Name: Ilościowe porównanie aktywności elementu cis-regulatorowego (CRE) u transgenicznej Drosophila melanogaster (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-19T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: Poznaj metodę ilościowego pomiaru aktywności elementów cis-regulatorowych u Drosophila melanogaster. Wykorzystuje się mikroskopię konfokalną i analizę ImageJ do badania wzorców ekspresji genów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy: Nicolasowi Gompelowi i Benjaminowi Prud'homme'owi za wkład w opracowanie tego protokołu; Melissie Williams oraz czterem anonimowym recenzentom za uwagi do manuskryptu; Graduate School Uniwersytetu w Dayton za stypendia badawcze dla WAR; a także Katedrze Biologii oraz Instytutowi Badawczemu (UDRI) Uniwersytetu w Dayton za wsparcie badawcze dla TMW. Praca ta była finansowana z grantu American Heart Association nr 11BGIA7280000 przyznanego TMW.

<ol><li>Davidson, E. H. The Regulatory Genome. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDavidson%2C+EH+%22Gene+Regulatory+Networks+in+Development+and+Evolution%22">Gene Regulatory Networks in Development and Evolution</a>. , Academic Press. (2006).</li>
<li>Wray, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolutionary+significance+of+cis-regulatory+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">The evolutionary significance of cis-regulatory mutations.</a> Nat. Rev. Genet. 8, 206-216 (2007).</li>
<li>Stern, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+developmental+biology+and+the+problem+of+variation%5BTitle%5D)+AND+%22Evolution%22%5BJournal%5D)">Evolutionary developmental biology and the problem of variation.</a> Evolution. 54, 1079-1091 (2000).</li>
<li>Carroll, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evo-devo+and+an+expanding+evolutionary+synthesis%3A+a+genetic+theory+of+morphological+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Evo-devo and an expanding evolutionary synthesis: a genetic theory of morphological evolution.</a> Cell. 134, 25-36 (2008).</li>
<li>Sethupathy, P., Collins, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+target+site+polymorphisms+and+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">MicroRNA target site polymorphisms and human disease.</a> Trends Genet. 24, 489-497 (2008).</li>
<li>Visel, A., Rubin, E. M., Pennacchio, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+views+of+distant-acting+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genomic views of distant-acting enhancers.</a> Nature. 461, 199-205 (2009).</li>
<li>Spradling, A. C., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposition+of+cloned+P+elements+into+Drosophila+germ+line+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Transposition of cloned P elements into Drosophila germ line chromosomes.</a> Science. 218, 341-347 (1982).</li>
<li>Bischof, J., Maeda, R. K., Hediger, M., Karch, F., Basler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+transgenesis+system+for+Drosophila+using+germ-line-specific+phiC31+integrases%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific phiC31 integrases.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 3312-3317 (2007).</li>
<li>Groth, A. C., Fish, M., Nusse, R., Calos, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+transgenic+Drosophila+by+using+the+site-specific+integrase+from+phage+phiC31%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Construction of transgenic Drosophila by using the site-specific integrase from phage phiC31.</a> Genetics. 166, 1775-1782 (2004).</li>
<li>Venken, K. J., He, Y., Hoskins, R. A., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P%5Bacman%5D%3A+a+BAC+transgenic+platform+for+targeted+insertion+of+large+DNA+fragments+in+in+D.+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">P[acman]: a BAC transgenic platform for targeted insertion of large DNA fragments in in D. melanogaster.</a> Science. 314, 1747-1751 (2006).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Exploiting+position+effects+and+the+gypsy+retrovirus+insulator+to+engineer+precisely+expressed+transgenes%22">Exploiting position effects and the gypsy retrovirus insulator to engineer precisely expressed transgenes</a>. Markstein, M., Pitsouli, C., Villalta, C., Celniker, S. E., Perrimon, N. , United States. (2008).</li>
<li>Rebeiz, M., Pool, J. E., Kassner, V. A., Aquadro, C. F., Carroll, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stepwise+modification+of+a+modular+enhancer+underlies+adaptation+in+a+Drosophila+population%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Stepwise modification of a modular enhancer underlies adaptation in a Drosophila population.</a> Science. 326, 1663-1667 (2009).</li>
<li>Williams, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+and+evolution+of+a+genetic+switch+controlling+sexually+dimorphic+traits+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The regulation and evolution of a genetic switch controlling sexually dimorphic traits in Drosophila.</a> Cell. 134, 610-623 (2008).</li>
<li>Shirangi, T. R., Dufour, H. D., Williams, T. M., Carroll, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+evolution+of+sex+pheromone-producing+enzyme+expression+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+biology%22%5BJournal%5D)">Rapid evolution of sex pheromone-producing enzyme expression in Drosophila.</a> PLoS biology. 7, e1000168-e1000168 (2009).</li>
<li>Barolo, S., Carver, L. A., Posakony, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GFP+and+beta-galactosidase+transformation+vectors+for+promoter%2Fenhancer+analysis+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">GFP and beta-galactosidase transformation vectors for promoter/enhancer analysis in Drosophila.</a> BioTechniques. 29, 726-732 (2000).</li>
<li>Fish, M. P., Groth, A. C., Calos, M. P., Nusse, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFish%2C+MP+%22Creating+transgenic+Drosophila+by+microinjecting+the+site-specific+phiC31+integrase+mRNA+and+a+transgene-containing+donor+plasmid%22">Creating transgenic Drosophila by microinjecting the site-specific phiC31 integrase mRNA and a transgene-containing donor plasmid</a>. , England. (2007).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Drosophila%3A+A+laboratory+handbook%22">Drosophila: A laboratory handbook</a>. Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, R. S. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor. (2005).</li>
<li>Abramoff, M. D., Magelhaes, P. S., Ram, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+Processing+with+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22Biophotonics+International%22%5BJournal%5D)">Image Processing with ImageJ.</a> Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).</li>
<li>Musunuru, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+noncoding+variant+to+phenotype+via+SORT1+at+the+1p13+cholesterol+locus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">From noncoding variant to phenotype via SORT1 at the 1p13 cholesterol locus.</a> Nature. 466, 714-721 (2010).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

cis-elementy regulacyjne kodują program genomiczny określający wzorce ekspresji genów, a tym samym proces rozwoju1, i stanowią kluczowe miejsca zarówno dla mutacji leżących u podstaw ewolucji morfologicznej2-4, jak i zmienności fenotypowej cech ludzkich5,6,19. Pomimo tego znaczenia, logika regulacyjna CRE pozostaje słabo poznana. Główną przyczyną tego deficytu wiedzy był brak odpowiednich metod do ilościowego porównywania funkcjonalnych sekwencji CRE. W niniejszym opracowaniu prz...

ilościowe porównanie cisaktywności cis-elementów regulacyjnych (cre) w organizmach transgenicznych drosophila melanogaster

Quantitative Comparison of cis-Regulatory Element (CRE) Activities in Transgenic Drosophila melanogaster

Wzorce ekspresji genów są określane przez cis-sekwencje elementów regulacyjnych (CRE), nazywane również enhancerami lub modułami cis-regulacyjnymi. Typowy CRE posiada układ miejsc wiązania dla kilku białek czynników transkrypcyjnych, które nadają logikę regulacyjną określającą, kiedy, gdzie i na jakim poziomie ekspresowany jest regulowany gen (lub geny). Pełny zestaw CRE w genomie zwierzęcia koduje organizm&prime;program rozwoju1a badania empiryczne oraz teoretyczne wskazują, że mutacje w CRE odgrywały istotną rolę w ewolucji morfologicznej2-4Ponadto badania asocjacyjne całego genomu u ludzi wskazują, że zmienność genetyczna w elementach regulacyjnych (CRE) w znacznym stopniu przyczynia się do zmienności fenotypowej.5,6Zatem zrozumienie logiki regulacyjnej oraz wpływu mutacji na tę logikę stanowi centralny cel genetyki. 
Transgeny reporterowe stanowią potężną metodę badania in vivo funkcja elementów regulacyjnych cis (CRE). W tym przypadku znana lub przypuszczana sekwencja CRE jest łączona z heterologicznym promotorem oraz sekwencjami kodującymi gen reporterowy, który koduje łatwo obserwowalny produkt białkowy. Po wprowadzeniu transgenu reporterowego do organizmu gospodarza, CRE&prime;aktywność staje się widoczna w postaci zakodowanego białka reporterowego. Transgeneza za pomocą elementu P u gatunku muszka owocowa Drosophila (D.) melanogaster7 od dziesięcioleci stosuje się w celu wprowadzenia transgenów reporterowych do tego organizmu modelowego, choć miejsce ich integracji w genomie jest przypadkowe. W związku z tym aktywność genu reporterowego jest silnie uzależniona od lokalnej chromatyny i otoczenia genowego, co ogranicza porównania elementów regulacyjnych CRE do analiz jakościowych. W ostatnich latach system integracji oparty na phiC31 został zaadaptowany do zastosowań w D. melanogaster w celu wprowadzenia transgenów do specyficznych miejsc lądowania w genomie8-10Możliwość ta umożliwiła ilościowy pomiar aktywności genu, a w niniejszym przypadku aktywności CRE11-13 wykonalne. Produkcja transgenicznych muszek owocowych może zostać zlecona na zewnątrz, w tym integracja oparta na phiC31, co eliminuje konieczność zakupu kosztownego sprzętu i/lub posiadania biegłości w specjalistycznych protokołach mikroiniekcji transgenów. 
W niniejszym opracowaniu przedstawiamy ogólny protokół służący do ilościowej oceny CRE&prime;aktywność i wykazać, w jaki sposób podejście to można wykorzystać do pomiaru wpływu wprowadzonej mutacji na element odpowiedzi cis (CRE)&prime;aktywności oraz w celu porównania aktywności ortologicznych elementów regulacyjnych (CRE). Choć podane przykłady dotyczą CRE aktywnego podczas metamorfozy muszki owocówki, podejście to można zastosować do innych etapów rozwoju, gatunków muszek owocówek lub organizmów modelowych. W ostateczności szersze zastosowanie tej metody w badaniu CRE powinno przyczynić się do lepszego zrozumienia logiki regulacyjnej oraz tego, jak logika ta może się różnić i ewoluować.

Zróżnicowanie fenotypowe cech może wynikać z mutacji w sekwencjach elementów cis-regulatorowych (CRE), które kontrolują wzorce ekspresji genów. Metody opracowane do zastosowania u Drosophila melanogaster pozwalają na ilościowe porównanie poziomów przestrzennych i czasowych wzorców ekspresji genów pośredniczonych przez zmodyfikowane lub naturalnie występujące warianty CRE.

Ilościowe porównanie cisAktywności cis-elementów regulacyjnych (CRE) w organizmach transgenicznych Drosophila melanogaster

Wzorce ekspresji genów są określane przez sekwencje elementów cis-regulatorowych (CRE), nazywanych również enhancerami lub modułami cis-regulatorowymi. Typowy element CRE ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest ilościowe pomiar aktywności regulacyjnej genów elementów regulacyjnych CIS lub CRE aktywnych podczas rozwoju metamorficznego drosophila melan gastro. Należy rozpocząć od metod integracji specyficznej dla miejsca w celu wygenerowania linii CRE włączonych transgenicznie jako transgeny reporterowe. Używając stereomikroskopu, należy pobrać transgeniczne okazy na odpowiednim etapie rozwoju.Wyjąć preparaty z zewnętrznej probówki i zamocować je na szkiełku przedmiotowym mikroskopu. Następnie zarejestrować poziom i wzór ekspresji fluorescencyjnego białka reporterowego w próbkach całych preparatów za pomocą analizy mikroskopowej konfokalnej. Na koniec określić ilościowo poziom ekspresji fluorescencyjnego białka reporterowego dla zarejestrowanych obrazów konfokalnych przy użyciu oprogramowania Image J.Wyniki te przypisują poziom aktywności regulacyjnej genu, aby pomóc w identyfikacji elementów regulacyjnych i ułatwić dalsze porównawcze badania ekspresji genów w zmodyfikowanych wersjach CRE. Procedura ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące regulacji genów oraz sposobu kodowania tej regulacji. DNA odgrywa istotną rolę w biolo

quantitative-comparison-cis-regulatory-element-cre-activities

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ilościowa porównanie aktywności cis-elementów regulacyjnych (CRE) w transgennych Drosophila melanogaster

Niniejszy protokół opisuje prostą i niedrogą metodę ilościowego określania aktywności elementów cis-regulatorowych (tj. enhancerów/promotorów) w żywych siatkówkach myszy za pomocą elektroporacji eksplantów. Opisano przygotowanie DNA, wycięcie siatkówki, elektroporację, hodowlę eksplantów siatkówki oraz analizę i kwantyfikację po utrwaleniu.

Ilościowe określenie aktywności elementów regulacyjnych cis w siatkówce myszy za pomocą elektroporacji eksplantatu

Drosophila melanogaster to wybitny organizm modelowy do badania wrodzonego układu odpornościowego oraz fizjologicznych konsekwencji infekcji i chorób. Protokół ten opisuje, w jaki sposób dostarczyć D. melanogaster solidne i ilościowo powtarzalne infekcje bakteryjne, a następnie jak zmierzyć nasilenie infekcji i określić ilościowo odpowiedź immunologiczną gospodarza.

Ogólnoustrojowe infekcje bakteryjne i fenotypy obrony immunologicznej u Drosophila melanogaster

W tej pracy zapewniamy eksperymentalny przepływ pracy, w jaki sposób aktywne wzmacniacze mogą być identyfikowane i eksperymentalnie weryfikowane.

Przewidywanie i walidacja elementów regulatorowych genów aktywowanych podczas różnicowania embrionalnych komórek macierzystych indukowanego kwasem retinowym

Ten protokół pokazuje, jak generować fluorescencyjnie oznaczone, genetycznie zdefiniowane guzy klonalne w oku/czułkach Drosophila imaginal discs (EAD). Opisuje, jak rozdzielić EAD i mózg od larw trzeciego stadium rozwojowego i jak je przetworzyć w celu wizualizacji i ilościowego określenia zmian ekspresji genów i inwazyjności guza.

Model guza dysku imaginalnego Drosophila: wizualizacja i kwantyfikacja ekspresji genów i inwazyjności guza za pomocą mozaik genetycznych

Regulacja środowiska chromatyny jest niezbędnym procesem niezbędnym do prawidłowej ekspresji genów. W tym miejscu opisujemy metodę kontrolowania ekspresji genów poprzez rekrutację maszynerii modyfikującej chromatynę w sposób specyficzny dla genu i odwracalny.

Tłumienie transkrypcji genów poprzez przekierowywanie maszynerii komórkowej za pomocą chemicznych modyfikatorów epigenetycznych

Przedstawiamy protokół kolorymetrycznego testu aktywności syntazy cytrynianu do ilościowego oznaczania nienaruszonej masy mitochondrialnej w homogenatach tkanek Drosophila.

Test kolorymetryczny aktywności syntazy cytrynianu u Drosophila melanogaster

Ten artykuł przedstawia szczegółowy protokół użycia enzymu Cas13D ukierunkowanego na RNA (RfxCas13D) u much.

Wszechobecne i specyficzne tkankowo celowanie RNA u Drosophila melanogaster przy użyciu CRISPR/CasRx

Ten artykuł bierze za przykład transgenezę za pośrednictwem integrazy phiC31 u Drosophila i przedstawia zoptymalizowany protokół mikroiniekcji zarodka, kluczowy krok do tworzenia transgenicznych muszek.

Mikroiniekcja zarodka w celu transgenezy u Drosophila

Protokół ten zapewnia uproszczony proces obliczeniowy do ilościowej identyfikacji początkujących transkrypcji wzmacniaczy. Integrując dostępność chromatyny, cechy chromatyny oraz dane transkrypcyjne, umożliwia dokładne wykrywanie i analizę aktywności wzmacniacza specyficzną dla nici w złożonych regionach intragenowych, pozostając jednocześnie dostępnym dla badaczy bez rozległego szkolenia bioinformatycznego.

Tok obliczeniowy do ilościowej identyfikacji RNA intergenowego/wewnątrzgenowego w embrionalnych komórkach macierzystych myszy

W tym artykule pokazujemy, jak wnikliwie ośrodkowego układu nerwowego z państw larw Drosophila stadium.

Dissection z larw CNS na Drosophila melanogaster

Poznaj metodę ilościowego pomiaru aktywności elementów cis-regulatorowych u Drosophila melanogaster. Wykorzystuje się mikroskopię konfokalną i analizę ImageJ do badania wzorców ekspresji genów.

Ilościowe porównanie cisAktywności cis-elementów regulacyjnych (CRE) w organizmach transgenicznych Drosophila melanogaster

Przeglądaj więcej filmów