Name: Obrazowanie aktywności wywołanych zapachem w mysiej opuszce węchowej przy użyciu sygnałów odbicia optycznego i autofluorescencji (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-31T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Poznaj metodę obrazowania aktywności wywołanych zapachem w mysiej opuszce węchowej przy użyciu sygnałów odbicia optycznego i autofluorescencji flawoprotein. Technika ta umożliwia mapowanie aktywności neuronalnej z wysoką rozdzielczością przestrzenną.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Niniejsza praca była wspierana przez grant „Agence Nationale de la Recherche” ANR-09-JCJC-0117-01 oraz grant „Neuropôle de Recherche Francilien-NERF” dla Romaina Chery. Dziękujemy Françoise Lefebvre za opracowanie oprogramowania w języku C++/Qt oraz Laurentowi Pinot i Batiste Janvier za pomoc w przygotowaniu układu do obrazowania optycznego.

1. Przygotowanie zwierzęcia do obrazowania (zgodnie z europejskimi zaleceniami dotyczącymi opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych, dyrektywa 86/609/EWG)
<ol>
	<li>Samce myszy szczepu C57BL6 w wieku od 6 do 8 tygodni są znieczulane poprzez doprzewotnikowe wstrzyknięcie mieszaniny ketaminy (10 mg/kg) i ksylazyny (100 mg/kg). Zabieg operacyjny rozpoczyna się, gdy mysz przestaje reagować na uciśnięcie tylnej łapy. Przez cały czas trwania eksperymentu zwierzę znajduje się na podgrzewaczu. Temperaturę ciała monitoruje się w sposób ciągły i utrzymuje na poziomie 37°CGłębokość znieczulenia jest utrzymywana przez cały czas trwania operacji i sesji obrazowania poprzez sprawdzanie braku odruchu cofania kończyny. W przeciwnym razie podaje się podskórnie 20% początkowego koktajlu anestetycznego.</li>
	<li>Za pomocą strzyżarki usuń włosy ze skóry głowy. Oczyszczaj odsłoniętą skórę z pozostałości włosów, używając sterylnej gazy nasączonej solą fizjologiczną.</li>
	<li>Umieść mysz w aparacie stereotaktycznym. Nos musi znajdować się w tej samej płaszczyźnie co tył głowy, aby ustawić powierzchnię opuszki węchowej poziomo. Mocno przymocuj pręty uszne i nosowy, aby zapobiec ruchom podczas obrazowania.</li>
	<li>Nanieść maść oftalmiczną na oczy zwierzęcia, aby zapobiec wysychaniu i bólowi.</li>
	<li>Zdezynfekuj wszystkie narzędzia chirurgiczne za pomocą 70° etanol oraz obszar skóry głowy za pomocą kolejnych pociągnięć betadyną.</li>
	<li>Aby usunąć skórę pokrywającą czaszkę, należy rozpocząć od wykonania nożyczkami nacięcia skóry z tyłu głowy, pomiędzy uszami. Następnie należy ciąć w obie strony w kierunku nasady uszu oraz w kierunku przednio-tylnym w stronę czoła, wzdłuż powiek. Usuwanie skóry głowy należy zakończyć poprzez przecięcie skóry na górnej części pyska, blisko kości nosowej.</li>
	<li>Pod obserwacją w stereomikroskopie, przy użyciu patyczka watnego nasączonego solą fizjologiczną, delikatnie oddziel okostną z górnej części czaszki. Za pomocą pęsety usuń pozostałą tkankę, a następnie zeskrob powierzchnię czaszki skalpelem, aby uzyskać czysty preparat.</li>
	<li>Opuszka węchowa (OB) jest strukturą symetryczną, składającą się z dwóch półopuszek zlokalizowanych pomiędzy powiekami. W kierunku rostralnym i kaudalnym są one ograniczone zatoką żylną, a od siebie oddzielone szwem strzałkowym. Na kości nad opuszkami węchowymi należy umieścić kawałek wchłanialnej gąbki żelatynowej nasączonej wodą destylowaną. Ważne jest, aby ten obszar kości pozostawał wilgotny przez cały czas trwania eksperymentu.</li>
</ol>
2. Przygotowanie okna czaszkowego
<ol>
	<li>Usuń gąbkę żelatynową i rozpocznij od delikatnego skrobania kości ostrzem skalpela n°10. Zachowaj stały kąt 45° między ostrzem a kością i przesuwaj ostrze od powiek w stronę strzałkową obszaru opuszki. Nie wywieraj nacisku pionowego na kość ani nie drażnij kości powyżej zatoki żylnej.</li>
	<li>W procesie ścieńczania przerywaj pracę co 5min i przykładaj do kości nawilżoną gąbkę żelatynową, aby schłodzić preparat. Przecieraj czaszkę gąbką w celu usunięcia pyłu kostnego.</li>
	<li>Kontynuuj naprzemienne skrobanie i chłodzenie, aż do uwidocznienia beleczek, czyli warstwy kości gąbczastej. Na tym etapie powinna być widoczna drobna sieć naczyniowa OB. Przestań skrobać kość i zacznij używać końcówki skalpela prostopadle, aby „wyrysować” prostokątny obszar obejmujący OB. Na tym etapie można użyć ostrza skalpela n°11. Prowadź zabieg w granicach zatok żylnych, które powinny pozostać bezpieczne przed jakimkolwiek pociągnięciem skalpela.</li>
	<li>Stopniowo pogłębiaj utworzony prostokątny rów, wykonując kolejne ruchy skalpelem. Okresowo wycieraj końcówkę skalpela, aby ją oczyścić i utrzymać jej ostrość. Zachowaj szczególną ostrożność co do głębokości wprowadzania końcówki, aby uniknąć dotknięcia powierzchni opony twardej.</li>
	<li>Aby ocenić grubość pozostałej kości, naciśnij ją delikatnie końcówką pęsety. Jeśli płat kostny ugina się pod naciskiem, przejdź do następnego kroku.</li>
	<li>Pod kroplą soli fizjologicznej użyj końcówki skalpela skierowanej poziomo, aby podważyć płat kostny. Usunięcie płata musi być wykonane ostrożnie, aby uniknąć wyrwania pozostałej części kości.</li>
	<li>Po odsłonięciu powierzchni OB sprawdź, czy nie występuje krwawienie lub anastomoza naczyń krwionośnych. Uszkodzenie opony twardej lub powierzchni tkanki zmniejszy szansę na uzyskanie sygnałów optycznych. Przetrzyj obszar gąbką żelatynową nasączoną solą fizjologiczną, aby utrzymać wilgotność opuszki.</li>
	<li>Nanieś dentystyczny cement poliakrylanowy, aby utworzyć pierścień na kości wokół okna.</li>
	<li>Nanieś kroplę agarozy o niskiej temperaturze topnienia (1.2%) na oponę twardą i połóż sterylną lamkę o wymiarach okna. Podczas sesji obrazowania można dodać niewielką ilość agarozy, aby zrekompensować wysychanie. Agaroza zapobiegnie przemieszczaniu się OB podczas oddychania i zapewni płaską powierzchnię do obrazowania optycznego.</li>
</ol>
3. Układ obrazowania optycznego do mapowania aktywności węchowej
<ol>
	<li>Stymulacja węchowa musi być precyzyjnie zdefiniowana w czasie i intensywności przy użyciu olfaktometru. Stosujemy zmodyfikowaną wersję systemu perfuzji wieloflakonowej Valvebank 8II firmy Automate Scientific połączoną z podstawową sprężarką powietrza (odpowiednie byłoby również sprężone powietrze do oddychania). System ten umożliwia dokładną i szybką zewnętrzną kontrolę zaworów. Roztwory czystego odorantu są rozcieńczane w oleju mineralnym do wybranego stężenia. Do aktywacji grzbietowej części OB powszechnie stosuje się aldehydy, takie jak heksanal. Precyzyjna objętość rozcieńczonego odorantu (20 do 50μl) jest nanoszona na papier filtracyjny i umieszczana w zbiorniku strzykawkowym. Poprzez system perfuzji do układu dostarczane jest powietrze o kontrolowanym ciśnieniu, co zapewnia stały przepływ powietrza zapachowego do nosa zwierzęcia podczas otwarcia zaworu. Odorant jest dostarczany przez rurkę próżniową Tygon R-3603 (Saint-Gobain Corporation), transportującą powietrze z przepływem ok. 1000ml/min. Należy unikać zanieczyszczeń między odorantami oraz pozostawania resztkowych ilości odorantu w rurkach. Jeśli jest dostępny, powtarzalność bodźca zapachowego może być kontrolowana za pomocą detektora jonizacji płomieniowej (microFID 2020 Photovac).</li>
	<li>Włącza się układ optyczny. Składa się on z chłodzonej kamery CCD 12-bitowej z przeplotem (ORCA AG Hamamatsu) połączonej ze stereomikroskopem fluorescencyjnym (Leica MZ16), olfaktometrem sterowanym komputerowo oraz stabilizowanymi lampami wzbudzenia z odpowiednimi interferencyjnymi filtrami pasmowymi. Schemat opisujący nasz układ przedstawiono na rysunku 2. Do obrazowania wewnętrznych sygnałów optycznych (IOSI) stosuje się lampę wolframowo-halogenową 200W (Oriel QTH) sprzężoną z pierścieniowym światłowodem (Schott) zamontowanym wokół obiektywu mikroskopu, aby zapewnić stabilne i równomierne oświetlenie. Do obrazowania sygnałów autofluorescencji flawoprotein (FASI) stosuje się lampę halogenową 150W (Leica) z ciekłym światłowodem o rdzeniu 5mm, co zapewnia równomierne, zlokalizowane wzbudzenie fluorescencji poprzez port epi-oświetlenia stereomikroskopu.
	 Akwizycja obrazu i synchronizacja sprzętowa są realizowane przez specjalistyczne oprogramowanie. Do sterowania układem optycznym i akwizycją można również wykorzystać oprogramowanie open source Micromanager.</li>
</ol>
4. Obrazowanie optyczne
<ol>
	<li>Umieść ramę stereotaktyczną pod stereomikroskopem, centrując okno czaszkowe w polu widzenia (schemat układu optycznego przedstawiono na Rys. 2A).</li>
	<li>Ustaw ostrość mikroskopu na naczynia włosowate. Przed próbami stymulacji (patrz opis w punkcie 5) wykonuje się obraz cebulki przy świetle 560nm (zielonym) (pierścień światłowodowy), co zapewnia dobry kontrast dla obrazowania naczyń krwionośnych. Obraz ten służy jako kontrola anatomiczna do sprawdzenia stanu preparatu i jest pozyskiwany kilkakrotnie w trakcie eksperymentu.</li>
	<li>W przypadku obrazowania IOS intensywność światła odbitego jest rejestrowana przez kamerę CCD przy oświetleniu 630+/-10 nm (czerwonym). Obrazy są pozyskiwane w pełnej klatce (bez binningu) z częstotliwością 5 klatek na sekundę, co odpowiada czasowi ekspozycji około 150ms. Moc źródła światła jest dostosowana tak, aby osiągnąć poziomy szarości co najmniej ˜3000 w obszarze OB, blisko nasycenia studni pikseli CCD. Pozwala to na wykorzystanie 12-bitowej dynamiki CCD do rejestracji słabych zmian intensywności podczas aktywacji. Maksymalne amplitudy IOS osiągają ˜1%.</li>
	<li>W przypadku obrazowania FAS fluorescencja jest pozyskiwana przy pobudzeniu światłem epifluorescencyjnym 480nm+/-20nm (niebieskim). Do przechwytywania światła zastosowano filtr górnoprzepustowy 515nm. Obrazy są pozyskiwane z częstotliwością 5 klatek na sekundę z binningiem 4 na 4 w celu maksymalizacji czułości. Moc światła pobudzenia jest dostosowana analogicznie do IOS, z poziomami szarości 3000 w obszarze OB. Maksymalne amplitudy FAS osiągają ˜3%.
	 Dla obu trybów obrazowania głębia ostrości w płaszczyźnie badanego obiektu jest taka sama i wyniosła 0,5 mm przy powiększeniu około 4-krotnym.</li>
	<li>Światło powinno być wyłączone pomiędzy próbami obrazowania, aby uniknąć nagrzewania i fotobleachingu preparatu.</li>
</ol>
5. Próby obrazowania
<ol>
	<li>Standardowa sesja obrazowania obejmowała linię bazową trwającą od 5 do 10 s, podczas której podawano tylko powietrze, a następnie stymulację zapachową trwającą od 3 do 10 s w zależności od wybranego stężenia zapachu, po czym rejestrowano kolejne 70 do 82 s przy stałym przepływie powietrza w celu powrotu do linii bazowej (Rys. 2A). Na koniec próby światło było wyłączane, a czyste powietrze podawano przez czas przerwy między próbami (od 1 do 3 minut), aby usunąć pozostałe cząsteczki zapachu i uniknąć habituacji sensorycznej. Próby z zapachami były przeplatane próbami kontrolnymi (podawaniem powietrza).</li>
	<li>Aktywowane strefy wywołane zapachami są wizualizowane na mapach jako obszary o kształcie zbliżonym do sferycznego i odpowiadają rozmiarom poszczególnych kłębuszków (średnica od 80 do 200 μm9). Przetwarzanie obrazów wyjaśniono na Rysunku 2B. Mapy węchowe przedstawiono na Rysunku 3. W przeciwieństwie do jakiegokolwiek innego systemu sensorycznego, stosunek sygnału do szumu w OB był wystarczający, aby rozdzielić odpowiedzi wywołane zapachami w pojedynczych próbach (Rys. 3B dla IOS i Rys. 3D dla FAS).</li>
	<li>Myszy są uśmiercane natychmiast po zakończeniu sesji obrazowania metodami zgodnymi z europejskimi zaleceniami dotyczącymi opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych.</li>
</ol>
6. Reprezentatywne wyniki (patrz mapy węchowe na rysunku 3):
<img alt="Schemat układu węchowego; ścieżki neuronów, struktura kłębuszka, połączenia neuronów sensorycznych." src="/files/ftp_upload/3336/3336fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1 Organizacja strukturalna głównej opuszki węchowej u gryzoni. Sensoryczne neurony węchowe, pierwotne komórki sensoryczne zlokalizowane w głównym nabłonku węchowym, wykazują ekspresję tego samego receptora zapachowego i zbiegają się w tych samych kłębuszkach w OB. Kłębuszki węchowe, okrągłe neuropile (przerywane okręgi), znajdują się na powierzchni OB. Należy zwrócić uwagę na obecność bardzo gęstej i złożonej sieci naczyniowej na poziomie kłębuszkowym. Skróty (od góry do dołu): ONL: warstwa nerwu węchowego; GL: warstwa kłębuszkowa, EPL: zewnętrzna warstwa splotowata; MCL: warstwa komórek mitralnych; GCL: warstwa komórek ziarnistych.
<img alt="Schemat olfaktometru ze stereomikroskopem i kamerą CCD dla zestawu eksperymentalnego do stymulacji zapachowej." src="/files/ftp_upload/3336/3336fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2 Rejestracja sygnałów odbicia i fluorescencji in vivo. A. Układ obrazowania optycznego w szerokim polu. Mózg znieczuplonej myszy jest naświetlany światłem czerwonym (IOS) lub niebieskim (FAS) za pomocą pierścienia światłowodowego przymocowanego do soczewki optycznej lub portu epi-oświetleniowego mikroskopu. Zapachy są umieszczane w szczelnych fiolkach, a napowietrzone powietrze jest dostarczane do nosa zwierzęcia (zielone światło: otwarty zawór). B. Protokół rejestracji i przetwarzanie danych. IOS i FAS są rejestrowane jako serie pojedynczych prób (o czasie trwania 90 s). Schemat przedstawia oś czasu pojedynczej próby: linia bazowa trwa od 5 do 10 s, stymulacja od 3 do 10 s, a powrót do linii bazowej od 70 do 82 s. Przetwarzanie obrazu wymaga odejmowania wartości natężenia podczas linii bazowej od wartości natężenia podczas okresów stymulacji (dla FAS) lub stymulacji wraz z powrotem do linii bazowej (dla IOS) w skali piksel po pikselu. Różnica ta jest następnie dzielona przez wartości bazowe w celu uzyskania wariancji w % (patrz obrazy wynikowe na Rys. 3).
<img alt="Wpływ heksanalu na obrazowanie naczyniowe; metoda IOSI/FASI; schemat przedstawiający wyniki eksperymentalne." src="/files/ftp_upload/3336/3336fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3 Mapy aktywności wywołanej zapachem w OB przy użyciu obrazowania IOS i FAS. A. Układ naczyniowy grzbietowej części OB wizualizowany w świetle zielonym. B-C. Obrazowanie IOS (odpowiednio pojedyncza próba oraz średnia z trzech prób) dla 10s prezentacji 20% heksanalu. Białe strzałki wskazują sferyczne obszary zainteresowania aktywowane przez ten zapach. Mapy aktywacji te uzyskano, uśredniając klatki z pierwszej sekundy po zakończeniu stymulacji zapachowej (maksimum zmienności odbicia -0,63% w A i -0,52% w B). Zwróć uwagę na czarne strefy absorpcji, w których wystąpiła aktywacja zapachowa. C-D. Obrazy FAS pozyskane sekwencyjnie u tej samej myszy dla tego samego substancji zapachowej (odpowiednio pojedyncza próba oraz średnia z trzech prób). Mapy aktywacji te uzyskano, uśredniając klatki z pierwszej sekundy po rozpoczęciu stymulacji zapachowej (maksimum zmienności fluorescencji +0,72% w D i +0,66% w E). Należy zauważyć, że białe strefy emisji autofluorescencji wskazane czarnymi strzałkami odpowiadają czarnym strefom w IOS. Ziarnistość widoczna na mapie FAS wynika z konieczności zastosowania binningu 4x4 w celu poprawy czułości. Obrazy FAS nie były korygowane pod kątem blaknięcia autofluorescencji. Rzeczywiste wymiary obrazów B-E: 0,7 mm szerokości x 1,2 mm długości.

<ol><li>Grinvald, A., Lieke, E., Frostig, R. D., Gilbert, C. D., Wiesel, T. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+architecture+of+cortex+revealed+by+optical+imaging+of+intrinsic+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional architecture of cortex revealed by optical imaging of intrinsic signals.</a> Nature. 324, 361-364 (1986).</li>
<li>Rubin, B. D., Katz, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+odorant+representations+in+the+mammalian+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of odorant representations in the mammalian olfactory bulb.</a> Neuron. 23, 499-511 (1999).</li>
<li>Chance, B., Cohen, P., J&246, bsis, &amp, F., Schoener, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+oxidation-reduction+states+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Intracellular oxidation-reduction states in vivo.</a> Science. 137, 499-508 (1962).</li>
<li>Shibuki, K., Hishida, R., Murakami, H., Kudoh, M., Kawaguchi, T., Watanabe, M., Watanabe, S., Kouuchi, T., Tanaka, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+imaging+of+somatosensory+cortical+activity+in+the+rat+visualized+by+flavoprotein+autofluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol.+549+%28Pt%22%5BJournal%5D)">Dynamic imaging of somatosensory cortical activity in the rat visualized by flavoprotein autofluorescence.</a> J. Physiol. 549 (Pt. 3, 919-9127 (2003).</li>
<li>Uchida, N., Takahashi, Y. K., Tanifuji, M., Mori, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odor+maps+in+the+mammalian+olfactory+bulb%3A+domain+organization+and+odorant+structural+features%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Odor maps in the mammalian olfactory bulb: domain organization and odorant structural features.</a> Nat. Neurosci. 3, 1035-1043 (2000).</li>
<li>Gurden, H., Uchida, N., Mainen, Z. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory-evoked+intrinsic+optical+signals+in+the+olfactory+bulb+are+coupled+to+glutamate+release+and+uptake%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Sensory-evoked intrinsic optical signals in the olfactory bulb are coupled to glutamate release and uptake.</a> Neuron. 52, 335-345 (2006).</li>
<li>Soucy, E. R., Albeanu, D. F., Fantana, A. L., Murthy, V. N., Meister, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precision+and+diversity+in+an+odor+map+on+the+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Precision and diversity in an odor map on the olfactory bulb.</a> Nat. Neurosci. 12, 210-220 (2009).</li>
<li>Frostig, R. D., Lieke, E. E., Ts'o, D. Y., Grinvald, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+functional+architecture+and+local+coupling+between+neuronal+activity+and+the+microcirculation+revealed+by+in+vivo+high-resolution+optical+imaging+of+intrinsic+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Cortical functional architecture and local coupling between neuronal activity and the microcirculation revealed by in vivo high-resolution optical imaging of intrinsic signals.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 6082-6086 (1990).</li>
<li>Meister, M., Bonhoeffer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuning+and+topography+in+an+odor+map+on+the+rat+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Tuning and topography in an odor map on the rat olfactory bulb.</a> J. Neurosci. 21, 1351-1360 (2001).</li>
<li>Dunn, A. K., Devor, A., Bolay, H., Andermann, M. L., Moskowitz, M. A., Dale, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+imaging+of+total+cerebral+hemoglobin+concentration%2C+oxygenation%2C+and+blood+flow+during+functional+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Simultaneous imaging of total cerebral hemoglobin concentration, oxygenation, and blood flow during functional activation.</a> Opt. Lett. 28, 28-30 (2003).</li>
<li>L'Heureux, B., Gurden, H., Pain, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autofluorescence+imaging+of+NADH+and+flavoproteins+in+the+rat+brain%3A+insights+from+Monte+Carlo+simulations%5BTitle%5D)+AND+%22Optics.+Express%22%5BJournal%5D)">Autofluorescence imaging of NADH and flavoproteins in the rat brain: insights from Monte Carlo simulations.</a> Optics. Express. 17, 9477-9490 (2009).</li>
<li>Renaud, R., Gurden, H., Chery, R., Bendhamane, M., Martin, C., Pain, F. Multispectral imaging of the olfactory bulb activation: influence of realistic differential pathlength correction factors on the derivation of oxygenation and total hemoglobin concentration maps (Proceedings Paper). Photonics West Conference, , (2011).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

W niniejszym artykule przedstawiamy techniki obrazowania IOS i FAS do rejestracji in vivo aktywności wywołanej zapachami w OB myszy. Aby osiągnąć ten cel konieczne jest zastosowanie stosunkowo prostego i przystępnego cenowo układu do szerokopolowego obrazowania optycznego. Pozyskiwanie danych obrazowych wymaga przeszkolenia w celu przeprowadzenia precyzyjnych procedur chirurgicznych i uniknięcia jakichkolwiek uszkodzeń opony twardej lub tkanki mózgowej. W szczególności silny krwawienie spowoduje absorpcję fotonów rejestrowanych podczas obrazowania i doprowadzi do zakończenia eksperymentu.
Jedną z zalet obrazowania IOS i FAS jest uniknięcie wstrzykiwania znaczników fluorescencyjnych, które mogłyby doprowadzić do toksyczności komórkowej lub niepożądanych skutków ubocznych. Pozwalają one na badanie kwestii map węchowych, a tym samym przestrzennego kodowania bodźców sensorycznych. W przeciwieństwie do obrazowania 2-DeoxyGlucose, umożliwiają one obrazowanie kilku zapachów u jednego zwierzęcia. Jednakże, ze względu na ograniczoną penetrację fotonów w tkance, metody IOS i FAS są ograniczone do grzbietowej części OB i nie mogą być rejestrowane z obszarów brzusznych.
Obrazowanie endogennych sygnałów optycznych oferuje doskonałą rozdzielczość przestrzenną w badaniach in vivo. Udoskonalenia techniczne dotyczą obliczeń ilościowych komponentów naczyniowych w sygnałach odbiciowych8,9, a także dynamiki utlenowania i objętości krwi podczas aktywacji sensorycznej10. W naszym laboratorium opracowywane są obecnie wielodługościowe metody obrazowania IOS w celu pełnego ilościowego określenia całkowitego stężenia hemoglobiny i poziomu utlenowania w OB podczas aktywacji sensorycznej. Te spektroskopowe pomiary optyczne, uzupełnione o obrazowanie FAS, umożliwią wyjaśnienie nierozwiązanej kwestii zależności między dynamiką naczyniową a wewnątrzkomórkową podczas aktywacji sensorycznej11,12.

<table><tbody><tr><td>Imalgene</td><td>Merial</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rompun</td><td>Bayer AG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agaroza, typ III-A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9793-50G</td><td></td></tr><tr><td>Heksanal 98%</td><td>Aldrich</td><td>115606-100ML</td><td></td></tr></tbody></table>

obrazowanie aktywności wywołanej zapachami w opoliach myszy z wykorzystaniem sygnałów odbicia optycznego i autofluorescencji

Imaging Odor-Evoked Activities in the Mouse Olfactory Bulb using Optical Reflectance and Autofluorescence Signals

W mózgu stymulacja sensoryczna aktywuje rozproszone populacje neuronów w obrębie modułów funkcjonalnych, które biorą udział w kodowaniu bodźca. Techniki funkcjonalnego obrazowania optycznego są korzystne do wizualizacji aktywacji tych modułów w korach sensorycznych z wysoką rozdzielczością przestrzenną. W tym kontekście endogenne sygnały optyczne, wynikające z mechanizmów molekularnych powiązanych z neuroenergetyką, stanowią cenne źródła kontrastu do rejestracji map przestrzennych bodźców sensorycznych w szerokich polach widzenia w mózgu gryzoni.
W niniejszej pracy przedstawiamy dwie techniki oparte na zmianach endogennych właściwości optycznych tkanki mózgowej podczas aktywacji. Po pierwsze, wewnętrzne sygnały optyczne (IOS) są generowane przez lokalną zmianę odbicia światła czerwonego wynikającą z: (i) absorpcji spowodowanej zmianami poziomu utlenowania krwi i objętości krwi (ii) rozpraszania fotonów. Wykorzystanie IOS in vivo do rejestracji map przestrzennych rozpoczęło się w połowie lat 80. od obserwacji map optycznych beczek wibrysowych u szczura oraz kolumn orientacyjnych w korze wzrokowej kota1. Obrazowanie IOS powierzchni głównej opuszki węchowej (OB) gryzoni w odpowiedzi na substancje zapachowe zostało później zademonstrowane przez grupę Larry'ego Katza2. Drugie podejście opiera się na sygnałach autofluorescencji flawoprotein (FAS), wynikających ze zmian stanu redoks tych mitochondrialnych produktów pośrednich metabolizmu. Dokładniej rzecz ujmując, technika ta opiera się na zielonej fluorescencji wynikającej ze stanu utlenionego flawoprotein, gdy tkanka jest pobudzana niebieskim światłem. Choć sygnały te były prawdopodobnie jednymi z pierwszych zarejestrowanych cząsteczek fluorescencyjnych w badaniach nad aktywnością mózgu przeprowadzonych w pionierskich pracach Brittona Chance'a i współpracowników3, dopiero niedawno zaczęto je wykorzystywać do mapowania aktywacji mózgu in vivo. Obrazowanie FAS zostało po raz pierwszy zastosowane w korze somatosensorycznej gryzoni w odpowiedzi na stymulację tylnej łapy przez grupę Katsueiego Shibukiego4.
Układ węchowy ma kluczowe znaczenie dla przetrwania ogromnej większości żyjących gatunków, ponieważ umożliwia efektywne wykrywanie i identyfikację substancji chemicznych w środowisku (pokarmu, drapieżników). OB jest pierwszym przekaźnikiem przetwarzania informacji węchowych w mózgu. Otrzymuje on projekcje doprowadzające z pierwotnych neuronów sensorycznych węchowych, które wykrywają lotne cząsteczki substancji zapachowych. Każdy neuron sensoryczny wykazuje ekspresję tylko jednego typu receptora zapachowego, a neurony posiadające ten sam typ receptora przesyłają swoje wypustki nerwowe do tych samych, ściśle określonych mikroregionów o objętości ˜100μm3, składających się z dyskretnego neuropila, czyli kłębków węchowych (Rys. 1). W ostatniej dekadzie obrazowanie IOS sprzyjało funkcjonalnej eksploracji OB5, 6, 7, która stała się jedną z najdokładniej badanych struktur sensorycznych. Mapowanie aktywności OB przy użyciu obrazowania FAS nie zostało jeszcze przeprowadzone.
W niniejszej pracy przedstawiamy kolejne kroki wydajnego protokołu obrazowania IOS i FAS w celu zmapowania aktywności wywołanej zapachami w opuszce węchowej (OB) myszy.

Niniejszy artykuł przedstawia protokoły obrazowania wrodzonych sygnałów optycznych oraz sygnałów autofluorescencji flawoprotein w celu mapowania aktywności wywołanej zapachami na powierzchni opolpacha u myszy.

Obrazowanie aktywności wywołanej zapachami w opoliach myszy z wykorzystaniem sygnałów odbicia optycznego i autofluorescencji

W mózgu stymulacja sensoryczna aktywuje rozproszone populacje neuronów w obrębie modułów funkcjonalnych, które uczestniczą w kodowaniu bodźca. ...

Ogólnym celem tego eksperymentu jest mapowanie aktywności wywołanej zapachami na powierzchni opuszki węchowej myszy z wykorzystaniem wewnętrznych sygnałów optycznych oraz sygnałów autofluorescencyjnych flawoprotein (obrazowanie FAS), po znieczuleniu myszy i odsłonięciu czaszki. Kość nad opuszką węchową zostaje ścieniona. Za pomocą ostrza skalpela wycina się płat kostny, który następnie usuwa się, a z cementu stomatologicznego tworzy się komorę otaczającą odsłoniętą powierzchnię opuszki węchowej.Preparat wypełnia się ARO, a na wierzchu umieszcza się szkiełko nakrywkowe. Mapy węchowe są pozyskiwane sekwencyjnie u tej samej myszy z wykorzystaniem wewnętrznych sygnałów optycznych oraz obrazowania FAS. Obrazowanie innych wywołanych aktywności w opuszce węchowej myszy przy użyciu sygnałów odbicia optycznego i autofluorescencji może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące przestrzennego rozmieszczenia kłaczków w opuszce węchowej. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak obrazowanie 2-DG lub fMRI, jest możliwość rejestracji aktywności wywołanych zapachami z rozdzielczością przestrzenną pojedynczego kłaczka.Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tymi metodami napotykają na początku trudności, ponieważ zarówno umiejętności chirurgiczne, jak i instrumentalne nabywa się powoli. Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, aby zwrócić uwagę na najważniejsze etapy procedur chirurgicznych i obrazowych. Ściśnij tylną łapę myszy, aby potwierdzić znieczulenie, a następnie usuń sierść ze skóry głowy za pomocą strzyżarki.Usunąć pozostałości sierści ze skóry za pomocą sterylnych gazików nasączonych wodą destylowaną. Umieścić mysz w aparacie stereotaksycznym w taki sposób, aby pysk znajdował się w tej samej płaszczyźnie co tył głowy. Aby ustawić opuszki węchowe poziomo, należy mocno zamocować pręty uszne i nosowy, aby zapobiec przemieszczaniu się zwierzęcia.Nałóż maść oftalmiczną do oczu, aby zapobiec ich wysychaniu podczas obrazowania, a następnie zdezynfekuj obszar skóry głowy Betadyną, używając sterylnych nożyczek. Wykonaj nacięcie z tyłu głowy pomiędzy uszami, następnie rozetnij skórę po obu stronach w kierunku podstawy uszu oraz w kierunku przednio-tylnym w stronę czoła wzdłuż powiek. Zakończ usuwanie skóry głowy, przecinając skórę na pysku.Używając paska nosowego jako prowadnicy, umieść zwierzę pod mikroskopem stereoskopowym i za pomocą patyczka higienicznego nasączonego solą fizjologiczną delikatnie oddziel okostną z górnej części czaszki. Użyj pęsety do usunięcia pozostałych tkanek, a następnie zdrap powierzchnię czaszki skalpelem, aby zapewnić czystość preparatu, co pozwoli utrzymać obszar opuszki węchowej w stanie wilgotnym przez cały czas trwania eksperymentu.Umieść kawałek wchłanialnej gąbki żelatynowej nasączonej wodą destylowaną na kości powyżej opuszki węchowej znajdującej się pomiędzy oczami. Usuń gąbkę żelatynową i rozpocznij od delikatnego skrobania kości ostrzem skalpela nr 10. Utrzymuj stały kąt 45 stopni między ostrzem a kością i przemieszczaj ostrze od powiek w stronę strzałkową obszaru opuszki.Podczas procesu ścieńczania należy uważać, aby nie wywierać nacisku pionowego na kość i nie porysować powierzchni kości nad zatoką żylną. Co pięć minut należy przerwać pracę i położyć na kości nawilżoną gąbkę żelatynową, aby schłodzić preparat. Przetrzeć czaszkę gąbką w celu usunięcia resztek kości oraz pyłu, a ostrze skalpela okresowo wycierać, aby utrzymać jego czystość i ostrość.Kontynuuj, aż pojawi się warstwa kości gąbczastej lub beleczki kostne. Gdy widoczne stanie się drobne unaczynienie opary cebulki węchowej, przestań skrobać kość i za pomocą ostrza skalpela nr 11 wyznacz obszar prostokątny, zamykając w nim cebulkę węchową. Utrzymując okno w obrębie granic zatok żylnych, kontynuuj skrobanie kości wewnątrz wyznaczonego obszaru prostokątnego.Należy zachować szczególną ostrożność w kwestii głębokości wprowadzenia ostrza skalpela, aby uniknąć dotknięcia powierzchni opony twardej. W celu oszacowania grubości pozostałej części kości, należy ją delikatnie nacisnąć końcówką pęsety. Jeśli kość ugnie się pod wpływem nacisku, można przejść do następnego kroku.Dodaj kroplę soli fizjologicznej i za pomocą końcówki skalpela skierowanego poziomo unieś płat kostny. Ostrożnie usuń płat pęsetą, aby uniknąć oderwania pozostałej części kości. Po odsłonięciu powierzchni opuszki węchowej sprawdź, czy nie występuje krwawienie ani nie są widoczne naczynia krwionośne.Anastomoza.Przetrzyj obszar gąbką żelatynową nasączoną solą fizjologiczną. Aby utrzymać wilgoć opuszki węchowej, nanieś dentystyczny cement poliakrylanowy za pomocą strzykawki o rozmiarze 29G, tworząc zagłębienie na kości wokół okna czaszkowego. Nanieś kroplę wosku Aros o niskiej temperaturze topnienia na oponę twardą, a następnie umieść sterylne szkiełko nakrywkowe nad oknem czaszkowym w celu przeprowadzenia obrazowania.Umieść ramę stereotaktyczną pod mikroskopem stereoskopowym, centrując okno czaszkowe w polu widzenia i ustawiając ostrość, aby uwidocznić naczynia włosowate. Przełącz na zielone światło o długości fali 580 nanometrów i wykonaj obraz kontrolny anatomiczny, aby sprawdzić stan preparatu podczas obrazowania. Następnie przystąp do rejestracji prób stymulacyjnych, wykorzystując obrazowanie wrodzonego sygnału optycznego przy oświetleniu 630 nanometrami lub obrazowanie sygnału autofluorescencyjnego flawoprotein przy oświetleniu 480 nanometrami. Standardowa sesja obrazowania obejmuje linię bazową trwającą od 5 do 10 sekund, podczas której podawane jest tylko powietrze, a następnie stymulację zapachem przez okres od 3 do 10 sekund, w zależności od wybranego stężenia zapachu.Na koniec, w celu ustalenia poziomu bazowego regeneracji, rejestruje się 70 do 82 sekund podawania powietrza. Następnie, przez okno czaszkowe, obrazowane jest unaczynienie opuszki węchowej, a po nim następują wyniki próby stymulacji z użyciem h sinal jako substancji zapachowej, zarejestrowane zarówno za pomocą obrazowania iOS, jak i FAS. W obrazowaniu iOS aktywność wywołana zapachem jest przedstawiona jako ciemne obszary absorpcji; obszary aktywowane przez AL są wskazane białymi strzałkami, a obszary aktywne można zaobserwować zarówno w pojedynczych, jak i uśrednionych z wielu prób badaniach.Po przełączeniu na obrazowanie FAS w tej samej myszy, aktywność wywołana przez OD jest teraz widoczna jako białe obszary emisji autofluorescencji wskazane czarnymi strzałkami; można ją zaobserwować zarówno w pojedynczych, jak i uśrednionych z wielu prób badaniach. Należy zauważyć, że czarne strefy absorpcji widoczne w obrazowaniu iOS oraz białe obszary emisji autofluorescencji widoczne w obrazowaniu FAS nakładają się na siebie. Ta zgodność przestrzenna potwierdza, że obie techniki umożliwiają wizualizację tych samych kłębków węchowych. Po opanowaniu obrazowania aktywności wywołanej przy użyciu sygnałów odbicia optycznego i autofluorescencji, cały proces może zostać zrealizowany w ciągu godziny w przypadku operacji i kilku godzin w przypadku akwizycji obrazów.Głównymi wadami stosowania tych metod obrazowania optycznego jest fakt, że nie mogą one zostać wykorzystane do wizualizacji map węchowych u myszy poruszających się swobodnie. Ponadto, ze względu na ograniczoną penetrację fotonów w tkanki biologiczne, nie zapewniają one dostępu do brzusznych kłębków węchowych po ich rozwoju pod koniec lat dziewięćdziesiątych, co utrudnia rejestrację sygnałów wewnętrznych w systemie węchowym. Być może stanowi to drogę dla badaczy z zakresu obrazowania optycznego do zgłębienia charakterystyki specjalnej powłoki od.Obrazowanie autofluorescencji flawoprotein w opuszce węchowej jest obiecującą techniką pozwalającą na uzyskanie nowych informacji o specjalnej otoczce OD z wykorzystaniem endogennych sygnałów optycznych.

imaging-odor-evoked-activities-mouse-olfactory-bulb-using-optical

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Obrazowanie aktywności wywołanej przez zapach w bulbusie wzrokowym myszy za pomocą sygnałów odbicia optycznego i autofluorescencji

Rejestracja elektroolfaktogramu (EOG) jest informacyjną, łatwą do przeprowadzenia i niezawodną metodą oceny funkcji węchowych na poziomie nabłonka węchowego. Niniejszy protokół opisuje konfigurację układu rejestracyjnego, przygotowanie tkanek mysich, gromadzenie danych oraz podstawową analizę danych.

Analiza odpowiedzi neuronów sensorycznych węchu myszy z wykorzystaniem zapisu elektroolfaktogramu w fazie gazowej

Przedstawiamy technikę lentiwirusową służącą do manipulacji genetycznej i wizualizacji pojedynczego aksonu neuronu sensorycznego węchu oraz jego arboryzacji terminalnej in vivo.

Lentiwirusowa manipulacja genetyczna i wizualizacja neuronów sensorycznych węchu in vivo

Neurony powstałe w wieku dorosłym w opalfaktorycznej cebulce mogą być kontrolowane optogenetycznie poprzez wstrzyknięcie lentiwirusa wykazującego ekspresję Channelrhodopsin2 do przedniego strumienia migracyjnego oraz przewlekłą fotostymulację za pomocą wszczepionej miniaturowej diody LED.

Selektywna transdukcja wirusowa neuronów węchowych pochodzenia dorosłego w celu chronicznej optogenetycznej stymulacji in vivo

Źródło: Zhang, L., et al. Światło bliskiej podczerwieni (NIr) zwiększa ekspresję markera funkcji mitochondriów w przedsionkowym nabłonku czuciowym myszy. J. Vis. Exp. (2015)Ten film pokazuje proces nakładania światła NIr na ogoloną skórę głowy myszy w celu aktywacji neuronów przedsionkowych i stymulacji produkcji dysmutazy ponadtlenkowej-1 (SOD-1), wspierając funkcje neuronów. Procedura podkreśla terapię NIr jako strategię neuroprotekcyjną.

Modulowanie czuciowej sygnalizacji neuronalnej w modelu mysim za pomocą światła bliskiej podczerwieni

Opisujemy protokół znakowania in vivo węchowych neuronów czuciowych za pomocą elektroporacji, a następnie konfokalnego skanowania laserowego lub mikroskopii wielofotonowej w celu wizualizacji morfologii neuronów i ich rozwoju w czasie.

Układ węchowy jako model do badania wzorców wzrostu i morfologii aksonów in vivo

Przedstawiamy prosty i bezstronny test węchowy na myszach. Dzięki temu protokołowi dyskryminacja węchowa, preferencje, unikanie i wrażliwość na nowy zapach w porównaniu z wodą mogą być oceniane w pojedynczych sesjach behawioralnych. Ta metoda jest wskazana dla pojedynczego eksperymentatora, a analiza opiera się na komputerowym przetwarzaniu wideo.

Proste i wspomagane komputerowo testy węchowe dla myszy

Tutaj opisujemy protokół pomiaru i analizy reakcji na temperaturę w opuszce węchowej Xenopus laevis. Neurony receptorów węchowych i komórki mitralne są barwione różnicowo, po czym rejestrowane są zmiany wapnia, odzwierciedlające wrażliwość niektórych sieci neuronowych w bańce na spadki temperatury wywołane w nosie.

Rejestrowanie aktywności neuronalnej wywołanej temperaturą poprzez monitorowanie zmian wapnia w opuszce węchowej Xenopus laevis

Węchowe neurony czuciowe wyrażają szeroką gamę cząsteczek sortujących aksony, aby ustanowić prawidłowe obwody neuronowe. Protokół ten opisuje metodę barwienia immunohistochemicznego w celu wizualizacji kombinatorycznych ekspresji cząsteczek sortujących aksony na końcach aksonów węchowych neuronów czuciowych.

Poczwórne barwienie immunologiczne opuszki węchowej w celu wizualizacji węchowych kodów tożsamości molekularnej aksonu czuciowego

Tutaj szkolimy myszy w zadaniu uczenia asocjacyjnego, aby przetestować rozróżnianie zapachów. Protokół ten pozwala również na badania nad zmianami strukturalnymi w mózgu wywołanymi uczeniem się.

Obiektywny i powtarzalny test uczenia się węchu i dyskryminacji u myszy

Ten protokół bada zależność między mózgiem a zachowaniem w hipokampie CA1 u myszy poruszających się po smugach zapachu. Zapewniamy protokół krok po kroku, w tym operację w celu uzyskania dostępu do obrazowania hipokampa, trening behawioralny, rejestrację i przetwarzanie mózgu w miniskopie GCaMP6f oraz dane behawioralne w celu dekodowania pozycji myszy na podstawie aktywności neuronalnej ROI.

Miniskop rejestrujący sygnały wapnia w hipokampie myszy poruszających się po pióropuszu zapachowym

Protokół ten opisuje konstrukcję olfaktometru do eksperymentów z zachowaniami węchowymi go/no-go. Instrukcje krok po kroku wraz ze zdjęciami są dostarczane, aby zapewnić pomyślną konstrukcję olfaktometru. Dołączone są również informacje dotyczące rozwiązywania problemów napotkanych podczas procesu.

Konstruowanie olfaktometru do badań zachowań węchowych gryzoni

Poznaj metodę obrazowania aktywności wywołanych zapachem w mysiej opuszce węchowej przy użyciu sygnałów odbicia optycznego i autofluorescencji flawoprotein. Technika ta umożliwia mapowanie aktywności neuronalnej z wysoką rozdzielczością przestrzenną.

Obrazowanie aktywności wywołanych zapachem w mysiej opuszce węchowej przy użyciu sygnałów odbicia optycznego i autofluorescencji (Wideo) | JoVE Journal

Obrazowanie aktywności wywołanej zapachami w opoliach myszy z wykorzystaniem sygnałów odbicia optycznego i autofluorescencji

Przeglądaj więcej filmów