Profilowanie białek powierzchniowych komórek raka jelita grubego z wykorzystaniem mikrotablicy przeciwciał i multipleksowania fluorescencyjnego

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest wykorzystanie macierzy przeciwciał DOT scan do profilowania molekularnego antygenów powierzchniowych w tkance raka jelita grubego. Dodatkowo zastosowano fluorescencyjny multipleksing, aby odróżnić typy komórek o określonych profilach w obrębie mieszanej populacji. Antygeny klastrów różnicowania (CD) zostały zidentyfikowane jako potencjalne biomarkery prognostyczne lub przerzutowe w raku jelita grubego.

Antygeny te stanowią idealne biomarkery, ponieważ ich ekspresja często zmienia się wraz z progresją guza lub w wyniku interakcji z innymi typami komórek. W tym filmie wykorzystujemy macierz przeciwciał DOT scan do wychwytywania żywych komórek za pomocą ekspresjonowanych antygenów powierzchniowych. Macierz przeciwciał DOT scan składa się z szkiełka przedmiotowego z warstwą nitrocelulozy.

Panel mikromacierzy przeciwciał DOT scan jest obramowany kropkami wyrównawczymi składającymi się z CD 29 i CD 44. Powielone macierze znajdują się również po obu stronach macierzy. Pierwszy panel składa się z oryginalnych 82 przeciwciał z mikromacierzy białemii DOT scan, a dodatkowe 40 przeciwciał wybrano na podstawie potencjału prognostycznego jako satelitarną mikromacierz dla raka jelita grubego.

Ostatni panel składa się z przeciwciał kontrolnych typu izotypowego. W tym przypadku tkanka raka jelita grubego oraz normalna błona śluzowa jelita zostają poddane trawieniu i filtracji w celu uzyskania żywej zawiesiny pojedynczych komórek. Zawiesinę tę można zamrozić lub przechowywać na później.

Zawiesina komórkowa jest wykorzystywana do wychwytywania komórek na mikrotablicy przeciwciał DOT scan, przy czym antygeny ekspresjonowane przez różne podtypy komórek są analizowane za pomocą multipleksowania fluorescencyjnego. Wynikowe profile ekspresji wykazują istotną zmianę w ekspresji antygenów pomiędzy komórkami raka jelita grubego a normalną błoną śluzową jelita. Różnica ta jest odzwierciedlona również w populacji leukocytów związanych z nowotworem.

Hierarchiczna analiza skupień kilku profili nowotworowych wykazuje grupowanie sygnatur choroby zgodnie z etapami raka jelita grubego. Cześć, jestem Jerry ze School of Molecular Bioscience na Uniwersytecie w Sydney w Australii i dzisiaj zaprezentuję eksperyment dotyczący profilowania antygenów powierzchniowych w tkance raka jelita grubego. Dzięki zastosowaniu mikromacierzy przeciwciał dot scan oraz multipleksowaniu fluorescencyjnemu, mikromacierze dot scan umożliwiają profilowanie około 140 antygenów powierzchniowych na żywych komórkach nowotworowych wraz z powiązanymi leukocytami stanu zapalnego.

Podgrupy komórek uchwycone na mikromierzach mogą zostać rozróżnione przy użyciu znakowanych fluorescencyjnie przeciwciał, które wiążą się z silnie eksponowanym antygenem markerowym na interesujących nas komórkach. Na jednym mikromierzu można profilować do trzech różnych podgrup komórek, stosując odpowiednie znaczniki fluorescencyjne w przeciwciałach o trzech różnych specyficznościach. Test mikromierza DOT scan jest stosunkowo prostą metodą, która została już wykorzystana do profilowania powierzchni komórkowej w kilku rodzajach nowotworów.

Kluczową cechą skanowania DOT jest możliwość wychwytywania żywych komórek za pomocą ich antygenów powierzchniowych, dzięki czemu uzyskany wzorzec wiązania odzwierciedla profil powierzchniowy komórki. Antygeny powierzchniowe odgrywają istotną rolę w rozwoju i przerzutowaniu nowotworów oraz w odpowiedzi zapalnej skierowanej przeciwko rakowi. Rozległe profile powierzchniowe lub immunofenotypy mogą być wykorzystywane jako sygnatury chorób w celu usprawnienia klasyfikacji nowotworów, co umożliwia optymalizację leczenia po operacji.

Dobrze, zacznijmy. W przedstawionym tutaj eksperymencie próbki kliniczne guza raka jelita grubego, w stopniach od A do D, są zbierane w buforze Hanksa. Na początek, używając dwóch skalpeli, ostrożnie przekrojono guz na plastry o grubości jednego milimetra.

Umieść skrawki w 2% roztworze kolagenazy typu czwartego i 10% roztworze DNA w celu trawienia. Fragmenty prawidłowej błony śluzowej jelita od tego samego pacjenta pobiera się w odległości 10 centymetrów od miejsca występowania guza pierwotnego. Służą one jako kontrola i są przetwarzane w taki sam sposób jak próbka guza.

Trawienie guza odbywa się w temperaturze 37°C przez jedną godzinę w celu promowania rozkładu tkanki łącznej, a DNaza usunie DNA z uszkodzonych komórek. Po inkubacji zawiesinę tkankową przepuszcza się przez sitko z drucianej siatki, płukając próbkę buforem Hanksa, podczas gdy tłok z strzykawki 10 ml służy do wspomagania przepychania komórek. Proces ten powtarza się kilkukrotnie, aż większość komórek przejdzie przez siatkę.

Siatka oddziela komórki od wszelkiej niestrawionej tkanki łącznej. Następnie należy dodatkowo przefiltrować zawiesinę komórkową, pobierając ją do strzykawki 10 M i filtrując przez filtr fcon 200 µm, a następnie przez filtr fil con 50 µm. Filtry o mniejszych oczkach powinny zapewnić usunięcie nadmiaru śluzu lub DNA, a także rozbicie skupisk komórek w celu uzyskania żywotnej zawiesiny pojedynczych komórek.

Tę samą procedurę zastosowano w przypadku błony śluzowej prawidłowej. Stwierdzono, że błona śluzowa prawidłowa wykazuje tendencję do zawierania większej ilości tkanki łącznej i w konsekwencji wymaga większej liczby przemyć, aby przejść przez sito, następnie wirowano zawiesinę komórkową przy 410 G w temperaturze 20 °C przez pięć minut. W ramach przygotowania do przechowywania w niskiej temperaturze, osad komórkowy zawieszono w 750 µL płodowej surowicy cielęcej, a następnie dodano równą objętość płodowej surowicy cielęcej z DMS.

Dodaj roztwór do DMS. Dodawaj roztwór kroplami przy ciągłym mieszaniu, a następnie przenieś alikwot nadnadkładu do probówki kriogenicznej i umieść w pojemniku izolacyjnym. Próbki te można przechowywać w temperaturze -80 °C do jednego roku.

Izolacja i DMSO powinny zapewnić powolne uwalnianie się komórek bez ich rozrywania. Skutkiem ubocznym przechowywania jest liza populacji erytrocytów. Na szczęście nie są one nam potrzebne.

Do przeprowadzenia eksperymentu wyjmij próbki z przechowywania i szybko je rozmroź. W kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C resuspenduj zawiesinę komórkową w 10 ml buforu Hanksa; bufor powinien pomóc rozcieńczyć 10% DMSO i płodową surowicę bydlęcą. Centryfuguj komórki przez pięć minut przy 410 ×g w temperaturze 20 °C.

Następnie zlej nadsącz i resuspenduj w 500 µL buforu Hank'a; w trakcie procesu zamrażania i rozmrażania kilka komórek może ulec zniszczeniu, co spowoduje uwolnienie DNA do zawiesiny. Aby przeciwdziałać temu problemowi, inkubuj próbkę z 0,1% DNazy w temperaturze pokojowej. W tym czasie można przeprowadzić ocenę żywotności komórek.

Wymieszaj równe ilości barwnika triam blue z 10 µL zawiesiny komórkowej, a następnie nanieś 10 µL mieszaniny do licznika komórek. Pod mikroskopem zdrowe i żywe komórki będą przezroczyste. Z kolei komórki nieżywe z uszkodzonymi błonami będą zabarwione na niebiesko.

Do przechwytywania komórek na przeciwciała w skanerze DOT MICRORAY wymagane jest minimum 4 milionów żywych komórek. Po obróbce DNA komórki przemyto po raz drugi 10 ml buforu Hanksa, a następnie odwirowano przy 410 G przez pięć minut w temperaturze 20 °C.

Resuspender końcowy osad komórkowy w 200 µL pożywki RPMI. Pożywka ta zawiera stosunkowo więcej składników odżywczych niż bufor Hanksa i jest stosowana w celu ułatwienia wychwytu komórek na mikrotablicy przeciwciał przy jednoczesnym zachowaniu żywotności komórek. Mikrotablica przeciwciał do skanowania kropelkowego w raku jelita grubego składa się ze 140 różnych kropel przeciwciał powielonych na nitrocelulozie.

Każda kropka na matrycy zawiera 10 nanolitrów przeciwciała monoklonalnego przeciwko antygenowi powierzchni komórkowej. Aby przygotować mikroarray przeciwciał, należy zanurzyć go w kuwecie z PBS w celu nawilżenia nitrocelulozy, a następnie przetrzeć szklaną krawędź matrycy. Używając chusteczek Kim wipes, należy uważać, aby nie dotknąć sekcji nitrocelulozowej, po czym umieścić mikroarray w kuwecie i nanieść pipetą zawiesinę komórkową na nitrocelulozę.

Równomierne rozprowadzenie zawiesiny komórkowej zapewni wszystkim przeciwciałom możliwość wychwytywania komórek. Inkubuj mikroarray w temperaturze 37 °C przez jedną godzinę. Podczas inkubacji różne komórki będą opadać i wchodzić w kontakt z przeciwciałami na komórkach array.

Przeciwciała wiążą i wychwytują komórki prezentujące odpowiadające im antygeny powierzchniowe po inkubacji. Niewiążące się komórki należy wypłukać, delikatnie zanurzając matryce w trzech kolejnych porcjach świeżego roztworu PPS. Komórki przytwierdzone do powierzchni należy utrwalić w 10% roztworze formaldehydu w PPS.

Ostrożnie nanieś pipetą odpowiednią ilość utrwalacza, aby pokryć sekcję załadowaną komórkami nitro. Inkubuj przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Następnie zanurz mikrotablice trzykrotnie w świeżym PBS.

Zostaw macierze w PBS na 30 sekund podczas każdego płukania, ponieważ nadmiar wysokości formera może zakłócać multipleksowanie fluorescencyjne. Możemy teraz sprawdzić, czy nastąpiło wiązanie komórek, trzymając mikromacierz pod światłem w celu przeprowadzenia znacznie dokładniejszej analizy. Skaner DOT scan oraz oprogramowanie analityczne pozwalają na zeskanowanie wzoru wiązania i uzyskanie ilościowych wyników ekspresji antygenów w mieszanej populacji komórek.

Oprogramowanie porównuje intensywność wiązania komórek z szumem tła w ośmiobitowej skali szarości. Jednostki intensywności są znormalizowane do wartości maksymalnej wynoszącej 256. W celu ułatwienia porównań pomiędzy macierzami, jakiekolwiek dodatnie wiązanie kontroli izotypowej jest odejmowane od przeciwciał o odpowiadających izotypach IG.

Nanieś 200 µl buforu blokującego na mikroarray i inkubuj przez 20 minut w temperaturze pokojowej. W przygotowaniu do multipleksowania fluorescencyjnego do 118 µl buforu blokującego dodaj 10 µl przeciwciała anty-CD3 sprzężonego z fluorochromem oraz 20 µl Alexa-sprzężonego EpCAM. Dodatkowo do mieszaniny dodaje się 2 µl serum inaktywowanego drogą ciepła, aby zapobiec nieswoistemu wiązaniu.

Po zakończeniu blokowania bufor blokujący zastępuje się roztworem do multipleksowania i inkubuje w ciemności przez 30 minut. W temperaturze pokojowej podczas inkubacji przeciwciała sprzężone z CD3 zwiążą się z wykazującymi ekspresję CD3 limfocytami T przytwierdzonymi do matrycy, natomiast przeciwciało sprzężone z EPAM zwiąże się z komórkami nabłonkowymi lub komórkami raka jelita grubego na matrycy. Następnie matrycę mikroarray płucze się trzykrotnie w świeżym PBS i pozostawia do wyschnięcia w ciemności przed skanowaniem fluorescencji.

Fluorescencję wykrywano za pomocą skanera Typhoon FLA 9000. Profil FICO skanowano przy użyciu lasera 532 nm i filtra emisyjnego 580 BP 30, natomiast Alexa 647 skanowano przy użyciu lasera 633 nm i filtra emisyjnego 670 BP 30. Uzyskane obrazy fluorescencyjne przekształcono do formatu tiff w celu przeprowadzenia analizy.

Przy użyciu oprogramowania do skanowania DOT. Fluorescencyjny multipleksing pozwala nam odróżnić profile antygenowe różnych populacji komórek w obrębie tej samej próbki tkanki. Przedstawione tutaj obrazy pochodzą z próbki raka jelita grubego.

Te trzy obrazy przedstawiają skan optyczny, skan fluorescencyjny dla komórek wykazujących ekspresję CD3 oraz skan fluorescencyjny dla komórek wykazujących ekspresję EPAM. Wyniki z mikroskanera DOT powinny wykazywać spójne wzorce wiązania komórek pomiędzy dwiema powielonymi preparatami. Intensywne wiązanie kropek wzdłuż krawędzi preparatu wskazuje na wychwycenie odpowiedniej liczby komórek.

Można wygenerować raport w formacie PDF, aby uzyskać ilościowe wartości wiązania komórek. Wykres słupkowy przedstawiający wiązanie komórek wykazuje różnicę w ekspresji antygenu pomiędzy błoną śluzową prawidłową a próbką nowotworową.

Wyniki optyczne dały ogólny obraz ekspresji antygenów we wszystkich typach komórek w próbce, natomiast wyniki multipleksowania AAM wykazują wyraźniejszy obraz różnic w ekspresji antygenów pomiędzy prawidłowymi komórkami nabłonkowymi a komórkami nowotworowymi. Chociaż wiele z różnicowo ekspresowanych antygenów jest znanych jako grupa biomarkerów raka jelita grubego, zapewniają one znacznie dokładniejszą sygnaturę choroby do stratyfikacji, niż byłby w stanie osiągnąć jakikolwiek pojedynczy biomarker. Wyniki multipleksowania CD3 wykazują większą liczbę limfocytów T w próbce nowotworowej w porównaniu z prawidłową.

Często limfocyty T z nowotworu wykazują ekspresję markerów aktywacji, co sugeruje, że mogą one być limfocytami naciekającymi guz lub limfocytami T związanymi ze stanem zapalnym. Analizy na szeroką skalę można przeprowadzić za pomocą programu Multi Experiment Viewer w wersji 4.4, który jest otwartoźródłowym oprogramowaniem do tworzenia map ciepła i analizy danych. Hierarchiczna analiza skupień próbek raka jelita grubego może zostać wykorzystana do korelacji ze stadium choroby lub rokowaniami pacjenta.

Obszerna biblioteka sygnatur chorobowych jest cennym narzędziem w prognozowaniu przebiegu choroby u pacjentów z rakiem jelita grubego lub w określaniu przebiegu leczenia pooperacyjnego. Przedstawiliśmy właśnie procedurę profilowania ekspresji antygenów powierzchniowych w mieszanej populacji komórek z tkanki raka jelita grubego z wykorzystaniem macierzy przeciwciał DOT scan oraz fluorescencyjnego detekcji multipleksowej. Ważnym aspektem tego eksperymentu, o którym należy pamiętać, jest stosowanie zawsze świeżej tkanki; do pomyślnego przeprowadzenia eksperymentu wymagane są co najmniej 4 miliony żywych komórek. Dziękujemy za obejrzenie tego filmu i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu doświadczeń.