BMJ. 7, 333-333 (2006).</li>
<li>Walsh, S. R., Tang, T., Wijewardena, C., Yarham, S. I., Boyle, J. R., Gaunt, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postoperative+arrhythmias+in+general+surgical+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+R+Coll+Surg+Engl%22%5BJournal%5D)">Postoperative arrhythmias in general surgical patients.</a> Ann R Coll Surg Engl. 89, 91-95 (2007).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

System ciśnieniowy pomyślnie poddał płatki zastawki aorty cyklicznym ciśnieniom reprezentującym rozkurczowe ciśnienie transzastawkowe. Nie był on jednak w stanie odtworzyć skurczowego ciśnienia transzastawkowego, ponieważ ciśnienie spadało jedynie do 40 mmHg. Ciśnienie transzastawkowe to różnica między ciśnieniem w aorcie wstępującej a ciśnieniem w lewej komorze. Podczas rozkurczu, gdy zastawka jest zamknięta, różnica ciśnień wynosi 80 mmHg w warunkach normotensyjnych oraz odpowiednio 90 mmHg i 100 mmHg w nadciśnieniu st...

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5671</td><td></td></tr><tr><td>PBS Dulbecco&amp;rsquo;a</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5652</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór antybiotyk-antybiotyki</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5955</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>SH30070</td><td></td></tr><tr><td>Elektrozawory z membraną z Vitonu</td><td>McMaster-Carr</td><td>4868K11</td><td></td></tr><tr><td>Przetwornik ciśnienia</td><td>Omega Engineering, Inc.</td><td>PX302-200GV</td><td></td></tr><tr><td>Kondycjoner tensometru</td><td>Encore Electronics, Inc.</td><td>4025-101</td><td></td></tr><tr><td>Moduł akwizycji danych (DAQ)</td><td>Measurement Computing</td><td>PMD1608</td><td></td></tr></tbody></table>

projekt cyklicznego bioreaktora ciśnieniowego do badań ex vivo zastawek tętniczych serca

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Zastawka aorty, znajdująca się pomiędzy lewą komorą a aortą, umożliwia jednokierunkowy przepływ krwi, zapobiegając jej cofaniu się do komory. Płatki zastawki aorty składają się z komórek śródmiąższowych zawieszonych w macierzy pozakomórkowej (ECM) i są wyścielone monowarstwą komórek śródbłonka. Zastawka znosi trudne, dynamiczne warunki i jest stale narażona na siły ścinania, zginanie, rozciąganie i ściskanie. Badania wykazały, że zmiany wapienne w chorych zastawkach występują w obszarach wysokiego naprężenia mechanicznego w wyniku uszkodzenia śródbłonka lub macierzy śródmiąższowej1-3. W związku z tym nie jest zaskakujące, że badania epidemiologiczne wykazały, iż wysokie ciśnienie krwi jest głównym czynnikiem ryzyka wystąpienia choroby zastawki aorty4.
Jedyną obecnie dostępną opcją leczenia chorób zastawek jest chirurgiczna wymiana chorej zastawki na zastawkę bioprotezę lub mechaniczną5. Lepsze zrozumienie biologii zastawek w odpowiedzi na stresy fizyczne pomogłoby wyjaśnić mechanizmy patogenezy zastawek. Z kolei mogłoby to pomóc w opracowaniu terapii nieinwazyjnych, takich jak interwencje farmakologiczne lub profilaktyka. Wcześniej opracowano kilka bioreaktorów do badania mechanobiologii natywnych lub inżynieryjnych zastawek serca6-9. Opracowano również bioreaktory pulsacyjne do badania szeregu tkanek, w tym chrząstki10, kości11 i pęcherza moczowego12. Celem niniejszej pracy było opracowanie systemu cyklicznego ciśnienia, który mógłby zostać wykorzystany do wyjaśnienia biologicznej odpowiedzi płatków zastawki aorty na zwiększone obciążenia ciśnieniowe.
Układ składał się z akrylowej komory, w której umieszczano próbki i generowano cykliczne ciśnienie, elektrozaworów z membraną z vitonu do sterowania czasem cyklu ciśnienia oraz komputera do sterowania urządzeniami elektrycznymi. Ciśnienie monitorowano za pomocą przetwornika ciśnienia, a sygnał był przetwarzany przez wzmacniacz tensometryczny. Program LabVIEW regulował ciśnienie, wykorzystując urządzenie analogowe do pompowania sprężonego powietrza do układu z odpowiednią prędkością. Układ odwzorowywał dynamiczne poziomy ciśnienia transwalwularnego związane z zastawką aorty; fala piłokształtna powodowała stopniowy wzrost ciśnienia, typowy dla gradientu ciśnienia transwalwularnego występującego w zastawce podczas rozkurczu, po czym następował gwałtowny spadek ciśnienia obrazujący otwarcie zastawki w skurczu. Program LabVIEW pozwalał użytkownikom na kontrolę amplitudy i częstotliwości cyklicznego ciśnienia. Układ umożliwiał poddawanie próbek tkanek fizjologicznym i patologicznym warunkom ciśnienia. Urządzenie to może być wykorzystane do poszerzenia wiedzy na temat reakcji zastawek serca na zmiany w lokalnym środowisku mechanicznym.

Zaprojektowano cykliczny bioreaktor ciśnieniowy, który umożliwia poddawanie tkanki zastawek serca fizjologicznym oraz patologicznym warunkom ciśnieniowym. Program LabVIEW pozwala użytkownikom na kontrolowanie wartości, amplitudy oraz częstotliwości ciśnienia. Urządzenie to może być wykorzystywane do badania mechanobiologii tkanki zastawek serca lub izolowanych komórek.

Projekt cyklicznego bioreaktora ciśnieniowego do badań ex vivo zastawek tętniczych serca

Zastawka aortalna, znajdująca się pomiędzy lewą komorą a aortą, umożliwia jednokierunkowy przepływ krwi, zapobiegając jej cofaniu się do komory. Aortalna...

Ogólnym celem tej procedury jest określenie odpowiedzi biologicznej tkanki zastawki aortycznej serca lub komórek na cykliczne ciśnienie. Jest to realizowane poprzez uprzednią izolację tkanki zastawkowej z serc świń i inkubowanie ich w pożywce do hodowli tkanek przez noc. Drugim krokiem procedury jest upewnienie się, że system pomiaru ciśnienia został skalibrowany. Dalej.Tkankę lub komórki zastawki umieszcza się w systemie ciśnieniowym. Komorę umieszcza się w inkubatorze w temperaturze 37 °C i uruchamia cykliczny reżim ciśnienia na wybrany czas, z określoną wartością i częstotliwością. Na koniec tkankę usuwa się z systemu w celu przeprowadzenia analizy biologicznej.Ostatecznie można uzyskać wyniki wykazujące, w jaki sposób podwyższone ciśnienie wpływa na ekspresję genów i białek za pomocą techniki real-time PCR, Western blotting lub mikroskopii. Główną zaletą tej techniki jest możliwość oddzielenia skutków ciśnienia mechanicznego od innych sił mechanicznych i stymulantów biochemicznych. Stanowi to przewagę nad innymi metodami, takimi jak modele zwierzęce, choć mogą one pomóc w zrozumieniu sposobu, w jaki siły mechaniczne wpływają na biologię i patogenezę zastawek serca.Może ona być również wykorzystana do opracowywania konstruktów inżynierii tkankowej. Tę procedurę zaprezentuje nam teraz Toy Fate, doktorant w moim laboratorium, przygotowując tkankę do poddania działaniu ciśnienia.W badaniach pobierane są zastawki aortalne od dorosłych samic świń o masie nieprzekraczającej 120 funtów, bezpośrednio po śmierci zwierzęcia. Zastawki należy przemyć dwukrotnie sterylnym PBS, a następnie umieścić na lodzie i przetransportować do laboratorium. Wszystkie kolejne etapy powinny być wykonywane w warunkach sterylnych.Upewnij się, że płatki nie wykazują żadnych oznak degeneracji, pęknięć lub zwapnień. Usuń płatki z pierścienia aortowego, przecinając tkankę w odległości jednej trzeciej od pierścienia. Umieść płatki w poszczególnych studzienkach płytki sześciostudzienkowej i inkubuj przez noc w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w 3 ml DMEM uzupełnionego o 1% roztwór antybiotyk-antymykotyk oraz 10% płodowej surowicy bydlęcej.Ten system ciśnieniowy został wykonany na zamówienie i zaprojektowany w celu badania mechanobiologicznych efektów cyklicznego ciśnienia na tkankę zastawki aortalnej. Aby skorzystać z systemu, zaloguj się do komputera i otwórz program LabVIEW. Sprawdź, czy sprężone powietrze jest podłączone do systemu, a następnie otwórz dopływ powietrza do pełnej prędkości.Włącz wzmacniacz sygnału. Upewnij się, że odczyt napięcia wynosi 0,00. W razie potrzeby dokonaj korekty.Interfejs LabVIEW posiada przełącznik oznaczony jako test record, ustawiony w pozycji test. Kliknij przycisk air supply, aby otworzyć elektrozawór wlotowy. Używając regulatora ciśnienia gazu, napompuj komorę sprężonym powietrzem do ciśnienia 1 PS.I. Odczytaj ciśnienie w komorze za pomocą cyfrowego manometru znajdującego się na tylnej płycie czołowej komory.Po wyrównaniu ciśnienia odczytaj wartość napięcia z wzmacniacza sygnałowego. Powtórz czynność dla wartości 2, 3, 4 i 5 PSI. Następnie wykreśl krzywą kalibracyjną zależności ciśnienia od napięcia.Przelicz ciśnienie z PSI na milimetry słupa rtęci. Wprowadź równanie z wykresu do kodu programu LabVIEW. Zdejmij przednią aluminiową płytę z komory ciśnieniowej i spryskaj komorę 70% etanolem.Umieść płytkę sześciodołkową zawierającą próbki listków w komorze i zamknij przednią płytę końcową. Upewnij się, że uszczelnienie jest szczelne, dokręcając ręcznie nakrętki znajdujące się na czterech prętach gwintowanych. Umieść komorę ciśnieniową w inkubatorze w temperaturze 37 °C.Wprowadź czas cyklu systemu między wlotem a wylotem sprężonego powietrza. Wartości te należy ustawić odpowiednio na 0,6 sekundy i 0,4 sekundy, aby odzwierciedlić warunki rozkurczowe i skurczowe przy częstotliwości jednego herca. Następnie wprowadź ścieżkę do pliku danych w programie LabVIEW.Kliknij run i przełącz przełącznik zapisu testu na record. Sprawdź, czy ciśnienie znajduje się na pożądanym poziomie, korzystając z wykresu na interfejsie LabVIEW. W razie potrzeby skoryguj ciśnienie za pomocą regulatora ciśnienia gazu.Po zakończeniu eksperymentu należy kliknąć przycisk stop w widoku laboratorium (lab view), wyłączyć dopływ powietrza i otworzyć zawór upustowy w komorze ciśnieniowej. Następnie należy wyjąć system ciśnieniowy z inkubatora. Na koniec zdejmij przednią płytę czołową z komory i wyjmij płytkę 6-dołkową.Próbki mogą teraz zostać poddane analizie pod kątem ekspresji genów, ekspresji białek, badania histologicznego oraz właściwości mechanicznych, reprezentujących kształty fal ciśnienia przy wartościach prawidłowych i podwyższonych. Warunki uzyskane z systemu są tutaj przedstawione w warunkach in vivo. Podczas rozkurczu występuje różnica ciśnień między lewą komorą a aortą wstępującą, która umożliwia zamknięcie zastawki aortalnej w normalnych warunkach fizjologicznych.Ciśnienie transwalwularne wynosi 80 mmHg. Jednak w przypadku nadciśnienia pierwszego i drugiego stopnia ciśnienie transwalwularne może wzrosnąć odpowiednio do 90 i 100 mmHg. System ciśnieniowy jest w stanie symulować maksymalne ciśnienia transwalwularne obserwowane w warunkach normotensyjnych, nadciśnienia pierwszego oraz drugiego stopnia.Przedstawiono tutaj reprezentatywne kształty fal ciśnienia uzyskane z systemu dla warunków ciśnienia prawidłowego oraz podwyższonego. Postępując zgodnie z tą procedurą, jesteśmy w stanie zastosować inne metody, takie jak PCR, Western blotting oraz mikroskopia, w badaniu listków zastawki. Pomaga nam to zrozumieć takie zjawiska jak zmiany w ekspresji genów i syntezie białek, a także pozwala zrozumieć mechanotransdukcję w zastawkach serca.Technika ta okazała się niezwykle pomocna w zrozumieniu biologii mechanicznej oraz mechanizmów chorobowych, a w przyszłości może pomóc nam zrozumieć zmiany zachodzące w innych tkankach, które mogą podlegać wahaniom ciśnienia in vivo.

design-cyclic-pressure-bioreactor-for-ex-vivo-study-aortic-heart

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Projekt cyklicznego bioreaktora ciśnieniowego do badania ex vivo zastawek aorty serca

Nasz zespół opracował system hodowli w bioreaktorze, który naśladuje fizjologiczne naprężenia pulsacyjne układu sercowo-naczyniowego w celu regeneracji wszczepialnych zastążek naczyniowych o małej średnicy.

Projektowanie biologicznych przeszczepów naczyniowych z wykorzystaniem bioreaktora pulsacyjnego

Ponownie pojawiło się zainteresowanie rozwojem zaworów polimerowych. W tym przypadku celem jest wykazanie wykonalności modyfikacji komercyjnego powielacza impulsów w celu dostosowania go do geometrii trójulotkowej oraz zdefiniowanie protokołu prezentacji danych hydrodynamicznych zaworów polimerowych w porównaniu z danymi natywnymi i protezowymi zastawek zebranymi w niemal identycznych warunkach.

Protokół względnej oceny hydrodynamicznej trójpłatkowych zaworów polimerowych

Zaprojektowaliśmy nowatorski bioreaktor obciążenia mechanicznego, który może zastosować jednoosiowe lub dwuosiowe naprężenie mechaniczne do biokompozytu chrząstki przed przeszczepem do ubytku chrząstki stawowej.

Projekt dwuosiowego bioreaktora obciążenia mechanicznego dla inżynierii tkankowej

Opisujemy zaprojektowany przez nas model komory przepływowej in vitro, który pozwala na badanie przylegania bakterii do przeszczepionych tkanek.

Model in vitro systemu perfuzyjnego z równoległymi płytkami do badania przylegania bakterii do tkanek przeszczepu

Celem tego protokołu jest przeprowadzenie dynamicznej ko-hodowli ludzkich makrofagów i miofibroblastów w rurowych rusztowaniach elektroprzędzonych w celu zbadania regeneracji tkanek sterowanej materiałem, przy użyciu bioreaktora, który umożliwia oddzielenie naprężeń ścinających od cyklicznego rozciągania.

Bioreaktor z wieloma wskazówkami do oceny zdolności zapalnej i regeneracyjnej biomateriałów poddanych przepływowi i rozciąganiu

Niedomykalność zastawki aortalnej to choroba serca zastawki aortalnej. Manuskrypt ten pokazuje, w jaki sposób czterowymiarowe obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego może ocenić niedomykalność zastawki aortalnej przy użyciu zastawek serca in vitro naśladujących niedomykalność zastawki aortalnej.

Metody in vitro Ocena niedomykalności zastawki aortalnej za pomocą czterowymiarowego przepływowego rezonansu magnetycznego

Trójwymiarowe tkanki serca bioinżynieryjne wykorzystujące kardiomiocyty pochodzące z komórek macierzystych okazały się obiecującymi modelami do badania zdrowego i chorego ludzkiego mięśnia sercowego in vitro, jednocześnie podsumowując kluczowe aspekty rodzimej niszy sercowej. Manuskrypt ten opisuje protokół wytwarzania i analizy zmodyfikowanych tkanek serca o wysokiej zawartości wygenerowanych z ludzkich pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych.

Projektowanie bioreaktora w celu usprawnienia pozyskiwania danych i modelowania przepustowości zmodyfikowanych tkanek serca

Ten protokół przedstawia konfigurację i działanie nowo opracowanego, wydrukowanego w 3D bioreaktora do hodowli ex vivo naczyń krwionośnych w trakcie perfuzji. System został zaprojektowany tak, aby mógł być łatwo przyjęty przez innych użytkowników, praktyczny, niedrogi i możliwy do dostosowania do różnych zastosowań eksperymentalnych, takich jak podstawowa biologia i badania farmakologiczne.

Ex vivo Kultura perfuzyjna dużych naczyń krwionośnych w bioreaktorze wydrukowanym w 3D

Przedstawiamy metodę montażu zaworu aortalnego świni na powielaczu impulsów w celu przetestowania jego właściwości hydrodynamicznych. Metoda ta może być stosowana do określania zmiany hydrodynamiki po zastosowaniu procedury eksperymentalnej lub nowatorskiego wyrobu medycznego przed użyciem w dużym modelu zwierzęcym.

Model świni ex vivo do badań hydrodynamicznych eksperymentalnych procedur zastawki aortalnej i nowatorskich urządzeń medycznych

Omówiono metodę, za pomocą której mechaniczne zachowanie in vivo materiałów reagujących na bodźce jest monitorowane w funkcji czasu. Próbki są badane ex vivo przy użyciu testera mikrorozciągania z kontrolą środowiska w celu symulacji środowiska fizjologicznego. Praca ta dodatkowo przyczynia się do zrozumienia zachowania naszego materiału in vivo.

Kontrolowane środowiskowo badania mikrorozciągalności mechanicznie adaptacyjnych nanokompozytów polimerowych do charakterystyki ex vivo

Poznaj metodę badania tkanki zastawki aortalnej w cyklicznym bioreaktorze ciśnieniowym. Technika pozwala analizować odpowiedź biologiczną na zmienne warunki mechaniczne w kontrolowanym środowisku.

Projekt cyklicznego bioreaktora ciśnieniowego do badań ex vivo zastawek tętniczych serca

Przeglądaj więcej filmów