Obrazowanie aktywności wywołanych zapachem w mysiej opuszce węchowej przy użyciu sygnałów odbicia optycznego i autofluorescencji

Ogólnym celem tego eksperymentu jest zmapowanie aktywności wywołanej zapachem na powierzchni opuszki węchowej myszy za pomocą wewnętrznych sygnałów optycznych i sygnałów autofluorescencyjnych flawoprotein lub obrazowania FAS po znieczuleniu myszy i odsłonięciu czaszki. Kość nad opuszką węchową jest cieńsza. Za pomocą ostrza skalpela pobiera się płat kostny, a następnie usuwa komorę wykonaną z cementu dentystycznego, która otacza odsłoniętą powierzchnię opuszki węchowej.

Wypełnia się go arosem, a na wierzchu tego preparatu umieszcza się szklankę nakryciową. Mapy węchowe są pozyskiwane sekwencyjnie u tej samej myszy za pomocą wewnętrznych sygnałów optycznych i obrazowania FAS, Obrazowanie innych czynności wywołanych w opuszce węchowej myszy za pomocą odbicia optycznego i sygnałów autofluorescencyjnych może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące specjalnego powlekania rzędów w opuszce węchowej. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak dwupoziomowe obrazowanie glukozy czy FMRI, jest możliwość rejestrowania czynności wywołania zamówienia w specjalnej rozdzielczości jednej listy glamour.

Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tych metodach będą miały trudności na początku swojej pracy, ponieważ zarówno umiejętności chirurgiczne, jak i instrumentalne są powolne do zdobycia. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie dla zwrócenia uwagi na kluczowe etapy procedur chirurgicznych i obrazowych. Uszczypnij tylną łapę myszy, aby potwierdzić znieczulenie i usuń włosy ze skóry głowy za pomocą maszynki do strzyżenia.

Zetrzyj resztki włosów ze skóry sterylnymi gazikami nasączonymi wodą destylowaną. Umieść mysz w ramce stereotaktycznej tak, aby pysk znajdował się w tej samej płaszczyźnie co tył głowy. Aby ustawić opuszkę węchową poziomo, mocno zabezpiecz nauszniki i nos, aby zapobiec ruchom.

Nałóż maść okulistyczną na oczy, aby zapobiec wysuszeniu podczas obrazowania, a następnie zdezynfekuj obszar skóry głowy za pomocą Betadine za pomocą sterylnych nożyczek. Wykonaj nacięcie z tyłu głowy między uszami, a następnie naciąć po obu stronach w kierunku podstawy ucha i w przednim tylnym kierunku w kierunku czoła wzdłuż powiek. Zakończ usuwanie skóry głowy, przecinając skórę na pysku.

Używanie paska na nos jako przewodnika. Umieść zwierzę pod mikroskopem stereoskopowym i użyj bawełnianego wacika nasączonego solą fizjologiczną, aby delikatnie odłączyć okostną na szczycie czaszki. Użyj kleszczy, aby usunąć pozostałą tkankę i zeskrobać powierzchnię czaszki skalpelem, aby zapewnić czyste przygotowanie, aby obszar opuszki węchowej był wilgotny przez cały czas trwania eksperymentu.

Umieść kawałek wchłanialnej żelatyny, gąbki nasączonej wodą destylowaną na kości nad opuszką węchową znajdującą się między oczami. Wyjmij gąbkę żelatynową i zacznij od delikatnego zeskrobania kości ostrzem skalpela numer 10. Utrzymuj stały kąt 45 stopni między ostrzem a kością i przesuwaj ostrze od powiek do strzałkowej strony obszaru bańki.

Uważaj, aby nie wywierać pionowego nacisku na kość ani nie drapać kości powyżej zatoki żylnej podczas procesu przerzedzania. Zatrzymuj się co pięć minut i umieść uwodnioną gąbkę żelatynową na kości, aby schłodzić preparat. Przetrzyj czaszkę gąbką, aby usunąć kość, kurz i okresowo wycieraj końcówkę skalpela, aby utrzymać ją w czystości i ostrą.

Kontynuuj, aż pojawi się gąbczasta warstwa kości lub bełkota. Kiedy widoczne jest drobne unaczynienie opuszki węchowej, przestań drapać kość i użyj końcówki skalpela z numerem 11, aby narysować prostokątny obszar i zamknąć opuszkę węchową. Trzymając okno w granicach zatok żylnych, kontynuuj drapanie kości w prostokątnym obszarze.

Zachowaj szczególną ostrożność co do głębokości końcówki skalpela, aby uniknąć dotykania powierzchni opony twardej. Aby zorientować się, jaka jest grubość pozostałej kości, należy ją delikatnie popchnąć końcówką par kleszczy. Jeśli kość fałduje się pod naciskiem, przejdź do następnego kroku.

Dodaj kroplę soli fizjologicznej i użyj końcówki skalpela skierowanej poziomo, aby podnieść płat kostny. Ostrożnie zdejmij płat za pomocą kleszczy, aby uniknąć oderwania pozostałej kości. Po odsłonięciu powierzchni opuszki węchowej sprawdź, czy nie ma krwawienia lub naczyń krwionośnych. Zespolenie.

Przetrzyj obszar gąbką żelatynową nasączoną solą fizjologiczną. Aby utrzymać wilgotność opuszki węchowej, nałóż poliakrylowy cement dentystyczny za pomocą strzykawki o rozmiarze 29, aby utworzyć zagłębienie na kości wokół okna czaszki. Umieść kroplę aros o niskiej temperaturze topnienia na oponie twardej i umieść sterylne szkło nakrywkowe na oknie czaszki w celu obrazowania.

Umieść ramkę stereotaktyczną pod mikroskopem stereoskopowym z okienkiem czaszki wyśrodkowanym w polu widzenia, aby wyświetlić naczynia włosowate. Przełącz się na zielone światło 580 nm i uchwyć anatomiczny obraz kontrolny, aby sprawdzić stan preparatu podczas obrazowania. Następnie przystąp do uchwycenia prób stymulacji za pomocą wewnętrznego obrazowania sygnału optycznego przy oświetleniu 630 nanometrów lub obrazowania sygnału autofluorescencyjnego flawoprotein przy oświetleniu 480 nanometrów, Standardowa sesja obrazowania obejmuje linię bazową od pięciu do 10 sekund, w której dostarczane jest tylko powietrze, a następnie stymulacja zapachu przez trzy do 10 sekund w zależności od wybranego stężenia zapachu.

I wreszcie, od 70 do 82 sekund dostarczania powietrza jest rejestrowane w celu odzyskania wartości wyjściowej. W tym przypadku unaczynienie opuszki węchowej jest obrazowane przez okno czaszki, a następnie uzyskuje się wyniki próby stymulacji przy użyciu h sinal jako substancji zapachowej wychwyconej za pomocą obrazowania zarówno iOS, jak i FAS. Korzystając z obrazowania iOS, aktywność wywołana zapachem jest pokazana, ponieważ ciemne obszary chłonności aktywowane przez AL są oznaczone białymi strzałkami, a obszary aktywne można zobaczyć zarówno w pojedynczych, jak i uśrednionych badaniach wielokrotnych.

Przełączenie na obrazowanie FAS w tej samej myszy, wywołanej aktywnością OD jest teraz pokazane jako białe obszary emisji autofluorescencji oznaczone czarnymi strzałkami i można je również zobaczyć zarówno w pojedynczych, jak i uśrednionych próbach wielokrotnych. Zauważ, że zarówno czarne strefy absorpcji widoczne za pomocą obrazowania iOS, jak i białe obszary emisji autofluorescencji widziane za pomocą obrazowania FAS nakładają się na siebie. To przestrzenne dopasowanie potwierdza, że obie techniki pozwalają na wizualizację tych samych kłębuszków węchowych: Po opanowaniu kolejności obrazowania, czynności wywołane za pomocą sygnałów odbicia optycznego i autofluorescencji można wykonać w ciągu jednej godziny w przypadku operacji i kilku godzin w przypadku akwizycji obrazu.

Główną wadą stosowania tych metod obrazowania optycznego jest fakt, że nie można ich zastosować do wizualizacji map węchowych w taki sposób, jak u myszy swobodnie poruszających się. A ze względu na ograniczoną penetrację fotonów do tkanek biologicznych, nie dają one dostępu do brzusznych kłębuszków węchowych po ich rozwoju pod koniec lat dziewięćdziesiątych, rejestrując wewnętrzne sygnały w układzie węchowym. Być może jest to sposób, w jaki naukowcy zajmujący się obrazowaniem optycznym mogą zbadać charakterystykę specjalnej powłoki OD.

Obrazowanie autofluorescencji flawoprotein w opuszkach węchowych jest obiecującą techniką, która daje nowe informacje na temat specjalnej powłoki OD przy użyciu endogennych sygnałów optycznych.