Ortogonalne oczyszczanie białek wspomagane przez mały bispecyficzny znacznik powinowactwa

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest otrzymanie bardzo czystych białek rekombinowanych za pomocą dwuetapowej procedury oczyszczania powinowactwem. Aby to osiągnąć, bispecyficzny znacznik oczyszczający oparty na domenie wiążącej albuminę jest klonowany do wektora ekspresyjnego zawierającego gen zainteresowania, po czym następuje ekspresja białka fuzyjnego w e coli. W drugim kroku lizat bakteryjny zawierający białko docelowe poddawany jest oczyszczaniu na kolumnie chromatograficznej z unieruchomioną albuminą surowicy ludzkiej lub HSA.

Następnie przeprowadzono dodatkową puryfikację na kolumnie MAB select superior resistance lub sure zawierającej unieruchomioną domenę Z pochodzącą z białka A gronkowca. Pozwala to na uzyskanie produktu o wysokiej czystości, odpowiedniego do wymagających zastosowań. Następnie oceniono czystość za pomocą elektroforezy SDS-PAGE, a w razie potrzeby za pomocą spektrometrii mas, aby upewnić się, że białko docelowe zostało pomyślnie oczyszczone do homogenności. Wyniki wykazują efektywną puryfikację po dwóch kolejnych etapach w porównaniu z pojedynczym etapem z wykorzystaniem nowej bispecyficznej znacznika puryfikacyjnego zastosowanego w tym protokole. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak jednokrokowa puryfikacja powinowactwa, jest możliwość uzyskania czystego białka za pomocą prostego protokołu z wykorzystaniem tylko jednego uchwytu powinowactwa, niezależnie od właściwości białka docelowego.

Metodę tę można zastosować do białek o bardzo zróżnicowanej charakterystyce. Ponadto, ze względu na niewielki rozmiar znacznika, jest on łatwo produkowany przez gospodarza bakteryjnego. Zazwyczaj osoby po raz pierwszy wykonujące tę procedurę oczyszczania uznają ją za bardzo prostą i przejrzystą.

Kluczowym krokiem jest dostosowanie pH próbki przed nałożeniem jej na drugą kolumnę. Mały znacznik oczyszczający o dwóch wrodzonych powinowactwach opracowano poprzez włączenie dodatkowego miejsca wiązania do istniejącej domeny wiążącej albuminy pochodzącej z białka G paciorkowców. Domena wiążąca albuminę składająca się z 46 aminokwasów zwija się w stabilny wiązek trzech helis i zawiera miejsce wiązania dla ludzkiej albuminy surowiczej, zlokalizowane głównie na drugiej helisie. Poprzez genetyczną randomizację 11 aminokwasów eksponowanych na powierzchni, zlokalizowanych w pierwszej i trzeciej helisie, zaprojektowano nowe powierzchnie wiążące. Kilka rund biopanningu przeciwko domenie Z pochodzącej z białka A gronkowców, z wykorzystaniem biblioteki kombinatorycznej ekspresjonowanej na fagach, doprowadziło do uzyskania cząsteczki bispecyficznej nazwanej A BDZ 1, wykazującej powinowactwo zarówno do HSA, jak i do domeny Z. Aby przygotować plazmid ekspresyjny dla bispecyficznego znacznika fuzyjnego, należy przygotować fragmenty PCR genu A BDZ 1 flankowane odpowiednimi miejscami restrykcyjnymi dla ligacji i terminalnie do genu docelowego w plazmidzie ekspresyjnym. Należy trawić fragmenty PCR A BDZ 1 oraz oczyszczony wektor ekspresyjny zawierający gen zainteresowania za pomocą wybranych enzymów restrykcyjnych w odpowiednim buforze reakcyjnym, a następnie oczyścić produkty przed ligacją.

Następnie liguj fragment A BDZ po restrykcji do wektora ekspresyjnego zawierającego interesujący gen i przeprowadź transformację produktu ligacji do szczepu e coli. Wysiej transformowane komórki na płytki agarowe uzupełnione o odpowiednie antybiotyki do selekcji. Przeprowadź screening PCR kilku kolonii i zweryfikuj sekwencję otrzymanej kasety ekspresyjnej za pomocą sekwencjonowania DNA.

Na koniec przygotuj plazmid z nocnej hodowli zweryfikowanej sekwencyjnie kolonii i przekształć go do preferowanego szczepu ekspresyjnego w celu ekspresji białka docelowego z nowym tagiem przyłączonym do jego końca. Najpierw zaszczep pojedynczą kolonię bakteryjną do 10 mililitrów bulionu sojowo-tryptonowego uzupełnionego o pięć gramów na litr ekstraktu drożdżowego i odpowiednie antybiotyki, a następnie inkubuj w 150 RPM i 37 stopniach Celsjusza przez noc. Następnego dnia zaszczep jeden mililitr nocnej hodowli do 100 mililitrów świeżej pożywki i zindukuj ekspresję białka.

Gdy komórki osiągną logarytmiczną fazę wzrostu. Po indukcji białka inkubować komórki przy 150 RPM i 25 °C przez noc, a następnego dnia zebrać komórki poprzez wirowanie. Ortogonalne oczyszczanie powinowactwem białka fuzyjnego A BDZ 1 przeprowadza się poprzez wstępne oczyszczanie na kolumnie z unieruchomionym HSA lub zoma. Następnie wykonuje się kolejny etap oczyszczania, wykorzystując drugie powinowactwo znacznika bispecyficznego.

Nośniki chromatograficzne z unieruchomioną domeną Z, takie jak MA select sure, są łatwo dostępne do oczyszczania przeciwciał. Z kolei HSA może zostać chemicznie sprzężone z nośnikiem, aby zapewnić drugą macierz do przeprowadzenia ortogonalnego oczyszczania powinowactwa. Resuspenduj osad w 25 mililitrach buforu doprowadzającego. Następnie zniszcz komórki poprzez sonikację przy amplitudzie 60% w impulsach jednosekundowych, po których następowała jednosekundowa przerwa, przez łącznie trzy minuty.

Po odwirowaniu próbki przefiltruj supernatant zawierający docelowe białko przez filtr o wielkości oczek 0,45 mikrona przed dalszą puryfikacją. Następnie zrównoważ objętość kolumny HSA spheros o pojemności 1 ml lub kolumny aktywowanej NHS sprzężonej z HSA, przepuszczając przez nią 10 objętości kolumny buforu elucyjnego z przepływem 1 ml na minutę w odpowiednim systemie do puryfikacji białek. Po zrównoważeniu nałóż lizat bakteryjny z przepływem 0,5 ml na minutę, przywróć szybkość przepływu do 1 ml na minutę i przemyj kolumnę pięciokrotnie objętością kolumny buforu elucyjnego, a następnie pięciokrotnie objętością kolumny buforu płuczącego.

Eluuj próbkę buforem do elucji z prędkością 1 ml/min i zbierz frakcje. Monitoruj absorbancję przy 280 nm, aby wybrać frakcje z eluowanego piku. W celu dalszej puryfikacji połącz frakcje o najwyższym stężeniu białka, a następnie rozcieńcz je dwukrotnie.

Należy przygotować bufor do elektroforezy i upewnić się, że jego pH jest bliskie neutralnemu. Krok ten jest krytyczny dla wiązania białek z domeną Z. W razie potrzeby dodać 1 M Tris-HCl o pH 8, aby zwiększyć wartość pH.

Następnie nałóż próbkę z szybkością 0,5 ml/min na kolumnę wysokoprzepływową SureTrap o objętości 1 ml, która została uprzednio równoważona buforem Sure Running Buffer. Po zresetowaniu szybkości przepływu do 1 ml/min przemyj kolumnę pięciokrotną objętością kolumny buforu Sure Running Buffer. Następnie eluuj białka za pomocą 0,2 M kwasu octowego o pH 2,7 w przypadku białek docelowych wrażliwych.

EIT można neutralizować bezpośrednio po pobraniu poprzez dodanie T tris. Do oceny czystości białka można wykorzystać żel H-C-L-S-D-S. Ważne jest całkowite zredukowanie próbki, ponieważ wolna cysteina w A BDZ one może powodować dimeryzację produktu w warunkach nieredukujących.

W ramach ostatniego etapu analizie spektrometrią mas poddano masę cząsteczkową oczyszczonego produktu po przeprowadzeniu oczyszczania zgodnie z protokołem ortogonalnym na kolumnie HSA, a następnie na kolumnie MA select sure. Próbki pobrane w kilku punktach oczyszczania analizowano za pomocą elektroforezy SDS-PAGE. Próbki obejmowały sam znacznik A BDZ one, a także trzy różne ludzkie białka docelowe połączone z AB DZ one, reprezentujące różne klasy rozpuszczalności, masy cząsteczkowe oraz punkty izoelektryczne.

Ścieżki od pierwszej do czwartej przedstawiają lizaty białek przed oczyszczaniem dla trzech różnych białek fuzyjnych AB DZ one oraz samego znacznika AB DZ one. Ścieżki od piątej do ósmej pokazują wyniki etapu oczyszczania białek przy użyciu HSA. Na koniec, ścieżki od dziewiątej do 12. są wynikiem końcowego etapu oczyszczania za pomocą mAbs select Sure.

Dodatkowo przeanalizowano próbki pobrane z tych samych lizatów, które zostały oczyszczone w odwrotnej kolejności na tych samych kolumnach. Ścieżki od pierwszej do trzeciej przedstawiają lizaty przed oczyszczaniem, natomiast ścieżki od czwartej do szóstej pobrano po pierwszym etapie oczyszczania na kolumnie MAB Select Sure. Produkty o wysokiej czystości na ścieżkach od siódmej do dziewiątej są wynikiem końcowego oczyszczania HSA.

Wyniki wyraźnie wykazują użyteczność podwójnej znaczki oraz dwóch wysoce specyficznych etapów oczyszczania. Mimo że po pierwszym etapie oczyszczania uzyskano zadowalającą czystość, co widać na żelach, kolejny krok pozwala otrzymać produkt o bardzo wysokiej czystości, odpowiedni do najbardziej wymagających zastosowań. Po opanowaniu techniki, kluczowy dla tej metody etap oczyszczania może zostać wykonany przez jedną osobę w ciągu kilku godzin, co pozwala uzyskać wysokiej czystości białko rekombinowane nadające się do wielu różnych zastosowań.

Na przykład, stosując tę procedurę, oczyszczone biomolekuły można wykorzystać w innych zastosowaniach, takich jak badania oddziaływań w celu odpowiedzi na pytania dotyczące np. siły wiązania kompleksu. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać pełną wiedzę na temat tego, jak uzyskać rzeczywistym czysty produkt białkowy, wykorzystując ten podwójny znacznik powinowactwa.