Dwa rodzaje testów do wykrywania chemoatrakcji plemników żaby

W niniejszym opracowaniu opisano dwie różne metody oceny chemoatrakcji plemników w teście dwukomorowym. Aktywowane plemniki żaby są najpierw dozowane do insertów z porowatą membraną na dnie, umieszczonych w dołkach płytki 24-dołkowej. Następnie, po umieszczeniu plemników, do dna dołka ostrożnie dodaje się chemoatraktant, aby zainicjować gradient chemoatrakcyjny.

Następnie plemniki inkubuje się, aby umożliwić komórkom czas na przekroczenie porowatej membrany w odpowiedzi na gradient chemotaktyczny. Na koniec wkład usuwa się, a plemniki, które przemieściły się na dno dołka w teście dwukomorowym, zlicza się za pomocą hemocytometru. Ostatecznie aktywność chemoatraktantów plemników można porównać i określić ilościowo, na przykład poprzez analizę krzywej zależności dawka-odpowiedź w teście śledzenia w komorze Zigmana.

Najpierw za pomocą oleju silikonowego przymocowuje się szkiełko nakrywkowe do komory Zigmana, a następnie umieszcza się ją dnem do góry nad okrągłym otworem mikroskopu. Jedną z części komory wypełnia się aktywnymi plemnikami żaby. Następnie drugą część wypełnia się roztworem chemoatraktanta.

Po pięciu minutach tworzy się gradient chemotaktyczny, a w tym czasie można zarejestrować na wideo ruch plemników płynących wzdłuż tego gradientu. Ostatecznie materiał uzyskany z testu śledzenia w komorze Zigmunnda może zostać przeanalizowany w celu określenia prędkości plemników oraz wzorców chemokinetycznych i trajektorii ich przemieszczania się w odpowiedzi na gradient chemoatraktanta. Te dwie metody wykrywania chemotaksji plemników są komplementarne i dostarczają różnych rodzajów danych.

Test w komorze dwudzielnej umożliwia przechodzenie plemników przez porowatą membranę, co pozwala na ilościowe określenie reakcji plemników na chemoatraktant. Wizualna prezentacja testu w komorze dwudzielnej jest kluczowa, ponieważ etapy dodawania plemników i chemoatraktantu na początku, a także usuwanie plemników i wkładów na końcu, wymagają precyzyjnego operowania mikropipetą. Test w komorze Zigmunda wykorzystuje zapis wideo do rejestracji ruchu plemników w gradiencie chemotaktycznym.

Umożliwia to określenie parametrów dynamicznych, takich jak prędkość i kierunek. Główną zaletą testu śledzenia w komorze Zigmunda w porównaniu z testem dwukomorowym jest możliwość wizualizacji i analizy ruchu plemników przy użyciu szeregu parametrów dynamicznych. Wypłucz plemniki z jądra żaby, wykonując otwory na jednym końcu i wstrzykując bufor za pomocą strzykawki z igłą z przeciwległego końca.

Po wypłukaniu plemników z jąder żaby, oszacuj liczbę komórek zebranych do probówki. Następnie rozcieńcz roztwór zapasowy plemników w buforze Ringera dla oocytów, aby uzyskać gęstość plemników na poziomie 2 × 10⁷ komórek/mL. Oceń ruchliwość plemników, rozcieńczając 5 µL plemników w stosunku 1:10 buforem F1 i obserwując ruchy przy użyciu optyki kontrastowej fazowej.

Następnie za pomocą mikropipety nanieś 700 µL buforu F1 do każdej studni plastikowej 24-studzienkowej płytki do hodowli tkanek. Następnie, w celu aktywacji ruchliwości plemników poprzez szok osmotyczny dla każdego planowanego testu, rozcieńcz 100 µL zawiesiny plemników w 900 µL buforu F1 w temperaturze pokojowej, używając probówki do mikrowirówki. Umieść wkładkę o średnicy zewnętrznej 12 mm i porowatości 12 µm w studni wypełnionej buforem, upewniając się, że wkładka jest umieszczona poza centrum, pozostawiając wolną przestrzeń z jednej strony.

Następnie, używając mikropipety z uciętą końcówką, natychmiast przenieś 400 µl plemników aktywowanych ruchliwie do dołka, nakładając zawiesinę plemników na ściankę wkładu, aby spłynęła ona na filtr znajdujący się na dnie wkładu. Następnie ostrożnie nanieś mikropipetą 50 µl czynnika chemoatraktującego do każdego dołka płytki, w przestrzeń między dołkiem a przesuniętym względem centrum wkładem.

Należy uważać, aby nanieść kroplę w miejscu, gdzie ścianka boczna łączy się z dnem dołka. Wyjąć pipetę, nie zakłócając układu. Po przygotowaniu wszystkich analiz.

Pozostaw płytkę w temperaturze pokojowej do momentu, aż pierwszy rozpoczęty test zostanie inkubowany przez 50 minut. Następnie, po zakończeniu pierwszego testu, ostrożnie unieruchom insert jedną ręką. Przerwij test, usuwając mikro pipetą większość lub całość zawiesiny plemników z górnej komory.

Po przeniesieniu plemników z górnej komory należy natychmiast wyjąć wkładkę i ją wyrzucić. Następnie wymieszać zawiesiny plemników w każdej studzience, aby resuspendować plemniki, które osiadły na dnie. Po tym przenieść całą zawiesinę plemników z każdej studzinki do oddzielnych probówek do mikrocentryfugi.

Dodać formaldehyd do stężenia końcowego 0,5% objętościowo. Odwirować utrwalone plemniki w każdej probówce, tworząc osad. Wykorzystując przycisk ustawienia na dziesięć sekund, wirować w osobistej mikrowirówce.

Następnie z każdej probówki usuń cały nadsącz, pozostawiając jedynie 100 µL, i w tej objętości resuspenduj osad. Dalej, 20 µL zawiesiny plemników rozcieńcz 1:10 wodą destylowaną, a następnie policz plemniki za pomocą komory countingowej (hemocytometru). Przy użyciu obiektywu 40x mikroskopu biologicznego, analiza w dwóch komorach dostarcza wyników ilościowych, które są odpowiednie do badań zależności dawka-odpowiedź lub do porównań między różnymi atraktantami.

Przykładowo, woda z jaj żaby zawiera chemoatraktant dla plemników, który przyciąga je w sposób pokazany za pomocą czerwonych symboli. Woda z jaj powoduje wzrost, a następnie spadek liczby plemników przenikających przez porowatą membranę wraz ze zwiększaniem dawki chemoatraktantu. W przeciwieństwie do tego, albumina surowicy bydlęcej, reprezentowana przez białe symbole, wykazuje niewielki wpływ w tym samym zakresie dawek.

Przed rozpoczęciem testu w komorze Zigmana należy najpierw upewnić się, że stanowisko z mikroskopem odwróconym jest przygotowane do rejestracji wideo. Należy ustawić mikroskop. Następnie należy uruchomić oprogramowanie sterujące kamerą, aby rejestrować siedem klatek na sekundę.

Należy upewnić się, że kamera jest ustawiona na platformie obserwacyjnej, a obraz jest przesyłany na monitor komputera. Następnie należy sprawdzić, czy pole widzenia mikroskopu obejmuje większość lub całość szerokości platformy obserwacyjnej. Potem należy przygotować zawiesinę plemników żaby w buforze Ringera dla oocytów oraz chemoatraktant rozcieńczony do odpowiedniego stężenia buforem F1, a oba roztwory przechowywać w lodzie do momentu użycia.

Następnie, zaczynając od czystej i suchej komory Zigmund, należy za pomocą mikropipety nanieść linię około 4 µL oleju silikonowego, w odległości około 5 mm od zewnętrznej krawędzi każdego wgłębienia, równolegle do niej. Następnie na komorę nakłada się szkiełko nakrywkowe o wymiarach 22 x 40 mm, pozwalając olejowi silikonowemu równomiernie rozpłynąć się do zewnętrznej krawędzi każdego wgłębienia.

Teraz należy odwrócić komorę i umieścić ją nad dużym okrągłym otworem w stole mikroskopu. Uważając, aby szkiełko nakrywkowe nie stykało się ze stołem, należy aktywować 20 µL plemników xap w buforze Ringer'a dla oocytów, mieszając je w stosunku 1:10 z buforem F1 w temperaturze pokojowej. Używając mikropipety z przyciętym końcem, należy niezwłocznie pobrać 70 µL plemników o aktywowanej ruchliwości.

Następnie, trzymając mikropipetę pod niskim kątem, należy umieścić końcówkę przy bocznym otworze. Wypełnić trth i mostek poprzez działanie kapilarne. Następnie w ten sam sposób wypełnić przeciwległe trth, używając roztworu chemoatraktanta, ponieważ plemniki xap mają ograniczony czas żywotności ruchliwości.

Rozpocznij nagrywanie w ciągu trzech minut i kontynuuj przez pięć minut. Test śledzenia w komorze Zigmana umożliwia mikroskopię wideo plemników płynących w gradiencie chemoatraktanta. Film ten przedstawia zapis ruchu plemników na platformie obserwacyjnej, przy czym ich trajektorie są zaznaczone na czerwono, tak jak pokazano na tym schemacie.

Trajektorie plemników składają się z segmentów, z których każdy jest zaznaczony strzałką i reprezentuje ruch plemnika pomiędzy kolejnymi klatkami filmu. Segmenty trajektorii odwzorowują zachowanie pływackie poszczególnych plemników i podkreślają wzorce, takie jak okręgi i zwroty. Na podstawie tych danych można określić prędkość i kierunek każdego segmentu lub właściwości wszystkich segmentów w jednej trajektorii bądź w grupie trajektorii.

Na przykład, wypadkowy dystans liniowy. Wektor łączący początek trajektorii z jej końcem posiada składową na osi x i znajduje się pod kątem theta względem osi x; jak przedstawiono tutaj na czerwono, theta powinna maleć, a przemieszczenie wzdłuż osi x powinno wzrastać w obecności gradientu chemoatraktanta. Zmiany te oznaczają, że plemniki wykazują preferencję do pływania w górę gradientu w kierunku chemoatraktanta. Podczas przeprowadzania obu tych testów należy pamiętać, że właściwe załadowanie plemników i chemoatraktanta do każdego urządzenia jest kluczowe dla uzyskania powtarzalnych gradientów chemotaktycznych w ocenie sprawności plemników.