Name: Profilowanie białek powierzchniowych komórek raka jelita grubego za pomocą mikromacierzy przeciwciał i multipleksowania fluorescencyjnego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 17 s
Description: Poznaj profilowanie antygenów powierzchniowych w raku jelita grubego za pomocą mikromacierzy przeciwciał DOT scan i multipleksowania fluorescencyjnego. Ta metoda umożliwia identyfikację biomarkerów prognostycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy pracownikom Laboratoriów Patologii Anatomicznej w szpitalach Royal Prince Alfred i Concord Repatriation za pobranie świeżych próbek CRC oraz prawidłowej błony śluzowej jelit. Praca była finansowana z grantu Programu Translacyjnego Cancer Institute New South Wales.

<img src="/files/ftp_upload/3322/3322fig1.jpg" alt="Schemat izolacji komórek i macierzy kropelkowej przeciwciał; dezagregacja guza, analiza antygenów komórkowych." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Schemat postępowania przy przygotowywaniu zawiesiny żywych komórek z próbki chirurgicznej CRC.
1. Dysagregacja próbki klinicznej
Wszystkie próbki zostały pobrane w Royal Prince Alfred Hospital (Camperdown, NSW, Australia) oraz Concord Repatriation Hospital (Concord West, NSW, Australia) za świadomą zgodą pacjentów zgodnie z protokołem nr X08-164.
<ol>
 <li>Pobrać świeże preparaty raka jelita grubego (CRC) lub gruczolaków, a także normalną błonę śluzową jelita z miejsca oddalonego o co najmniej 10 cm od guza. Próbki przechowywać w zrównoważonym roztworze soli Hanksa pH 7.3 (HBSS) w temperaturze 4°C przez maksymalnie 12 h po resekcji.</li>
 <li>Przestrzegać zasad bezpieczeństwa dotyczących ludzkich patogenów; wszystkie próbki kliniczne przetwarzać w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II. Posiekać próbki na kostki o boku 2 mm w szalce Petriego, używając dwóch ostrzy skalpela.</li>
 <li>Inkubować tkankę nowotworową i prawidłową w oddzielnych probówkach Eppendorf przez 60 min w temperaturze 37°C z okresowym delikatnym mieszaniem, w równej objętości pożywki RPMI 1640 zawierającej 2% (v/v) kolagenazy typu 4 (Worthington, Lakewood, NJ, USA) oraz 0.1% (w/v) doksyrybonukleazy I z trzustki bydlęcej (DNAse I; Sigma-Aldrich).</li>
 <li>Przecisnąć częściowo strawioną tkankę przez drobne sito z drucianej siatki, używając tłoka z strzykawki 10 mL; wypłukać komórki za pomocą HBSS.</li>
 <li>Przepuścić otrzymaną zawiesinę komórkową przez filtry Filcon 200 μm i 50 μm (BD Biosciences) w celu usunięcia agregatów komórkowych. W tej serii filtracji usuwana jest większość DNA, śluzu oraz agregatów komórkowych.</li>
 <li>Wirować zawiesiny komórkowe przy 400 x g w temperaturze 20° przez 5 min.</li>
 <li>Resuspendować osady komórkowe w inaktywowanym termicznie FCS zawierającym 10% dimetylosulfoksyd (DMSO), zamrozić powoli w krioprobówkach i przechowywać w temperaturze -80°. Proces zamrażania przyczynia się do redukcji zawartości śluzu w próbce oraz lizy krwinek czerwonych.</li>
</ol>
2. Przygotowanie próbek do wychwytu komórek
<ol>
 <li>Szybko rozmrozić próbki w łaźni wodnej o temperaturze 37° i resuspender komórki w 10 mL HBSS w celu wypłukania DMSO.</li>
 <li>Odwirować zawiesiny komórkowe przy 410 x g w temperaturze 20° przez 5 min.</li>
 <li>Odlać nadsącz i resuspender osad komórkowy w 500 μL HBSS.</li>
 <li>Traktować próbkę 0,1% (w/v) DNAse I przez 20 min w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>Wymieszać 10 μL każdej zawiesiny komórkowej z równą objętością błękitu trypanu i nanieść 10 μL mieszaniny do hemocytometru. Używając mikroskopu świetlnego z powiększeniem 100-krotnym, policzyć żywe komórki, które pozostają bezbarwne dzięki wykluczeniu błękitu trypanu, podczas gdy martwe komórki pochłaniają barwnik. Do wychwytu komórek na mikroarray wymagane jest minimum 4 x 106 żywych komórek.</li>
 <li>Po traktowaniu DNAse resuspender zawiesinę komórkową w 10 mL HBSS i odwirować przy 410 x g w temperaturze 20° przez 5 min.</li>
 <li>Odlać nadsącz i resuspender osady komórkowe w RPMI 1640 do końcowej objętości 200 μL.</li>
</ol>
3. Wychwytywanie komórek na mikrotablicy przeciwciał
<ol>
 <li>Nawilżyć macierz przeciwciał DotScan, zanurzając sekcję nitrocelulozową w roztworze soli fosforanowej (PBS) przez około 20 s. Ostrożnie wytrzeć szklane krawędzie macierzy złożonymi chusteczkami Kimwipes, unikając dotykania sekcji nitrocelulozowej. </li>
 <li>Dodać wodę do tacki inkubacyjnej macierzy, aby stworzyć komorę wilgotną. Umieścić macierz w komorze i nanieść pipetą zawiesinę komórek w pożywce RPMI 1640 na wilgotną sekcję nitrocelulozową. Nanieść krople w każdym rogu nitrocelulozy, aby zapewnić równomierne rozprzestrzenienie komórek. </li>
 <li>Inkubować macierze w temperaturze 37°C przez 1 h. Inkubacja pozwala komórkom osiąść i wejść w kontakt z przeciwciałami na macierzy. Komórki wykazujące ekspresję antygenów powierzchniowych odpowiadających przeciwciałom, na których osiadły, zostaną uchwycone. </li>
 <li>Po inkubacji delikatnie i pionowo zanurzyć macierze w trzech korytkach zawierających co najmniej 15 mL PBS, aby wypłukać niezwiązane komórki (20 s na każde płukanie).</li>
 <li>Przygotować 3,7% (w/v) formaldehyd w PBS w celu utrwalenia komórek i przeciwciał poprzez sieciowanie. Delikatnie nanieść pipetą około 1 mL, aby pokryć sekcję nitrocelulozową macierzy. Inkubować przez 20 min w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>Następnie zanurzyć macierze w trzech kolejnych porcjach PBS (15 mL; po 30 s każda), aby wypłukać nadmiar formaldehydu. </li>
 <li>Wytrzeć krawędzie i tył szkiełka przedmiotowego chusteczkami Kimwipes i zeskanować macierz za pomocą skanera DotScan, gdy sekcja nitrocelulozowa jest jeszcze wilgotna. Skan optyczny pozwala uzyskać wzór ekspresji antygenów mieszanej populacji komórek, np. komórek CRC, leukocytów i innych komórek zrębu guza. </li>
</ol>
4. Fluorescencyjne multipleksowanie
<ol>
 <li>Wyjmij macierz mikroarray ze skanera i nanieś 200 μL buforu blokującego (2% w/v BSA, 2% inaktywowanego ciepłem ludzkiego serum AB, PBS, pH 7.3). Inkubuj w tacy do mikroarray w temperaturze pokojowej przez 20 min. </li>
 <li>Przygotuj roztwór do multipleksowania w probówce Eppendorf owiniętej folią aluminiową: 20 μL Phycoerythrin-anti-CD3 (Beckman Coulter, Gladesville, NSW, Australia, #IM12824; końcowe rozcieńczenie 1/7.5), 10 μL Alexa Fluor 647-anti-EpCAM (Biolegend, San Diego, CA, USA; rozcieńczenie 1/15), 2 μL inaktywowanego ciepłem ludzkiego serum AB (Sigma-Aldrich, Castle Hill, NSW, Australia) oraz 118 μL buforu blokującego. </li>
 <li>Odlej nadmiar buforu blokującego z mikroarray i nanieś pipetą roztwór do multipleksowania na sekcję z nitrocelulozy, rozprowadzając go równomiernie. Inkubuj przez 30 min w ciemności w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>Zanurz mikroarray pionowo w trzech korytkach zawierających po 15 ml świeżego PBS (po 30 s w każdym).</li>
 <li>Pozostaw mikroarray do wyschnięcia w ciemności i przechowuj w temperaturze 4°C w pudełku na szkiełka. Mikroarray można przechowywać w ciemności do 3 miesięcy bez utraty fluorescencji.</li>
 <li>Zeskanuj wysuszony mikroarray za pomocą skanera Typhoon FLA 9000 (GE Healthcare, Rydalmere, NSW, Australia) z rozdzielczością ustawioną na 50 (laser 532 nm, filtr emisji 580 BP30 dla PE; laser 633 nm i filtr emisji 670 BP30 dla Alexa 647). Mikroarray są skanowane stroną z nitrocelulozy skierowaną w dół na szklanej tacy skanera.</li>
 <li>Zapisz obrazy fluorescencyjne jako pliki TIFF, a następnie w programie Photoshop ustaw rozmiar obrazu na 17 x 25 cm i rozdzielczość na 72 pixels/cm. Zaimportuj obraz do oprogramowania analitycznego DotScan w celu analizy intensywności plamek.</li>
 <li>Program DotReader rejestruje cyfrowy obraz wzoru wiązania plamek i kwantyfikuje gęstość wiązania komórek na każdej plamce przeciwciała w 8-bitowej skali szarości (1-256 U). Sporadyczne nieswoiste wiązanie kontroli izotypowej odjęto od wartości wiązania dla przeciwciał o odpowiadających im izotypach immunoglobulin. Intensywności fluorescencji plamek dla każdego mikroarray znormalizowano względem najjaśniejszej plamki ustawionej na 100% intensywności. Siła sygnału/plamki została zapisana w pliku .xml (dane surowe) lub przedstawiona w formie wykresu słupkowego w pliku .pdf (raport końcowy).</li>
 <li>Mapy ciepła (heatmaps) i klasteryzacja hierarchiczna mikroarray zostały wykonane przy użyciu programu MultiExperiment Viewer (MeV) wersja 4.4 z pakietu TM4 Microarray Software Suite (<a href="http://www.tm4.org/mev.html">http://www.tm4.org/mev.html</a>). Klasteryzację hierarchiczną przeprowadzono na danych skorygowanych o tło za pomocą programu MeV z analizą pełnego wiązania (complete linkage analysis). Jako miarę podobieństwa zastosowano odległość euklidesową. Do wyznaczenia istotności statystycznej wyników użyto dwustronnego testu t Studenta przy założeniu równości wariancji.</li>
</ol>
5. Reprezentatywne wyniki:
Wyniki z mikroarray DotScan powinny wykazywać spójne wzorce wiązania komórek pomiędzy powtórzonymi macierzami. Silne wiązanie kropek wyrównawczych (CD44/CD29) umożliwia nałożenie siatki na obszar macierzy. Rysunek 2 przedstawia przykład optymalnego wychwytu komórek i multipleksowania. Rysunek 3 przedstawia niektóre typowe problemy napotykane podczas wychwytu komórek oraz możliwe rozwiązania.
Wyniki wiązania komórek w mikrotablicy można ilościowo określić poprzez pomiar intensywności plamek wyrażonej w skali szarości od 1 do 256. Rysunek 4 przedstawia dane numeryczne z 58 chirurgicznych próbek CRC, zabarwionych przeciwciałem EpCAM-Alexa 647, w formie mapy ciepła z klastrowaniem hierarchicznym. Mimo ograniczonej liczby próbek, CRC w tym samym stadium mają tendencję do grupowania się w jednej grupie.
<img src="/files/ftp_upload/3322/3322fig2.jpg" alt="Schemat mikrotablicy białkowej z wizualizacją danych: a) układ, b) wyniki w skali szarości, c) fluorescencja czerwona, d) fluorescencja niebieska." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Wzór wiązania komórek guza raka jelita grubego z próbki klinicznej (Australian Clinic-Pathological Staging, stopień ACP B1). (a) Legenda przeciwciał DotScan wskazująca lokalizację przeciwciał dla lewej połowy zdublowanej mikrotablicy (obrysowanej). Górna sekcja zawiera oryginalne 82 przeciwciała z mikrotablicy DotScan do białaczek. Dodatkowo dodano 40 przeciwciał odpowiadających specyficznym antygenom powierzchniowym, których nadekspresja została wykazana w literaturze, tworząc „satelitarną” mikrotablicę CRC. Dolna sekcja składa się z przeciwciał kontrolnych izotypowych. (b) Obraz optyczny komórek CRC wiążących się z mikrotablicą. (c) Obraz fluorescencyjny CD showing T-cells. (d) Obraz fluorescencyjny EpCAM wskazujący komórki CRC.
<img src="/files/ftp_upload/3322/3322fig3.jpg" alt="Równowaga statyczna; ΣFx=0; analiza wzoru kropek; eksperyment; wizualizacja rozkładu sił." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Przykłady nieprawidłowych wyników DotScan oraz możliwe rozwiązania. (a) Słabe wiązanie komórek; rozwiązanie: upewnij się, że na matrycy znajduje się co najmniej 4x106 żywych komórek (b) Wiązanie kontroli izotypowej i nieswoiste wiązanie komórek; rozwiązanie: przed inkubacją na mikrotablicy dodaj do próbki inaktywowaną ciepłem ludzkie surowicę AB, aby zminimalizować wiązanie kontroli izotypowej. Sporadycznie w próbkach CRC występuje niewielka ilość nieswoistego wiązania komórek do nitrocelulozy, co nie wpływa znacząco na wyniki. (c) Wysychanie nitrocelulozy podczas inkubacji; rozwiązanie: upewnij się, że próbka pokrywa całą sekcję nitrocelulozy, a mikrotablica jest inkubowana na płaskiej powierzchni. (d) Artefakty wysokiego tła; rozwiązanie: upewnij się, że mikrotablica została dokładnie wypłukana po inkubacji.
<img src="/files/ftp_upload/3322/3322fig4.jpg" alt="Analiza raka jelita grubego; skany optyczne i multipleksowe; markery EpCAM, CD; porównawcze wykresy słupkowe." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4. Wykresy słupkowe wygenerowane przez oprogramowanie analityczne DotScan przedstawiające gęstość wiązania komórek w skali szarości od 1 do 256. Liczby na osi odnoszą się do antygenów CD. Pozostałe skróty to: TCR, receptor limfocytów T; κ, λ, lekkie łańcuchy immunoglobulin; sIg, immunoglobuliny powierzchniowe; DCC, białko DCC (deleted in colorectal cancer); EGFR, receptor epidermalnego czynnika wzrostu; FAP, białko aktywacji fibroblastów; HLA-A,B,C i HLA-DR, odpowiednio ludzkie antygeny leukocytarne A, B, C oraz DR; MICA, białko MICA (MHC class I chain-related protein A); MMP-14, metalopeptydaza macierzy 14; PIGR, receptor polimerycznej immunoglobulin; TSP-1, trombospondyna-1; Mabthera, humanizowane przeciwciało anty-CD20. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3322/3322fig4large.jpg">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz</a>.

<ol><li>Steinert, R., Buschmann, T., vander Linden, M., Fels, L. M., Lippert, H., Reymond, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+proteomics+in+the+diagnosis+and+outcome+prediction+in+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Technol.+Cancer.+Res.+Treat%22%5BJournal%5D)">The role of proteomics in the diagnosis and outcome prediction in colorectal cancer.</a> Technol. Cancer. Res. Treat. 1, 297(2002).</li>
<li>Eifel, P., Axelson, J. A., Costa, J., Crowley, J., Curran, W. J., Deshler, A., Fulton, S., Hendricks, C. B., Kemeny, M., Kornblith, A. B., Louis, T. A., Markman, M., Mayer, R., Roter, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((National+Institutes+of+Health+Consensus+Development+Conference+Statement%3A+adjuvant+therapy+for+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Natl.+Canc.+Inst%22%5BJournal%5D)">National Institutes of Health Consensus Development Conference Statement: adjuvant therapy for breast cancer.</a> J. Natl. Canc. Inst. 93, 979(2001).</li>
<li>Swerdlow, S. H., Campo, E., Harris, H. L., Jaffe, E. S., Pileri, S. A., Stein, H., Thiele, J., Vardiman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WHO+classification+of+tumour+of+haematopoietic+and+lymphoid+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22IARC+WHO+Classification+of+Tumours%22%5BJournal%5D)">WHO classification of tumour of haematopoietic and lymphoid tissues.</a> IARC WHO Classification of Tumours. 2, Fourth, (2008).</li>
<li>Xiao, G. G., Recker, R. R., Deng, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+proteomics+and+cancer+biomarker+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Med.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Recent advances in proteomics and cancer biomarker discovery.</a> Clin. Med. Oncol. , (2008).</li>
<li>Belov, L., Mulligan, S. P., Barber, N., Woolfson, A., Scott, M., Stoner, K., Chrisp, J. S., Sewell, W. A., Bradstock, K. F., Bandall, L., Pascovici, D. S., Thomas, M., Erber, W., Huang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+human+leukaemias+and+lymphomas+using+extensive+immunophenotypes+from+an+antibody+microarray%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Haematol%22%5BJournal%5D)">Analysis of human leukaemias and lymphomas using extensive immunophenotypes from an antibody microarray.</a> Br. J. Haematol. 135, 184(2006).</li>
<li>Belov, L., Huang, P., Barber, N., Mulligan, S. P., Christopherson, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+repertories+of+surface+antigens+on+leukemias+using+an+antibody+microarray%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Identification of repertories of surface antigens on leukemias using an antibody microarray.</a> Proteomics. 3, 2147(2003).</li>
<li>Zhou, J., Belov, L., Huang, P. Y., Shin, J., Solomon, M. J., Chapuis, P. H., Bokey, L., Chan, C., Clarke, C., Clarke, S. J., Christopherson, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+antigen+profiling+of+colorectal+cancer+using+antibody+microarrays+with+fluorescence+multiplexing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Surface antigen profiling of colorectal cancer using antibody microarrays with fluorescence multiplexing.</a> J. Immunol. Methods. 355 (1-2), 40-51 (2010).</li>
<li>Ellmark, P., Belov, L., Huang, P., Lee, C. S., Solomon, M. J., Morgan, D. K., Christopherson, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+detection+of+surface+molecules+on+colorectal+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Multiplex detection of surface molecules on colorectal cancers.</a> Proteomics. 6, 1791(2006).</li>
<li>Pearson, J. P., Allen, A., Hutton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rheology+of+mucin%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Rheology of mucin.</a> Methods Mol. Biol. 125, 99(2000).</li>
<li>Yang, Y. H., Dudoit, S., Luu, P., Lin, D. M., Peng, V., Ngai, J., Speed, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normalization+for+cDNA+microarray+data%3A+a+robust+composite+method+addressing+single+and+multiple+slide+systematic+variation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Normalization for cDNA microarray data: a robust composite method addressing single and multiple slide systematic variation.</a> Nucleic Acids Res. 30, 15(2002).</li>
<li>Al Saeed,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TMA%3A+A+free%2C+open-source+system+for+microarray+data+management+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">TMA: A free, open-source system for microarray data management and analysis.</a> BioTechniques. 34, 374-378 (2003).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

W tym filmie demonstrujemy, w jaki sposób macierz przeciwciał DotScan może być wykorzystana w prosty, półilościowy sposób do badania profili antygenów powierzchniowych dla populacji komórek z tkanki CRC.
Uzyskanie żywotnej zawiesiny pojedynczych komórek z tkanki jest kluczowe dla sukcesu eksperymentu, ponieważ procesy zależne od energii (np. tworzenie czapek antygenowych i/lub pseudopodiów) wydają się być niezbędne do trwałego wiązania całych komórek z kropkami przeciwciał podczas inkubacji, p...

The author's email has been corrected in the publication of <a href="http://www.jove.com/video/3322">Colorectal Cancer Cell Surface Protein Profiling Using an Antibody Microarray and Fluorescence Multiplexing</a>. There was an error with the author, Jerry Zhou's, email. The author's email has been updated to:
j.zhou@uws.edu.au
from:
jzho7551@mail.usyd.edu.au

Erratum: Colorectal Cancer Cell Surface Protein Profiling Using an Antibody Microarray and Fluorescence Multiplexing

<table><tbody><tr><td>Zrównoważony roztwór soli Hanksa&amp;rsquo;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6136-10X1L</td><td>Buforowany 25 mM Hepes (Sigma #H3375)</td></tr><tr><td>Biologiczna komora bezpieczna klasy II Airpure</td><td>Westinghouse</td><td>1687-2340/612</td><td></td></tr><tr><td>Skalpele chirurgiczne</td><td>Livingstone</td><td>090609</td><td>Opakowanie po 100 szt.</td></tr><tr><td>RPMI 1640 z 2 mM Hepes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R4130-10X1L</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza typu 4</td><td>Worthington Biochemical</td><td>4188</td><td></td></tr><tr><td>Deoksiryb nukleaza 1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN25-1G</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka Terumo (10 mL)</td><td>Terumo Medical Corp.</td><td>SS+10L</td><td>Pudełko po 100 szt.</td></tr><tr><td>Filtr Filcon (200 &amp;mu;m)</td><td>BD Biosciences</td><td>340615</td><td></td></tr><tr><td>Filtr Filcon (50 &amp;mu;m)</td><td>Filtr Filcon (50 &amp;#181;m)</td><td>Filtr Filcon (50 &amp;#181;m) Filtr Filcon (50 &amp;#181;m) 340603</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica cielęca</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>10099-141</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka 5810 R</td><td>Eppendorf</td><td>7017</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Błękit trypanu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometr Technocolor Neubar</td><td>Hirschmann</td><td>brak danych</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop świetlny</td><td>Nikon Instruments</td><td>Nikon TMS</td><td></td></tr><tr><td>Probówki kriogeniczne Cyrovial</td><td>Greiner Bio-One</td><td>121278</td><td></td></tr><tr><td>Kontener do mrożenia kriogenicznego</td><td>Nalge Nunc international</td><td>5100-0001</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do mikroarray przeciwciał DotScan</td><td>Medsaic</td><td>brak danych</td><td></td></tr><tr><td>Kuweta do płukania mikroarray DotScan</td><td>Medsaic</td><td>brak danych</td><td></td></tr><tr><td>KimWipes</td><td>Kimberly-Clark Corporation</td><td>4103</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd 37%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1635-500ML</td><td></td></tr><tr><td>DotReaderTM</td><td>Medsaic</td><td>brak danych</td><td></td></tr><tr><td>Seryjna albumina wołowa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9418-10G</td><td></td></tr><tr><td>Inaktywowana ciepłem surowica AB 2%</td><td>Invitrogen</td><td>34005100</td><td></td></tr><tr><td>CD3 sprzężone z fiko&amp;#8211;erytryną</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>ET386</td><td></td></tr><tr><td>EpCAM sprzężone z AlexaFluor647</td><td>BioLegend</td><td>324212</td><td></td></tr><tr><td>Typhoon FLA 9000</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9558-08</td><td>laser 532 nm, filtr emisyjny 580 BP30 dla PE; laser 633 nm i filtr emisyjny 670 BP30 dla Alexa647</td></tr><tr><td>MultiExperiment Viewer v4.4</td><td>TM4 Microarray Software Suite</td><td>Oprogramowanie o otwartym &amp;#8211; źródle (Ref 11)</td><td></td></tr></tbody></table>

profilowanie białek powierzchniowych komórek raka jelita grubego z wykorzystaniem mikrotablicy przeciwciał i multipleksowania fluorescencyjnego

Colorectal Cancer Cell Surface Protein Profiling Using an Antibody Microarray and Fluorescence Multiplexing

Obecne rokowania i klasyfikacja CRC opierają się na systemach stopniowania, które integrują wyniki histopatologiczne i kliniczne. Jednak w większości przypadków CRC dysfunkcja komórek jest wynikiem licznych mutacji modyfikujących ekspresję białek oraz modyfikacje potranslacyjne1.
Liczne antygeny powierzchniowe komórek, w tym antygeny klastrów różnicowania (CD), zostały zidentyfikowane jako potencjalne biomarkery prognostyczne lub przerzutowe w CRC. Antygeny te stanowią idealne biomarkery, ponieważ ich ekspresja często zmienia się wraz z progresją nowotworu lub w wyniku oddziaływań z innymi typami komórek, takimi jak limfocyty naciekające guz (TILs) oraz makrofagi związane z nowotworem (TAMs).
Zastosowanie immunohistochemii (IHC) w subklasyfikacji i prognozowaniu nowotworów jest dobrze ugruntowane w przypadku niektórych typów guzów2,3. Jednakże żaden pojedynczy „marker” nie wykazał większego znaczenia prognostycznego niż stopień zaawansowania kliniczno-patologicznego i nie zyskał powszechnej akceptacji w rutynowym raportowaniu patomorfologicznym wszystkich przypadków CRC.
Nowsze podejście do stratyfikacji prognostycznej fenotypów choroby opiera się na profilach białek powierzchniowych z wykorzystaniem wielu „markerów”. Choć profilowanie ekspresji w guzach przy użyciu technik proteomicznych, takich jak iTRAQ, jest potężnym narzędziem do odkrywania biomarkerów4, nie jest ono optymalne do rutynowego stosowania w laboratoriach diagnostycznych i nie pozwala na rozróżnienie różnych typów komórek w populacji mieszanej. Ponadto do profilowania oczyszczonych glikoprotein błony plazmatycznej tymi metodami wymagane są duże ilości tkanki nowotworowej.
W niniejszym filmie opisaliśmy prostą metodę profilowania proteomu powierzchniowego żywych komórek z rozaggregated próbek CRC z wykorzystaniem macierzy przeciwciał DotScan CRC. Macierz zawierająca 122 przeciwciała składa się ze standardowego regionu 82 przeciwciał rozpoznających szereg markerów leukocytów specyficznych dla linii komórkowych, cząsteczek adhezyjnych, receptorów oraz markerów stanu zapalnego i odpowiedzi immunologicznej5, wraz z regionem satelitarnym służącym do wykrywania 40 potencjalnych markerów prognostycznych dla CRC. Komórki są wychwytywane wyłącznie przez przeciwciała, dla których wykazują ekspresję odpowiadającego im antygenu. Gęstość komórek na kropce, określana za pomocą skanowania optycznego, odzwierciedla proporcję komórek wykazujących ekspresję danego antygenu, poziom ekspresji antygenu oraz powinowactwo przeciwciała6.
W przypadku tkanki CRC lub prawidłowej błony śluzowej jelita skany optyczne odzwierciedlają immunofenotyp mieszanych populacji komórek. Następnie można zastosować multipleksowanie fluorescencyjne w celu profilowania wybranych podpopulacji komórek zainteresowania uchwyconych na macierzy. Na przykład Alexa 647-anty-cząsteczka adhezyjna komórek nabłonkowych (EpCAM; CD326) jest pan-nabłonkowym antygenem różnicowania, który został użyty do wykrywania komórek CRC, a także komórek nabłonkowych prawidłowej błony śluzowej jelita, natomiast fikoerytryna-anty-CD3 posłużyła do wykrywania naciekających limfocytów T7. Mikromacierze DotScan CRC powinny stanowić prototyp diagnostycznej alternatywy dla systemu oceny stopnia zaawansowania CRC opartego na anatomii.

Opisaliśmy procedurę dysagregacji raka jelita grubego (CRC) w celu uzyskania żywotnych pojedynczych komórek, które następnie są wychwytywane na dostosowane mikrotablice przeciwciał rozpoznających antygeny powierzchniowe (mikrotablica DotScan CRC). Subpopulacje komórek związanych z mikrotablicą mogą być profilowane za pomocą multipleksowania fluorescencyjnego z wykorzystaniem przeciwciał monoklonalnych znakowanych barwnikami fluorescencyjnymi.

Profilowanie białek powierzchniowych komórek raka jelita grubego z wykorzystaniem mikrotablicy przeciwciał i multipleksowania fluorescencyjnego

Obecne rokowanie i klasyfikacja CRC opierają się na systemach stopniowania, które integrują znaleziska histopatologiczne i kliniczne. Jednak w większości...

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest wykorzystanie macierzy przeciwciał DOT scan do profilowania molekularnego antygenów powierzchniowych w tkance raka jelita grubego. Dodatkowo zastosowano fluorescencyjny multipleksing, aby odróżnić typy komórek o określonych profilach w obrębie mieszanej populacji. Antygeny klastrów różnicowania (CD) zostały zidentyfikowane jako potencjalne biomarkery prognostyczne lub przerzutowe w raku jelita grubego.Antygeny te stanowią idealne biomarkery, ponieważ ich ekspresja często zmienia się wraz z progresją guza lub w wyniku interakcji z innymi typami komórek. W tym filmie wykorzystujemy macierz przeciwciał DOT scan do wychwytywania żywych komórek za pomocą ekspresjonowanych antygenów powierzchniowych. Macierz przeciwciał DOT scan składa się z szkiełka przedmiotowego z warstwą nitrocelulozy.Panel mikromacierzy przeciwciał DOT scan jest obramowany kropkami wyrównawczymi składającymi się z CD 29 i CD 44. Powielone macierze znajdują się również po obu stronach macierzy. Pierwszy panel składa się z oryginalnych 82 przeciwciał z mikromacierzy białemii DOT scan, a dodatkowe 40 przeciwciał wybrano na podstawie potencjału prognostycznego jako satelitar

colorectal-cancer-cell-surface-protein-profiling-using-an-antibody

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Analiza spektralna białek powierzchni komórkowej raka jelita grubego przy użyciu mikroarray przeciwciał i wielokrotnego fluoryzowania

W niniejszym badaniu opisujemy ulepszony protokół wieloparametrycznego, wysokoprzepustowego mikrociągu przeciwciał z metodą detekcji lektynami, który może być wykorzystany do profilowania glikozylacji specyficznych białek. Protokół ten wprowadza nowe, niezawodne odczynniki i znacząco redukuje czas, koszty oraz zapotrzebowanie na sprzęt laboratoryjny w porównaniu do poprzedniej procedury.

Mikromacierze przeciwciał z blokowaniem chemicznym do multipleksowego wysokoprzepustowego profilowania specyficznej glikozylacji białek w próbkach złożonych

Ten film opisuje technikę badania ekspresji białek w transfekowanych komórkach raka płuc transfekowanych miRNA za pomocą mikromacierzy przeciwciał do pomiaru ekspresji określonych genów. W przedstawionym protokole wykonujemy mikromacierz przeciwciał w celu identyfikacji aktywności kombinatorycznego leczenia miRNA w zatrzymywaniu cyklu komórkowego i angiogenezie.

Mikromacierz przeciwciał: technika badania ekspresji białek w komórkach raka płuc leczonych miRNA

Ten protokół opisuje wytwarzanie wielkoskalowego, multipleksowanego dwuwymiarowego DNA lub matrycy przeciwciał, z potencjalnymi zastosowaniami w badaniach nad sygnalizacją komórkową i wykrywaniem biomarkerów.

Wytwarzanie mikromacierzy przeciwciał z kodami kreskowymi o dużej gęstości pod kontrolą przepływu

Szczegółowy protokół dla sześciomarkerowego multipleksowego panelu immunofluorescencyjnego jest zoptymalizowany i wykonany, przy użyciu automatycznego barwnika dla bardziej spójnych wyników i krótszego czasu zabiegu. Podejście to może być bezpośrednio zaadaptowane przez dowolne laboratorium do badań immunoonkologicznych.

Zautomatyzowany multipleksowy panel immunofluorescencyjny do badań immunoonkologicznych na próbkach tkanek raka utrwalonego formaliną

Multiplex fluorescencyjna immunohistochemia to nowa technologia, która umożliwia wizualizację wielu typów komórek w nienaruszonej, utrwalonej formaliną, zatopionej parafinie tkance (FFPE). Przedstawiono wytyczne dotyczące zapewnienia udanego 7-kolorowego multipleksu wraz z instrukcjami dotyczącymi optymalizacji przeciwciał i odczynników, przygotowaniem preparatów, projektem i wskazówkami dotyczącymi unikania typowych problemów.

Optymalizacja, projektowanie i unikanie pułapek w manualnej multipleksowej immunohistochemii fluorescencyjnej

Analiza obrazu z multipleksowanym kodowaniem kreskowym ostatnio poprawiła charakterystykę mikrośrodowiska guza, umożliwiając kompleksowe badania składu komórki, stanu funkcjonalnego i interakcji komórka-komórka. W niniejszym artykule opisano protokół barwienia i obrazowania z wykorzystaniem kodowania kreskowego przeciwciał sprzężonych z oligonukleotydami i obrazowania cyklicznego, który pozwala na zastosowanie techniki wysokowymiarowej analizy obrazu.

Multipleksowa analiza obrazu z kodowaniem kreskowym do charakterystyki immunoprofilowania i mapowania przestrzennego w analizie pojedynczej komórki próbek tkanek parafinowych

W tym artykule opisany jest protokół ręcznego wzmacniania sygnału tyramidowego (TSA) multipleksowego immunofluorescencji (mIF) połączonego z analizą obrazu i analizą przestrzenną. Protokół ten może być stosowany z sekcjami zatopionymi w parafinie (FFPE) utrwalonymi w formalinie do barwienia od dwóch do sześciu antygenów na szkiełko, w zależności od skanera do szkiełek dostępnego w laboratorium.

Multipleksowa immunofluorescencja połączona z przestrzenną analizą obrazu w celu klinicznej i biologicznej oceny mikrośrodowiska guza

Ten protokół szczegółowo opisuje metodę glikoproteomiki sterowaną przez glikomikę, zintegrowaną technologię omiczną, która oferuje wszechstronny wgląd w heterogeniczny glikoproteom w złożonych mikrośrodowiskach nowotworowych, niezbędny do lepszego zrozumienia glikobiologii nowotworów.

Glikoproteomika sterowana glikomiką ułatwia kompleksowe profilowanie glikoproteomu w złożonych mikrośrodowiskach nowotworowych

Ten raport opisuje zautomatyzowany protokół do multipleksowych testów immunofluorescencyjnych (mIF) na automatycznym barwniku do szkiełek. Wykazano wysoką odtwarzalność proteomiki przestrzennej na standardowych autostainerach tkankowych o wysokiej przepustowości i obrazach fluorescencyjnych na całych szkiełkach, co jest idealne do niestandardowych testów mIF na dużej liczbie szkiełek tkankowych w badaniach translacyjnych.

Wysokowydajne zautomatyzowane multipleksowe testy immunofluorescencyjne do badań translacyjnych

Protokół ten zawiera przewodnik krok po kroku dotyczący projektowania multipleksowego panelu przeciwciał immunofluorescencyjnych do obrazowania mysich tkanek czerniaka FFPE na podstawie kodów kreskowych. Opisujemy również proces analizy obrazu przy użyciu narzędzi typu open source do generowania przestrzennych wglądów proteomicznych w mikrośrodowisku immunologicznym mysiego czerniaka.

Multipleksowe obrazowanie immunofluorescencyjne oparte na kodach kreskowych DNA do analizy próbek FFPE z genetycznie przeprogramowanego mysiego czerniaka

Protokół ten opisuje metodologię wykrywania multipleksowego mRNA za pomocą obrazowania białek w tkankach tkanek osadzonych formaliną w parafinie.

Kartografia molekularna z podwójną modalnością: Integracja detekcji multipleksowego mRNA z obrazowaniem białek z cytometrią masową

Poznaj profilowanie antygenów powierzchniowych w raku jelita grubego za pomocą mikromacierzy przeciwciał DOT scan i multipleksowania fluorescencyjnego. Ta metoda umożliwia identyfikację biomarkerów prognostycznych.

Profilowanie białek powierzchniowych komórek raka jelita grubego za pomocą mikromacierzy przeciwciał i multipleksowania fluorescencyjnego (Wideo) | JoVE Journal

Profilowanie białek powierzchniowych komórek raka jelita grubego z wykorzystaniem mikrotablicy przeciwciał i multipleksowania fluorescencyjnego

Przeglądaj więcej filmów