Myszowy model chirurgicznie wywołanej endometriozy poprzez autotransplantację tkanki macicy

Ogólnym celem niniejszej procedury jest chirurgiczne wywołanie endometriozy u myszy poprzez autologiczny transfer tkanki macicy do kaskady tętniczej krezki jelitowej. Osiąga się to najpierw poprzez podwiązanie, usunięcie i odsłonięcie błony śluzowej macicy. Drugim krokiem procedury jest stworzenie trzech implantów endometrydalnych z odsłoniętego endometrium przy użyciu dwumilimetrowego kleszczyka do biopsji.

Trzecim krokiem procedury jest przyszycie trzech implantów endometrioidalnych do tętnic w kaskadzie tętniczej krezki jelitowej. Ostatnim krokiem procedury jest zamknięcie ściany brzucha oraz skóry i pozostawienie zwierzęcia w celu rozwoju zmian endometrioidalnych. Wycięte z myszy zmiany przypominają te występujące u kobiet z endometriozą, co potwierdzono w analizie histologicznej oraz badaniu wzorców ekspresji genów i białek.

Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności z trzech głównych powodów. Po pierwsze, tkanki mysie są bardzo małe. Po drugie, krezka jelitowa jest podatna na uszkodzenia, a po trzecie, zbyt mocne zaciśnięcie szwów prowadzi do martwicy jelit.

Zacznij od zgromadzenia całego niezbędnego sprzętu chirurgicznego do przeprowadzenia skutecznej operacji aseptycznej, w tym roztworów do analgezji i anestezji. Po znieczuleniu zwierzęcia za pomocą wziewnego izofluranu, potwierdź pełną anestezję poprzez brak reakcji na bodziec uciskowy palca; aby zapobiec wysychaniu podczas operacji, nałóż maść oftalmiczną na oczy, a następnie wygol miejsce operacyjne za pomocą małej maszynki do golenia. Zdezynfekuj pole operacyjne, wykonując trzy naprzemienne przetarcia preparatem do mycia z chloreksydyną i 70% etanolem, a następnie przykryj zwierzę sterylnym polem operacyjnym.

Wykonaj niewielkie nacięcie w linii środkowej za pomocą małych nożyczek lub ostrza skalpela, kończąc je 0,5 do 1,0 centymetra rostralnie od otworu pochwy. Delikatnie rozszerz tępym sposobem ścianę ciała od ściany brzusznej, aby ułatwić późniejsze zamknięcie miejsca operacyjnego. Po rozszerzeniu tępym wykonaj niewielkie nacięcie w linii środkowej w ścianie brzusznej.

Następnie, używając małej pęsety, delikatnie zlokalizuj lewy róg macicy. Macica znajduje się grzbietnie w stosunku do jelita, które jest zazwyczaj widoczne bezpośrednio po wejściu w miejsce nacięcia; delikatnie odciągnij róg macicy do góry i wsuń pod niego rozwartą pęsetę, która będzie służyć jako retraktor. Warto również w tym momencie odnotować wygląd jajników oraz macicy.

Aby ułatwić datowanie cyklu rujowego. Na slajdzie dwa, umieść kawałki czarnej plecionej nici jedwabnej 5-0 o długości od 6 do 8 cm pod rozciągniętym rogiem macicy. Solidnie podwiąż róg na poziomie połączenia macicy z jajowodem.

Przymocuj szwy do jajowodu oraz w miejscu połączenia macicy z szyjką macicy. Wykonując węzeł kwadratowy w każdym z tych miejsc, pozostaw nieodcięte końce nici chirurgicznej. Wycięty fragment rogu macicy pomiędzy dwiema ligaturami umieść w szklanej płytce Petriego zawierającej około 100 µL PBS z dodatkiem penicyliny i streptomycyny.

Na koniec odetnij końce szwu jedwabnego. Jeśli szew poluzuje się lub wystąpi krwawienie, zlokalizuj kikut i zawiąż kolejny węzeł, używając małych nożyczek. Usuń tłuszcz z rogu macicy.

Otwórz róg macicy, wprowadzając jedno ostrze małych nożyczek do światła narządu. Delikatnie przesuwaj nożyczki wzdłuż rogu macicy, trzymając go pęsetą. W szklanej płytce Petriego użyj biopsyjnego wycinaka o średnicy 2 mm, aby wyciąć trzy implanty o jednakowej wielkości, dbając o to, aby nie doprowadzić do ich wyschnięcia.

Umieść sterylną gazę bezpośrednio nad miejscem nacięcia i dokładnie zwilż ją sterylnym PBS zawierającym penicylinę i streptomycynę. Ważne jest, aby podczas kolejnych etapów utrzymywać nawilżenie, używając do tego małych, gładkich pincet. Delikatnie zlokalizuj kątnicę i przesuń się wzdłuż jelita cienkiego.

Wyciągnij krótki, czterech do pięciu centymetrowy odcinek jelita i rozłóż go w formie wachlarza na uprzednio zwilżonej gazie, tak aby kaskada tętnicza krezki jelitowej była wyraźnie widoczna. Należy dopilnować, aby jelita były przez cały czas nawilżane sterylną solą fizjologiczną. Umieść jeden implant na igle, a następnie użyj szwu 6-0 aut black alon, aby delikatnie przymocować implant do tętnicy w odległości około 0,5 centymetra od jelita.

Użyć tylko jednego. Przerzucić przez pęsetę i nie zaciskać szwu zbyt mocno, ponieważ może to doprowadzić do zahamowania przepływu krwi i w konsekwencji do martwicy jelita.

Wykonać dwa węzły z jednym dodatkowym, zaciągnąć każdy z nich i odciąć szew w odległości dwóch milimetrów od implantu, a następnie nawilżyć jelito. Następnie przesunąć się w kierunku rostralnym. Wysunąć kolejne trzy do czterech centymetrów jelita i delikatnie przywrócić na miejsce odcinek, w którym znajduje się już implant.

Omiń jedną lub dwie tętnice od miejsca poprzedniego implantu i zaszyj kolejny implant; powtórz tę czynność dla trzeciego implantu. Na koniec zaszyj ścianę brzusną i zamknij skórę za pomocą klipsów chirurgicznych. Po zamknięciu miejsca operacyjnego i podaniu leków przeciwbólowych umieść zwierzę w klatce stroną brzuszną do dołu, częściowo na recyrkulacyjnej podkładce grzewczej z wodą, aż do momentu pełnego wybudzenia zwierzęcia.

Aby wyizolować zmiany endometrioidalne, należy zlokalizować czarne szwy w krezce jelitowej. Za pomocą suwmiarki zmierz długość i szerokość każdej zmiany endometrioidalnej. Wypreparuj zmiany endometrioidalne, uważając, aby ich nie rozciąć.

Usuń wszelką tkankę nieendometrioidalną z zmiany. Delikatnie poruszaj trzema wypełnionymi płynem zmianami endometrioidalnymi przed usunięciem szwu. Ostrożnie usuń szew i nacinij dwie z zmian endometrioidalnych.

Zważ je ponownie przed przystąpieniem do obróbki tkanek. Następnie wyciąć i zważyć pozostały róg macicy. Analiza histologiczna endometriozy u kobiet oraz w przedstawionym tutaj modelu mysim wskazuje, że zmiana endometrioidalna zawiera gruczoły i zręb endometrium. Zmiany endometriotyczne u myszy zawierają również makrofagi obciążone hemosyderyną, które są typową cechą endometriozy u kobiet. Zmiany endometrioidalne usunięte od myszy trzy dni po indukcji wydają się zapalne i krwotoczne, jak pokazano po lewej stronie, po dwóch do czterech tygodniach wzrostu.

Zmiany endometriozowe w modelu mysim są cystowate, wypełnione płynem i otoczone zrostami otrzewnymi w porównaniu z masą zmian w momencie indukcji. Zmiany wypełnione płynem były odpowiednio o 306% i 862% większe, a zmiany lancetowate o 51% i 172% większe w pierwszym i drugim miesiącu po indukcji. Zmiana endometriozowa wypełniona płynem i lancetowata.

Masa ciała pozostaje stała w miesiącu po indukcji w pięciu różnych eksperymentach przeprowadzonych zgodnie z tą procedurą. Model ten może być wykorzystany do odpowiedzi na pytania dotyczące patofizjologii endometriozy oraz do badania nowych terapii w leczeniu bólu i niepłodności związanych z tą chorobą.