Name: Ortogonalne oczyszczanie białek ułatwione przez mały bispecyficzny znacznik powinowactwa (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: Poznaj dwuetapową metodę oczyszczania białek rekombinowanych z wykorzystaniem bispecyficznego znacznika powinowactwa. Protokół ten umożliwia uzyskanie wysoce czystych produktów białkowych w prosty sposób.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Projekt ten był finansowany przez Fundację Knuta i Alice Wallenberga oraz Szwedzką Radę Badawczą.

1. Klonowanie genu docelowego/konstruktu fuzyjnego z tagiem ABDz1
<ol>
 <li>Przygotować fragmenty PCR genu ABDz1 z odpowiednimi miejscami restrykcyjnymi, umożliwiającymi ligację N-końcową genu docelowego w plazmidzie ekspresyjnym (plazmid zawierający ABDz1 jest dostępny bezpłatnie na podstawie umowy o przekazaniu materiału).</li>
 <li>Przetrawić oczyszczony wektor ekspresyjny oraz fragmenty PCR wybranymi enzymami restrykcyjnymi w odpowiednim buforze reakcyjnym. Produkty oczyścić przed ligacją.</li>
 <li>Zligować przetrawiony fragment ABDz1 do wektora ekspresyjnego zawierającego interesujący gen i transformować produkt ligacji do E. coli (w oryginalnej metodzie zastosowano szczep RR1ΔM158). Rozsiać transformowane komórki na płytki agarowe z dodatkiem odpowiednich antybiotyków w celu selekcji.</li>
 <li>Przeprowadzić screening PCR kilku kolonii i zweryfikować sekwencję otrzymanej kasety ekspresyjnej za pomocą sekwencjonowania DNA.</li>
 <li>Wyizolować plazmid z hodowli nocnej kolonii zweryfikowanej sekwencją i transformować do preferowanego szczepu ekspresyjnego (w oryginalnej metodzie zastosowano E. coli Rosetta (DE3) z plazmidem pRARE w celu zwiększenia produkcji białek kodowanych przez geny ludzkie).</li>
</ol>
2. Ekspresja białka
<ol>
 <li>Pojedynczą kolonię bakterii zaszczepić do 10 ml bulionu sojowego z trypsyną z dodatkiem 5 g/l ekstraktu drożdżowego i odpowiednich antybiotyków. Inkubować przy 150 rpm w temperaturze 37 °C przez noc.</li>
 <li>1 ml kultury nocnej zaszczepić do 100 ml świeżego medium i indukować ekspresję białka (pierwotnie 1 mM izopropyl-β-D-thiogalaktosyd w przypadku wykorzystania operonu lac), gdy komórki osiągną logarytmiczną fazę wzrostu.</li>
 <li>Inkubować przy 150 rpm w temperaturze 25 °C przez noc, a następnie zebrać komórki poprzez wirowanie.</li>
</ol>
3. Ortogonalna puryfikacja powinowactwa
<ol>
 <li>Resuspenduj osad w 25 ml buforu roboczego (25 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,05% (w/v) Tween 20, pH 8,0) i zniszcz komórki poprzez sonikację przy amplitudzie 60% i impulsach 1,0/1,0 przez 3 min. Odwiruj próbkę i przefiltruj supernatant zawierający białko docelowe (0,45 μm) przed dalszym oczyszczaniem.</li>
 <li>Równoważ kolumnę HSA Sepharose 1 ml lub kolumnę aktywowaną NHS, uprzednio sprzężoną z HSA zgodnie z zaleceniami dostawcy, przy użyciu 10 objętości kolumny (CV) buforu roboczego z przepływem 1 ml/min w odpowiednim systemie do oczyszczania białek. Nałóż lizat bakteryjny przy przepływie 0,5 ml/min, a następnie przywróć szybkość przepływu do 1 ml/min.</li>
 <li>Przemyj kolumnę 5 CV buforu roboczego, a następnie 5 CV buforu piorącego (5 mM NH4Ac, pH 5,5).</li>
 <li>Eluuj próbkę buforem elucyjnym (0,5 M HAc, pH 2,5) przy przepływie 1 ml/min i zbieraj frakcje; monitoruj absorbancję przy 280 nm, aby wybrać frakcje z piku elucyjnego do dalszego oczyszczania.</li>
 <li>Połącz frakcje o najwyższym stężeniu białka, rozcieńcz je dwukrotnie w buforze roboczym SuRe (20 mM fosforan, 150 mM NaCl, pH 7,2) i upewnij się, że pH jest bliskie neutralnemu. W razie potrzeby dodaj 1 M Tris-HCl pH 8, aby podnieść pH.</li>
 <li>Nałóż próbkę z przepływem 0,5 ml/min na kolumnę HiTrap MabSelect SuRe 1 ml, która została zrównoważona 10 CV buforu roboczego SuRe przy przepływie 1 ml/min. Po nałożeniu próbki przywróć szybkość przepływu do 1 ml/min.</li>
 <li>Przemyj kolumnę 5 CV buforu roboczego SuRe (krok 5) i eluuj białka za pomocą 0,2 M HAc, pH 2,7. W przypadku wrażliwych białek docelowych eluat można neutralizować bezpośrednio podczas zbierania poprzez dodanie Tris-HCl.</li>
</ol>
Jeśli kolejność etapów chromatograficznych zostanie odwrócona, eluat z kolumny MabSelect SuRe można rozcieńczyć w buforze prowadzącym (krok 3.1), a pH podnieść do około 8 poprzez dodanie 1 M Tris-HCl. Zazwyczaj w przypadku zastosowania matrycy SuRe w drugim etapie obserwuje się węższe piki.
4. Ocena czystości za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym z dodecylosiarczanem sodu (SDS-PAGE)
<ol>
 <li>Naniesione oczyszczone frakcje na redukującą elektroforezę SDS-PAGE a następnie, w razie potrzeby, przeanalizuj masę cząsteczkową oczyszczonego produktu za pomocą spektrometrii mas. Ważne jest całkowite zredukowanie próbki, ponieważ wolna cysteina w ABDz1 może powodować dimeryzację produktu w warunkach nieredukujących.</li>
</ol>
5. Reprezentatywne wyniki:
W celu dowiedzenia zasady działania, ortogonalną puryfikację powinowactwa wspomaganą znacznikiem ABDz1 oceniono dla trzech ludzkich białek docelowych reprezentujących różne klasy rozpuszczalności, masy cząsteczkowe i punkty izoelektryczne (Tabela 1). Gen ABDz1 połączono genetycznie z genami docelowymi, a konstrukty wyeksprymowano w E. coli; Rysunek 2 przedstawia schemat blokowy wszystkich kolejnych etapów metody. Po oczyszczaniu zgodnie z protokołem ortogonalnym, próbki pobrane w różnych punktach przeanalizowano za pomocą SDS-PAGE (Rysunek 3). Wyniki wyraźnie wykazują użyteczność podwójnego znacznika i dwóch wysoce specyficznych etapów oczyszczania. Chociaż, jak widać na żelach, po pierwszym etapie oczyszczania uzyskano zadowalającą czystość, kolejny etap pozwala na otrzymanie bardzo czystego produktu, odpowiedniego do zastosowań o wysokich wymaganiach.
<img alt="Schemat helisy białkowej, opisana sekwencja aminokwasowa, biologia strukturalna, analiza molekularna." src="/files/ftp_upload/3370/3370fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Projekt biblioteki kombinatorycznej wykorzystanej do selekcji bispecyficznego znacznika ABDz1. 
46-aminokwasowa domena wiążąca albuminę zwija się w stabilny pęczek trzech helis i zawiera miejsce wiązania dla ludzkiej albuminy surowiczej, zlokalizowane głównie w drugiej helisie. Poprzez genetyczną randomizację jedenastu aminokwasów wystawionych na powierzchnię, znajdujących się w pierwszej i trzeciej helisie, zaprojektowano nową powierzchnię wiążącą. Jedenaście pozycji jest zaznaczonych na rycinie i ponumerowanych zgodnie z Kraulis et al.9 . Po biopanningu przeciwko dimerowi domeny Z białka A gronkowca z wykorzystaniem biblioteki kombinatorycznej ekspresowanej na fagach, zidentyfikowano bispecyficzną cząsteczkę ABDz1.
<img alt="Schemat oczyszczania białka rekombinowanego; proces klonowania, ekspresji i oczyszczania; wynik SDS-PAGE." src="/files/ftp_upload/3370/3370fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Uproszczony schemat blokowy protokołu ortogonalnego oczyszczania powinowactwa. 
Fragment PCR zawierający sekwencję ABDz1 jest ligowany (na końcu N) z genem docelowym w odpowiednim wektorze ekspresyjnym. Produkt ligacji jest transformowany do E. coli w celu weryfikacji sekwencji i przygotowania plazmidu. Po transformacji do gospodarza ekspresyjnego, na podstawie wstępnej hodowli nocnej, przygotowywana jest wielkoskalowa hodowla do ekspresji białka rekombinowanego. Bakterie są zbierane przez wirowanie i lizowane za pomocą sonikacji w celu uzyskania lizatu bakteryjnego zawierającego białko docelowe. Po etapie filtracji w celu usunięcia pozostałych cząstek stałych, lizat poddawany jest ortogonalnemu oczyszczaniu powinowactwa w systemie do obsługi cieczy, przechodząc dwa kolejne etapy oczyszczania. Pik elucji z obu etapów oczyszczania są pobierane i oceniane za pomocą SDS-PAGE w celu określenia czystości oraz porównywane z lizatem przed oczyszczaniem.
<img alt="Wyniki elektroforezy żelowej SDS-PAGE oczyszczonych białek; analiza ścieżek, markery masy cząsteczkowej." src="/files/ftp_upload/3370/3370fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Analiza SDS-PAGE białek docelowych eksprymowanych i oczyszczonych w fuzji z ABDz1. 
Próbki pobrane z lizatu bakteryjnego trzech białek eksprymowanych w fuzji z ABDz1, reprezentujących różne właściwości, oraz samej etykiety ABDz1 zostały zebrane wraz z próbkami z odpowiadających im pików po oczyszczaniu na kolumnie HSA, a następnie na kolumnie MabSelect SuRe (A). Ścieżki 1-4 przedstawiają próbki z lizatów przed oczyszczaniem, ścieżki 5-8 z oczyszczania HSA (pierwszy etap), a ścieżki 9-12 z oczyszczania MabSelect SuRe (drugi etap). Próbki naniesiono w następującej kolejności: ABDz1-141377, ABDz1-HT875, ABDz1-HT2375 oraz ABDz1. Dodatkowo przeanalizowano próbki pobrane z tych samych lizatów, oczyszczone w odwrotnej kolejności na tych samych kolumnach (B). Ścieżki 1-3 przedstawiają próbki z lizatów przed oczyszczaniem, ścieżki 4-6 z oczyszczania MabSelect SuRe (pierwszy etap), a ścieżki 7-9 z oczyszczania HSA (drugi etap). Próbki naniesiono w tej samej kolejności co w (A), z pominięciem samej etykiety. Z tych wyników jasno wynika, że ta dwuetapowa metoda pozwala na uzyskanie wysokiego stopnia czystości białek, niezależnie od kolejności zastosowania poszczególnych etapów.
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Nazwab</td>
 <td>Białko docelowe Uniprotc</td>
 <td>Masa molekularna (kDa)</td>
 <td>Klasa rozpuszczalnościd</td>
 <td>Masa molekularna produktu fuzyjnego (kDa)</td>
 <td>Punkt izoelektryczny produktu fuzyjnego</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>141377</td>
 <td>B7Z315</td>
 <td>17.4</td>
 <td>4</td>
 <td>23.7</td>
 <td>8.5</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HT875</td>
 <td>P01040</td>
 <td>10.8</td>
 <td>3</td>
 <td>17.1</td>
 <td>4.9</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HT2375</td>
 <td>P00740</td>
 <td>8.9</td>
 <td>5</td>
 <td>15.2</td>
 <td>6.8</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
<ol class="lalpha">
 <li>Masa cząsteczkowa samej etykiety ABDz1 wynosi 6.3 kDa, punkt izoelektryczny 6.7.</li>
 <li>Białko docelowe stanowi fragment białka z bazy Uniprot.</li>
 <li><a href="http://www.uniprot.org">http://www.uniprot.org</a>.</li>
 <li>Klasa rozpuszczalności fragmentu białka z N-terminalnym His6ABP10.</li>
</ol>
Tabela 1. Białka docelowe i produkty fuzyjne z tagiem ABDz1a oceniane w badaniu dowodowym.
Do ekspresji i oczyszczania metodą ortogonalnego powinowactwa wybrano trzy unikalne białka ludzkie o różnej masie cząsteczkowej, rozpuszczalności i punkcie izoelektrycznym.

<ol><li>Waugh, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+the+most+of+affinity+tags%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Making the most of affinity tags.</a> Trends Biotechnol. 23, 316-320 (2005).</li>
<li>Hedhammar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+engineering+strategies+for+selective+protein+purification%5BTitle%5D)+AND+%22CET%22%5BJournal%5D)">Protein engineering strategies for selective protein purification.</a> CET. 28, 1315-1325 (2005).</li>
<li>Porath, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metal+chelate+affinity+chromatography%2C+a+new+approach+to+protein+fractionation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation.</a> Nature. 258, 206-213 (1975).</li>
<li>Linhult, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutational+analysis+of+the+interaction+between+albumin-binding+domain+from+streptococcal+protein+G+and+human+serum+albumin%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Mutational analysis of the interaction between albumin-binding domain from streptococcal protein G and human serum albumin.</a> Protein Sci. 11, 206-213 (2002).</li>
<li>Nilsson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synthetic+IgG-binding+domain+based+on+staphylococcal+protein%5BTitle%5D)+AND+%22A.+Protein+Eng%22%5BJournal%5D)">A synthetic IgG-binding domain based on staphylococcal protein.</a> A. Protein Eng. 1, 107-113 (1987).</li>
<li>Alm, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small+bispecific+protein+selected+for+orthogonal+affinity+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+J%22%5BJournal%5D)">A small bispecific protein selected for orthogonal affinity purification.</a> Biotechnol. J. 5, 605-617 (2010).</li>
<li>Nilsson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+affinity+domains+for+the+detection%2C+purification+and+immobilization+of+recombinant+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Recognit%22%5BJournal%5D)">Multiple affinity domains for the detection, purification and immobilization of recombinant proteins.</a> J. Mol. Recognit. 9, 585-594 (1996).</li>
<li>Rüther, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pUR+250+allows+rapid+chemical+sequencing+of+both+DNA+strands+of+its+inserts%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">pUR 250 allows rapid chemical sequencing of both DNA strands of its inserts.</a> Nucleic Acids Res. 10, 5765-5772 (1982).</li>
<li>Kraulis, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+serum+albumin-binding+domain+of+streptococcal+protein+G+is+a+three-helical+bundle%3A+a+heteronuclear+NMR+study%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">The serum albumin-binding domain of streptococcal protein G is a three-helical bundle: a heteronuclear NMR study.</a> FEBS Lett. 378, 190-194 (1996).</li>
<li>Hedhammar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+flow+cytometry-based+method+for+analysis+of+expression+levels+in+E+coli+giving+information+about+precipitated+and+soluble+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Novel flow cytometry-based method for analysis of expression levels in E coli giving information about precipitated and soluble protein.</a> J. Biotechnol. 119, 133-146 (2005).</li>
<li>Carter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+proteolysis+of+fusion+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Sympos.+Ser%22%5BJournal%5D)">Site-specific proteolysis of fusion proteins.</a> ACS Sympos. Ser. 427, 181-193 (1990).</li>
<li>Hedhammar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negatively+charged+purification+tags+for+selective+anion-exchange+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22PEDS%22%5BJournal%5D)">Negatively charged purification tags for selective anion-exchange recovery.</a> PEDS. 17, 779-786 (2004).</li>
<li>Gräslund, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Charge+engineering+of+a+protein+domain+to+allow+efficient+ion-exchange+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Eng%22%5BJournal%5D)">Charge engineering of a protein domain to allow efficient ion-exchange recovery.</a> Protein Eng. 13, 703-709 (2000).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Przedstawiony tutaj protokół ortogonalnego oczyszczania powinowactwa umożliwia efektywne oczyszczanie szerokiego zakresu białek docelowych. Poprzez połączenie wrodzonego miejsca wiązania domeny wiążącej albuminy z nową powierzchnią wiążącą opracowano niewielki bispecyficzny znacznik białkowy. Wykorzystanie tego znacznika jest bardzo proste, ponieważ można go po prostu sklonować i wyexprymować w fuzji z dowolnym białkiem zainteresowania w dowolnym preferowanym wektorze ekspresyjnym. Do dwuetapowego oczyszczania białek można wykorzystać standardowy sprzęt dostępny w większości laboratoriów. Ponieważ funkcja znacznika ABDz1 zależy od prawidłowego fałdowania domeny w celu efektywnego wyeksponowania obu powierzchni wiążących, metoda ta ogranicza się do białek eksprymowanych w formie rozpuszczalnej i nie nadaje się do oczyszczania w warunkach denaturujących. Należy również unikać środków redukujących, ponieważ zakłócają one wiązanie ABDz1 z domeną Z na matrycy MabSelect SuRe.
Ortogonalna oczyszczanie powinowactwem stanowi przydatną alternatywę dla tradycyjnych metod w celu zaspokojenia zapotrzebowania na wysoką czystość białek w wielu wymagających zastosowaniach. Jednocześnie metoda ta eliminuje konieczność stosowania tagowania kombinatorycznego, gdy kolejne strategie oczyszczania są używane sekwencyjnie. W zastosowaniach wymagających natywnego białka docelowego można wprowadzić miejsce cięcia proteazy, aby umożliwić enzymatyczne usunięcie tagu ABDz111. Ponadto tag ABDz1 jest pierwszą opisaną do tej pory bispecyficzną, małą i pofałdowaną domeną białkową. Jest on wyjątkowy, ponieważ zapewnia strategię oczyszczania opartą na dwóch specyficznych oddziaływaniach powinowactwa do celu. W przyszłości interesujące byłoby rozwinięcie tej koncepcji poprzez opracowanie nowych tagów bispecyficznych z nowymi powierzchniami wiążącymi, które byłyby kompatybilne z łatwo dostępnymi i niedrogimi żywicami chromatograficznymi. Na przykład poprzez zastąpienie aminokwasów zaangażowanych w wiązanie z albuminą resztami zasadowymi można uzyskać tag kompatybilny z chromatografią wymiany jonowej. Podobna koncepcja okazała się skuteczna w przypadku inżynierii ładunku domeny Z w celu wygenerowania tagów znanych jako Zacid12 oraz Zbasic13, które są odpowiednio kompatybilne z wymianą anionową i kationową.

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;*E. coli*&lt;/em&gt; RR1&amp;#916;M15</td><td>American Type Culture Collection</td><td>35102</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;*E. coli*&lt;/em&gt; Rosetta (DE3)</td><td>Novagen, EMD Millipore</td><td>70954</td><td></td></tr><tr><td>Bulion sojowo-kazeinowy</td><td>Difco Laboratories</td><td>211822</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt z drożdży</td><td>Difco Laboratories</td><td>212720</td><td></td></tr><tr><td>Sonikator do komórek Vibra cell</td><td>Sonics and Materials, Inc.</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>HSA Sepharose</td><td>Pharmacia Corporation (Pfizer)</td><td>Poprzedni produkt</td><td></td></tr><tr><td>HiTrap MabSelect SuRe</td><td>GE Healthcare</td><td>11-0034-93</td><td></td></tr><tr><td>kolumna HiTrap NHS-activated HP</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0716-01</td><td></td></tr></tbody></table>

ortogonalne oczyszczanie białek wspomagane przez mały bispecyficzny znacznik powinowactwa

Orthogonal Protein Purification Facilitated by a Small Bispecific Affinity Tag

Ze względu na wysokie koszty związane z oczyszczaniem białek rekombinowanych, protokoły muszą zostać zracjonalizowane. W przypadku działań wysokoprzepustowych istnieje zapotrzebowanie na ogólne metody, które nie wymagają optymalizacji specyficznej dla konkretnego białka docelowego1. Aby to osiągnąć, powszechnie stosuje się znaczniki oczyszczające, które można genetycznie połączyć z genem zainteresowania2. Najczęściej wykorzystywanym uchwytem powinowactwa jest znacznik heksa-histydynowy, który nadaje się do oczyszczania zarówno w warunkach natywnych, jak i denaturujących3. Obciążenie metaboliczne związane z produkcją tego znacznika jest niskie, jednak nie zapewnia ono tak wysokiej specyficzności, jak konkurencyjne strategie oparte na chromatografii powinowactwa1,2.
Opracowano bispecyficzny znacznik oczyszczający z dwoma różnymi miejscami wiązania w obrębie niewielkiej domeny białkowej składającej się z 46 aminokwasów. Domena wiążąca albuminy pochodzi z białka G paciorkowców i wykazuje silne naturalne powinowactwo do ludzkiej albuminy surowiczej (HSA). Jadenastu aminokwasów wyeksponowanych na powierzchni, które nie uczestniczą w wiązaniu albumin4, poddano randomizacji genetycznej w celu stworzenia biblioteki kombinatorycznej. Biblioteka białek z nową, losowo ułożoną powierzchnią wiążącą (Rysunek 1) została wyekspresowana na cząsteczkach fagów, aby ułatwić selekcję wiązaczy za pomocą technologii phage display. Poprzez kilka rund biopanningu przeciwko dimerycznej domenie Z pochodzącej z białka A gronkowców5, zidentyfikowano małą, bispecyficzną cząsteczkę wykazującą powinowactwo zarówno do HSA, jak i do nowego celu6.
Nowa domena białkowa, określona jako ABDz1, została oceniona jako znacznik oczyszczający dla wybranego zestawu białek docelowych o różnej masie cząsteczkowej, rozpuszczalności i punkcie izoelektrycznym. Trzy białka docelowe wyeksprymowano w Escherishia coli z nowym znacznikiem połączonym z ich końcami N-końcowymi, a następnie oczyszczono metodą powinowactwa. Wstępne oczyszczanie na kolumnie z unieruchomionym HSA lub domeną Z doprowadziło do uzyskania względnie czystych produktów. Dwustopniowe oczyszczanie powinowactwa z zastosowaniem znacznika bispecyficznego skutkowało znaczną poprawą czystości białek. Nośniki chromatograficzne z unieruchomioną domeną Z, na przykład MabSelect SuRe, są powszechnie dostępne do oczyszczania przeciwciał, a HSA można łatwo sprzęgać chemicznie z nośnikami w celu stworzenia drugiej matrycy.
Metoda ta jest szczególnie korzystna w przypadku wysokich wymagań dotyczących czystości odzyskanego białka docelowego. Bifunkcyjność znacznika pozwala na zastosowanie dwóch różnych etapów chromatograficznych, podczas gdy obciążenie metaboliczne gospodarza ekspresyjnego jest ograniczone ze względu na niewielki rozmiar znacznika. Stanowi ona konkurencyjną alternatywę dla tzw. znakowania kombinatoryjnego, w którym stosuje się kombinację wielu znaczników1,7.

Opracowano i szczegółowo opisano nowatorski i wysoce wydajny dwuetapowy protokół chromatografii powinowactwa. Metoda ta opiera się na niewielkim znaczniku oczyszczającym o dwóch wrodzonych powinowactwach i jest możliwa do zastosowania w odniesieniu do szerokiego zakresu białek docelowych o różnych właściwościach.

Ortogonalne oczyszczanie białek wspomagane przez mały bispecyficzny znacznik powinowactwa

Ze względu na wysokie koszty związane z oczyszczaniem białek rekombinowanych protokoły te wymagają racjonalizacji. W przypadku działań o wysokiej przepustowości istnieje...

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest otrzymanie bardzo czystych białek rekombinowanych za pomocą dwuetapowej procedury oczyszczania powinowactwem. Aby to osiągnąć, bispecyficzny znacznik oczyszczający oparty na domenie wiążącej albuminę jest klonowany do wektora ekspresyjnego zawierającego gen zainteresowania, po czym następuje ekspresja białka fuzyjnego w e coli. W drugim kroku lizat bakteryjny zawierający białko docelowe poddawany jest oczyszczaniu na kolumnie chromatograficznej z unieruchomioną albuminą surowicy ludzkiej lub HSA.Następnie przeprowadzono dodatkową puryfikację na kolumnie MAB select superior resistance lub sure zawierającej unieruchomioną domenę Z pochodzącą z białka A gronkowca. Pozwala to na uzyskanie produktu o wysokiej czystości, odpowiedniego do wymagających zastosowań. Następnie oceniono czystość za pomocą elektroforezy SDS-PAGE, a w razie potrzeby za pomocą spektrometrii mas, aby upewnić się, że białko docelowe zostało pomyślnie oczyszczone do homogenności. Wyniki wykazują efektywną puryfikację po dwóch kolejnych etapach w porównaniu z pojedynczym etapem z wykorzystaniem nowej bispecyficznej znacznika puryfikacyjnego zastosowanego w tym protokole. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak jednokrokowa puryfikacja powinowactwa, jest możliwość uzyskania czystego białka za pomocą prostego protokołu z wykorzystaniem tylko jednego uchwytu powinowactwa, niezależnie od właściwości białka docelowego.Metodę tę można zastosować do białek o bardzo zróżnicowanej charakterystyce. Ponadto, ze względu na niewielki rozmiar znacznika, jest on łatwo produkowany przez gospodarza bakteryjnego. Zazwyczaj osoby po raz pierwszy wykonujące tę procedurę oczyszczania uznają ją za bardzo prostą i przejrzystą.Kluczowym krokiem jest dostosowanie pH próbki przed nałożeniem jej na drugą kolumnę. Mały znacznik oczyszczający o dwóch wrodzonych powinowactwach opracowano poprzez włączenie dodatkowego miejsca wiązania do istniejącej domeny wiążącej albuminy pochodzącej z białka G paciorkowców. Domena wiążąca albuminę składająca się z 46 aminokwasów zwija się w stabilny wiązek trzech helis i zawiera miejsce wiązania dla ludzkiej albuminy surowiczej, zlokalizowane głównie na drugiej helisie. Poprzez genetyczną randomizację 11 aminokwasów eksponowanych na powierzchni, zlokalizowanych w pierwszej i trzeciej helisie, zaprojektowano nowe powierzchnie wiążące. Kilka rund biopanningu przeciwko domenie Z pochodzącej z białka A gronkowców, z wykorzystaniem biblioteki kombinatorycznej ekspresjonowanej na fagach, doprowadziło do uzyskania cząsteczki bispecyficznej nazwanej A BDZ 1, wykazującej powinowactwo zarówno do HSA, jak i do domeny Z. Aby przygotować plazmid ekspresyjny dla bispecyficznego znacznika fuzyjnego, należy przygotować fragmenty PCR genu A BDZ 1 flankowane odpowiednimi miejscami restrykcyjnymi dla ligacji i terminalnie do genu docelowego w plazmidzie ekspresyjnym. Należy trawić fragmenty PCR A BDZ 1 oraz oczyszczony wektor ekspresyjny zawierający gen zainteresowania za pomocą wybranych enzymów restrykcyjnych w odpowiednim buforze reakcyjnym, a następnie oczyścić produkty przed ligacją.Następnie liguj fragment A BDZ po restrykcji do wektora ekspresyjnego zawierającego interesujący gen i przeprowadź transformację produktu ligacji do szczepu e coli. Wysiej transformowane komórki na płytki agarowe uzupełnione o odpowiednie antybiotyki do selekcji. Przeprowadź screening PCR kilku kolonii i zweryfikuj sekwencję otrzymanej kasety ekspresyjnej za pomocą sekwencjonowania DNA.Na koniec przygotuj plazmid z nocnej hodowli zweryfikowanej sekwencyjnie kolonii i przekształć go do preferowanego szczepu ekspresyjnego w celu ekspresji białka docelowego z nowym tagiem przyłączonym do jego końca. Najpierw zaszczep pojedynczą kolonię bakteryjną do 10 mililitrów bulionu sojowo-tryptonowego uzupełnionego o pięć gramów na litr ekstraktu drożdżowego i odpowiednie antybiotyki, a następnie inkubuj w 150 RPM i 37 stopniach Celsjusza przez noc. Następnego dnia zaszczep jeden mililitr nocnej hodowli do 100 mililitrów świeżej pożywki i zindukuj ekspresję białka.Gdy komórki osiągną logarytmiczną fazę wzrostu. Po indukcji białka inkubować komórki przy 150 RPM i 25 °C przez noc, a następnego dnia zebrać komórki poprzez wirowanie. Ortogonalne oczyszczanie powinowactwem białka fuzyjnego A BDZ 1 przeprowadza się poprzez wstępne oczyszczanie na kolumnie z unieruchomionym HSA lub zoma. Następnie wykonuje się kolejny etap oczyszczania, wykorzystując drugie powinowactwo znacznika bispecyficznego.Nośniki chromatograficzne z unieruchomioną domeną Z, takie jak MA select sure, są łatwo dostępne do oczyszczania przeciwciał. Z kolei HSA może zostać chemicznie sprzężone z nośnikiem, aby zapewnić drugą macierz do przeprowadzenia ortogonalnego oczyszczania powinowactwa. Resuspenduj osad w 25 mililitrach buforu doprowadzającego. Następnie zniszcz komórki poprzez sonikację przy amplitudzie 60% w impulsach jednosekundowych, po których następowała jednosekundowa przerwa, przez łącznie trzy minuty.Po odwirowaniu próbki przefiltruj supernatant zawierający docelowe białko przez filtr o wielkości oczek 0,45 mikrona przed dalszą puryfikacją. Następnie zrównoważ objętość kolumny HSA spheros o pojemności 1 ml lub kolumny aktywowanej NHS sprzężonej z HSA, przepuszczając przez nią 10 objętości kolumny buforu elucyjnego z przepływem 1 ml na minutę w odpowiednim systemie do puryfikacji białek. Po zrównoważeniu nałóż lizat bakteryjny z przepływem 0,5 ml na minutę, przywróć szybkość przepływu do 1 ml na minutę i przemyj kolumnę pięciokrotnie objętością kolumny buforu elucyjnego, a następnie pięciokrotnie objętością kolumny buforu płuczącego.Eluuj próbkę buforem do elucji z prędkością 1 ml/min i zbierz frakcje. Monitoruj absorbancję przy 280 nm, aby wybrać frakcje z eluowanego piku. W celu dalszej puryfikacji połącz frakcje o najwyższym stężeniu białka, a następnie rozcieńcz je dwukrotnie.Należy przygotować bufor do elektroforezy i upewnić się, że jego pH jest bliskie neutralnemu. Krok ten jest krytyczny dla wiązania białek z domeną Z. W razie potrzeby dodać 1 M Tris-HCl o pH 8, aby zwiększyć wartość pH.Następnie nałóż próbkę z szybkością 0,5 ml/min na kolumnę wysokoprzepływową SureTrap o objętości 1 ml, która została uprzednio równoważona buforem Sure Running Buffer. Po zresetowaniu szybkości przepływu do 1 ml/min przemyj kolumnę pięciokrotną objętością kolumny buforu Sure Running Buffer. Następnie eluuj białka za pomocą 0,2 M kwasu octowego o pH 2,7 w przypadku białek docelowych wrażliwych.EIT można neutralizować bezpośrednio po pobraniu poprzez dodanie T tris. Do oceny czystości białka można wykorzystać żel H-C-L-S-D-S. Ważne jest całkowite zredukowanie próbki, ponieważ wolna cysteina w A BDZ one może powodować dimeryzację produktu w warunkach nieredukujących.W ramach ostatniego etapu analizie spektrometrią mas poddano masę cząsteczkową oczyszczonego produktu po przeprowadzeniu oczyszczania zgodnie z protokołem ortogonalnym na kolumnie HSA, a następnie na kolumnie MA select sure. Próbki pobrane w kilku punktach oczyszczania analizowano za pomocą elektroforezy SDS-PAGE. Próbki obejmowały sam znacznik A BDZ one, a także trzy różne ludzkie białka docelowe połączone z AB DZ one, reprezentujące różne klasy rozpuszczalności, masy cząsteczkowe oraz punkty izoelektryczne.Ścieżki od pierwszej do czwartej przedstawiają lizaty białek przed oczyszczaniem dla trzech różnych białek fuzyjnych AB DZ one oraz samego znacznika AB DZ one. Ścieżki od piątej do ósmej pokazują wyniki etapu oczyszczania białek przy użyciu HSA. Na koniec, ścieżki od dziewiątej do 12. są wynikiem końcowego etapu oczyszczania za pomocą mAbs select Sure.Dodatkowo przeanalizowano próbki pobrane z tych samych lizatów, które zostały oczyszczone w odwrotnej kolejności na tych samych kolumnach. Ścieżki od pierwszej do trzeciej przedstawiają lizaty przed oczyszczaniem, natomiast ścieżki od czwartej do szóstej pobrano po pierwszym etapie oczyszczania na kolumnie MAB Select Sure. Produkty o wysokiej czystości na ścieżkach od siódmej do dziewiątej są wynikiem końcowego oczyszczania HSA.Wyniki wyraźnie wykazują użyteczność podwójnej znaczki oraz dwóch wysoce specyficznych etapów oczyszczania. Mimo że po pierwszym etapie oczyszczania uzyskano zadowalającą czystość, co widać na żelach, kolejny krok pozwala otrzymać produkt o bardzo wysokiej czystości, odpowiedni do najbardziej wymagających zastosowań. Po opanowaniu techniki, kluczowy dla tej metody etap oczyszczania może zostać wykonany przez jedną osobę w ciągu kilku godzin, co pozwala uzyskać wysokiej czystości białko rekombinowane nadające się do wielu różnych zastosowań.Na przykład, stosując tę procedurę, oczyszczone biomolekuły można wykorzystać w innych zastosowaniach, takich jak badania oddziaływań w celu odpowiedzi na pytania dotyczące np. siły wiązania kompleksu. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać pełną wiedzę na temat tego, jak uzyskać rzeczywistym czysty produkt białkowy, wykorzystując ten podwójny znacznik powinowactwa.

orthogonal-protein-purification-facilitated-small-bispecific-affinity

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Oczyszczanie białek oparte na ortogonalności ułatwione przez mały bispecyjny tag afinicyjny

Tandemowa puryfikacja powinowactwa (TAP) jest skuteczną metodą identyfikacji białek wiążących. W ramach dowodu koncepcji metodologię tę zastosowano do dobrze scharakteryzowanego czynnika inicjacji translacji eIF4E w celu koprecypitacji czynników komórkowych gospodarza zaangażowanych w inicjację translacji. Metoda ta może być łatwo zaadaptowana do dowolnego białka komórkowego lub wirusowego.

Identyfikacja partnerów oddziaływań białkowych z wykorzystaniem tandemowej oczyszczania powinowactwa

Oczyszczanie powinowactwa oznaczonych białek w połączeniu ze spektrometrią mas (APMS) to potężna metoda systematycznego mapowania sieci interakcji białek i badania mechanistycznych podstaw procesów biologicznych. W tym miejscu opisujemy zoptymalizowaną procedurę APMS opartą na powinowactwie do peptydów sekwencyjnych (SPA) opracowaną dla bakterii Escherichia coli, która może być stosowana do izolowania i charakteryzowania stabilnych kompleksów wielobiałkowych do niemal jednorodności, nawet...

Identyfikacja kompleksów białkowych w Escherichia coli za pomocą sekwencyjnego oczyszczania powinowactwa peptydów w połączeniu z tandemową spektrometrią mas

Opisujemy metodę oczyszczania białek rekombinowanych z użyciem znaczników powinowactwa przy wykorzystaniu robotyki do obsługi cieczy. Metoda ta znajduje ogólne zastosowanie w małoscale’owym oczyszczaniu rozpuszczalnych białek z znacznikiem His w formacie wysokoprzepustowym.

Wysokoprzepustowe oczyszczanie rekombinowanych białek z markerami powinowactwa

Źródło: Becker, B. i inni. Prosty test reporterowy oparty na fluorescencji do identyfikacji składników komórkowych niezbędnych do transportu łańcucha toksyny rycyny A (RTA) w drożdżach. J. Vis. Exp. (2017).Ten film demonstruje oczyszczanie rekombinowanego białka oznaczonego polisystydyną za pomocą chromatografii powinowactwa na bazie niklu. Określa kluczowe kroki, w tym lizę bakteryjną przez sonikację, klarowanie i filtrację lizatu oraz selektywne wiązanie i eluację docelowego białka za pomocą...

 Technika chromatografii powinowactwa do oczyszczania rekombinowanego białka bakteryjnego

W tym filmie demonstrujemy technikę chromatografii powinowactwa niklu do oczyszczania enzymów pirofosfokinazy znakowanych histydyną z bakterii Clostridium difficile.

Oczyszczanie białek oparte na chromatografii powinowactwa niklu: technika oczyszczania rekombinowanych białek znakowanych polihistydyną z lizatu komórek bakteryjnych

W obecnym protokole demonstrujemy wysoce efektywną i opłacalną metodę oczyszczania białek na małą skalę, która pozwala na oczyszczanie rekombinowanych białek poprzez unikalne połączenie rozszczepialnego znacznika GST i małego znacznika His.

Oczyszczanie GST-His : Dwuetapowy protokół oczyszczania powinowactwa dający oczyszczone białka o pełnej długości

Metoda Tandem Affinity Purification (TAP) była szeroko stosowana do izolowania natywnych kompleksów z ekstraktu komórkowego, głównie eukariotycznego, do proteomiki. W tym miejscu przedstawiamy protokół metody TAP zoptymalizowany pod kątem oczyszczania kompleksów natywnych do badań strukturalnych.

Oczyszczanie kompleksów natywnych do badań strukturalnych za pomocą metody tandemowego znacznika powinowactwa

Tutaj prezentujemy protokoły oczyszczania kompleksów białkowych i ich separacji za pomocą niebieskiej natywnej STRONY, a następnie profilowania korelacji białek za pomocą ilościowej spektrometrii mas bez etykiet. Ta metoda jest przydatna do przekształcania interaktomów w odrębne kompleksy białkowe.

Rozwiązywanie kompleksów białkowych oczyszczonych z powinowactwa za pomocą Blue Native PAGE i profilowania korelacji białek

W tej procedurze, ligand epitopowy oparty na DsRed jest unieruchamiany w celu wytworzenia wysoce selektywnej żywicy o powinowactwie do wychwytywania przeciwciał monoklonalnych z surowych ekstraktów roślinnych lub supernatantów do hodowli komórkowych, jako alternatywa dla białka A.

Aktywowana usieciowana agaroza do szybkiego rozwoju żywic chromatograficznych o powinowactwie - wychwytywanie przeciwciał jako studium przypadku

Ten artykuł przedstawia procedurę oczyszczania powinowactwa ludzkiego białka rekombinowanego, endonukleazy płatowej 1 (FEN1), które zostało oznaczone znacznikiem 6X-histydyny. Protokół polega na wykorzystaniu dwóch odrębnych unieruchomionych kolumn jonów metalu do oczyszczania znakowanego białka.

Oczyszczanie powinowactwa białka oznaczonego 6X-His-His-Tagged przy użyciu systemu szybkiej chromatografii cieczowej białek

Poznaj dwuetapową metodę oczyszczania białek rekombinowanych z wykorzystaniem bispecyficznego znacznika powinowactwa. Protokół ten umożliwia uzyskanie wysoce czystych produktów białkowych w prosty sposób.

Ortogonalne oczyszczanie białek wspomagane przez mały bispecyficzny znacznik powinowactwa

Przeglądaj więcej filmów