Elektroporacja mezenchymy twarzoczaszki

Ogólnym celem tej procedury jest elektrooperacja naładowanych makrocząsteczek w mezenchymie czaszki twarzy. Osiąga się to poprzez uprzednie umieszczenie znieczulonego zarodka w stadium 28 w komorze elektroporacji. Kolejnym krokiem jest mikrowstrzyknięcie roztworu zawierającego naładowane makrocząsteczki do mezenchymy czaszkowo-twarzowej.

Po tym szybko stosuje się prąd elektryczny, wprowadzając w ten sposób nukleotydy ładunku do komórek w pozostałym miejscu. Ostatnim etapem zabiegu jest wizualizacja elektroporowanej tkanki za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Ostatecznie można uzyskać wyniki pokazujące zmiany w tkankach czaszki twarzy.

Wyniki te można analizować in vivo lub w tkance utrwalonej za pomocą fluorescencji, mikroskopii lub immunohistochemii. Główną przewagą elektroporacji nad istniejącymi metodami, takimi jak mikroiniekcja i mutacja, jest tkankowa i czasowa kontrola naszych narzędzi molekularnych, co zademonstruje nasza dzisiejsza procedura Jackie Tabler, doktor habilitowany w moim laboratorium. Para elektrod w kształcie litery L wymagana do tej procedury jest wykonana z drutu wolframowego o wysokiej czystości 0,4 milimetra, a każda elektroda najpierw przecina osiem centymetrów drutu.

Następnie za pomocą szpachli, takiej jak niebieska strzykawka, uderza w jednomililitrową strzykawkę w środku drutu wolframowego, pozostawiając cztery centymetry drutu odsłonięte od końcówki strzykawki. Zegnij końcówkę w kształt litery L jeden centymetr od końca. Przytnij końcówkę tak, aby koniec miał 0,5 centymetra długości.

Ta końcówka jest końcem elektrody, która prowadzi nadmiar drutu wolframowego równolegle do strzykawki. Będzie on służył do podłączenia generatora impulsów elektrody po wykonaniu drugiej elektrody. Przymocuj parę elektrod do siebie za pomocą taśmy tak, aby końcówka elektrody przebiegała równolegle, w odległości jednego centymetra od siebie.

Na koniec podłącz elektrody do generatora impulsów fali prostokątnej za pomocą prądu stałego. Aby przygotować specjalnie wykonaną komorę do elektroporacji, wyłóż dno 90-milimetrowego naczynia około pięcioma milimetrami nietoksycznej gipsowej plasteliny do modelowania scen. Napełnij naczynie środkiem do elektroporacji, zanurzając scenę gipsową.

Następnie użyj kleszczyków zegarmistrzowskich numer pięć, aby wyrzeźbić studnię w kształcie litery T w gipsowej scenie, aby utworzyć elektroporację. Cóż, długi bok studni powinien mieć wymiary około dwóch milimetrów na dwa milimetry na 10 milimetrów, a krótki bok powinien mieć wymiary dwa milimetry na dwa milimetry na pięć milimetrów. Mikropipety do tej procedury są wykonane z kapilar ze szkła krzemianowego.

Za pomocą ściągacza do igieł przygotuj mikropipety ze stożkiem o długości od 8 do 12 milimetrów i cienką końcówką, zmiażdż końcówkę około dwóch milimetrów od końcówki za pomocą kleszczy, tworząc postrzępioną przerwę w celu ustawienia mikropipety. Najpierw napełnij go około jednym mikrolitrem roztworu do wstrzykiwań, który w tej demonstracji zawiera fluorescencyjnie znakowane oligonukleotydy. Następnie zabezpiecz mikropipetę pod kątem mikromanipulatora w odległości 50 stopni od blatu.

Ustaw ciśnienie wtrysku na 20 PSI i skalibruj mikropipetę, aby wstrzykiwać 30 litrów na impuls. Przygotowując się do elektroporacji, znieczul larwy ksenolarne w stadium 28, inkubując je przez pięć minut. W pożywkach do elektroporacji, które są normalnymi pożywkami zawierającymi 0,1% benzokainy, przenieś znieczuloną kijankę do komory elektroporacji.

Który jest wypełniony mediami do elektroporacji. Najtrudniejszą częścią procedury jest włożenie mikro zwierzaka do kijanki. Tak więc, aby zapewnić sukces, należy bardzo mocno zabezpieczyć zarodek, a następnie szybko przyłożyć prąd po mikroiniekcji.

Umieść zarodek w długiej studzience tak, aby głowa spoczywała w złączu T. Z odsłoniętą stroną grzbietową do dołu i stroną brzuszną, głowę należy lekko unieść w porównaniu z ogonem za pomocą kleszczy, delikatnie zabezpieczyć kijankę w studni z otaczającą ją sceną gipsową. Ważne jest, aby zabezpieczyć kijankę, aby nie drgała podczas elektroporacji, co mogłoby spowodować poważne uszkodzenie tkanek twarzy.

Aby rozpocząć tę procedurę, należy włożyć końcówkę mikropipety bezpośrednio za gruczołem cementowym i do mechy twarzy. Wstrzyknąć 30 nanolitrów roztworu do mezenchymy, wycofać mikropipetę. Szybko ustaw końcówki elektrod równolegle do głowy zarodka i zastosuj osiem 50-milisekundowych impulsów kwadratowych o napięciu 20 miliwoltów.

Następnie wycofaj elektrody za pomocą kleszczy. Ostrożnie wypuść kijankę ze studni. Następnie za pomocą pipety przenieś kijankę na trzy czwarte nom z 0,025 miligrama na mililitr.

Kijanki gentamycyny można inkubować w tym podłożu przez noc lub dłużej po 24 godzinach. Kijanki przesiewowe za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej w celu uzyskania wydajnej elektroporacji. Zastosowanie cząsteczek fluorescencyjnych pozwala na łatwe badania przesiewowe zarodków poddanych elektropostacji.

Rysunek ten przedstawia typową partię kijanek morfologicznych oligonukleotydowych poddanych elektroporacji około 1248 roku i 96 godzin po elektroporacji. Odpowiednio na etapach 30, 34 i 44. Fluorescencyjne oligonukleotydy morficzne można uwidocznić w obrębie czaszki twarzy na etapach 30 i 34.

Na etapie 44 fluorescencyjny można wykryć w chrząstkach oznaczonych białymi grotami strzałek. Obszarem silnie autofluorescencyjnym jest jelito. Postępując zgodnie z tą procedurą, możemy śledzić linię elektrokomórek, a także wymagania molekularne dla interesujących nas białek.

Podejście to można połączyć z technikami obrazowania na żywo w celu zbadania funkcji genów w czasie podczas rozwoju twarzoczaszki.