Name: Identyfikacja celów ludzkich mikroRNA za pomocą systemu testowego Lucyferazy LightSwitch przy użyciu konstruktów reporterowych 3UTR i naśladownictwa mikroRNA w komórkach adherentnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: Poznaj metodę walidacji celów mikroRNA w ludzkich komórkach przy użyciu systemu LightSwitch z reporterami 3'UTR i naśladownictwem mikroRNA. Technika ta umożliwia badaczom funkcjonalną analizę interakcji mikroRNA z regionami 3'UTR w żywych komórkach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wstęp
MikroRNA stały się ważnymi regulatorami ekspresji genów, które modulują aktywność wielu istotnych procesów biologicznych. Biorąc pod uwagę, że do tej pory zidentyfikowano ponad 700 ludzkich miRNA1, nie jest zaskakujące, że mutacje i niewłaściwa regulacja miRNA są powiązane z różnymi zaburzeniami fizjologicznymi, takimi jak nowotwory i choroby serca2,3. Niedawne badania wykazały, że większość regulatorowych miejsc wiązania miRNA znajduje się w 3'UTR4,5, a niektórzy badacze szacują, że w komórce przypada setki celów na jedno miRNA6. Ze względu na znaczenie biologiczne miRNA, dużą liczbę istniejących cząsteczek miRNA oraz ogromną liczbę celów dla każdej z nich, kluczowe jest, aby badacze mogli niezawodnie identyfikować endogenne cele miRNA, najlepiej na platformach umożliwiających badania wysokoprzepustowe.
Chociaż wykorzystanie narzędzi obliczeniowych, takich jak miRBase, TargetScan i PicTar1,6,7, jest skutecznym sposobem generowania list potencjalnych celów mRNA dla dowolnego miRNA, przewidywania te nie są jeszcze na tyle dokładne, aby można było na nich polegać wyłącznie8. Dlatego badacze stosują również szereg podejść eksperymentalnych w celu identyfikacji celów de novo lub walidacji przewidzianych celów. Wiele zespołów opierało się na wysokoprzepustowych pomiarach stacjonarnych poziomów mRNA lub białek, aby zidentyfikować geny, których ekspresja zmienia się w przypadku zaburzenia aktywności miRNA4,9,10. Takie zmiany są bez wątpienia istotne biologicznie i stanowią ważny pierwszy krok, jednak pomiar zmian w ogólnej ekspresji nie pozwala odróżnić bezpośrednich efektów działania miRNA na transkrypty od pośrednich efektów sygnalizacyjnych lub efektów w dalszych ogniwach kaskady. Innymi potężnymi narzędziami dostarczającymi dowodów na bezpośrednie interakcje miRNA-mRNA są strategie immunoprecypitacji chromatyny (ChIP), które sieciują białka argonautowe (a tym samym kompleks RISC) z miRNA i mRNA, choć identyfikacja partnerów interakcji nie wskazuje bezpośrednio na funkcjonalne skutki takiego wiązania5,11. W związku z tym testy reporterowe 3'UTR, które dostarczają funkcjonalnych dowodów na wpływ miRNA na konkretny region UTR, stały się istotnym elementem kompleksowych badań nad miRNA. Dane z takich testów opartych na komórkach, w połączeniu z obliczeniowymi przewidywaniami celów lub danymi z ekspresji i proteomiki, stanowią silny dowód na to, że dany 3'UTR jest bezpośrednio regulowany przez badane miRNA.
W teście reporterowym 3'UTR, sekwencja 3'UTR genu zainteresowania jest dołączana do końca genu reporterowego lucyferazy. Jeśli 3'UTR jest celem dla miRNA, stabilność transkryptu reporterowego i/lub jego wydajność translacji ulegną zmianie wraz ze zmianą stężenia funkcjonalnego miRNA. W przeciwieństwie do testów opartych wyłącznie na transkrypcie, testy reporterowe pomagają zidentyfikować efekty wpływające zarówno na stacjonarny poziom mRNA, jak i na poziom białka. Systemy reporterowe mogą być również wykorzystywane do badania funkcjonalnych skutków mutagenezy domniemanego miejsca wiązania miRNA w 3'UTR w celu potwierdzenia, że jest ono rzeczywiście niezbędne dla interakcji8. Chociaż zakrojone na szeroką skalę badania z wykorzystaniem macierzy ekspresji, technik proteomiki oraz ChIP białka Argonaute dostarczają cennych danych w skali całego genomu dla niewielkiej liczby warunków doświadczalnych, komórkowe testy reporterowe są najbardziej podatne na skalowanie w celu badania interakcji miRNA-3'UTR w setkach lub tysiącach warunków, co może stać się konieczne podczas wysokoprzepustowego screeningu małych cząsteczek lub innych efektorów z bibliotek.
Wielu naukowców wykorzystało technologię testów reporterowych do badania oddziaływań miRNA-3'UTR. Jednakże, z uwagi na fakt, że wiele cząsteczek miRNA celuje w setki różnych transkryptów, badaczom trudno było zastosować to potężne podejście na skalę wysokoprzepustową, ponieważ etapy klonowania, walidacji i optymalizacji niezbędne do stworzenia tysięcy różnych wektorów reporterowych 3'UTR są często zbyt kosztowne. Aby udostępnić badania nad reporterami 3'UTR w małej i dużej skali każdemu badaczowi, stworzyliśmy genomową kolekcję ludzkich 3'UTR, preklownowanych do wysoce zoptymalizowanego systemu testowego LightSwitch Luciferase Assay System. System reporterowy zawiera również zwalidowane wektory kontrolne, zestaw ponad 700 syntetycznych konstruktów reporterowych celów miRNA do wykorzystania jako kontrole pozytywne oraz serię ustandaryzowanych protokołów eksperymentalnych.
Korzystając z poniższego protokołu, można sprawdzić, czy konkretny ludzki region 3'UTR jest celem badanego miRNA. Kluczowymi etapami tego procesu są: projektowanie eksperymentu, transfekcja konstruktów reporterowych i mimików miRNA, testy reporterowe lucyferazy oraz analiza danych. W fazie projektowania eksperymentu ważne jest przemyślane wybranie linii komórkowej podatnej na transfekcję, eksperymentalnych i kontrolnych konstruktów reporterowych, a także mimików miRNA i kontroli nietargetujących. Powszechnie stosowane, wysoce podatne na transfekcję adherentne linie komórkowe, takie jak HT1080, HepG2, HCT-116, Hela, 293 i inne, często sprawdzają się w tym protokole.
Ważne uwagi dotyczące projektu eksperymentalnego
System analizy lucyferazy LightSwitch to w pełni zoptymalizowany system reporterowy, który obejmuje konstrukty GoClone wykorzystujące gen lucyferazy RenSP oraz odczynniki do analizy lucyferazy LightSwitch. Aby uzyskać optymalne wyniki analizy reporterowej, należy stosować wszystkie komponenty systemu LightSwitch zgodnie z zaleceniami.
Współtransfekcja jakichkolwiek oligosów/plazmidów z konstruktami reporterowymi SwitchGear GoClone redukuje całkowite sygnały lucyferazy w sposób nieswoisty. Dlatego ważne jest przeprowadzenie następujących kombinacji transfekcji: sam reporter, reporter + kontrolne miRNA niezwiązujące (non-targeting) oraz reporter + specyficzne miRNA.
Nasz wektor empty_3UTR (silny promotor, brak UTR) zapewnia bardzo wysoki poziom sygnału lucyferazy i służy jako kontrola pozytywna wydajności transfekcji, natomiast wektor reporterowy z syntetycznym celem miRNA może służyć jako kontrola pozytywna aktywności mimetyku. Ponadto zalecamy stosowanie kontroli GoClone 3'UTR dla genów housekeepingowych oraz kontroli randomowych w celu dokładnego odróżnienia efektów swoistych dla sekwencji od efektów nieswoistych.
Zapoznaj się z protokołem i, w miarę możliwości, przygotuj mieszaniny główne (master mixy), aby zmniejszyć zmienność danych wynikającą z błędów pipetowania lub odparowania.
W tym protokole zastosowano odczynnik do transfekcji DharmaFect Duo (Dharmacon).
Dzień 1
WAŻNA WSKAZÓWKA: Dobierz linię komórkową z rozwagą. Aby uzyskać najlepsze wyniki, należy użyć linii komórkowej, która jest znana jako podatna na transfekcję. Zaobserwowaliśmy również, że mierzalna odpowiedź reportera 3' UTR na mimik miRNA jest osłabiona w liniach komórkowych o wysokim endogennym poziomie danego miRNA. Jeśli nie znasz poziomu ekspresji miRNA w swojej linii komórkowej, wypróbuj syntetyczny cel microRNA od SGG, który pośrednio mierzy obfitość konkretnego miRNA w komórce, a także informuje o zakresie dynamicznym Twojego testu.
1. Wysiej komórki tak, aby w momencie transfekcji osiągnęły ≥80% konfluencji.
<ol>
<li>Wysiej komórki na białą płytkę TC 96-dołkową w całkowitej objętości 100µl.</li>
<li>Równolegle wysiej odpowiednią liczbę komórek na przezroczystą płytkę 96-dołkową w celu oceny konfluencji.</li>
</ol>
WAŻNA WSKAZÓWKA 1: Stopień konfluencji ma kluczowe znaczenie dla uzyskania dobrych wyników w eksperymencie typu mimic. Aby zapewnić optymalny knockdown, komórki powinny osiągnąć 100% konfluencji w momencie transfekcji.
WAŻNA WSKAZÓWKA 2: Aby uzyskać najlepsze wyniki, należy używać komórek o niskim numerze pasażu. Komórki, które przeszły zbyt wiele pasażów, mają tendencję do generowania szumów w danych po transfekcji.
Dzień 2
Przygotować konstrukty reporterowe GoClone oraz miRNA, a następnie przeprowadzić transfekcję do konfluencyjnych komórek.
2. Przygotowanie konstruktów
<ol>
<li>Rozmrozić konstrukty GoClone (plazmidowe DNA) w temperaturze pokojowej. Dobrze wymieszać.</li>
<li>Odwirować, aby usunąć kondensat z zakrętki.</li>
</ol>
3. Przygotowanie mikroRNA
<ol>
<li>Odmrozić mikroRNA (specyficzne mimiki i kontrole nietargetujące) w temperaturze pokojowej, a następnie odwirować w celu usunięcia kondensatu z zakrętek.</li>
<li>Rozcieńczyć do stężenia roboczego 2 µM w wodzie wolnej od RNaz.</li>
</ol>
Oprócz eksperymentalnego mimiku miRNA ZAWSZE należy uwzględnić niecelujący miRNA kontrolny. Współtransfekcja plazmidu i krótkiego oligonukleotydu RNA prowadzi do uzyskania słabszego sygnału niż transfekcja samego plazmidu.
Należy uwzględnić jedną lub więcej kontroli pozytywnych. Warto rozważyć zastosowanie jednego z setek syntetycznych wektorów reporterowych dla celów miRNA dostępnych w katalogu SGG.
Należy uwzględnić jedną lub więcej kontroli negatywnych lub niespecyficznych. SGG dysponuje zakresem kontroli, obejmującym 3' UTR genów housekeepingowych, fragmenty losowe i/lub kontrolę pustą (bez wstawki UTR). Zastosowanie jednej lub większej liczby takich kontroli wraz z konstruktem eksperymentalnym pozwoli na normalizację wszelkich niespecyficznych efektów przypisywanych nadekspresji konkretnego miRNA lub kontroli nietargetującej.
4. Przygotowanie do transfekcji
<ol>
<li>Dla każdej transfekcji połącz następujące odczynniki dla jednego testu:</li>
</ol>
Mieszanina 1
<table border="1">
<tbody>
<tr><td>Poszczególny reporter GoClone:</td><td>3.33 µL</td></tr>
<tr><td>microRNA:</td><td>Zmienne*</td></tr>
<tr><td>Pożywka beztoksyczna (bez surowicy):</td><td>do 10 µL</td></tr>
</tbody>
</table>
* Efektywne stężenie miRNA może wynosić od 10 nM do 100 nM. Należy skonsultować się z producentem miRNA w celu ustalenia odpowiedniego stężenia.
WAŻNA WSKAZÓWKA: Nie dodawaj zbyt dużej ilości mimetyku. Rozsądny zakres stężeń mimetyku to 10-50 nM w końcowej objętości reakcji 100uL.
Wykonaj co najmniej trzy powtórne transfekcje dla każdej kombinacji traktowania/UTR i uwzględnij dodatkową objętość, aby zrekompensować błędy pipetowania.
Na przykład pomnóż objętości dla pojedynczej reakcji przez 3,5, aby uzyskać wystarczającą ilość mieszaniny do transfekcji dla 3 powtórzeń w studzienkach, uwzględniając nadmiar na błędy pipetowania lub parowanie.
Dla każdego reporteru należy przygotować powtórzenia dla następujących wariantów: sam reporter, reporter + niecelująca kontrolna miRNA oraz reporter + specyficzna miRNA.
Przeprowadź transfekcje dla mikroRNA celującego w tym samym czasie, co dla kontroli niecelującej.
<ol start="2">
<li>Przygotować mieszaninę DharmaFECT DUO (Dharmacon) dla każdej transfekcji w następujący sposób:</li>
</ol>
Mieszanina 2
<table border="1">
<tbody>
<tr><td>DharmaFect Duo:</td><td>0.15 µL</td></tr>
<tr><td>Poziom medium bezsurowiczego:</td><td>9.85 µL</td></tr>
</tbody>
</table>
Ilość dodawanego DharmaFECT Duo może zależeć od linii komórkowej.
Wskazane powyżej ilości są odpowiednie dla komórek HT1080.
Należy zapoznać się z dokumentacją producenta, aby określić odpowiednią ilość dla stosowanej linii komórkowej.
Wskazówka: Przygotuj większą objętość mieszaniny do transfekcji, mnożąc powyższe objętości przez liczbę reporterów, liczbę powtórzeń oraz liczbę testowanych miRNA. Obliczając ilość mieszaniny do przygotowania, należy uwzględnić niewielką nadwyżkę, aby zrekompensować błędy pipetowania oraz odparowanie.
<ol start="3">
<li>Pozostaw mieszaninę DharmaFECT Duo do inkubacji w temperaturze pokojowej przez 5 minut.</li>
<li>Po 5 minutach dodaj 10µL mieszaniny DharmaFECT Duo (Mieszanina 2) do każdej przygotowanej probówki zawierającej 10uL plazmidu i/lub miRNA (Mieszanina 1). Każda probówka powinna zawierać objętość 20µL na każdą powtórną transfekcję.</li>
<li>Inkubuj każdą mieszaninę przez 20 minut w temperaturze pokojowej.</li>
<li>Po 20 minutach dodaj do każdej probówki 80 µL uprzednio ogrzanej (37°C), kompletnej pożywki bez antybiotyków na każdą powtórkę, tak aby uzyskać łącznie 100µL na każdą powtórną transfekcję. Do jednoczesnego przygotowania wielu powtórek i próbek można użyć bloku z głębokimi dołkami. Wymieszaj roztwór, pipetując go w górę i w dół.</li>
<li>Wyjmij zasianą płytkę z inkubatora. Upewnij się, że konfluencja komórek wynosi co najmniej 80%.</li>
<li>Ostrożnie odpipetuj pożywkę z każdego dołka.</li>
<li>Dodaj 100µL mieszaniny do transfekcji (20uL mieszaniny DNA/odczynnika + 80uL pożywki) do każdego dołka.</li>
<li>Umieść płytkę w inkubatorze na noc.</li>
</ol>
Należy unikać zbyt długiej inkubacji. Większość mimetyków wykaże istotne rezultaty w odniesieniu do rzeczywistych celów w ciągu 24 godzin. Poziom represji mierzony po 48 godzinach może być większy, ale wzrośnie również zmienność między poszczególnymi studzienkami.
Eksperymenty z mimetykami są łatwiejsze niż eksperymenty z inhibitorami. Podczas gdy większość mimetyków znacząco represuje właściwe cele w ciągu 24 godzin, znacząca derepresja przypisywana inhibitorowi może wymagać 48 godzin, aby stała się mierzalna, i prawie zawsze będzie mniej wyraźna niż efekt działania mimetyku.
Dzień 3
Uwaga: Analizy lucyferazy można przeprowadzić natychmiast lub zamrozić płytki w temperaturze -80°C (zamrażanie zazwyczaj zwiększa lizę komórek i sygnał lucyferazy). Dla uzyskania najlepszych wyników należy zamrozić i rozmrozić komórki przed przeprowadzeniem analizy.
PAMIĘTAJ, aby rozmrozić zamrożone komórki do temperatury pokojowej przed dodaniem odczynnika LightSwitch Assay Reagent.
5. Pomiar aktywności lucyferazy przy użyciu odczynników LightSwitch AssayReagents
<ol>
<li>Wyjąć płytkę z inkubatora i doprowadzić ją do temperatury pokojowej.</li>
<li>Przygotować odczynniki do testu LightSwitch (dla zestawu LS010; protokoły dla innych rozmiarów zestawów są dostępne online):
<ol>
<li>Zrekonstytuować Substrat 100X, dodając 100µL rozpuszczalnika do substratu do probówki z liofilizowanym substratem testowym. Chronić przed światłem i minimalizować czas przebywania w temperaturze pokojowej. Substrat 100X można przechowywać w temperaturze -20C przez 2-3 tygodnie. Dla uzyskania najlepszych wyników należy użyć świeżo zrekonstytuowanego substratu.</li>
<li>Przygotować roztwór testowy, rozmrażając butelkę 10mL buforu testowego w kąpieli wodnej o temperaturze pokojowej, a następnie dodać 100µL zrekonstytuowanego Substratu 100X przed użyciem. Wymieszać dokładnie.</li>
</ol>
</li>
<li>Za pomocą pipety wielokanałowej dodać 100µL roztworu testowego LightSwitch (bufor+substrat) bezpośrednio do każdej studni z próbką (zawierającej 100uL komórek + podłoża) w białej płytce 96-dołkowej. Jeśli komórki były hodowane w innym formacie płytki lub kolby, przenieść próbki do białej płytki 96-dołkowej w całkowitej objętości 100µL (podłoża lub PBS).</li>
<li>Przykryć płytkę, chronić przed światłem i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej. W przypadku badania więcej niż jednej płytki, należy rozłożyć w czasie dodawanie roztworu testowego tak, aby każda płytka była inkubowana przez 30 minut przed odczytem.</li>
<li>Odczytać każdą studnię przez 2 sekundy w luminometrze do płytek (SpectraMax L lub odpowiedniku).</li>
<li>Obliczyć stopień wyciszenia (knockdown), wyznaczając stosunek sygnału lucyferazy dla każdego konstruktu dla konkretnego miRNA w stosunku do kontroli nietargetującej (luminescencja = konkretne miRNA/kontrola nietargetująca). Wykorzystać dane z konstruktów housekeeping, random oraz pustych konstrukcji w celu kontrolowania efektów działania preparatów niespecyficznych dla UTR.</li>
</ol>
Reprezentatywne wyniki
Cele 3'UTR w obecności targetującego miRNA wykazują knockdown lucyferazy.
Wyciszenie aktywności reportera lucyferazy 3'UTR przez let-7a zmierzono w komórkach HT1080 poprzez kotransfekcję 100ng każdego konstruktu reporterowego z 20nM mimiku let-7a lub kontrolą nietargetującą, inkubację przez 24 godziny, a następnie odczyt sygnału luminescencyjnego reportera przy użyciu odczynników LightSwitch Luciferase Assay Reagents.
<img src="/files/ftp_upload/3343/3343fig1.jpg" alt="Wykres słupkowy porównujący efekty kontroli nietargetującej i mimiku miRNA let-7a na konstrukty 3'UTR." data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Ludzkie 3'UTR PUNC i ARID3B są celami mikroRNA let-7a. Sygnały z ludzkich reporterów 3'UTR dla genów PUNC i ARID3B są znacząco obniżone w obecności mimiku mikroRNA let-7a, podczas gdy sygnały dla 3'UTR genów housekeepingowych i sekwencji losowych nie ulegają zmianie.

<ol><li>Griffiths-Jones, S., Grocock, R. J., van Dongen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRBase%3A+microRNA+sequences%2C+targets+and+gene+nomenclature%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature.</a> Nucleic Acids Res. 34, D140-D144 (2006).</li>
<li>Calin, G. A., Croce, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+cancer+connection%3A+the+beginning+of+a+new+tale%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">MicroRNA cancer connection: the beginning of a new tale.</a> Cancer Res. 66, 7390-7394 (2006).</li>
<li>Chen, J. F., Murchison, E. P., Tang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+deletion+of+Dicer+in+the+heart+leads+to+dilated+cardiomyopathy+and+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Targeted deletion of Dicer in the heart leads to dilated cardiomyopathy and heart failure.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 6-6 (2008).</li>
<li>Baek, D., Villen, J., Shin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+microRNAs+on+protein+output%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The impact of microRNAs on protein output.</a> Nature. 455, 64-71 (2008).</li>
<li>Hendrickson, D. G., Hogan, D. J., Herschlag, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+identification+of+mRNAs+recruited+to+argonaute+2+by+specific+microRNAs+and+corresponding+changes+in+transcript+abundance%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Systematic identification of mRNAs recruited to argonaute 2 by specific microRNAs and corresponding changes in transcript abundance.</a> PLoS One. 3, e2126-e2126 (2008).</li>
<li>Friedman, R. C., Farh, K. K., Burge, C. B., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Most+mammalian+mRNAs+are+conserved+targets+of+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs.</a> Genome Res. 19, 92-105 (2009).</li>
<li>Lall, S., Krek, A., Chen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-wide+map+of+conserved+microRNA+targets+in%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">A genome-wide map of conserved microRNA targets in.</a> 16, 460-471 (2006).</li>
<li>Boutz, D. R., Collins, P. J., Suresh, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-tiered+approach+identifies+a+network+of+cancer+and+liver+disease-related+genes+regulated+by+miR-122%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Two-tiered approach identifies a network of cancer and liver disease-related genes regulated by miR-122.</a> J. Biol. Chem. 286, 18066-18078 (2011).</li>
<li>Lim, L. P., Lau, N. C., Garrett-Engele, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+analysis+shows+that+some+microRNAs+downregulate+large+numbers+of+target+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Microarray analysis shows that some microRNAs downregulate large numbers of target mRNAs.</a> Nature. 433, 769-773 (2005).</li>
<li>Selbach, M., Schwanhausser, B., Thierfeldner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+changes+in+protein+synthesis+induced+by+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Widespread changes in protein synthesis induced by microRNAs.</a> Nature. 455, 58-63 (2008).</li>
<li>Hutvagner, G., Simard, M. J., Mello, C. C., Zamore, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence-specific+inhibition+of+small+RNA+function%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Sequence-specific inhibition of small RNA function.</a> PLoS Biol. 2, e98-e98 (2004).</li>
<li>Meister, G., Landthaler, M., Dorsett, Y., Tuschl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence-specific+inhibition+of+microRNA-+and+siRNA-induced+RNA+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Sequence-specific inhibition of microRNA- and siRNA-induced RNA silencing.</a> RNA. 10, 544-5450 (2004).</li>
<li>Liao, J. M., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Auto-regulatory+suppression+of+c-Myc+by+miR-185-3p%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem.+Epub%22%5BJournal%5D)">Auto-regulatory suppression of c-Myc by miR-185-3p.</a> J. Biol. Chem. Epub. , Forthcoming (2011).</li>
</ol>

Autorzy są pracownikami firmy SwitchGear Genomics, która produkuje narzędzia i odczynniki przedstawione w niniejszym artykule. Produkcja tego artykułu była sponsorowana przez SwitchGear Genomics.

Stworzyliśmy obejmującą cały genom kolekcję preklonowanych konstruktów reporterowych z 3'UTR człowieka, aby umożliwić badanie oddziaływań miRNA-3'UTR w żywych komórkach. Przedstawiliśmy tutaj powtarzalną i wysokoprzepustową metodę kotransfekcji mimików miRNA z reporterami 3'UTR przy użyciu systemu reporterowego lucyferazy.
Metoda ta opiera się na wykorzystaniu przez badaczy linii komórkowej o wysokiej wydajności transfekcji oraz zaburzeniu aktywności miRNA za pomocą techniki nadekspresji. Badacze korzystający z linii komórkowych o niskiej wydajności transfekcji mogą rozważyć użycie naszego towarzyszącego zestawu lentiwirusowych reporterów 3'UTR, stworzonego we współpracy z firmą Sigma (Mission 3'UTR Lenti GoClones). Traktowanie komórek mimikami miRNA skutkuje eksperymentem typu nadekspresja, a w przypadku każdego takiego badania naukowcy muszą wziąć pod uwagę, że może to, lub nie, odzwierciedlać rzeczywiste warunki fizjologiczne. Aby rozwiązać problem związany z nadekspresją, badacze mogą stosować inhibitory miRNA dodatkowo do mimików, aby zbadać interakcję przy dwóch różnych typach zaburzeń12-14.
Po zidentyfikowaniu prawdopodobnych celów miRNA, badacze mogą chcieć przeprowadzić mutogenezę domniemanych miejsc wiązania miRNA, aby ustalić, czy miejsca te są niezbędne do interakcji funkcjonalnej. Mogą również chcieć zwiększyć skalę badań do testowania setek różnych potencjalnych 3'UTR celowych (Boutz). Ponadto, jeśli badaczy interesuje, czy miRNA wpływa na stabilność transkrypcyjną lub wydajność translacji, dane z reportera lucyferazy można porównać z pomiarami stacjonarnych poziomów transkrypcyjnych. Każda zmiana sygnału lucyferazy, która nie wiąże się z proporcjonalną zmianą poziomów transkryptu, będzie wskazywać na wpływ na wydajność translacji. Wreszcie badacze mogą wykorzystać wektory reporterowe do stworzenia krzywej zależności dawka-odpowiedź, aby porównać względną wrażliwość różnych UTR na zmiany stężenia miRNA14.

<table><tbody><tr><td>Białe płytki do hodowli tkankowych (96-dołkowe z twardym dnem)</td><td>VWR international</td><td>82050-736</td><td></td></tr><tr><td>Przezroczyste płytki do hodowli tkankowych (96-dołkowe) z pokrywką</td><td>VWR international</td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href="http://switchgeargenomics.com/jove/"&gt;Odczynnik do testu lucyferazowego LightSwitch&lt;/a&gt;</td><td><a href="http://switchgeargenomics.com/jove/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Aparatura rozdzielcza</a></td><td>&lt;a href="http://switchgeargenomics.com/jove/"&gt;LS010&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik do transfekcji DharmaFECT Duo (0,75 ml)</td><td>Dharmacon</td><td>T-2010-02</td><td></td></tr><tr><td>Taśma aluminiowa do uszczelniania płytek</td><td>E&amp;amp;K Scientific</td><td>T592100</td><td></td></tr><tr><td>Przepuszczalna taśma do uszczelniania płytek</td><td>E&amp;K Scientific</td><td>T896100-S</td><td></td></tr><tr><td>Luminometr do płytek</td><td>Molecular Devices</td><td>SpectraMax L</td><td></td></tr></tbody></table>

identyfikacja celów ludzkich mikrorna za pomocą systemu testowego lightswitch luciferase z wykorzystaniem konstruktów reporterowych 3'utr oraz mimiku mikrorna w komórkach adherentnych

Identifying Targets of Human microRNAs with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3'UTR-reporter Constructs and a microRNA Mimic in Adherent Cells

MikroRNA (miRNA) są istotnymi regulatorami ekspresji genów i odgrywają rolę w wielu procesach biologicznych. Do tej pory zidentyfikowano ponad 700 ludzkich miRNA, z których każde może posiadać setki unikalnych docelowych mRNA. Narzędzia obliczeniowe, analizy ekspresji i proteomiki oraz techniki oparte na immunoprecypitacji chromatyny dostarczają istotnych wskazówek w identyfikacji mRNA, które są bezpośrednimi celami konkretnego miRNA. Ponadto testy reporterowe 3'UTR stały się ważnym elementem szczegółowych badań nad celami miRNA, ponieważ dostarczają dowodów funkcjonalnych i pozwalają ilościowo określić efekty specyficznych oddziaływań miRNA-3'UTR w systemie komórkowym. Aby umożliwić większej liczbie badaczy wykorzystanie testów reporterowych 3'UTR oraz wesprzeć skalowanie takich analiz do poziomów wysokoprzepustowych, stworzyliśmy obejmującą cały genom kolekcję ludzkich reporterów lucyferazowych 3'UTR w wysoko zoptymalizowanym systemie LightSwitch Luciferase Assay System. System ten zawiera również syntetyczne konstrukty reporterowe celów miRNA do użytku jako kontrole pozytywne, różne endogenne konstrukty reporterowe 3'UTR oraz serię znormalizowanych protokołów eksperymentalnych.
W niniejszej pracy opisujemy metodę kotransfekcji pojedynczych konstruktów reporterowych 3'UTR wraz z mimikiem miRNA, która jest wydajna, powtarzalna i dostosowana do analiz wysokoprzepustowych.

MikroRNA (miRNA) są istotnymi regulatorami ekspresji genów i wykazano, że odgrywają one rolę w licznych procesach biologicznych. Aby lepiej zrozumieć interakcje miRNA-UTR, stworzyliśmy obejmującą cały genom kolekcję reporterów lucyferazy 3' UTR, połączonych z nowym genem lucyferazy i odczynnikiem analitycznym, systemem LightSwitch.

Identyfikacja celów ludzkich mikroRNA za pomocą systemu testowego LightSwitch Luciferase z wykorzystaniem konstruktów reporterowych 3'UTR oraz mimiku mikroRNA w komórkach adherentnych

MikroRNA (miRNA) są istotnymi regulatorami ekspresji genów i odgrywają rolę w wielu procesach biologicznych. Zidentyfikowano ponad 700 ludzkich miRNA...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest kotransfekcja konstruktów reporterowych z mimikiem mikroRNA w celu walidacji przewidywanych celów mikroRNA w ludzkich obszarach 3' UTR. Jest to realizowane poprzez opracowanie projektu eksperymentalnego, obejmującego wybór linii komórkowej oraz dobór mimików mikroRNA wraz z eksperymentalnymi i kontrolnymi konstruktami reporterowymi GoClone 3' UTR. Następnie, około 24 godziny przed transfekcją, wysiewa się komórki adherentne. Kolejnym krokiem procedury jest kotransfekcja każdego eksperymentalnego lub kontrolnego konstruktu reporterowego GoClone 3' UTR z mimikiem mikroRNA lub kontrolą nietargetową, a następnie inkubacja przez 24 do 48 godzin. W ostatnim kroku odczynnik do testu lucyferazy LightSwitch dodaje się bezpośrednio do hodowli komórkowej, a sygnał luminescencyjny odczytuje się za pomocą luminometru do płytek.Ostatecznie można uzyskać wyniki wskazujące, które ludzkie regiony 3' UTR są celami danego mikroRNA, poprzez pomiar wyciszenia sygnału lucyferazy z wykorzystaniem technologii testów reporterowych. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania badaczy mikroRNA, ponieważ dostarcza funkcjonalnego testu do walidacji przewidywanych interakcji mikroRNA z celami w regionach 3' UTR w żywych komórkach. Projektowanie eksperymentu rozpoczyna się od wyboru odpowiedniej, łatwo transfektowalnej linii komórek przylegających; testy oparte na mimikach mikroRNA działają najlepiej w liniach komórkowych o niskim poziomie endogennej ekspresji danego mikroRNA.Następnie wybierz parę mimiku mikro-RNA i kontroli nietargetowej; uwzględnienie kontroli nietargetowej jest kluczowe, ponieważ kotranfekcja plazmidu i krótkiego oligonukleotydu RNA prowadzi do uzyskania słabszego sygnału niż w przypadku tranfekcji samego plazmidu. Następnie wybierz przedklonowane konstrukty reporterowe 3'UTR GoClone z kolekcji genomowej switchgears. Przejdź do katalogu online i kliknij przycisk wyszukiwania UTR.Po wprowadzeniu listy nazw genów, symboli genów lub numerów dostępu, wynik wyszukiwania dostarczy informacji o wektorze i sekwencji wraz ze statusem stanu magazynowego. Teraz należy wybrać kontrolne konstrukty reporterowe. Wybierz konstrukty kontrolne z sekwencjami 3' UTR, które są mało prawdopodobne do bycia celem wybranego mikroRNA, takie jak geny gospodarza (housekeeping), sekwencje UTR lub fragmenty losowe, aby kontrolować niespecyficzne efekty nadekspresji mikroRNA na ogólny stan komórek lub sygnał testowy.Warto również rozważyć zastosowanie syntetycznego reportera celu mikroRNA jako kontroli pozytywnej dla aktywności mimiku. Pierwszego dnia wysiej komórki przylegające o niskim numerze pasażu, tak aby po 24 godzinach przed transfekcją osiągnęły 80 do 100% konfluencji. Użycie wysoko konfluentnych komórek jest kluczowe dla uzyskania dobrych wyników. Wysiej komórki w białej 96-dołkowej płytce do hodowli tkanek w całkowitej objętości 100 µL.Równolegle. W drugim dniu, 24 godziny po wysianiu komórek, sprawdź odpowiednią liczbę komórek w przezroczystej płytce pod kątem osiągnięcia konfluencji. Przygotuj się do rozmrażania w celu transfekcji.Odprzeżyć konstrukty reporterowe i mikro-RNA w temperaturze pokojowej. Po rozmrożeniu dokładnie wymieszać i rozcieńczyć mikro-RNA do stężenia roboczego 2 µM w wodzie wolnej od RNK. Plazmidy DNA są dostarczane w stężeniu 30 ng/µL i nie wymagają dalszego rozcieńczania. Przygotowując mieszaninę do transfekcji, należy pamiętać, że każda kombinacja DNA-RNA powinna zostać przetransfekowana w trzech powtórzeniach; objętość należy dostosować do liczby wykonywanych analiz.Przygotuj mieszaninę odczynnika do transfekcji, łącząc 9,85 µL medium bezsurowiczego i 0,15 µL Dharma effect DUO na jedną transfekcję. Pozostaw mieszaninę do inkubacji w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Następnie przygotuj mieszaninę DNA-RNA dla każdego testu, łącząc 3,33 µL konstruktu reporterowego go clone z odpowiednią ilością mimiku mikroRNA, aby uzyskać pożądane stężenie końcowe.Dopełnić objętość do 10 µL za pomocą medium bezsurowiczego. Następnie połączyć 10 µL mieszaniny odczynnika do transfekcji z 10 µL każdej mieszaniny D-N-A-R-N-A i dokładnie wymieszać. Końcowa objętość dla każdego testu wynosi 20 µL.Przykryć i inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Po inkubacji dodać 80 µL podgrzanej wcześniej pożywki bez antybiotyków. Po uzupełnieniu pożywki do całkowitej objętości 100 µL na każdą pojedynczą studzienkę testową, końcowe stężenia mimików wyniosą od 10 do 15 nM.W ostatnim kroku należy ostrożnie usunąć medium z każdej studni z wysianymi komórkami i zastąpić je 100 µL odpowiedniej końcowej mieszaniny do transfekcji. Płytkę należy umieścić z powrotem w inkubatorze i inkubować przez 24 do 48 godzin. Większość mieszanin przyniesie istotne wyniki w ciągu 24 godzin.48-godzinny okres inkubacji spowoduje większą zmienność sygnału między poszczególnymi studzienkami. W 3. dniu, 24 godziny po transfekcji, należy przeprowadzić analizy lucyferazy z użyciem odczynników do testu light switch luciferase; komórki można analizować natychmiast lub zamrozić w temperaturze -80 °C i przeanalizować później. Zastosowanie cyklu zamrażania i rozmrażania doprowadzi do zwiększonej lizy komórek i silniejszego sygnału reporterowego. Płytkę z transfektowanymi komórkami należy doprowadzić do temperatury pokojowej.Następnie przygotować roztwór do testu lucyferazy light switch zgodnie z instrukcją dołączoną do zestawu i przelać go do sterylnego zbiornika. Za pomocą pipety wielokanałowej dodać 100 µL roztworu testowego light switch bezpośrednio do każdej studzienki w białej płytce 96-dołkowej. Przykryć płytkę, aby chronić ją przed światłem, i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.Odczytaj każdą studzienkę przez dwie sekundy za pomocą luminometru do płytek. Wyciszenie aktywności reportera lucyferazy z 3' UTR przez let-7a zmierzono w komórkach HT-1080 poprzez kotranfekcję każdego konstruktu reporterowego z mimikiem let-7a lub kontrolą nietargetową w celu analizy wyników. Przyjmij sygnał z kontroli nietargetowej za 100% dla każdego konstruktu.Oblicz procentowy stopień wyciszenia (knockdown), dzieląc sygnał z konkretnego mimiku mikroRNA przez sygnał z kontroli nietarczowej. Dowolny mimik mikroRNA może wywoływać nieswoiste efekty wpływające na ogólną żywotność komórek lub sygnał badania, co wymaga korekty w celu wyeliminowania tych nieswoistych efektów. Porównaj wyciszenie zaobserwowane dla eksperymentalnego celu UTR z wyciszeniem zaobserwowanym dla kontroli housekeepingowej lub losowej, jak pokazano tutaj.PONC oraz arid3B są celami mikroRNA let-7a. Sygnały z reporterów 3' UTR genów PONC i arid3B pochodzenia ludzkiego są znacząco obniżone w obecności mimiku mikroRNA let-7a, podczas gdy sygnały dla sekwencji kontrolnych (housekeeping) oraz losowych 3' UTR nie wykazują takich zmian. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak przeprowadzić skuteczną kotransfekcję mimików mikroRNA oraz konstruktów reporterowych 3' UTR w żywych komórkach oraz jak odczytać sygnał na lumnometrze w celu pomiaru stopnia obniżenia sygnału.

identifying-targets-human-micrornas-with-lightswitch-luciferase-assay

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Identyfikacja celów ludzkich mikroRNA za pomocą systemu testowego Lucyferazy LightSwitch przy użyciu konstruktów reporterowych 3'UTR i naśladownictwa mikroRNA w komórkach adherentnych

Biblioteka Target ID jest opartą na plazmidach, genomową kolekcją klonowanego cDNA, służącą do identyfikacji celów miRNA. W niniejszym materiale prezentujemy sposób jej użycia i zastosowania.

Przesiew genomowy w celu identyfikacji celów miRNA z wykorzystaniem biblioteki MISSION Target ID

Zegary okołodobowe funkcjonują w obrębie poszczególnych komórek, tzn. są autonomiczne komórkowo. W niniejszej pracy opisujemy metody tworzenia autonomicznych komórkowo modeli zegara z wykorzystaniem nieinwazyjnej technologii bioluminescencji w czasie rzeczywistym opartej na lucyferazie. Komórki reporterowe stanowią praktyczne, funkcjonalne systemy modelowe do badania biologii okołodobowej.

Monitorowanie komórkowych autonomicznych rytmów okołodobowych ekspresji genów z wykorzystaniem reporterów bioluminescencyjnych lucyferazy

Osiągnięcie zrozumienia procesów komórkowych na poziomie systemowym jest celem współczesnej biologii komórki. Opisujemy tutaj strategie multipleksowania reporterów lucyferazy różnych punktów końcowych funkcji komórkowych w celu zbadania funkcji genów przy użyciu bibliotek RNAi w skali genomu.

Multipleksowana platforma przesiewowa oparta na lucyferazie do badania transdukcji sygnału związanego z rakiem w hodowanych komórkach

Tutaj opisujemy metodologię przeprowadzania ukierunkowanego badania przesiewowego "ubikwitom" siRNA w celu zidentyfikowania nowych regulatorów ubikwityny i podobnych do ubikwityny odpowiedzi komórkowej na niedotlenienie, w której pośredniczy HIF1A. Można to dostosować do dowolnej ścieżki biologicznej, gdzie dostępny jest solidny odczyt aktywności reporterowej.

Badania przesiewowe siRNA w celu identyfikacji ubikwityny i regulatorów systemów podobnych do ubikwityny szlaków biologicznych w hodowanych komórkach ssaków

Z zamiarem scharakteryzowania zmian w miRNA na zróżnicowanych ludzkich nerwowych komórkach macierzystych (hNSC) opisujemy różnicowanie hNSC w systemie trójwymiarowym, ocenę zmian w ekspresji mikroRNA za pomocą macierzy miRNA PCR oraz analizę obliczeniową do przewidywania celu miRNA i jego walidacji za pomocą testu podwójnej lucyferazy.

Różnicowanie ludzkiej linii nerwowych komórek macierzystych w hodowlach trójwymiarowych, analiza mikroRNA i przypuszczalnych genów docelowych

Tutaj opisujemy komórkowy test genu reporterowego jako cenne narzędzie do badania bibliotek chemicznych pod kątem związków modulujących mechanizmy kontroli potranskrypcyjnej wywieranej przez 3' UTR.

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe pod kątem chemicznych modulatorów genów regulowanych potranskrypcyjnie

Luminescencyjna identyfikacja elementów funkcjonalnych w nieulegających translacji regionach 3' (3'UTR) (3'LIFE) to technika identyfikacji funkcjonalnej regulacji w 3'UTR przez miRNA lub inne czynniki regulacyjne. Protokół ten wykorzystuje metodologię o wysokiej przepustowości, taką jak transfekcja 96-dołkowa i testy lucyferazy, do badania przesiewowego setek domniemanych interakcji pod kątem represji funkcjonalnej.

Wykrywanie celów miRNA w trybie wysokoprzepustowym za pomocą testu 3'LIFE

Ten raport opisuje szybką i niezawodną metodę walidacji celów mRNA komórkowych miRNA. Metoda wykorzystuje syntetyczne biotynylowane miRNA oparte na zablokowanych kwasach nukleinowych (LNA) do wychwytywania docelowego mRNA. Następnie kulki magnetyczne pokryte streptawidyną są wykorzystywane do ściągania docelowego mRNA w celu ilościowego oznaczania w reakcji łańcuchowej polimerazy qPCR.

Test pulldown na bazie biotyny do walidacji celów mRNA komórkowych miRNA

Ten protokół wykorzystuje opartą na sondzie reakcję łańcuchową polimerazy w czasie rzeczywistym (PCR), test sulforodaminy B (SRB), klonowanie 3' nietranslowanych regionów (3' UTR) oraz test lucyferazy w celu weryfikacji docelowych genów interesującego miRNA i zrozumienia funkcji miRNA.

Protokół in vitro do oceny poziomów, funkcji i powiązanych genów docelowych w komórkach nowotworowych

Aby zidentyfikować nowe regulatory czynników transkrypcyjnych, opracowaliśmy podejście do badania przesiewowego bibliotek RNAi lentiwirusowych lub retrowirusowych za pomocą testu reporterowego opartego na podwójnej lucyferazie. Takie podejście oferuje szybki i stosunkowo niedrogi sposób na przebadanie przesiewowe setek kandydatów w jednym eksperymencie.

Identyfikacja regulatorów czynników transkrypcyjnych za pomocą średnioprzepustowego badania przesiewowego bibliotek tablicowych i reportera opartego na podwójnej lucyferazie

Opracowaliśmy test reporterowy biogenezy mikroRNA do wykorzystania w komórkach in vitro z czterema plazmidami: jeden z miRNA intronicznym, jeden z celem, jeden do nadekspresji białka regulatorowego i jeden dla lucyferazy Renilla. MiRNA zostało przetworzone i mogło kontrolować ekspresję lucyferazy poprzez wiązanie się z sekwencją docelową.

Test reporterowy do analizy dojrzewania intronowego mikroRNA w komórkach ssaków

Poznaj metodę walidacji celów mikroRNA w ludzkich komórkach przy użyciu systemu LightSwitch z reporterami 3'UTR i naśladownictwem mikroRNA. Technika ta umożliwia badaczom funkcjonalną analizę interakcji mikroRNA z regionami 3'UTR w żywych komórkach.

Identyfikacja celów ludzkich mikroRNA za pomocą systemu testowego Lucyferazy LightSwitch przy użyciu konstruktów reporterowych 3UTR i naśladownictwa mikroRNA w komórkach adherentnych (Wideo) | JoVE Journal

Identyfikacja celów ludzkich mikroRNA za pomocą systemu testowego LightSwitch Luciferase z wykorzystaniem konstruktów reporterowych 3'UTR oraz mimiku mikroRNA w komórkach adherentnych

Przeglądaj więcej filmów