Monitorowanie aktywności kinaz i fosfatazy w całym cyklu komórkowym za pomocą ratiometrycznego FRET

W tym filmie aktywność kinazy i fosfatazy jest monitorowana przez cały cykl komórkowy za pomocą transferu energii rezonansu Forrester lub progu. W tym przypadku sonda aktywności kinazy polo lub LK ma cyjanowo-fluorescencyjne białko CFP umieszczone na jednym końcu i żółte białko fluorescencyjne YFP umieszczone na drugim. Ta sonda jest transfekowana do komórek U2 OS.

Następnie, aby zbadać stan fosforylacji celów LK one podczas przejścia G dwa dwa M, komórki TRANSFECTED U2 OS są poddawane obrazowaniu fluorescencyjnemu w czasie poklatkowym. Gdy CFP i YFP znajdują się w bliskiej odległości, a CFP jest wzbudzony, energia jest przekazywana do YFP i można wykryć przyjęcie YFP. Jednakże, gdy sonda ulega fosforylacji, potwierdzona zmiana w białku oddziela CFP i YFP.

Teraz, gdy CFP jest wzbudzony, wykrywa się silną emisję CFP i tylko słabą emisję YFP Kwantyfikacja stosunku emisji YFP po wzbudzeniu zarówno CFP, jak i YFP pokazuje, że aktywność PLK one wzrasta w G dwa i osiąga szczyt podczas mitozy. Tak więc główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak standardowe filmowanie geometryczne, jest to, że szczególną uwagę zwraca się na to, aby cykl komórkowy nie był zaburzony ani przez warunki filmowania, ani przez ekspresję sondy. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie cyklu komórkowego, takie jak to, gdzie i kiedy aktywowane są określone kinazy lub fosfatazy.

Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w enzymy regulowane cyklem komórkowym, może być również stosowana w innych systemach, w których wymagane są warunki nierozwierne, takich jak testy proliferacji komórek. Aby monitorować ludzki cykl komórkowy, komórki U2 OS są transfekowane za pomocą sondy aktywności PK One opartej na progu. Stosując standardową metodę transfekcji fosforanu wapnia, komórki są selekcjonowane w pur mycynie przez co najmniej siedem dni.

Wzbogaca to populację komórek wykazujących ekspresję sondy i ogranicza liczbę komórek z toksycznymi poziomami ekspresji lub poziomami ekspresji, które poważnie wpływają na cykl komórkowy. Stabilne klony są następnie wybierane przez ograniczoną ekspresję CFP w rozcieńczeniu, a YFP jest następnie badany w celu sprawdzenia, czy są one obecne we wszystkich komórkach w przybliżeniu w tym samym stosunku. Jeśli niektóre komórki zawierają tylko CFP lub prawdopodobnie w tym przypadku nastąpiła rekombinacja YFP, powtórz przygotowanie plazmidu przy użyciu bakterii, które są mniej podatne na rekombinację homologiczną, takich jak pewne dwie komórki, a następnie linearyzuj plazmid i powtórz transfekcję.

Gdy komórki stabilnie wyrażają sondę, umieść je na szklanych naczyniach o dnie 1,5 po tym, jak się przyczepią i są w 30 do 50% zlewane. Zmień pożywkę na taką, która jest niezależna od CO2 i nie zawiera czerwieni fenolowej, zamontuj komórki na zmotoryzowanym mikroskopie fluorescencyjnym epi Z kontrolą temperatury ustawioną na 37 stopni Celsjusza. Mikroskop powinien być wyposażony w filtry wzbudzenia i emisji CFP i YFP.

Lustro ROIC odpowiednie do monitorowania CFP i YFP oraz obiektyw odpowiedni do wymaganej rozdzielczości. W tym przypadku używany jest obiektyw powietrzny 20 x NA 0,75. Korzystając ze światła przechodzącego, ustaw ostrość komórek.

W tym momencie nie używaj światła fluorescencyjnego, ponieważ wywoła ono reakcję stresową, która może zakłócić cykl komórkowy. Aby uniknąć fototoksyczności, ustaw zginanie na maksimum dostępne, które pozwala na wymaganą rozdzielczość subkomórkową. W tym eksperymencie powinno być możliwe rozróżnienie jądra i cytoplazmy.

Ustaw krótki czas naświetlania i włóż filtr o wysokiej neutralnej gęstości. Następnie uzyskaj 12- lub 16-bitowy obraz testowy Korzystając z wzbudzenia i emisji YFP, dostosuj czas ekspozycji i filtry o neutralnej gęstości tak, aby średnia intensywność w komórce była w przybliżeniu równa intensywności tła plus pięciokrotna różnica między minimalną i maksymalną intensywnością tła. Aby sprawdzić, czy obrazy nie są nasycone, sprawdź intensywność fluorescencji dla przykładowego obrazu.

Maksymalna intensywność obrazu powinna być mniejsza niż połowa zakresu dynamicznego, aby umożliwić różnice w intensywności, gdy komórki wchodzą w mitozę. Następnie powtórz ten proces za pomocą filtrów wzbudzenia CFP i emisji YFP. Wybierz wiele regionów z transfekowanymi komórkami, z wyłączeniem regionów używanych do ustawiania ostrości i optymalizacji warunków ekspozycji.

Ponieważ procedury te mogły wywołać reakcję na stres, upewnij się, że maksymalna intensywność jest mniejsza niż połowa zakresu dynamicznego we wszystkich komórkach. Poinstruuj oprogramowanie, aby robiło dwa obrazy co 45 minut przy użyciu wzbudzenia YFP, emisji YFP i wzbudzenia CFP. Filtry emisji YFP.

Ustaw również całkowitą długość eksperymentu tak, aby przekraczała czas trwania cyklu komórkowego. Gdy wszystko zostanie ustawione, rozpocznij pobieranie obrazów po zakończeniu akwizycji, otwórz uzyskane obrazy i monitoruj czas cyklu komórkowego od mitozy do mitozy. W przypadku komórek, które wykazują ekspresję transfekowanej sondy w tym miejscu, czas cyklu komórkowego wynosił około 20 do 25 godzin.

Porównaj to z danymi kontrolnymi dla używanego typu komórki. Jeśli czas cyklu ogniwa odpowiada czasom referencyjnym, można przeanalizować próg. Po zweryfikowaniu czasu obrazy można przeanalizować.

Analiza może być wykonywana przez większość programów dedykowanych do mikroskopii. W tym przypadku używane jest darmowe oprogramowanie image j z wtyczką ratio plus. Rozpocznij analizę od otwarcia obrazów na obrazie J. Jeśli obrazy są w formacie stosu wielokolorowego, oddziel poszczególne kanały, konwertując je na hiperstos Wybierając obraz.

Następnie hyper stack, a następnie stack do hyper stack. Zostanie otwarte okno konwersji na hiperstos z wyświetlonymi ustawieniami i kliknij przycisk OK. Obraz będzie teraz wyświetlany z dwoma suwakami pod nim.

Następnie, aby podzielić obrazy na stosy jednokanałowe, kliknij obraz i wybierz hyper stack reduce dimensionality. Spowoduje to otwarcie okna redukcji, upewnij się, że wybrano klatki i zachowaj źródło. Następnie kliknij przycisk OK.

Pojawi się nowy obraz zawierający tylko jeden kanał. Powtórz ten proces, aby wyświetlić nowy obraz z drugim kanałem. Następnie, aby zwiększyć przejrzystość wizualną końcowych obrazów, wybierz stos emisyjny YFP wzbudzenia YFP.

Kliknij proces, a następnie kliknij matematykę. Następnie pomnóż Gdy otworzy się okno mnożenia, wprowadź trzy, aby pomnożyć stos emisji wzbudzenia YFP YFP przez trzy. Krok jest opcjonalny i zapewnia, że proporcje nie mieszczą się w zakresie od zera do jednego.

Następnie na pasku narzędzi obrazu J wybierz narzędzie odręczne. Następnie w wzbudzeniu YFP, stosie emisji YFP, narysuj obszar zainteresowania lub ROI w obszarze, który jest pozbawiony komórek, ale znajduje się blisko komórki, która będzie mierzona, aby dodać ROI do menedżera ROI, kliknij narzędzia do analizy. Następnie menedżer ROI.

Pojawi się okno menedżera ROI. Kliknij dodaj, aby zapisać współrzędne ROI, aby zmierzyć średnią intensywność ROI w stosie emisji wzbudzenia YFP. Kliknij Analizuj, a następnie wybierz miarę.

Otworzy się okno wyników. Wybierz stos emisji YFP wzbudzenia CFP. Następnie kliknij dwukrotnie ROI w menedżerze ROI i powtórz pomiar.

Pomiar zostanie dodany do okna wyników. Przewiń do innych miejsc w stosie, aby powtórzyć ten proces w wielu punktach czasowych. Sprawdź, czy intensywność tła w pobliżu komórki zainteresowania jest podobna w całym filmie, porównując pomiary w oknie wyników.

Aby ustawić pomiary tak, aby zawierały minimalną intensywność, kliknij analizuj, a następnie kliknij ustaw pomiary i wskaż minimalną i maksymalną wartość szarości. Następnie pojawi się okno pokazujące alternatywy pomiaru. Po dostosowaniu jasności i kontrastu zgodnie z potrzebami narysuj ROI obejmujący większość komórki i zmierz minimalną intensywność w obu stosach.

Następnie wykonaj pomiary jak poprzednio, używając komórki zamiast tła. Korzystając z wartości z sekcji wyników, oblicz różnicę między zmierzoną minimalną intensywnością a intensywnością tła i podziel ją przez dwa. Zapewnia to początkowe oszacowanie stosunku wartości przycinania do otwarcia oraz wybranych wtyczek.

Następnie stosunek plus. Następnie dla stosunku progów wybierz stos S wzbudzenia CFP emisji YFP jeden lub dla odwróconego stosunku progów, wizualizując sondy, w których wydajność progów spada po fosforylacji. Wybierz stos S wzbudzenia YFP, aby wstawić zmierzone intensywności tła i wartości przycinania.

Użyj wartości z okna wyników i wklej je w oknie proporcji plus. Ustaw skalowanie wynikowego stosu proporcji i zastosuj odpowiednią tabelę przeglądową, aby zwizualizować zmiany proporcji. Komórki U2 OS wyrażające sondę opartą na fret monitorującą jedną aktywność PLK były filmowane przez 60 godzin, jak opisano w tym filmie.

Ten obraz pokazuje skumulowane wejście mitotyczne komórek eksprymujących 50-progową sondę, w tym podziały komórek potomnych. Większość komórek wykazujących ekspresję sondy proliferuje w czasie cyklu komórkowego od 20 do 25 godzin, co wskazuje, że warunki obrazowania i poziomy ekspresji sondy nie wpływają na czas cyklu komórkowego. Fałszywa reprezentacja kolorystyczna odwróconego stosunku progów po jednej komórce przez cztery podziały pokazuje, że chociaż występuje znaczny szum, obserwuje się trend, w którym aktywność PK jeden wzrasta w G dwa i osiąga szczyt podczas mitozy.

Gdy surowe dane są filtrowane i prezentowane w postaci wykresu, czas między szczytami aktywności jest łatwy do oszacowania. Ten rysunek przedstawia kwantyfikację odwróconego stosunku progów komórki pokazanej na poprzednich obrazach z wykresu. Czas aktywacji można oszacować i jak widać tutaj, fosforylacja sondy staje się widoczna około czterech godzin przed szczytem fosforylacji w mitozie.

Podczas próby tej procedury ważne jest, aby utrzymać komórki w stanie niestresowym, dlatego odbywa się to poprzez zminimalizowanie ekspozycji na światło, a także zminimalizowanie zmian temperatury lub pH. Należy również pamiętać, że metoda ta monitoruje równowagę między aktywnością kinazy i fosfatazy w komórce. Procedura ta może być połączona z badaniami przesiewowymi interferencji RNA lub inhibitorów w celu zidentyfikowania regulatorów tych kinaz i fosfotaz.