Ilościowe porównanie aktywności elementu cis-regulatorowego (CRE) u transgenicznej Drosophila melanogaster

Ogólnym celem tej procedury jest ilościowy pomiar aktywności regulacyjnej genów elementów regulatorowych CIS lub CRE aktywnych podczas rozwoju metamorficznego ślimaka melan. Zacznij od metod integracji specyficznych dla miejsca, aby wygenerować linie CRE Transgenically Incorporated jako transgeny reporterowe. Za pomocą mikroskopu stereoskopowego uzyskaj transgeniczne próbki w prawidłowym stadium rozwoju.

Wyjmij próbki z zewnętrznego pubu i zamontuj je na szklanym mikroskopie. Przystąp do szkiełka, aby zarejestrować poziom i wzór ekspresji fluorescencyjnego białka reporterowego w całych próbkach za pomocą konfokalnej analizy mikroskopowej. Na koniec określ ilościowo poziom ekspresji fluorescencyjnego białka reporterowego dla zarejestrowanych obrazów konfokalnych za pomocą narzędzia programowego Image J.

Wyniki te przypisują poziom aktywności regulacyjnej genów, aby wspomóc element regulatorowy i ułatwić dalsze badania porównawcze ekspresji genów na zmodyfikowanych wersjach CRE. Ta procedura może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania i czuje się zainteresowany regulacją genów oraz tym, jak ta regulacja genów koduje. DNA przypomina biologię rozwojową i ewolucyjną.

Procedura ta została opracowana w celu uzyskania wglądu w elementy regulatorowe cis, które funkcjonują podczas rozwoju metamorficznego Drosophila melanogaster. W zasadzie jednak można go zastosować do elementów regulatorowych cis, które funkcjonują w innych stadiach rozwojowych oraz innych gatunków muszek owocowych, a nawet innych organizmów modelowych. W celu rozszerzenia linii transgenicznych należy ustawić dwie fiolki z kilkoma samcami i samicami much na przemian.

Przenieść muchy z jednej z fiolek do nowej fiolki. Powtarzaj to przez tydzień. Pod koniec dwóch tygodni sprawdź, czy transgeniczne muszki owocowe są w stadium od larwalnego do dorosłego.

Ocenę stopnia zaawansowania próbek należy rozpocząć pod koniec trzeciego stadium larwalnego w stadium rozwojowym, gdy utworzy się ER. Należy pamiętać, że próbka nie jest ruchliwa. ER jest zmiękczony na biało, a sfery zostały odwrócone do określonego punktu czasowego.

Jako zero HAPF. Odróżnienie samców od samic dzięki obecności obustronnie położonych gonad w pobliżu środka ciała, które pojawiają się jako półprzezroczyste okręgi do inscenizacji w oparciu o długość metamorfozy. Przy zerowym HAPF przenieś próbki do świeżej fiolki za pomocą zwilżonego pędzla.

Dodaj kawałek chusteczki Kim i zwilż wodą, aby próbki nie wyschły. Teraz inkubuj fiolkę w temperaturze 25 stopni Celsjusza, aż do pożądanego HAPF. Alternatywnie, klasyfikuje się próbki poprzez sortowanie na podstawie identyfikacji obecności i położenia kilku markerów morfologicznych, jak wyszczególniono w dołączonym tekście.

Za pomocą taśmy laboratoryjnej przyklej kawałek taśmy pakowej do deski rozwarstwiającej tak, aby powierzchnia taśmy klejącej była skierowana do góry. Zwilż pędzel i nałóż wilgoć na próbki za pomocą pędzla. Przenieś próbki do chusteczki Kim.

Przenieś próbki na taśmę pakową i przyklej powierzchnią grzbietową skierowaną do góry. Pozostaw próbki do wyschnięcia na 15 minut. Stopniowo otwieraj ostry dyżur za pomocą kleszczy.

Zacznij od przedniej lub trwałej ondulacji i idź w kierunku tylnego końca. Następnie przenieś pui do kropli lepkiego oleju na szkiełku mikroskopowym i oceń próbkę pod mikroskopem dla całych próbek mocowanych. Użyj obiektywu Forex lub 10 x, aby ustawić ostrość próbki.

Korzystając z oprogramowania mikroskopu konfokalnego, dostosuj długość fali wzbudzenia dla pożądanego białka fluorescencyjnego, aby zapobiec fotowybielaniu. Zacznij od intensywności lasera od pięciu do 10%Jeśli sygnał jest rozczarowujący, zwiększ intensywność w razie potrzeby, aby poprawić stosunek sygnału do szumu. W przypadku obrazów konfokalnych włącz ustawienia oprogramowania, które uśredniają pomiary pikseli z powtórzonych skanów, takie jak uśrednianie Kalmana do ilościowych porównań aktywności CRE, wykorzystuje przekrój C, w którym fluorescencja wydaje się najbardziej intensywna.

Przełącz się na tabelę przeglądową ostrzeżeń o nasyceniu i dostosuj wzmocnienie napięcia kanału i przesunięcie do ustawień, w których niewiele pikseli jest nasyconych. W razie potrzeby wyreguluj przysłonę konfokalną. Po określeniu optymalnych ustawień uruchom skanowanie ZS, aby uzyskać serię obrazów wzdłuż osi Z.

Po zakończeniu skanowania przekonwertuj stos obrazów na projekcję i zapisz ten plik obrazu w formacie TIF. Do ilościowego porównania aktywności CRE należy użyć tych samych ustawień konfokalnych dla wszystkich próbek replikowanych i reporterowych linii transgenowych. W przypadku eksperymentu z Image J program rozpoczął otwieranie obrazu TIFF, który ma zostać oceniony.

Kliknij przycisk wyboru odręcznego i obrysuj obszar próbki, w którym pożądane jest określenie ilościowe. Aby uzyskać statystykę wartości pikseli, kliknij kartę analizy, a następnie wybierz miarę. Zapisz średnią wartość piksela z pola wyników.

Zbierz również drugą średnią wartość piksela z obszaru tła, w którym CRE nie jest aktywny. Aby uzyskać skorygowaną średnią wartość piksela, kontynuuj generowanie statystyk wartości pikseli dla powtórzonych próbek. Następnie na podstawie skorygowanych w replice średnich wartości pikseli określ średnią aktywność regulacyjną dla A CRE, a także oblicz błąd standardowy średniej.

W tym eksperymencie wykorzystano intensywność fenotypu białego oka ratunkowego, aby linie transgeniczne były homozygotyczne. Białe zmutowane tło genetyczne genu z sekwencją miejsca lądowania A TTP jest wykorzystywane do integracji transgenu specyficznego dla danego miejsca. Osobniki transgeniczne, hemizygotyczne i homozygotyczne pod względem zintegrowanego wektora, różnią się intensywnością uratowanego fenotypu koloru oczu liczbą kopii zintegrowanego genu mini białego.

Linie homozygotyczne są następnie ustalane przez krzyżowanie samców i samic much o fenotypie najciemniejszego koloru oczu. Markery morfologiczne służą do określenia stadium metamorficznego dla drosophila podczas metamorfozy z larwy do dorosłej muszki owocowej. Osobnik przechodzi przez szereg stereotypowych morfologii, które można wykorzystać do określenia płci i przybliżenia etapu rozwojowego. Tu.

Dzika wersja A CRE określana jako element dymorficzny napędza wysoki poziom ekspresji reportera EGFP w segmencie brzusznym ASIC samicy puy. Stwierdzono, że sekwencja 13 par zasad w tym CRE jest miejscem wiązania czynnika transkrypcyjnego DSX, a znaczenie tej sekwencji in vivo wykazano poprzez ilościowe określenie aktywności regulatorowej CRE, gdy to miejsce wiązania jest zmutowane. Analizy ilościowe wskazują, że mutacja tego miejsca DSX zmniejszyła aktywność regulacyjną do 28 plus minus 3% ekspresji typu dzikiego w kontekście zastosowanego tutaj miejsca insercji transgenu.

Podobne porównania oceniają działania regulacyjne dla wewnątrzswoistych alleli CRE lub między autologicznymi CRE z różnych gatunków, na przykład w porównaniu z poziomami EGFP w segmencie żeńskim. Szóstka napędzana przez szczep żołądkowy D Melin S autologiczne CRE dla stymulantów gatunku D i D willi ma aktywność regulacyjną równą 75 plus minus 4% i zero plus lub minus 0% odpowiednio. Następujące metody proceduralne, takie jak interferencja RNA, mogą być stosowane z genami czynników transkrypcyjnych, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, w jaki sposób te geny czynników transkrypcyjnych oddziałują z elementami regulatorowymi CYS.

Wskazywałoby na to wzrost i spadek ekspresji fluorescencyjnych białek reporterowych, które są napędzane przez elementy regulatorowe CIS po jego opracowaniu. Procedura ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się regulacją genów do zbadania funkcjonalnego znaczenia, jakie motywy elementów regulatorowych cis i wyewoluowane mutacje mają dla ekspresji genów.