Identyfikacja celów ludzkich mikroRNA za pomocą systemu testowego LightSwitch Luciferase z wykorzystaniem konstruktów reporterowych 3'UTR oraz mimiku mikroRNA w komórkach adherentnych

Ogólnym celem niniejszej procedury jest kotransfekcja konstruktów reporterowych z mimikiem mikroRNA w celu walidacji przewidywanych celów mikroRNA w ludzkich obszarach 3' UTR. Jest to realizowane poprzez opracowanie projektu eksperymentalnego, obejmującego wybór linii komórkowej oraz dobór mimików mikroRNA wraz z eksperymentalnymi i kontrolnymi konstruktami reporterowymi GoClone 3' UTR. Następnie, około 24 godziny przed transfekcją, wysiewa się komórki adherentne. Kolejnym krokiem procedury jest kotransfekcja każdego eksperymentalnego lub kontrolnego konstruktu reporterowego GoClone 3' UTR z mimikiem mikroRNA lub kontrolą nietargetową, a następnie inkubacja przez 24 do 48 godzin. W ostatnim kroku odczynnik do testu lucyferazy LightSwitch dodaje się bezpośrednio do hodowli komórkowej, a sygnał luminescencyjny odczytuje się za pomocą luminometru do płytek.

Ostatecznie można uzyskać wyniki wskazujące, które ludzkie regiony 3' UTR są celami danego mikroRNA, poprzez pomiar wyciszenia sygnału lucyferazy z wykorzystaniem technologii testów reporterowych. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania badaczy mikroRNA, ponieważ dostarcza funkcjonalnego testu do walidacji przewidywanych interakcji mikroRNA z celami w regionach 3' UTR w żywych komórkach. Projektowanie eksperymentu rozpoczyna się od wyboru odpowiedniej, łatwo transfektowalnej linii komórek przylegających; testy oparte na mimikach mikroRNA działają najlepiej w liniach komórkowych o niskim poziomie endogennej ekspresji danego mikroRNA.

Następnie wybierz parę mimiku mikro-RNA i kontroli nietargetowej; uwzględnienie kontroli nietargetowej jest kluczowe, ponieważ kotranfekcja plazmidu i krótkiego oligonukleotydu RNA prowadzi do uzyskania słabszego sygnału niż w przypadku tranfekcji samego plazmidu. Następnie wybierz przedklonowane konstrukty reporterowe 3'UTR GoClone z kolekcji genomowej switchgears. Przejdź do katalogu online i kliknij przycisk wyszukiwania UTR.

Po wprowadzeniu listy nazw genów, symboli genów lub numerów dostępu, wynik wyszukiwania dostarczy informacji o wektorze i sekwencji wraz ze statusem stanu magazynowego. Teraz należy wybrać kontrolne konstrukty reporterowe. Wybierz konstrukty kontrolne z sekwencjami 3' UTR, które są mało prawdopodobne do bycia celem wybranego mikroRNA, takie jak geny gospodarza (housekeeping), sekwencje UTR lub fragmenty losowe, aby kontrolować niespecyficzne efekty nadekspresji mikroRNA na ogólny stan komórek lub sygnał testowy.

Warto również rozważyć zastosowanie syntetycznego reportera celu mikroRNA jako kontroli pozytywnej dla aktywności mimiku. Pierwszego dnia wysiej komórki przylegające o niskim numerze pasażu, tak aby po 24 godzinach przed transfekcją osiągnęły 80 do 100% konfluencji. Użycie wysoko konfluentnych komórek jest kluczowe dla uzyskania dobrych wyników. Wysiej komórki w białej 96-dołkowej płytce do hodowli tkanek w całkowitej objętości 100 µL.

Równolegle. W drugim dniu, 24 godziny po wysianiu komórek, sprawdź odpowiednią liczbę komórek w przezroczystej płytce pod kątem osiągnięcia konfluencji. Przygotuj się do rozmrażania w celu transfekcji.

Odprzeżyć konstrukty reporterowe i mikro-RNA w temperaturze pokojowej. Po rozmrożeniu dokładnie wymieszać i rozcieńczyć mikro-RNA do stężenia roboczego 2 µM w wodzie wolnej od RNK. Plazmidy DNA są dostarczane w stężeniu 30 ng/µL i nie wymagają dalszego rozcieńczania. Przygotowując mieszaninę do transfekcji, należy pamiętać, że każda kombinacja DNA-RNA powinna zostać przetransfekowana w trzech powtórzeniach; objętość należy dostosować do liczby wykonywanych analiz.

Przygotuj mieszaninę odczynnika do transfekcji, łącząc 9,85 µL medium bezsurowiczego i 0,15 µL Dharma effect DUO na jedną transfekcję. Pozostaw mieszaninę do inkubacji w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Następnie przygotuj mieszaninę DNA-RNA dla każdego testu, łącząc 3,33 µL konstruktu reporterowego go clone z odpowiednią ilością mimiku mikroRNA, aby uzyskać pożądane stężenie końcowe.

Dopełnić objętość do 10 µL za pomocą medium bezsurowiczego. Następnie połączyć 10 µL mieszaniny odczynnika do transfekcji z 10 µL każdej mieszaniny D-N-A-R-N-A i dokładnie wymieszać. Końcowa objętość dla każdego testu wynosi 20 µL.

Przykryć i inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Po inkubacji dodać 80 µL podgrzanej wcześniej pożywki bez antybiotyków. Po uzupełnieniu pożywki do całkowitej objętości 100 µL na każdą pojedynczą studzienkę testową, końcowe stężenia mimików wyniosą od 10 do 15 nM.

W ostatnim kroku należy ostrożnie usunąć medium z każdej studni z wysianymi komórkami i zastąpić je 100 µL odpowiedniej końcowej mieszaniny do transfekcji. Płytkę należy umieścić z powrotem w inkubatorze i inkubować przez 24 do 48 godzin. Większość mieszanin przyniesie istotne wyniki w ciągu 24 godzin.

48-godzinny okres inkubacji spowoduje większą zmienność sygnału między poszczególnymi studzienkami. W 3. dniu, 24 godziny po transfekcji, należy przeprowadzić analizy lucyferazy z użyciem odczynników do testu light switch luciferase; komórki można analizować natychmiast lub zamrozić w temperaturze -80 °C i przeanalizować później. Zastosowanie cyklu zamrażania i rozmrażania doprowadzi do zwiększonej lizy komórek i silniejszego sygnału reporterowego. Płytkę z transfektowanymi komórkami należy doprowadzić do temperatury pokojowej.

Następnie przygotować roztwór do testu lucyferazy light switch zgodnie z instrukcją dołączoną do zestawu i przelać go do sterylnego zbiornika. Za pomocą pipety wielokanałowej dodać 100 µL roztworu testowego light switch bezpośrednio do każdej studzienki w białej płytce 96-dołkowej. Przykryć płytkę, aby chronić ją przed światłem, i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.

Odczytaj każdą studzienkę przez dwie sekundy za pomocą luminometru do płytek. Wyciszenie aktywności reportera lucyferazy z 3' UTR przez let-7a zmierzono w komórkach HT-1080 poprzez kotranfekcję każdego konstruktu reporterowego z mimikiem let-7a lub kontrolą nietargetową w celu analizy wyników. Przyjmij sygnał z kontroli nietargetowej za 100% dla każdego konstruktu.

Oblicz procentowy stopień wyciszenia (knockdown), dzieląc sygnał z konkretnego mimiku mikroRNA przez sygnał z kontroli nietarczowej. Dowolny mimik mikroRNA może wywoływać nieswoiste efekty wpływające na ogólną żywotność komórek lub sygnał badania, co wymaga korekty w celu wyeliminowania tych nieswoistych efektów. Porównaj wyciszenie zaobserwowane dla eksperymentalnego celu UTR z wyciszeniem zaobserwowanym dla kontroli housekeepingowej lub losowej, jak pokazano tutaj.

PONC oraz arid3B są celami mikroRNA let-7a. Sygnały z reporterów 3' UTR genów PONC i arid3B pochodzenia ludzkiego są znacząco obniżone w obecności mimiku mikroRNA let-7a, podczas gdy sygnały dla sekwencji kontrolnych (housekeeping) oraz losowych 3' UTR nie wykazują takich zmian. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak przeprowadzić skuteczną kotransfekcję mimików mikroRNA oraz konstruktów reporterowych 3' UTR w żywych komórkach oraz jak odczytać sygnał na lumnometrze w celu pomiaru stopnia obniżenia sygnału.