Name: Dwa rodzaje testów do wykrywania chemoatrakcyjności plemników żab (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 2 s
Description: Poznaj dwie metody badania chemoatrakcyjności plemników żab: test akumulacji i test śledzenia ruchu. Techniki te pozwalają ilościowo ocenić migrację komórek w odpowiedzi na gradienty chemotaktyczne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy W.M. Keck Bioimaging Laboratory za możliwość skorzystania ze stanowiska mikroskopii wideo. Badanie to zostało sfinansowane z grantu NSF nr IBN-0615435.

<ol><li>Ward, G. E., Brokaw, C. J., Garbers, D. L., Vacquier, V. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotaxis+of+Arbacia+punctulata+spermatozoa+to+resact%2C+a+peptide+from+the+egg+jelly+layer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemotaxis of Arbacia punctulata spermatozoa to resact, a peptide from the egg jelly layer.</a> J. Cell Biol. 101, 2324-2329 (1985).</li>
<li>Olivera, R. G., Tomasi, L., Rovasio, R. A., Giojalas, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+velocity+and+induction+of+chemotactic+response+in+mouse+spermatozoa+by+follicular+and+oviductal+fluids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Reprod.+Fertil%22%5BJournal%5D)">Increased velocity and induction of chemotactic response in mouse spermatozoa by follicular and oviductal fluids.</a> J. Reprod. Fertil. 115, 23-27 (1999).</li>
<li>Fabro, G., Rovasio, R. A., Civalero, S., Frenkel, A., Caplan, S. R., Eisenbach, M., Giojalas, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotaxis+of+capacitated+rabbit+spermatozoa+to+follicular+fluid+revealed+by+a+novel+directionality-based+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Chemotaxis of capacitated rabbit spermatozoa to follicular fluid revealed by a novel directionality-based assay.</a> Biol. Reprod. 67, 1565-1571 (2002).</li>
<li>Sugiyama, H., Burnett, L., Xiang, X., Olson, J., Willis, S., Miao, A., Akema, T., Bieber, A. L., Chandler, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+multimer+formation+of+allurin%2C+a+sperm+chemoattractant+from+Xenopus+laevis+egg+jelly%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Reprod.+Dev%22%5BJournal%5D)">Purification and multimer formation of allurin, a sperm chemoattractant from Xenopus laevis egg jelly.</a> Mol. Reprod. Dev. 76, 527-536 (2009).</li>
<li>Al-Anzi, B., Chandler, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+laevis+egg+jelly+releases+a+sperm+chemoattractant+during+spawning%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Xenopus laevis egg jelly releases a sperm chemoattractant during spawning.</a> Dev. Biol. 198, 366-375 (1998).</li>
<li>Ralt, D., Goldenberg, M., Fetterolf, P., Thompson, D., Dor, J., Mashiach, S., Garbers, D. L., Eisenbach, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sperm+attraction+to+a+follicular+factor%28s%29+correlates+with+human+egg+fertilizability%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Sperm attraction to a follicular factor(s) correlates with human egg fertilizability.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 2840-2844 (1991).</li>
<li>Gakamsky, A., Schechtman, E., Caplan, S. R., Eisenbach, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+chemotaxis+when+the+fraction+of+responsive+cells+is+small--application+to+mammalian+sperm+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of chemotaxis when the fraction of responsive cells is small--application to mammalian sperm guidance.</a> Int. J. Dev. Biol. 52, 481-487 (2008).</li>
<li>Böhmer, M., Van, Q., Weyand, I., Hagen, V., Beyermann, M., Matsumoto, M., Hoshi, M., Hildebrand, E., Kaupp, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B+spikes+in+the+flagellum+control+chemotactic+behavior+of+sperm%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Ca2+ spikes in the flagellum control chemotactic behavior of sperm.</a> EMBO J. 24, 2741-2752 (2005).</li>
<li>Shiba, K., Baba, S. A., Inoue, T., Yoshida, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B+bursts+occur+around+a+local+minimal+concentration+of+attractant+and+trigger+sperm+chemotactic+response%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Ca2+ bursts occur around a local minimal concentration of attractant and trigger sperm chemotactic response.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 19312-19317 (2008).</li>
<li>Burnett, L. A., Sugiyama, H., Bieber, A. L., Chandler, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Egg+jelly+proteins+stimulate+directed+motility+in+Xenopus+laevis+sperm%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Reprod.+Dev%22%5BJournal%5D)">Egg jelly proteins stimulate directed motility in Xenopus laevis sperm.</a> Mol. Reprod. Dev. 78, 450-462 (2011).</li>
<li>Abaigar, T., Barbero, J., Holt, W. V. Trajectory variance and autocorrelations within single sperm tracks as population level descriptors of sperm track complexity, predictability and energy generating ability. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAbaigar%2C+T+%22J.+Androl%22">J. Androl</a>. , Forthcoming (2011).</li>
<li>Mortimer, S. T., Swan, M. A., Mortimer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fractal+analysis+of+capacitating+human+spermatozoa%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Fractal analysis of capacitating human spermatozoa.</a> Hum. Reprod. 11, 1049-1054 (1996).</li>
<li>Guerrero, A., Carneiro, J., Pimentel, A., Wood, C. D., Corkidi, G., Darszon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+locating+the+female+gamete%3A+the+importance+of+measuring+sperm+trajectories+in+three+spatial+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Strategies for locating the female gamete: the importance of measuring sperm trajectories in three spatial dimensions.</a> Mol. Hum. Reprod. 17, 511-523 (2011).</li>
<li>Yoshida, M., Yoshida, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sperm+chemotaxis+and+regulation+of+flagellar+movement+by+Ca2%2B%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Sperm chemotaxis and regulation of flagellar movement by Ca2+.</a> Mol. Hum. Reprod. 17, 457-465 (2011).</li>
<li>Spehr, M., Schwane, K., Riffell, J. A., Zimmer, R. K., Hatt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odorant+receptors+and+olfactory-like+signaling+mechanisms+in+mammalian+sperm.Mol%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Odorant receptors and olfactory-like signaling mechanisms in mammalian sperm.Mol.</a> Cell. Endocrinol. 250, 128-136 (2006).</li>
<li>Veitinger, T., Riffell, J. R., Veitinger, S., Nascimento, J. M., Triller, A., Chandsawangbhuwana, C., Schwane, K., Geerts, A., Wunder, F., Berns, M. W., Neuhaus, E. M., Zimmer, R. K., Spehr, M., Hatt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemosensory+Ca2%2B+dynamics+correlate+with+diverse+behavioral+phenotypes+in+human+sperm%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Chemosensory Ca2+ dynamics correlate with diverse behavioral phenotypes in human sperm.</a> J. Biol. Chem. 286, 17311-17325 (2011).</li>
<li>Tholl, N., Naqvi, S., McLaughlin, E., Boyles, S., Bieber, A. L., Chandler, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Swimming+of+Xenopus+laevis+sperm+exhibits+multiple+gears+and+its+duration+is+extended+by+egg+jelly+constituents%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Bull%22%5BJournal%5D)">Swimming of Xenopus laevis sperm exhibits multiple gears and its duration is extended by egg jelly constituents.</a> Biol. Bull. 220, 174-185 (2011).</li>
<li>Eisenbach, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sperm+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Rev.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Sperm chemotaxis.</a> Rev. Reprod. 4, 56-66 (1999).</li>
<li>Riffell, J. A., Zimmer, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+and+flow%3A+the+consequences+of+fluid+shear+for+sperm-egg+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Sex and flow: the consequences of fluid shear for sperm-egg interactions.</a> J. Exp. Biol. 210, 3644-3660 (2007).</li>
<li>Corkidi, G., Taboada, B., Wood, C. D., Guerrero, A., Darszon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+sperm+in+three-dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Tracking sperm in three-dimensions.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 373, 125-129 (2008).</li>
<li>Himes, J. E., Riffell, J. A., Zimmer, C. A., Zimmer, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sperm+chemotaxis+as+revealed+with+live+and+synthetic+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Bull%22%5BJournal%5D)">Sperm chemotaxis as revealed with live and synthetic eggs.</a> Biol Bull. 220, 1-5 (2011).</li>
<li>Sun, F., Giojolas, L. C., Rovasio, R. A., Tur-Kaspa, I., Sanchez, R., Eisenbach, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lack+of+species-specificity+in+mammalian+sperm+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Lack of species-specificity in mammalian sperm chemotaxis.</a> Dev. Biol. 255, 423-427 (2003).</li>
<li>Guidobaldi, H. A., Teves, M. E., Uñates, D. R., Anastasía, A., Giojalas, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progesterone+from+the+cumulus+cells+is+the+sperm+chemoattractant+secreted+by+the+rabbit+oocyte+cumulus+complex%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Progesterone from the cumulus cells is the sperm chemoattractant secreted by the rabbit oocyte cumulus complex.</a> PLoS One. 3, e3040-e3040 (2008).</li>
<li>Oren-Benaroya, R., Orvieto, R., Gakamsky, A., Pinchasov, M., Eisenbach, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sperm+chemoattractant+secreted+from+human+cumulus+cells+is+progesterone%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">The sperm chemoattractant secreted from human cumulus cells is progesterone.</a> Hum. Reprod. 23, 2339-2345 (2008).</li>
<li>Teves, M. E., Guidobaldi, H. A., Uñates, D. R., Sanchez, R., Miska, W., Publicover, S. J., Morales Garcia, A. A., Giojalas, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanism+for+human+sperm+chemotaxis+mediated+by+progesterone%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanism for human sperm chemotaxis mediated by progesterone.</a> PLoS One. 4, 8211-82 (2009).</li>
<li>Blengini, C. S., Teves, M. E., Uñates, D. R., Guidobaldi, H. A., Gatica, L. V., Giojalas, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+sperm+pattern+of+movement+during+chemotactic+re-orientation+towards+a+progesterone+source%5BTitle%5D)+AND+%22Asian+J.+Androl%22%5BJournal%5D)">Human sperm pattern of movement during chemotactic re-orientation towards a progesterone source.</a> Asian J. Androl. 13, 769-773 (2011).</li>
<li>Strünker, T., Goodwin, N., Brenker, C., Kashikar, N. D., Weyand, I., Seifert, R., Kaupp, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CatSper+channel+mediates+progesterone-induced+Ca2%2B+influx+in+human+sperm%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The CatSper channel mediates progesterone-induced Ca2+ influx in human sperm.</a> Nature. 471, 382-386 (2011).</li>
<li>Lishko, P. V., Botchkina, I. L., Kirichok, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progesterone+activates+the+principal+Ca2%2B+channel+of+human+sperm%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Progesterone activates the principal Ca2+ channel of human sperm.</a> Nature. 471, 387-391 (2011).</li>
<li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> J. Exp. Med. 115, 453-465 (1962).</li>
<li>Zigmond, S. H., Lauffenburger, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assays+of+leukocyte+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Med%22%5BJournal%5D)">Assays of leukocyte chemotaxis.</a> Annu. Rev. Med. 37, 149-155 (1986).</li>
<li>Villanueva-Diaz, C., Vadillo-Ortega, F., Kably-Ambe, A., Diaz-Pérez, M. A., Krivitzky, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+that+human+follicular+fluid+contains+a+chemoattractant+for+spermatozoa%5BTitle%5D)+AND+%22Fertil.+Steril%22%5BJournal%5D)">Evidence that human follicular fluid contains a chemoattractant for spermatozoa.</a> Fertil. Steril. 54, 1180-1182 (1990).</li>
<li>Villanueva-Diaz, C., Arizs-Martinez, J., Bermejo-Martinez, L., Vadillo-Ortega, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progesterone+induces+human+sperm+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Fertil.+Steril%22%5BJournal%5D)">Progesterone induces human sperm chemotaxis.</a> Fertil. Steril. 64, 1183-1188 (1995).</li>
<li>Olson, J., Xiang, X., Ziegert, T., Kittleson, A., Rawls, A., Bieber, A., Chandler, D. E. A. llurin <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+21+kD+sperm+chemoattractant+from+Xenopus+egg+jelly%2C+is+homologous+to+mammalian+sperm-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">a 21 kD sperm chemoattractant from Xenopus egg jelly, is homologous to mammalian sperm-binding proteins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 11205-11210 (2001).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Chemotaksja komórek przemieszczających się za pomocą ruchu ameboidalnego lub pływania napędzanego wiciami występuje w wielu kontekstach biologicznych, a badanie tego zjawiska wymaga dostępności praktycznych i niezawodnych testów. Niektóre przykłady tego zjawiska, takie jak przyciąganie plemników do komórki jajowej jeżowca lub gromadzenie się komórek śluzowców w celu utworzenia ciała owocnikowego, mają bezpośredni efekt wizualny. Ilościowe określanie tego zjawiska było podejmowane na różne sposoby, jak opisano w pracy Eis...

<table><tbody><tr><td>Płytki 24-dołkowe</td><td>BD Biosciences</td><td>35/1147</td><td></td></tr><tr><td>Wkładki o średnicy zewnętrznej 12 mm z membraną o porach 12 &amp;mu;m</td><td>EMD Millipore</td><td>PIXP01250</td><td>Wcześniej używano płytek transwell Costar-Corning nr 3403 – obecnie wycofane z produkcji</td></tr><tr><td>Komora Zigmonda</td><td>Neuroprobe</td><td>Z02</td><td></td></tr><tr><td>Olej silikonowy</td><td>GE Healthcare</td><td>SF1154</td><td>Odpowiednik Dow Corning 550 Fluid</td></tr><tr><td>Oprogramowanie Image J</td><td>Wayne Rasband, Research Services Branch, National Institute of Mental Health</td><td>Bezpłatne pobieranie ze strony http://rsbweb.nih.gov/ij</td><td>Program w języku Java działający w systemach Windows, Linux i Mac</td></tr><tr><td>Oprogramowanie MtrackJ</td><td><a href="http://www.bigr.nl/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Biomedical Imaging Group</a></td><td>Bezpłatne pobieranie ze strony &lt;a href=&quot;http://www.imagescience.org/meijering/software/mtrackj/">http://www.imagescience.org/meijering/software/mtrackj/&lt;/a&gt;</td><td>Program w języku Java działający w systemach Windows, Linux i Mac</td></tr><tr><td>Oprogramowanie Virtual Dub</td><td><a href="http://www.virtualdub.org/gpl.html" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> GNU General Public Licensed</a></td><td>Bezpłatne pobieranie z adresu &lt;a href=&quot;http://www.virtualdub.org/index.html">http://www.virtualdub.org/index.html&lt;/a&gt;</td><td>Instrukcje instalacji na stronie Image J w sekcji wtyczek (plugins); tylko dla systemu Windows</td></tr><tr><td>Oprogramowanie cellSens</td><td>Olympus Corporation</td><td>Patrz strona internetowa: &lt;a href=&quot;http://www.olympusamerica.com/seg_section/product.asp?product=1070">http://www.olympusamerica.com/seg_section/product.asp?product=1070&lt;/a&gt;</td><td>Służy do sterowania i pozyskiwania obrazów z różnych kamer. Posiada również funkcje przetwarzania obrazu</td></tr></tbody></table>

dwa rodzaje testów do wykrywania chemoatrakcji plemników żaby

Two Types of Assays for Detecting Frog Sperm Chemoattraction

Chemoatrakcja plemników u bezkręgowców może być na tyle silna, że można umieścić pipetę zawierającą atraktujący peptyd w zawiesinie plemników i pod mikroskopem zaobserwować ich gromadzenie się wokół pipety1. Chemoatrakcja plemników u kręgowców, takich jak żaby, gryzonie i ludzie, jest trudniejsza do wykrycia i wymaga analiz ilościowych. Analizy te dzielą się na dwa główne rodzaje: testy ilościowo określające ruch plemników w stronę źródła chemoatraktanta, tzw. testy akumulacji plemników, oraz testy umożliwiające rzeczywiste śledzenie trajektorii pływania poszczególnych plemników.
Testy akumulacji plemników są stosunkowo szybkie, co pozwala na przeprowadzenie od kilkunastu do kilkuset pomiarów w ciągu jednego dnia, umożliwiając tym samym sprawne wyznaczanie krzywych odpowiedzi na dawkę oraz przebiegów czasowych. Tego rodzaju analizy były szeroko wykorzystywane do charakteryzacji wielu ugruntowanych systemów chemoatrakcji – na przykład chemotaksji neutrofili w kierunku peptydów bakteryjnych oraz chemotaksji plemników w kierunku płynu pęcherzykowego. Testy śledzenia plemników mogą być bardziej pracochłonne, ale dostarczają dodatkowych danych na temat tego, w jaki sposób chemoatraktanty faktycznie zmieniają ścieżki pływania plemników. Ten typ analizy jest niezbędny do wykazania orientacji ruchu plemników względem osi gradientu chemoatraktanta oraz do wizualizacji charakterystycznych zwrotów lub zmian orientacji, które przybliżają plemnik do komórki jajowej.
W niniejszym opracowaniu opisujemy metody stosowane w obu tych rodzajach testów. Wykorzystany test akumulacji plemników nazywany jest testem „dwukomorowym”. Plemniki płazów umieszcza się w wkładce do płytki hodowlanej z poliwęglanowym dnem filtrującym o porach o średnicy 12 μm. Wkładki z plemnikami umieszcza się w dołkach płytki hodowlanej zawierających bufor oraz chemoatraktant, który jest ostrożnie pipetowany na dno dołka w miejscu styku dna ze ścianką (patrz Rys. 1). Po inkubacji górną wkładkę zawierającą rezerwuar plemników ostrożnie usuwa się, a plemniki w dolnej komorze, które przeszły przez membranę, są pobierane, wirowane w celu uzyskania osadu, a następnie zliczane za pomocą hemocytometru lub cytometru przepływowego.
Test śledzenia plemników wykorzystuje komorę Zigmonda, opracowaną pierwotnie do obserwacji chemotaksji neutrofilów i zmodyfikowaną do obserwacji plemników przez Giojalasa i współpracowników2,3. Komora składa się z grubego szkiełka przedmiotowego, w którym wyfrezowano dwa pionowe rowki. Są one oddzielone platformą obserwacyjną o szerokości 1 mm. Po nałożeniu szkiełka nakrywkowego, do jednego rowka wprowadza się plemniki, a do drugiego czynnik chemoatraktancyjny, a następnie ruch poszczególnych plemników jest wizualizowany za pomocą mikroskopii wideo. Materiał wideo jest następnie analizowany za pomocą oprogramowania w celu zidentyfikowania dwuwymiarowych ruchów komórek w płaszczyźnie x-y jako funkcji czasu (zbiory danych xyt), które tworzą trajektorię każdego plemnika.

Komórki jajowe oraz otaczające je powłoki pozakomórkowe często uwalniają peptydy, białka i małe cząsteczki, które komunikują się z plemnikami, by prowadzić je do jaja, wspomagając tym samym zapłodnienie. Wykorzystując plemniki żaby, opisujemy i porównujemy dwie klasy testów służących do wykrywania chemotaksji plemników – testy akumulacji plemników oraz testy śledzenia trajektorii plemników.

Dwa rodzaje testów do wykrywania chemoatrakcji plemników żaby

Chemoatrakcja plemników u bezkręgowców może być na tyle silna, że można umieścić pipetę zawierającą atrakcyjny peptyd w zawiesinie plemników...

W niniejszym opracowaniu opisano dwie różne metody oceny chemoatrakcji plemników w teście dwukomorowym. Aktywowane plemniki żaby są najpierw dozowane do insertów z porowatą membraną na dnie, umieszczonych w dołkach płytki 24-dołkowej. Następnie, po umieszczeniu plemników, do dna dołka ostrożnie dodaje się chemoatraktant, aby zainicjować gradient chemoatrakcyjny.Następnie plemniki inkubuje się, aby umożliwić komórkom czas na przekroczenie porowatej membrany w odpowiedzi na gradient chemotaktyczny. Na koniec wkład usuwa się, a plemniki, które przemieściły się na dno dołka w teście dwukomorowym, zlicza się za pomocą hemocytometru. Ostatecznie aktywność chemoatraktantów plemników można porównać i określić ilościowo, na przykład poprzez analizę krzywej zależności dawka-odpowiedź w teście śledzenia w komorze Zigmana.Najpierw za pomocą oleju silikonowego przymocowuje się szkiełko nakrywkowe do komory Zigmana, a następnie umieszcza się ją dnem do góry nad okrągłym otworem mikroskopu. Jedną z części komory wypełnia się aktywnymi plemnikami żaby. Następnie drugą część wypełnia się roztworem chemoatraktanta.Po pięciu minutach tworzy się gradient chemotaktyczny, a w tym czasie można zarejestrować na wideo ruch plemników płynących wzdłuż tego gradientu. Ostatecznie materiał uzyskany z testu śledzenia w komorze Zigmunnda może zostać przeanalizowany w celu określenia prędkości plemników oraz wzorców chemokinetycznych i trajektorii ich przemieszczania się w odpowiedzi na gradient chemoatraktanta. Te dwie metody wykrywania chemotaksji plemników są komplementarne i dostarczają różnych rodzajów danych.Test w komorze dwudzielnej umożliwia przechodzenie plemników przez porowatą membranę, co pozwala na ilościowe określenie reakcji plemników na chemoatraktant. Wizualna prezentacja testu w komorze dwudzielnej jest kluczowa, ponieważ etapy dodawania plemników i chemoatraktantu na początku, a także usuwanie plemników i wkładów na końcu, wymagają precyzyjnego operowania mikropipetą. Test w komorze Zigmunda wykorzystuje zapis wideo do rejestracji ruchu plemników w gradiencie chemotaktycznym.Umożliwia to określenie parametrów dynamicznych, takich jak prędkość i kierunek. Główną zaletą testu śledzenia w komorze Zigmunda w porównaniu z testem dwukomorowym jest możliwość wizualizacji i analizy ruchu plemników przy użyciu szeregu parametrów dynamicznych. Wypłucz plemniki z jądra żaby, wykonując otwory na jednym końcu i wstrzykując bufor za pomocą strzykawki z igłą z przeciwległego końca.Po wypłukaniu plemników z jąder żaby, oszacuj liczbę komórek zebranych do probówki. Następnie rozcieńcz roztwór zapasowy plemników w buforze Ringera dla oocytów, aby uzyskać gęstość plemników na poziomie 2 × 10⁷ komórek/mL. Oceń ruchliwość plemników, rozcieńczając 5 µL plemników w stosunku 1:10 buforem F1 i obserwując ruchy przy użyciu optyki kontrastowej fazowej.Następnie za pomocą mikropipety nanieś 700 µL buforu F1 do każdej studni plastikowej 24-studzienkowej płytki do hodowli tkanek. Następnie, w celu aktywacji ruchliwości plemników poprzez szok osmotyczny dla każdego planowanego testu, rozcieńcz 100 µL zawiesiny plemników w 900 µL buforu F1 w temperaturze pokojowej, używając probówki do mikrowirówki. Umieść wkładkę o średnicy zewnętrznej 12 mm i porowatości 12 µm w studni wypełnionej buforem, upewniając się, że wkładka jest umieszczona poza centrum, pozostawiając wolną przestrzeń z jednej strony.Następnie, używając mikropipety z uciętą końcówką, natychmiast przenieś 400 µl plemników aktywowanych ruchliwie do dołka, nakładając zawiesinę plemników na ściankę wkładu, aby spłynęła ona na filtr znajdujący się na dnie wkładu. Następnie ostrożnie nanieś mikropipetą 50 µl czynnika chemoatraktującego do każdego dołka płytki, w przestrzeń między dołkiem a przesuniętym względem centrum wkładem.Należy uważać, aby nanieść kroplę w miejscu, gdzie ścianka boczna łączy się z dnem dołka. Wyjąć pipetę, nie zakłócając układu. Po przygotowaniu wszystkich analiz.Pozostaw płytkę w temperaturze pokojowej do momentu, aż pierwszy rozpoczęty test zostanie inkubowany przez 50 minut. Następnie, po zakończeniu pierwszego testu, ostrożnie unieruchom insert jedną ręką. Przerwij test, usuwając mikro pipetą większość lub całość zawiesiny plemników z górnej komory.Po przeniesieniu plemników z górnej komory należy natychmiast wyjąć wkładkę i ją wyrzucić. Następnie wymieszać zawiesiny plemników w każdej studzience, aby resuspendować plemniki, które osiadły na dnie. Po tym przenieść całą zawiesinę plemników z każdej studzinki do oddzielnych probówek do mikrocentryfugi.Dodać formaldehyd do stężenia końcowego 0,5% objętościowo. Odwirować utrwalone plemniki w każdej probówce, tworząc osad. Wykorzystując przycisk ustawienia na dziesięć sekund, wirować w osobistej mikrowirówce.Następnie z każdej probówki usuń cały nadsącz, pozostawiając jedynie 100 µL, i w tej objętości resuspenduj osad. Dalej, 20 µL zawiesiny plemników rozcieńcz 1:10 wodą destylowaną, a następnie policz plemniki za pomocą komory countingowej (hemocytometru). Przy użyciu obiektywu 40x mikroskopu biologicznego, analiza w dwóch komorach dostarcza wyników ilościowych, które są odpowiednie do badań zależności dawka-odpowiedź lub do porównań między różnymi atraktantami.Przykładowo, woda z jaj żaby zawiera chemoatraktant dla plemników, który przyciąga je w sposób pokazany za pomocą czerwonych symboli. Woda z jaj powoduje wzrost, a następnie spadek liczby plemników przenikających przez porowatą membranę wraz ze zwiększaniem dawki chemoatraktantu. W przeciwieństwie do tego, albumina surowicy bydlęcej, reprezentowana przez białe symbole, wykazuje niewielki wpływ w tym samym zakresie dawek.Przed rozpoczęciem testu w komorze Zigmana należy najpierw upewnić się, że stanowisko z mikroskopem odwróconym jest przygotowane do rejestracji wideo. Należy ustawić mikroskop. Następnie należy uruchomić oprogramowanie sterujące kamerą, aby rejestrować siedem klatek na sekundę.Należy upewnić się, że kamera jest ustawiona na platformie obserwacyjnej, a obraz jest przesyłany na monitor komputera. Następnie należy sprawdzić, czy pole widzenia mikroskopu obejmuje większość lub całość szerokości platformy obserwacyjnej. Potem należy przygotować zawiesinę plemników żaby w buforze Ringera dla oocytów oraz chemoatraktant rozcieńczony do odpowiedniego stężenia buforem F1, a oba roztwory przechowywać w lodzie do momentu użycia.Następnie, zaczynając od czystej i suchej komory Zigmund, należy za pomocą mikropipety nanieść linię około 4 µL oleju silikonowego, w odległości około 5 mm od zewnętrznej krawędzi każdego wgłębienia, równolegle do niej. Następnie na komorę nakłada się szkiełko nakrywkowe o wymiarach 22 x 40 mm, pozwalając olejowi silikonowemu równomiernie rozpłynąć się do zewnętrznej krawędzi każdego wgłębienia.Teraz należy odwrócić komorę i umieścić ją nad dużym okrągłym otworem w stole mikroskopu. Uważając, aby szkiełko nakrywkowe nie stykało się ze stołem, należy aktywować 20 µL plemników xap w buforze Ringer'a dla oocytów, mieszając je w stosunku 1:10 z buforem F1 w temperaturze pokojowej. Używając mikropipety z przyciętym końcem, należy niezwłocznie pobrać 70 µL plemników o aktywowanej ruchliwości.Następnie, trzymając mikropipetę pod niskim kątem, należy umieścić końcówkę przy bocznym otworze. Wypełnić trth i mostek poprzez działanie kapilarne. Następnie w ten sam sposób wypełnić przeciwległe trth, używając roztworu chemoatraktanta, ponieważ plemniki xap mają ograniczony czas żywotności ruchliwości.Rozpocznij nagrywanie w ciągu trzech minut i kontynuuj przez pięć minut. Test śledzenia w komorze Zigmana umożliwia mikroskopię wideo plemników płynących w gradiencie chemoatraktanta. Film ten przedstawia zapis ruchu plemników na platformie obserwacyjnej, przy czym ich trajektorie są zaznaczone na czerwono, tak jak pokazano na tym schemacie.Trajektorie plemników składają się z segmentów, z których każdy jest zaznaczony strzałką i reprezentuje ruch plemnika pomiędzy kolejnymi klatkami filmu. Segmenty trajektorii odwzorowują zachowanie pływackie poszczególnych plemników i podkreślają wzorce, takie jak okręgi i zwroty. Na podstawie tych danych można określić prędkość i kierunek każdego segmentu lub właściwości wszystkich segmentów w jednej trajektorii bądź w grupie trajektorii.Na przykład, wypadkowy dystans liniowy. Wektor łączący początek trajektorii z jej końcem posiada składową na osi x i znajduje się pod kątem theta względem osi x; jak przedstawiono tutaj na czerwono, theta powinna maleć, a przemieszczenie wzdłuż osi x powinno wzrastać w obecności gradientu chemoatraktanta. Zmiany te oznaczają, że plemniki wykazują preferencję do pływania w górę gradientu w kierunku chemoatraktanta. Podczas przeprowadzania obu tych testów należy pamiętać, że właściwe załadowanie plemników i chemoatraktanta do każdego urządzenia jest kluczowe dla uzyskania powtarzalnych gradientów chemotaktycznych w ocenie sprawności plemników.

two-types-of-assays-for-detecting-frog-sperm-chemoattraction

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Dwa rodzaje badań w celu wykrycia chemoatraktantów plemników żab

Opisano metodę ilościowej oceny reakcji chemotaktycznej Caenorhabditis elegans. Zastosowano wskaźnik chemotaksyczny (CI) jako sposób dokładnej oceny reakcji robaków na określone cele oraz jako platformę porównawczą między odmianami i związkami interesującymi.

C. elegans Test chemotaktyksy

Różnicowa zdolność konkurencyjna plemników wśród samców Drosophila o różnych genotypach może być stwierdzona poprzez eksperymenty z podwójnym kryciem. Każdy z tych eksperymentów obejmuje jednego z interesujących samców i samca referencyjnego. Łatwe do zidentyfikowania markery w potomstwie pozwalają na wnioskowanie o frakcji osobników spłodzonych przez każdego samca.

Ocena różnic w zdolności konkurencyjnej plemników u Drosophila

Kijanki Xenopus laevis preferują pływanie po białej stronie czarno-białego zbiornika. W tym zachowaniu kieruje się ich wizją. Opierając się na tym zachowaniu, przedstawiamy prosty test do testowania funkcji wzrokowej kijanek.

Prosty test behawioralny do badania funkcji wzrokowych u Xenopus laevis

Tutaj prezentujemy metodologie oceny integralności błony plemników, cechy komórkowej związanej z kompetencją zapłodnienia plemników. Opisujemy trzy techniki fluorymetrycznej oceny błon plemników: jednoczesne barwienie za pomocą specyficznych sond fluorescencyjnych, mikroskopię fluorescencyjną oraz zaawansowaną cytometrię przepływową dedykowaną plemnikom. Przedstawiono również przykłady łączenia metodyk.

Techniki fluorymetryczne do oceny błon plemników

Tutaj opisane są dwa średnioprzepustowe testy do oceny wpływu na sygnalizację Ca2+ i reakcję akrosomów w plemnikach ludzkich. Testy te można wykorzystać do szybkiego i łatwego badania przesiewowego dużych ilości związków pod kątem wpływu na sygnalizację Ca2 + i reakcję akrosomów w ludzkich plemnikach.

Średnioprzepustowe testy przesiewowe do oceny wpływu na sygnalizacjęCa2+ i reakcję akrosomów w plemnikach ludzkich

Plemnik musi pomyślnie przejść przez jajowód, aby zapłodnić oocyt. W tym miejscu opisujemy test do pomiaru migracji plemników w obrębie macicy hermafrodyty C. elegans. Test ten może dostarczyć danych ilościowych na temat rozmieszczenia plemników w macicy po kryciu, a także na temat prędkości, prędkości kierunkowej i częstotliwości odwrócenia.

Pomiar przewodnictwa i ruchliwości plemników w hermafrodytowym układzie rozrodczym Caenorhabditis elegans

Opisujemy zastosowanie analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego do monitorowania zmian w czasie rzeczywistym w glikolizie i fosforylacji oksydacyjnej podczas kapacytacji nasienia myszy.

Używanie analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego do pomiaru zmian w glikolizie i fosforylacji oksydacyjnej podczas kapacytacji plemników myszy

Tutaj prezentujemy protokół badania konkurencyjności godowej samców Aedes aegypti przy użyciu barwnika fluorescencyjnego jako markera. Samice komarów są narażone na kontakt zarówno z oznaczonymi, jak i nieoznaczonymi samcami w celu kopulacji. Po kryciu ich plemniki są badane pod mikroskopem fluorescencyjnym w celu określenia ich partnera godowego.

Wykorzystanie barwnika fluorescencyjnego, rodaminy B, do badania konkurencyjności godowej samców komarów Aedes aegypti

Gdy transformujący czynnik wzrostu ß białka prekursorowe rodziny są ektopowo wyrażane w zarodkach Xenopus laevis, ulegają one dimeryzacji, rozszczepianiu i są wydzielane do blastocoele, który zaczyna się w późnym stadium blastuli do wczesnego stadium gastruli. Opisano metodę zasysania produktów rozszczepienia z jamy blastocoele do analizy immunoblot.

Analiza produktów rozpadu rodziny transformujących czynników wzrostu wydzielanych do blastocoele zarodków Xenopus laevis

Ten protokół ustanawia metody ekstrakcji i ilościowego określania reakcji na lotny feromon płciowy w C. elegans, zapewniając narzędzia do badania komunikacji chemicznej i trajektorii nawigacji.

Lotna ekstrakcja feromonów płciowych i test chemoatrakcji w Caenorhabditis elegans

Poznaj dwie metody badania chemoatrakcyjności plemników żab: test akumulacji i test śledzenia ruchu. Techniki te pozwalają ilościowo ocenić migrację komórek w odpowiedzi na gradienty chemotaktyczne.

Dwa rodzaje testów do wykrywania chemoatrakcji plemników żaby

Przeglądaj więcej filmów