Name: Elektroporacja mezenchymy twarzoczaszki (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: Naucz się elektroporacji makrocząsteczek do mezenchymy twarzoczaszki w zarodkach Xenopus laevis. Ta metoda umożliwia precyzyjną kontrolę czasową i przestrzenną w badaniach rozwoju twarzoczaszki.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni Nancy Papalopulu i Boyanowi Bonevowi za pomoc w elektroporacji Xenopus. Dziękujemy również Marcowi Dionne za krytyczną lekturę, Jeremy'emu Greenowi i Johnowi Wallingfordowi za pomocne dyskusje oraz członkom laboratorium Liu za wsparcie. Praca ta była finansowana z grantów BBSRC (BB/E013872/1) oraz Wellcome Trust (081880/Z/06/Z) przyznanych KJL.

Część 1A. Sprzęt
Mikroskop: stereomikroskop prosty z obiektywem o małym powiększeniu
<ul>
 <li>Generator napięcia/impulsów: System do elektroporacji BTX ECM 830 Square Wave</li>
 <li>Wytwornica mikropipet: Wytwornica mikropipet P-87 (Sutter Instrument Company, CA)</li>
 <li>Manipulator: grubo nastawny lub łączony grubo i precyzyjnie, w zależności od preparacji</li>
 <li>Uchwyt do mikropipet: Fine Science Tools</li>
 <li>Elektroda: wykonana własnym sposobem</li>
 <li>Komora do elektroporacji: wykonana własnym sposobem</li>
</ul>
Elektrody w kształcie litery L:
<ol>
 <li>Odciąć 8 cm wysokiej czystości drutu wolframowego o średnicy 0,4 mm (Goodfellow) i przymocować w jego środkowej części strzykawkę o pojemności 1 ml za pomocą masy plastycznej (stosujemy Blu-Tack). Pozostawić 4 cm drutu wolframowego wystającego poza końcówkę strzykawki i zgiąć go w kształt litery L w odległości 1 cm od końca (Rys. 1A).</li>
 <li>Przyciąć końcówkę tak, aby odcinek końcowy miał długość 0,5 mm. Końcówka ta stanowi zakończenie elektrody.</li>
 <li>Nadmiar drutu wolframowego poprowadzić równolegle do strzykawki i wykorzystać go do podłączenia generatora impulsów elektrody.</li>
 <li>Powtórzyć proces w celu przygotowania pary elektrod.</li>
 <li>Podłączyć elektrody do generatora impulsów prostokątnych za pomocą kabli DC.</li>
</ol>
Komora do elektroporacji
<ol>
 <li>Wyłożyć dno szalki 90 mm warstwą nietoksycznej plasteliny o grubości ∼5 mm.</li>
 <li>Napełnić szalkę pożywką do elektroporacji.</li>
 <li>Za pomocą pęsety zegarmistrzowskiej nr 5 uformować wgłębienie w kształcie litery T (Rys. 2). Dłuższy odcinek wgłębienia powinien mieć wymiary ∼2 mm x 2 mm x 10 mm, a krótszy ∼2 mm x 2 mm x 5 mm. Szalkę do elektroporacji można umyć i użyć ponownie.</li>
</ol>
Część 1B. Odczynniki
DNA lub naładowane makromolekuły
<ul>
 <li>Mikropipety: kapilary z borokrzemianowego szkła o szerokości 1 mm i długości 4" (WPI, TW100-F)</li>
 <li>Podłoże hodowlane: Normal Amphibian Media (NAM)</li>
 <li>&gt;Zatrag 10 X: 1100 mM NaCl, 20 mM KCL, 10 mM Ca(NO3)2•4H2O, 1 mM EDTA.
 <ul>
 <li>Autoklawować i przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
 <li>NAM 1 X: Rozcieńczyć z zatragu 10x, buforować 0,1 mM NaHCo3 oraz 0,2 mM Na3PO4.</li>
 </ul>
 </li>
 <li>Xenopus laevis kijanki, stadium 28</li>
</ul>
Przygotowanie DNA:
<ol>
 <li>Przygotować plazmidy ekspresyjne zgodnie ze standardowymi protokołami.</li>
 <li>Resuspendować DNA do końcowego stężenia 1 μg/μl w nukleazowo wolnej H20.</li>
</ol>
* Pozytywne wyniki uzyskano przy użyciu wektorów zawierających silny promotor CMV, takich jak pCS2+ [16]. Do analizy linii komórkowych zazwyczaj włączamy DNA kodujące zielone białko fluorescencyjne (pCS2+GFP) w stężeniu końcowym 0,1 μg/μl. [Testowano również stężenia DNA w zakresie 0,1-3 μg/μl. Stwierdzono, że stężenia poniżej 0,8 μg/μl skutkują nieefektywnym znakowaniem komórek, natomiast stężenia DNA powyżej 2 μg/μl nie poprawiały wydajności elektroporacji.]
Przygotowanie oligonukleotydów morfolinowych:
(Uwaga: MO muszą być znakowane fluorescencyjnie (zmodyfikowane 3'-karboksyfluoresceiną) lub w inny sposób naładowane).
<ol>
 <li>Resuspender oligonukleotydy morpholino (MO) (Genetools, <a href="http://www.genetools.com" target="_blank">www.genetools.com</a>) do stężenia 2 mM w wodzie H20 wolnej od nukleaz.</li>
 <li>Podgrzać alikwot roztworu zapasowego w temperaturze 65°C przez 5 minut.</li>
 <li>Rozcieńczyć do stężenia końcowego 0,5 mM w wodzie wolnej od nukleaz.</li>
</ol>
* Przetestowano roztwory MO o stężeniu 0,1-1 mM. Roztwory MO o stężeniu 0,5 mM okazały się wystarczające do elektroporacji wielu komórek mezenchymalnych.
Mikropipety
<ol>
 <li>Przygotować mikropipety z kapilar z borokrzemianowego szkła (szerokość 1 mm, długość 4", WPI nr TW100-F). Użyć wyciągacza do igieł, aby przygotować mikropipety z obszarem zwężenia o długości 8-12 mm i cienką końcówką.</li>
 <li>Zgnieść końcówkę w odległości ok. 2 mm od wierzchołka za pomocą pęsety, aby uzyskać poszarpane przełamanie.</li>
</ol>
Podłoża
<ol>
 <li>Pożywka inkubacyjna: Przygotować świeżą pożywkę 3/4 Normal Amphibian Media (NAM) z roztworu stokowego 1x. Dodać 0,025 mg/ml gentamycyny.</li>
 <li>Pożywka do elektroporacji: jak powyżej, z dodatkiem 0,1% benzokainy (Sigma, 06950).</li>
</ol>
2. Elektroporacja
Przygotowanie mikropipety
<ol>
 <li>Napełnić mikropipetę ∼1 μl roztworu do iniekcji.</li>
 <li>Zabezpieczyć mikropipetę w mikromanipulatorze i podłączyć do mikroinjektora (Picospritzer II).</li>
 <li>Ustawić mikropipetę pod kątem 50° względem blatu stołu.</li>
 <li>Ustawić ciśnienie iniekcji na 20 PSI.</li>
 <li>Skalibrować mikropipetę, aby podawać 30 nl na impuls.</li>
</ol>
Przygotowanie kijanek
<ol>
 <li>Zanurzyć larwy Xenopus w stadium 28 w podłożu do elektroporacji na 5 minut w celu przeprowadzenia znieczulenia.</li>
 <li>Przenieść znieczulonego kijanka do komory elektroporacyjnej wypełnionej podłożem do elektroporacji. Umieścić embrion w długiej studzience tak, aby głowa spoczywała w złączu T stroną grzbietową do dołu, a stroną brzuszną do góry. Głowa powinna być lekko uniesiona w stosunku do ogona.</li>
 <li>Za pomocą pęsety delikatnie unieruchomić kijanka w studzience, otaczając go plasteliną. (Uwaga: Jeśli kijanek nie zostanie unieruchomiony, może drgnąć i dotknąć elektrody podczas elektroporacji. W takim przypadku należy odrzucić kijanka, ponieważ tkanki twarzy zostaną poważnie uszkodzone).</li>
</ol>
Elektroporacja
<ol>
 <li>Wprowadzić końcówkę mikropipety bezpośrednio za gruczoł cementowy, do mezenchymy twarzy.</li>
 <li>Wstrzyknąć 30 nl roztworu do mezenchymy.</li>
 <li>Wycofać mikropipetę.</li>
 <li>Szybko ustawić końcówki elektrod równolegle do głowy zarodka (Rys. 3).</li>
 <li>Przyłożyć 8 impulsów prostokątnych o napięciu 20 V i czasie trwania 50 ms.</li>
 <li>Wycofać elektrody.</li>
 <li>Za pomocą pęsety ostrożnie wyjąć kijanka z dołka i przenieść do 3/4 NAM z 0,025 mg/ml gentamycyny.</li>
 <li>Kijanki można inkubować w 3/4 NAM z 0,025 mg/ml przez noc lub dłużej.</li>
 <li>Po 24 godzinach przeprowadzić selekcję zarodków pod kątem wydajności elektroporacji za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.</li>
</ol>
3. Reprezentatywne wyniki:
Zastosowanie cząsteczek fluorescencyjnych umożliwia łatwe przesiewanie elektroporowanych embrionów. Rysunek 4 przedstawia typową partię kijankami poddanych elektroporacji MO ok. 12, 48 i 96 godzin po zabiegu, inkubowanych w temperaturze 14,5°C. Dzięki mikroskopii fluorescencyjnej MO można wizualizować natychmiast po elektroporacji; fluorescencja utrzymuje się przez kilka dni po zabiegu. Według naszych doświadczeń fluorescencja jest słabo widoczna w stadium 46 (ok. 5 dni później). W chrząstkach fluorescencja gwałtownie spada po rozpoczęciu różnicowania (ok. st 42); jednak fluorescencja MO utrzymuje się silniej w innych typach komórek, takich jak endoderm rzekoma. Mikroskopia fluorescencyjna wykazuje, że oligonukleotydy są wbudowane w kilka tkanek czaszkowo-twarzowych, w tym w chrząstkę. Fluorescencję oligonukleotydów często można zaobserwować w tkankach po obu stronach głowy. Jest to prawdopodobnie spowodowane szybką dyfuzją roztworu wstrzykiwanego w obrębie luźnej mezenchymy czaszkowo-twarzowej przed elektroporacją.
 
 
 
<img alt="Układ z drutu wolframowego, strzykawka 1 ml, koniec elektrody; kable DC do eksperymentów elektrycznych." src="/files/ftp_upload/3381/3381fig1.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1 Samodzielnie wykonane elektrody. Drut wolframowy w kształcie litery L jest przymocowany do strzykawki 1 ml za pomocą nietoksycznej glinki lub masy plastycznej. (A) Długość końca elektrody wynosi 5 mm. (B) Należy zamocować parę elektrod w taki sposób, aby ich końce biegły równolegle. Elektrody są podłączone do generatora impulsów za pomocą kabli DC.
<img alt="Ustawienie do elektroporacji dla badania kijanek w stadium 28; schemat z pomiarami i opisanymi elementami." src="/files/ftp_upload/3381/3381fig2.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2 Komora do elektroporacji. (A) Szalka o średnicy 90 mm wyłożona plasteliną jest wypełniona pożywką, a w niej wycięto w kształcie litery T komorę przy użyciu pęsety zegarmistrzowskiej nr 5. (B) Dłuższy bok ma wymiary 2 mm X 2 mm X 10 mm, natomiast krótszy 2 mm X 2 mm X 5 mm. Głowa embrionu spoczywa w rozwidleniu litery T, stroną brzuszną do góry.
<img alt="Schemat procesu edycji genów; metoda mikroiniekcji w zarodku do badań rozwojowych." src="/files/ftp_upload/3381/3381fig3.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3 Schemat przedstawiający procedurę elektroporacji. Kijanka w stadium St. 28 zostaje umieszczona w komorze do elektroporacji stroną brzuszną do góry. Mikropipetę wprowadza się do mezenchymy twarzy pod gruczołem cementowym. Wykonuje się iniekcję. Mikropipetę usuwa się, a elektrody w kształcie litery L ustawia się równolegle wzdłuż głowy. Przykładamy osiem prostokątnych impulsów o czasie trwania 50 ms i napięciu 20 V. Elektrody zostają wycofane. Kijanki hoduje się do pożądanych stadiów. Ekspresję MO lub GFP wizualizuje się za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.
<img alt="Etapy rozwoju kijanki; mikroskopia fluorescencyjna; obserwacja morfologii; analiza ekspresji genów." src="/files/ftp_upload/3381/3381fig4.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4 Reprezentatywne kijanki 12 (A), 48 (B) i 96 (C) godzin po elektroporacji (odpowiednio stadia 30, 34 i 44). (A"-B") Fluorescencyjne MO można zwizualizować w obrębie mezonchymu kraniofacjalnego w stadiach 30 i 34. Fluorescencję można wykryć w chrząstkach w stadium 44 (grot strzałki, C'-C"). Jelito wykazuje silną autofluorescencję.

<ol><li>Bonev, B., Pisco, A., Papalopulu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-9+reveals+regional+diversity+of+neural+progenitors+along+the+anterior-posterior+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-9 reveals regional diversity of neural progenitors along the anterior-posterior axis.</a> Dev. Cell. 20, 19-32 (2011).</li>
<li>Haas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+electroporation+for+gene+transfer+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Single-cell electroporation for gene transfer in vivo.</a> Neuron. 29, 583-591 (2001).</li>
<li>Calegari, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+RNA+interference+in+post-implantation+mouse+embryos+using+directional+electroporation+and+whole+embryo+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific RNA interference in post-implantation mouse embryos using directional electroporation and whole embryo culture.</a> Differentiation. 72, 92-102 (2004).</li>
<li>Drinjakovic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E3+ligase+Nedd4+promotes+axon+branching+by+downregulating+PTEN%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">E3 ligase Nedd4 promotes axon branching by downregulating PTEN.</a> Neuron. 65, 341-357 (2010).</li>
<li>Falk, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+of+cDNA%2FMorpholinos+to+targeted+areas+of+embryonic+CNS+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22BMC.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Electroporation of cDNA/Morpholinos to targeted areas of embryonic CNS in Xenopus.</a> BMC. Dev. Biol. 7, 107-107 (2007).</li>
<li>Hewapathirane, D. S., Haas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Cell+Electroporation+in+vivo+within+the+Intact+Developing+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Single Cell Electroporation in vivo within the Intact Developing Brain.</a> J. Vis. Exp. (17), e705-e705 (2008).</li>
<li>Kuriyama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tsukushi+controls+ectodermal+patterning+and+neural+crest+specification+in+Xenopus+by+direct+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22of+BMP4+and+X-delta-1+activity.+Development%22%5BJournal%5D)">Tsukushi controls ectodermal patterning and neural crest specification in Xenopus by direct regulation.</a> of BMP4 and X-delta-1 activity. Development. 133, 75-88 (2006).</li>
<li>Mende, M., Christophorou, N. A., Streit, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+and+effective+gene+knock-down+in+early+chick+embryos+using+morpholinos+but+not+pRFPRNAi+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Specific and effective gene knock-down in early chick embryos using morpholinos but not pRFPRNAi vectors.</a> Mech. Dev. 125, 947-962 (2008).</li>
<li>Neumann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+into+mouse+lyoma+cells+by+electroporation+in+high+electric+fields%5BTitle%5D)+AND+%22Embo.+J%22%5BJournal%5D)">Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields.</a> Embo. J. 1, 841-845 (1982).</li>
<li>Price, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+motor+neuron+pool+sorting+by+differential+expression+of+type+II+cadherins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of motor neuron pool sorting by differential expression of type II cadherins.</a> Cell. 109, 205-216 (2002).</li>
<li>Grossin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+gene+transfer+into+rat+articular+cartilage+by+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Faseb.+J%22%5BJournal%5D)">Direct gene transfer into rat articular cartilage by in vivo electroporation.</a> Faseb. J. 17, 829-835 (2003).</li>
<li>Khoury, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+study+on+intra-articular+versus+systemic+gene+electrotransfer+in+experimental+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gene.+Med%22%5BJournal%5D)">A comparative study on intra-articular versus systemic gene electrotransfer in experimental arthritis.</a> J. Gene. Med. 8, 1027-1036 (2006).</li>
<li>Takahashi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Down-regulation+of+cathepsin+K+in+synovium+leads+to+progression+of+osteoarthritis+in+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis.+Rheum%22%5BJournal%5D)">Down-regulation of cathepsin K in synovium leads to progression of osteoarthritis in rabbits.</a> Arthritis. Rheum. 60, 2372-2380 (2009).</li>
<li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSive%2C+HL+%22Early+Development+of+Xenopus+laevis%3A+A+Laboratory+Manual%22">Early Development of Xenopus laevis: A Laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbour Laboratories Press. (2000).</li>
<li>Wheeler, G. N., Brandli, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+vertebrate+models+for+chemical+genetics+and+drug+discovery+screens%3A+lessons+from+zebrafish+and+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Simple vertebrate models for chemical genetics and drug discovery screens: lessons from zebrafish and Xenopus.</a> Dev. Dyn. 238, 1287-1308 (2009).</li>
<li>Turner, D. L., Weintraub, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+achaete-scute+homolog+3+in+Xenopus+embryos+converts+ectodermal+cells+to+a+neural+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Genes.+Dev%22%5BJournal%5D)">Expression of achaete-scute homolog 3 in Xenopus embryos converts ectodermal cells to a neural fate.</a> Genes. Dev. 8, 1434-1447 (1994).</li>
</ol>

Autorzy nie deklarują żadnego konfliktu interesów.

W tym filmie zademonstrowaliśmy możliwość dostarczania genów za pomocą elektroporacji do mezenchymy twarzy kijanek Xenopus. Stosując to podejście, możemy pominąć wczesne efekty rozwojowe manipulacji funkcją genu, co pozwala nam celować w konkretne tkanki w późniejszych punktach czasowych. Nasze badania pokazują, że można oddziaływać na heterogenne populacje mezenchymalnych komórek kraniotwarzowych, co umożliwia badanie linii komórkowych komórek poddanych elektroporacji, a także autonomicznych wymagań komórkowych dla białek będących przedmiotem zainteresowania. W połączeniu z obrazowaniem na żywo możemy wykorzystać tę metodę do badania funkcji genów w czasie, podczas rozwoju kraniotwarzowego. Ta nowatorska metoda podkreśla przydatność Xenopus do badania organogenezy. Przewidujemy, że metoda ta może zostać szeroko zaadaptowana do badania morfogenezy i różnicowania innych tkanek.

A correction was made to <a href="http://http://www.jove.com/video/3381">Electroporation of Craniofacial Mesenchyme</a>. There was an incorrect unit used for the voltage.

Erratum: Electroporation of Craniofacial Mesenchyme

elektroporacja mezenchymy kraniofacialnej

Electroporation of Craniofacial Mesenchyme

Elektroporacja jest wydajną metodą dostarczania DNA oraz innych naładowanych makrocząsteczek do tkanek w precyzyjnych punktach czasowych i lokalizacjach. Na przykład elektroporację z dużym sukcesem wykorzystywano do badania rozwoju układu nerwowego i siatkówki u Xenopus, kurczaka oraz myszy 1-10. Należy jednak zauważyć, że we wszystkich tych badaniach badacze nie kierowali się na tkanki miękkie. Ponieważ interesuje nas rozwój kraniofacjalny, dostosowaliśmy metodę w celu celowania w mezenchymę twarzy.
Przeszukując literaturę, ze zdziwieniem odkryliśmy, że istnieje bardzo niewiele doniesień o udanym transferze genów do tkanki chrzęstnej. Większość tych prac dotyczyła terapii genowej, takiej jak dostarczanie siRNA lub białek do chondrogennych linii komórkowych, bądź obejmowała modele zwierzęce zapalenia stawów 11-13. W innych systemach, takich jak kurczak czy mysz, elektroporacja mezenchymy twarzy okazała się problematyczna (komunikaty osobiste, Dept of Craniofacial Development, KCL). Postawiliśmy hipotezę, że elektroporacja tkanek prochrząstkowych i chrzęstnych u Xenopus może przynieść lepsze efekty. W naszych badaniach wykazujemy, że transfer genów do chrząstek twarzy zachodzi wydajnie na wczesnych etapach (28), gdy pierwotek twarzy składa się jeszcze z tkanki miękkiej, przed różnicowaniem chrząstki.
Xenopus jest bardzo dostępnym systemem kręgowców do analizy rozwoju kraniofacialnego. Struktury kraniofacialne są lepiej widoczne w Xenopus niż w jakimkolwiek innym modelu kręgowca, przede wszystkim dlatego, że Xenopus embriony są zapładniane zewnętrznie, co umożliwia analizę najwcześniejszych etapów rozwoju oraz ułatwia obrazowanie na żywo z rozdzielczością pojedynczych komórek, a także ponowne wykorzystanie samic 14Wśród modeli kręgowców rozwijających się zewnętrznie, Xenopus jest bardziej użyteczny w analizach kraniofacjalnych niż rybki zebrafish, ponieważ Xenopus larwy są większe i łatwiejsze do preparowania, a rozwijający się obszar twarzy jest łatwiej dostępny do obrazowania niż analogiczny obszar u ryb. Ponadto, Xenopus jest ewolucyjnie bliższy ludziom niż danio pręgowany (&tilde;o 100 milionów lat bliżej) 15Wreszcie, na tych etapach, Xenopus kijanki są przezroczyste, a jednoczesna ekspresja białek lub cząsteczek fluorescencyjnych umożliwi łatwą wizualizację rozwijających się chrząstek. Przewidujemy, że podejście to pozwoli nam na szybkie i wydajne testowanie potencjalnych cząsteczek w... in vivo system modelowy

Chrząstki kraniofacjalne rozwijają się w bliskim kontakcie z innymi tkankami i są trudne do manipulacji u żywych zwierząt. Wykorzystujemy elektroporację do dostarczania narzędzi molekularnych podczas wzrostu szkieletu kraniofacjalnego, z pominięciem wczesnych efektów embrionalnych. Podejście to pozwoli nam na efektywne testowanie cząsteczek kandydackich in vivo.

Elektroporacja mezenchymy kraniofacialnej

Elektroporacja jest wydajną metodą dostarczania DNA oraz innych naładowanych makrocząsteczek do tkanek w precyzyjnie określonych punktach czasowych i lokalizacjach.

Ogólnym celem tej procedury jest wprowadzenie naładowanych makrocząsteczek do mezenchymy kraniofacialnej za pomocą elektroporacji. W tym celu w pierwszej kolejności umieszcza się znieczulony embrion w stadium 28 w komorze do elektroporacji. Następnym krokiem jest mikroiniekcja roztworu zawierającego naładowane makrocząsteczki do mezenchymy kraniofacialnej.Następnie szybko aplikuje się prąd elektryczny, wprowadzając w ten sposób naładowane nukleotydy do wnętrza komórek. Ostatnim etapem procedury jest wizualizacja tkanki poddanej elektroporacji za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. W rezultacie można uzyskać wyniki wykazujące zmiany w tkankach czaszkowo-twarzowych.Wyniki te można analizować in vivo lub w utrwalonej tkance, wykorzystując fluorescencję, mikroskopię lub immunohistochemię. Główną zaletą elektroporacji w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak mikroiniekcja i mutacje, jest kontrola tkankowa i czasowa nad naszymi narzędziami molekularnymi; dzisiejszą procedurę zaprezentuje Jackie Tabler, postdok w moim laboratorium. Para elektrod w kształcie litery L, niezbędna do tej procedury, jest wykonana z wysokiej czystości drutu wolframowego o średnicy 0,4 mm; dla każdej elektrody odetnij najpierw osiem centymetrów drutu.Następnie, używając masy mocującej (np. Blue Tack), przymocuj strzykawkę o pojemności 1 ml w połowie długości drucika wolframowego, pozostawiając 4 cm drutu wystającego poza końcówkę strzykawki. Zegnij końcówkę w kształt litery L w odległości 1 cm od końca. Przytnij końcówkę tak, aby jej długość wynosiła 0,5 cm.Ta końcówka to terminal elektrody; poprowadź nadmiar drucika wolframowego równolegle do strzykawki. Będzie on służył do podłączenia generatora impulsów elektrody po wykonaniu drugiej elektrody. Przymocuj parę elektrod do siebie za pomocą taśmy tak, aby terminale elektrod biegły równolegle, w odległości jednego centymetra od siebie.Na koniec podłącz elektrody do generatora impulsów prostokątnych za pomocą przewodów DC. Aby przygotować niestandardową komorę do elektroporacji, wyłóż dno szalki o średnicy 90 mm około pięcioma milimetrami nietoksycznej modeliny Plaster Scene. Wypełnij szalkę medium do elektroporacji, zanurzając modelinę.Następnie użyj pęsety zegarmistrzowskiej nr 5, aby wyciąć w gipsowej scenie otwór w kształcie litery T, który posłuży do elektroporacji. Dłuższy bok otworu powinien mieć wymiary około 2 mm x 2 mm x 10 mm, a krótszy bok 2 mm x 2 mm x 5 mm. Mikropipety do tej procedury są wykonane z kapilar ze szkła krzemianowego.Użyj wyciągacza igieł, aby przygotować mikropipety z obszarem zwężenia o długości od 8 do 12 mm i cienką końcówką; zmiażdż końcówkę pęsetą w odległości około 2 mm od wierzchołka, tworząc poszarpanany przełom w celu przygotowania mikropipety. Najpierw wypełnij ją około 1 µL roztworu do wstrzykiwania, który w tej demonstracji zawiera znakowane fluorescencyjnie oligonukleotydy. Następnie zamocuj mikropipetę w mikromanipulatorze, ustawiając ją pod kątem 50 stopni względem blatu stołu.Ustaw ciśnienie wtrysku na 20 PSI i skalibruj mikropipetę tak, aby wstrzykiwała 30 litrów na impuls. W ramach przygotowania do elektroporacji, znieczul larwę ksenopijki w stadium 28 poprzez inkubację przez pięć minut. W medium do elektroporacji, które jest standardowym medium dla płazów zawierającym 0,1% benzokainy, przenieś znieczulonego kijka do komory elektroporacyjnej.Jest ono wypełnione medium do elektroporacji. Najtrudniejszym elementem procedury jest wprowadzenie mikro-pipety do kijanki. Aby zapewnić sukces, należy bardzo mocno unieruchomić embrion, a następnie szybko przyłożyć prąd po wykonaniu mikroiniekcji.Umieść embrion w długiej studzience w taki sposób, aby głowa spoczywała w rozwidleniu w kształcie litery T. Gdy strona grzbietowa znajduje się na dole, a strona brzuszna jest wyeksponowana, głowa powinna być lekko uniesiona w stosunku do ogona; za pomocą pęsety delikatnie unieruchom kijanka w studzience, wykorzystując otaczającą gipsową scenę. Ważne jest, aby unieruchomić kijankę, by zapobiec jej drganiom podczas elektroporacji, co mogłoby doprowadzić do poważnego uszkodzenia tkanek twarzy.Aby rozpocząć tę procedurę, należy wprowadzić końcówkę mikropipety bezpośrednio za gruczoł cementowy i do mezenchymy twarzowej. Wstrzyknij 30 nanolitrów roztworu do mezenchymy, a następnie wycofaj mikropipetę. Szybko ustaw końcówki elektrod równolegle do głowy zarodka i przyłóż osiem prostokątnych impulsów o napięciu 20 millivolt i czasie trwania 50 milisekund każdy.Następnie wycofaj elektrody za pomocą pęsety. Ostrożnie wyjmij kijanka z dołka. Następnie za pomocą pipety przenieś kijankę do trzech czwartych objętości medium z roztworem 0,025 mg/mL. kijanki poddane działaniu gentamycyny można inkubować w tym medium przez noc lub dłużej niż przez 24 godziny. W celu oceny wydajności elektroporacji należy poddać kijanki badaniu za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Zastosowanie cząsteczek fluorescencyjnych umożliwia łatwe przesiewanie elektroporowanych embrionów.Rysunek ten przedstawia typową partię kijanek po elektroporacji morfooligonukleotydami około 1248 oraz 96 godzin po zabiegu, odpowiednio w stadiach 30, 34 i 44. Fluorescencyjne morfooligonukleotydy można zaobserwować w obrębie struktur czaszkowo-twarzowych w stadiach 30 i 34.W stadium 44 fluorescencję można wykryć w chrząstkach wskazanych białymi grotami strzałek. Obszarem o wysokiej autofluorescencji jest jelito. Po zastosowaniu tej procedury możemy śledzić linię komórek elektrodowych, a także wymagania molekularne dla białek będących przedmiotem zainteresowania.Podejście to można połączyć z technikami obrazowania na żywo w celu badania funkcji genów w czasie w trakcie rozwoju kraniofacialnego.

electroporation-of-craniofacial-mesenchyme

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Elektroporacja mezenchymy twarzoczaszki

Elektroporacja pojedynczych komórek (SCE) to specjalistyczna technika umożliwiająca dostarczenie DNA lub innych makrocząsteczek do poszczególnych komórek w obrębie nienaruszonej tkanki, w tym w preparatach in vivo. W niniejszym materiale szczegółowo opisujemy procedurę SCE w celu wprowadzenia barwnika fluorescencyjnego lub plazmidowego DNA do neuronów w nienaruszonym mózgu kijanki Xenopus laevis.

Elektroporacja pojedynczych komórek in vivo w nienaruszonym rozwijającym się mózgu

Niniejsza procedura opisuje metodę izolacji i hodowli mysiego narządu Cortiego z lub bez listka spiralnego i neuronów zwoju spiralnego. Prezentujemy również metodę ekspresji egzogennego genu reporterowego w eksplantacie narządu Cortiego za pomocą elektroporacji.

Kultura pierwotna i elektroporacja plazmidowa mysiego narządu Cortiego.

In utero elektroporacja umożliwia szybkie dostarczanie genów w sposób kontrolowany przestrzennie i czasowo do rozwijającego się ośrodkowego układu nerwowego (OUN). W niniejszej pracy opisujemy wysoce adaptowalny protokół elektroporacji in utero, który może być wykorzystany do dostarczania konstruktów ekspresyjnych do wielu embrionalnych domen OUN, w tym do telencefalonu, diencefalonu i siatkówki.

Efektywne dostarczanie genów do wielu obszarów OUN z wykorzystaniem elektroporacji in utero

Opisano metodę transferu genów do rozwijającego się mózgu myszy z wykorzystaniem unikalnej metody chirurgicznej oraz specjalnego kształtu elektrod. Ta wyjątkowa technika umożliwia czasową i przestrzenną transfekcję plazmidowego DNA, co pomoże wielu neuronaukowcom w badaniu rozwoju mózgu.

Elektroporacja myszy in utero: kontrolowana spatiotemporalna transfekcja genów

W celu przeprowadzenia szybkiej oceny funkcji genów w rozwoju kory mózgu opisujemy metody obejmujące elektroporację ex vivo plazmidów koekspresujących inhibicyjne RNA (RNAi) i GFP w zarodkowej korze mysiej. Protokół ten nadaje się do badania różnych aspektów neurorozwoju, takich jak neurogeneza, migracja neuronów oraz morfogeneza neuronów, w tym wzrost dendrytów i aksonów.

Metody badania morfogenezy neuronalnej: Elektroporacja RNAi ex vivo w embrionalnej korze mózgu myszy

Jak sieci neuronowe są tworzone w embrionalnym mózgu, jest fundamentalnym pytaniem w neurobiologii rozwojowej. Połączyliśmy technikę elektroporacji z nowatorskimi narzędziami genetycznymi, takimi jak plazmidy Cre/Lox i system transpozycji DNA za pośrednictwem PiggyBac w tyłomózgowiu ptaków, aby oznaczyć interneurony grzbietowe i śledzić ich projekcje aksonalne i cele synaptyczne na różnych etapach rozwoju.

Elektroporacja tyłomózgowia w celu śledzenia trajektorii aksonów i celów synaptycznych w zarodku pisklęcia

Powierzchnia pial to unikalna strefa progenitorowa w OUN, której poświęca się coraz więcej uwagi.  W niniejszym artykule szczegółowo opisujemy metodę szybkiej manipulacji genetycznej tej strefy progenitorowej przy użyciu zmodyfikowanej metody elektroporacji.  Procedura ta może być stosowana do badań komórkowych i molekularnych linii komórkowych i szlaków sygnałowych zaangażowanych w różnicowanie komórek oraz do wyjaśnienia losów i właściwości komórek potomnych.

Elektroporacja powierzchni pialu noworodków

Prezentujemy metodę, która opisuje izolację i hodowlę eksplantatów ślimaka z embrionalnego ucha wewnętrznego myszy.  Demonstrujemy również metodę transferu genów do eksplantatów ślimakowych za pomocą elektroporacji fali prostokątnej. Hodowla eksplantatów in vitro w połączeniu z techniką transferu genów umożliwia naukowcom badanie skutków zmiany ekspresji genów podczas rozwoju.

Hodowla embrionalnych eksplantatów ślimakowych myszy i transfer genów za pomocą elektroporacji

Podwójna elektroporacja w macicy pozwala na celowanie w populacje komórek, które są przestrzennie i czasowo oddzielone. Technika ta jest przydatna do wizualizacji interakcji między tymi populacjami komórek przy użyciu białek fluorescencyjnych w normalnych warunkach, ale także po eksperymentach funkcjonalnych w celu zakłócenia interesujących genów.

Podwójna elektroporacja in utero w celu ukierunkowania na czasowo i przestrzennie oddzielone populacje komórek

Tutaj prezentujemy protokół, który łączy elektroporację in vivo i denerwację mięśnia dźwigacza długiego czaszki (LAL). Zabieg ten umożliwia badanie potencjalnej roli białek pochodzenia mięśniowego w regeneracji synapsy nerwowo-mięśniowej.

Połączona elektroporacja in vivo i krótkotrwałe unerwienie mięśnia szkieletowego dźwigacza bocznego zorza długiego czaszki

Tutaj prezentujemy ostrą manipulację genetyczną pokrojonych ludzkich organoidów korowych za pomocą elektroporacji. Te korowe modele organoidów są szczególnie podatne na wstrzykiwanie, ponieważ struktury podobne do komór można łatwo zidentyfikować po pokrojeniu, co umożliwia funkcjonalne badanie rozwoju kory mózgowej człowieka, zaburzeń neurorozwojowych i ewolucji kory mózgowej.

Elektroporacja pokrojonych w plasterki organoidów korowych człowieka do badań funkcji genów

Naucz się elektroporacji makrocząsteczek do mezenchymy twarzoczaszki w zarodkach Xenopus laevis. Ta metoda umożliwia precyzyjną kontrolę czasową i przestrzenną w badaniach rozwoju twarzoczaszki.

Elektroporacja mezenchymy kraniofacialnej

Przeglądaj więcej filmów