Name: Monitorowanie aktywności kinaz i fosfatazy w całym cyklu komórkowym za pomocą ratiometrycznego FRET (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-27T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 38 s
Description: Poznaj metodę monitorowania aktywności kinaz i fosfataz w całym cyklu komórkowym za pomocą ratiometrycznego FRET w żywych komórkach U2 OS. Technika ta umożliwia wizualizację zmian fosforylacji w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy otrzymali wsparcie od Szwedzkiej Rady Badawczej (Swedish Research Council), Szwedzkiej Fundacji Badań Strategicznych (Swedish Foundation for Strategic Research), Szwedzkiego Towarzystwa Walki z Rakiem (Swedish Cancer Society), Szwedzkiego Towarzystwa Walki z Rakiem Dziecka (Swedish Child Cancer Society), Fundacji Åke Wiberga oraz Fundacji Jeanssona.

1. Wprowadzanie sondy do komórek
<ol>
 <li>Wykonaj kotransfekcję komórek sondą opartą na FRET oraz plazmidem nadającym oporność. Wybierz metodę transfekcji, która jest wydajna dla badanego typu komórek. W przypadku komórek U2OS standardowe metody transfekcji za pomocą fosforanu wapnia dają odpowiednie wyniki15.</li>
 <li>Prowadź selekcję komórek w odpowiednim antybiotyku przez co najmniej siedem dni. Pozwala to zwiększyć liczbę komórek wykazujących ekspresję sondy i ograniczyć liczbę komórek o toksycznym poziomie ekspresji lub takim, który silnie wpływa na cykl komórkowy.</li>
 <li>(opcjonalnie) Wyselekcjonuj klony stabilne.</li>
 <li>Na komórkach utrwalonych lub żywych zweryfikuj, czy zarówno CFP, jak i YFP są obecne we wszystkich komórkach w przybliżeniu w tym samym stosunku.</li>
 <li>W przypadku, gdy niektóre komórki zawierają tylko CFP lub YFP, prawdopodobnie doszło do rekombinacji. Rekombinacja może wystąpić podczas wzrostu bakterii lub po transfekcji sondy, a w tym drugim przypadku może zależeć od jakości plazmidu. Jeśli problem będzie się powtarzał, powtórz przygotowanie plazmidu i zlinearyzuj go przed transfekcją.</li>
</ol>
2. Monitorowanie ratiometrycznego FRET
<ol>
 <li>Wysiać komórki na szalkach z szklanym dnem lub na szkiełkach podstawkowych do montażu w komorze. Należy upewnić się, że szalki/szkiełka podstawkowe są z grubością nr 1.5 (170 μm).</li>
 <li>Zamontować komórki w pożywce wzrostowej bez czerwieni fenolowej w zmotoryzowanym mikroskopie epifluorescencyjnym z kontrolą temperatury ustawioną na 37 °C. Zapewnić regulację pH pożywki, albo za pomocą CO2, albo stosując pożywki niezależne od CO2, takie jak Liebowitz-15.</li>
 <li>Ustawić ostrość na komórkach, korzystając ze światła przechodzącego. Nie obserwować komórek przy użyciu światła fluorescencyjnego.</li>
 <li>Rozpocząć od pozyskania obrazu 12 lub 16-bitowego, używając filtrów wzbudzenia YFP (YFPex) i emisji YFP (YFPem) oraz odpowiedniego lustra dichroicznego. Zastosować maksymalny dostępny binning, który wciąż pozwala na uzyskanie wymaganej rozdzielczości subkomórkowej. Użycie wysokiego binningu w celu skrócenia czasu ekspozycji lub zmniejszenia intensywności jest kluczowe dla uniknięcia fototoksyczności.</li>
 <li>Zmierzyć lub oszacować intensywność tła oraz przybliżony poziom szumu, mierząc lub szacując przybliżone średnie, minimalne i maksymalne wartości pikseli w obszarze pozbawionym komórek. Zmienić czas ekspozycji i filtry neutralnej gęstości tak, aby średni sygnał w komórce wynosił w przybliżeniu intensywność tła plus pięciokrotność do dziesięciokrotności różnicy między maksymalną a minimalną intensywnością tła.</li>
 <li>Zweryfikować, czy obrazy nie są bliskie nasycenia. Maksymalna intensywność na obrazie powinna być mniejsza niż połowa zakresu dynamicznego (np. maks. 2000 w obrazie 12-bitowym), aby uwzględnić różnice w intensywności w momencie wejścia komórek w fazę mitozy.</li>
 <li>Powtórzyć kroki 2.4 do 2.6, używając filtrów wzbudzenia CFP i emisji YFP oraz odpowiedniego lustra dichroicznego.</li>
 <li>Wybrać wiele obszarów z transfekowanymi komórkami, z wyłączeniem obszarów wykorzystanych w punktach 2.4 do 2.7, i upewnić się, że maksymalna intensywność we wszystkich komórkach jest mniejsza niż połowa zakresu dynamicznego.</li>
 <li>Rozpocząć eksperyment time-lapse, pozyskując dwa obrazy co 45 min przy użyciu zestawów filtrów YFPex - YFPem oraz CFPex - YFPem.</li>
</ol>
3. Weryfikacja i optymalizacja warunków
<ol>
 <li>Otwórz pozyskane obrazy i monitoruj czas cyklu komórkowego od mitozy do mitozy dla komórek wykazujących ekspresję transfektowanej sondy.</li>
 <li>Porównaj zmierzony czas cyklu komórkowego z opublikowanymi danymi dla użytego typu komórek. Alternatywnie, zarejestruj obraz nietransfektowanych komórek, wykonując co godzinę jeden obraz w świetle przechodzącym (np. DIC lub kontrast fazowy), aby uzyskać referencyjne czasy cyklu komórkowego.</li>
 <li>Jeśli czas od mitozy do mitozy odpowiada referencyjnym czasom cyklu komórkowego, przejdź do kroku 4. W przeciwnym razie ponownie pozyskaj obrazy, stosując silniejszą ekspozycję, większą liczbę punktów czasowych lub wiele poziomów z i powtórz krok 3.</li>
 <li>W przypadku gdy czas od mitozy do mitozy nie odpowiada referencyjnym czasom cyklu komórkowego, zarejestruj obraz transfektowanych komórek, wykonując co godzinę jeden obraz w świetle przechodzącym (np. DIC lub kontrast fazowy), a następnie jeden obraz na koniec eksperymentu w celu zidentyfikowania komórek transfektowanych.</li>
 <li>Jeśli komórki transfektowane nadal wykazują wydłużony czas cyklu komórkowego, powtórz krok 1, transfektując mniejszą ilość sondy lub wybierając klony stabilne zawierające bardzo niskie ilości sondy.</li>
 <li>Jeśli komórki transfektowane wykazują prawidłowy czas cyklu komórkowego w nieobecności światła fluorescencyjnego, powtórz krok 2, zmniejszając ekspozycję poprzez modyfikację binningu, filtrów gęstości neutralnej, czasu ekspozycji oraz odstępów czasowych między obrazami.</li>
</ol>
4. Analiza FRET
<ol>
 <li>Analizę można przeprowadzić za pomocą większości oprogramowania przeznaczonego do mikroskopii. Tutaj opisujemy, jak wykonać analizę przy użyciu bezpłatnego programu ImageJ (<a href="http://rsb.info.nih.gov/ij" target="_blank">http://rsb.info.nih.gov/ij</a>) z wykorzystaniem wtyczki Ratio Plus (<a href="http://imagej.nih.gov/ij/plugins/ratio-plus.html" target="_blank">http://imagej.nih.gov/ij/plugins/ratio-plus.html</a>).</li>
 <li>Otwórz obrazy w programie ImageJ. W przypadku, gdy obrazy są w formacie wielokolorowego stosu (np. Deltavision), oddziel poszczególne kanały, najpierw konwertując je na hyperstack: Image-hyperstack-stack to hyperstack, a następnie rozdziel je na stosy pojedynczych kanałów za pomocą: Image-hyperstack-reduce dimensionality</li>
 <li>Pomnóż stos YFPex - YFPem przez 3 za pomocą funkcji: Process-Math-Multiply. Ten krok jest opcjonalny, ponieważ ma on na celu jedynie zwiększenie przejrzystości wizualnej obrazów poprzez zapewnienie, że wartości stosunku nie znajdują się w zakresie od 0 do 1.</li>
 <li>W stosie YFPex - YFPem wyznacz obszar zainteresowania (ROI) w miejscu pozbawionym komórek, ale znajdującym się blisko komórki przeznaczonej do pomiaru. Różne komórki na tym samym obrazie mogą wymagać różnych obszarów, ponieważ zarówno tło, jak i intensywność sygnału są zazwyczaj najsilniejsze w centrum obrazu.</li>
 <li>Dodaj ROI do menedżera ROI: Analyze-tools-ROI manager.</li>
 <li>Zmierz średnią intensywność ROI zarówno w stosie YFPex - YFPem, jak i w stosie CFPex - YFPem: Analyze-Measure.</li>
 <li>Powtórz czynność w wielu punktach czasowych i zweryfikuj, czy intensywności tła w pobliżu badanej komórki są podobne w całym filmie.</li>
 <li>Ustaw pomiary tak, aby obejmowały minimalną intensywność: Analyze-Set measurements-Min and Max grey value.</li>
 <li>Wyznacz obszar zainteresowania obejmujący większość komórki i zmierz minimalną intensywność w stosie YFPex - YFPem oraz CFPex - YFPem. Oblicz różnicę między zmierzoną minimalną intensywnością a intensywnością tła z punktu 4.6 i podziel ją przez dwa. Daje to wstępną szacunkową wartość przycięcia (clipping value).</li>
 <li>Otwórz Ratio Plus. Wybierz stosy YFPex - YFPem oraz CFPex - YFPem. Dla stosunku FRET wybierz CFPex - YFPem jako stos 1; dla odwróconego stosunku FRET, służącego do wizualizacji sond, w których wydajność FRET spada podczas fosforylacji, wybierz YFPex - YFPem jako stos 1.</li>
 <li>Wprowadź zmierzone intensywności tła oraz wartości przycięcia.</li>
 <li>Ustaw skalowanie wynikowego stosu stosunków i zastosuj odpowiednią tablicę wyszukiwania (LUT), aby zwizualizować zmiany stosunków.</li>
</ol>
5. Reprezentatywne wyniki
Aktywność Plk1 jest najpierw widoczna w jądrze komórkowym w fazie G2 i osiąga szczyt podczas mitozy. Rysunek 3 przedstawia eksperyment z zastosowaniem minimalnych ustawień fototoksyczności, zgodnie z opisem w sekcji 2. Należy pamiętać, że jest to reprezentatywny wynik wstępny, a warunki ekspozycji lub czas między obrazami mogą zostać zmodyfikowane w celu zwiększenia stosunku sygnału do szumu lub rozdzielczości czasowej. Rysunek 3D pokazuje, że większość komórek wykazujących ekspresję sondy proliferuje z czasem cyklu komórkowego wynoszącym od 20 do 25 godzin, co wskazuje, że warunki obrazowania i poziomy ekspresji sondy nie wpływają na czas trwania cyklu komórkowego. Mimo znacznego szumu, trend wzrostu aktywności Plk1 w fazie G2 i jej szczytu w mitozie14 jest wyraźnie widoczny (rys. 3A). Przetwarzanie surowych danych, tutaj poprzez filtrowanie średnią przedstawione jako kymograf (rys. 3B), lub kwantyfikacja średniego odwróconego stosunku (rys. 3C) mogą poprawić przejrzystość.
<img alt="Schemat cyklu kinaza-fosfataza, regulacja białek, działanie enzymów, proces fosforylacji." src="/files/ftp_upload/3410/3410fig1.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Zasada działania sondy opartej na FRET do monitorowania aktywności kinaz i fosfataz. Dwa fluorofory, zazwyczaj CFP (niebieski) i YFP (zielony), są połączone domeną wiążącą fosforan (pomarańczowy) i sekwencją fosforylowalną (żółty). Fosforylacja (czerwony) pośredniczy w wiązaniu z domeną wiążącą fosforan, indukując tym samym zmianę konformacyjną sondy. Zmiana konformacyjna skutkuje różnicą w odległości lub orientacji między dwoma fluoroforami, co wpływa na wydajność FRET pomiędzy CFP a YFP. FRET można zwizualizować poprzez pobudzenie CFP i monitorowanie emisji YFP (linie przerywane).
<img alt="Schemat procesu transfekcji plazmidowej, mikroskopia epifluorescencyjna, etapy analizy stosunku FRET." src="/files/ftp_upload/3410/3410fig2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Schematyczny zarys procedury eksperymentalnej.
<img alt="Obrazowanie time-lapse oraz wykresy ekspresji białek i wejścia w mitozę, analiza danych fluorescencyjnych." src="/files/ftp_upload/3410/3410fig3.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Aktywność Plk1 jest po raz pierwszy widoczna w jądrze w fazie G2 i osiąga szczyt podczas mitozy. Komórki U2OS wykazujące ekspresję sondy opartej na FRET do monitorowania aktywności Plk19,14 były filmowane przez 60 hr przy użyciu systemu obrazowania Deltavision Spectris wyposażonego w obiektyw powietrzny 20x NA 0.7 i lampę rtęciową. Warunki obrazowania dobrano tak, aby zminimalizować fototoksyczność, zgodnie z opisem w sekcji 2, stosując binning 4x oraz filtry gęstości neutralnej blokujące 99% światła wpadającego. A, reprezentacja w fałszywych kolorach odwróconego stosunku FRET, śledząca jedną komórkę przez 4 podziały. B, kymograf komórki pokazanej w A po zastosowaniu filtra średniej. C, ilościowe oznaczenie odwróconego stosunku FRET komórki pokazanej w A. D, skumulowane wejście w mitozę 50 komórek wykazujących ekspresję sondy FRET, wliczając podziały komórek potomnych.

<ol><li>Sun, Y., Wallrabe, H., Seo, S. A., Periasamy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FRET+microscopy+in+2010%3A+the+legacy+of+Theodor+Forster+on+the+100th+anniversary+of+his+birth%5BTitle%5D)+AND+%22Chemphyschem%22%5BJournal%5D)">FRET microscopy in 2010: the legacy of Theodor Forster on the 100th anniversary of his birth.</a> Chemphyschem. 12, 462-474 (2011).</li>
<li>Allen, M. D., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+dynamics+of+protein+kinase+A+activity+visualized+by+FRET-based+reporters%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Subcellular dynamics of protein kinase A activity visualized by FRET-based reporters.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 348, 716-721 (2006).</li>
<li>Kunkel, M. T., Ni, Q., Tsien, R. Y., Zhang, J., Newton, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatio-temporal+dynamics+of+protein+kinase+B%2FAkt+signaling+revealed+by+a+genetically+encoded+fluorescent+reporter%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Spatio-temporal dynamics of protein kinase B/Akt signaling revealed by a genetically encoded fluorescent reporter.</a> J. Biol. Chem. 280, (2005).</li>
<li>Violin, J. D., Zhang, J., Tsien, R. Y., Newton, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetically+encoded+fluorescent+reporter+reveals+oscillatory+phosphorylation+by+protein+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22C.+J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">A genetically encoded fluorescent reporter reveals oscillatory phosphorylation by protein kinase.</a> C. J. Cell. Biol. 161, 899-909 (2003).</li>
<li>Kunkel, M. T., Toker, A., Tsien, R. Y., Newton, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-dependent+regulation+of+protein+kinase+D+revealed+by+a+genetically+encoded+kinase+activity+reporter%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Calcium-dependent regulation of protein kinase D revealed by a genetically encoded kinase activity reporter.</a> Journal of Biological Chemistry. 282, 6733-6742 (2007).</li>
<li>Harvey, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetically+encoded+fluorescent+sensor+of+ERK+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A genetically encoded fluorescent sensor of ERK activity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 19264-19269 (2008).</li>
<li>Fosbrink, M., Aye-Han, N. N., Cheong, R., Levchenko, A., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+JNK+activity+dynamics+with+a+genetically+encoded+fluorescent+biosensor%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Visualization of JNK activity dynamics with a genetically encoded fluorescent biosensor.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 5459-5464 (2010).</li>
<li>Gavet, O., Pines, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progressive+activation+of+CyclinB1-Cdk1+coordinates+entry+to+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Progressive activation of CyclinB1-Cdk1 coordinates entry to mitosis.</a> Dev. Cell. 18, 533-543 (2010).</li>
<li>Fuller, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Midzone+activation+of+aurora+B+in+anaphase+produces+an+intracellular+phosphorylation+gradient%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Midzone activation of aurora B in anaphase produces an intracellular phosphorylation gradient.</a> Nature. 453, 1132-1136 (2008).</li>
<li>Ni, Q., Titov, D. V., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+protein+kinase+dynamics+in+living+cells+with+FRET+reporters%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analyzing protein kinase dynamics in living cells with FRET reporters.</a> Methods. 40, 279-286 Forthcoming.</li>
<li>Morgan, D. O. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMorgan%2C+DO+%22The+cell+cycle+%3A+principles+of+control%22">The cell cycle : principles of control</a>. , New Science Press, in association with Oxford University Press. (2007).</li>
<li>Lindqvist, A., Rodriguez-Bravo, V., Medema, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+decision+to+enter+mitosis%3A+feedback+and+redundancy+in+the+mitotic+entry+network%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">The decision to enter mitosis: feedback and redundancy in the mitotic entry network.</a> J. Cell. Biol. 185, 193-202 (2009).</li>
<li>Gavet, O., Pines, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+cyclin+B1-Cdk1+synchronizes+events+in+the+nucleus+and+the+cytoplasm+at+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Activation of cyclin B1-Cdk1 synchronizes events in the nucleus and the cytoplasm at mitosis.</a> J. Cell. Biol. 189, 247-259 (2010).</li>
<li>Macurek, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polo-like+kinase-1+is+activated+by+aurora+A+to+promote+checkpoint+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Polo-like kinase-1 is activated by aurora A to promote checkpoint recovery.</a> Nature. 455, 119-123 (2008).</li>
<li>van der Eb, A. J., Graham, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assay+of+transforming+activity+of+tumor+virus+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Assay of transforming activity of tumor virus DNA.</a> Methods. Enzymol. 65, 826-839 (1980).</li>
<li>Lamprecht, M. R., Sabatini, D. M., Carpenter, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellProfiler%3A+free%2C+versatile+software+for+automated+biological+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">CellProfiler: free, versatile software for automated biological image analysis.</a> Biotechniques. 42, 71-75 (2007).</li>
<li>Roszik, J., Lisboa, D., Szollosi, J., Vereb, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+intensity-based+ratiometric+FRET+in+image+cytometry--approaches+and+a+software+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Evaluation of intensity-based ratiometric FRET in image cytometry--approaches and a software solution.</a> Cytometry A. 75, 761-767 (2009).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

Monitorowanie FRET w trakcie całego cyklu komórkowego wymaga uwzględnienia kwestii, które są mniej istotne podczas oceny krótkotrwałych reakcji na bodźce zewnętrzne. Po pierwsze, progresja cyklu komórkowego jest łatwo zaburzana przez sygnalizację stresu, co wymaga zminimalizowania fototoksyczności. Po drugie, wszystkie reportery mogą potencjalnie wpływać na procesy komórkowe poprzez miareczkowanie kinaz, fosfataz lub domen interakcji. Prawdopodobnie najprostszym sposobem na ocenę, czy warunki eksperymentalne są odpowiedn...

<table><tbody><tr><td>Leibovitz L-15, bez czerwieni fenolowej</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>21083-027</td><td></td></tr><tr><td>DMEM+Glutamax-I</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>31966</td><td></td></tr><tr><td>Płotkowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Hyclone</td><td>SV30160.03</td><td></td></tr><tr><td>0.05% Trypsyna EDTA</td><td>Hyclone</td><td>SH30236.01</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14287</td><td></td></tr><tr><td>Puromycyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8833</td><td></td></tr></tbody></table>

monitorowanie aktywności kinaz i fosfataz w cyklu komórkowym za pomocą ratiometrycznego fret

Monitoring Kinase and Phosphatase Activities Through the Cell Cycle by Ratiometric FRET

Raportory oparte na transferze energii rezonansowej Förstera (FRET)1 umożliwiają ocenę endogennej aktywności kinaz i fosfataz w żywych komórkach. Takie sondy zazwyczaj składają się z wariantów białek CFP i YFP, przedzielonych sekwencją podatną na fosforylację oraz domeną wiążącą grupy fosforanowe. W wyniku fosforylacji sonda zmienia konformację, co prowadzi do zmiany odległości lub orientacji między CFP a YFP, co z kolei skutkuje zmianą wydajności FRET (Ryc. 1). W ciągu ostatniej dekady opublikowano szereg sond monitorujących równowagę aktywności wielu kinaz i fosfataz, w tym raportory dla PKA2, PKB3, PKC4, PKD5, ERK6, JNK7, Cdk18, Aurora B9 oraz Plk19. Biorąc pod uwagę modułową budowę, w najbliższej przyszłości prawdopodobnie pojawią się kolejne sondy10.
Postępowanie przez cykl komórkowy jest wpływane przez szlaki sygnalizacji stresu 11. Warto zauważyć, że cykl komórkowy jest regulowany inaczej podczas niezakłóconego wzrostu w porównaniu do momentu, gdy komórki regenerują się po stresie12. Obrazowanie time-lapse komórek w trakcie cyklu komórkowego wymaga zatem szczególnej ostrożności. Staje się to problemem zwłaszcza przy zastosowaniu obrazowania ratiometrycznego, ponieważ do poprawnej interpretacji wyników wymagane są dwa obrazy o wysokim stosunku sygnału do szumu. Ratiometryczne obrazowanie FRET zmian w aktywnościach kinaz i fosfataz zależnych od cyklu komórkowego było ograniczone głównie do poszczególnych etapów cyklu komórkowego8,9,13,14.
W niniejszym artykule omawiamy metodę monitorowania sond opartych na FRET z wykorzystaniem obrazowania ratiometrycznego w trakcie cyklu komórkowego człowieka. Metoda ta opiera się na sprzęcie dostępnym dla wielu badaczy w naukach o życiu i nie wymaga eksperckiej wiedzy z zakresu mikroskopii ani przetwarzania obrazów.

Reportery oparte na FRET są coraz częściej wykorzystywane do monitorowania aktywności kinaz i fosfataz w żywych komórkach. W niniejszej pracy opisujemy metodę wykorzystania reporterów opartych na FRET do oceny zmian w fosforylacji celu zależnych od cyklu komórkowego.

Monitorowanie aktywności kinaz i fosfataz w cyklu komórkowym za pomocą ratiometrycznego FRET

Raporty oparte na transferze energii rezonansowej Förstera (FRET)1 umożliwiają ocenę aktywności endogennych kinaz i fosfataz w żywych komórkach. Takie ...

W tym filmie aktywności kinazy i fosfatazy są monitorowane w trakcie cyklu komórkowego przy użyciu transferu energii między fluorescencyjnymi dipolami, znanego jako FRET. Tutaj sonda aktywności kinazy podobnej do Polo 1 (PLK1) posiada białko CFP (cyjanowa białka fluorescencyjna) umieszczone na jednym końcu oraz białko YFP (żółte białko fluorescencyjne) umieszczone na drugim końcu. Sonda ta jest transfektowana do komórek U2 OS.Następnie, aby zbadać stan fosforylacji celów LK1 podczas przejścia z fazy G2 do fazy M, poddaje się przetransfekowane komórki U2 OS obrazowaniu fluorescencyjnemu w odstępach czasu (time-lapse). Gdy CFP i YFP znajdują się w bliskiej odległości i CFP zostanie pobudzony, energia jest przekazywana do YFP, co umożliwia detekcję emisji YFP. Jednak w momencie fosforylacji sondy następuje zmiana konformacyjna białka, która oddziela CFP od YFP.Obecnie, gdy CFP zostanie wzbudzone, wykrywana jest silna emisja CFP i jedynie słaba emisja YFP; kwantyfikacja stosunku emisji YFP po wzbudzeniu zarówno CFP, jak i YFP wykazuje, że aktywność PLK1 wzrasta w fazie G2 i osiąga maksimum podczas mitozy. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak standardowe obrazowanie czasowe, jest fakt, że zwrócono szczególną uwagę na to, aby cykl komórkowy nie został zaburzony ani przez warunki obrazowania, ani przez ekspresję sondy. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie cyklu komórkowego, takie jak miejsce i czas aktywacji konkretnych kinaz lub fosfataz.Choć metoda ta może dostarczyć informacji na temat enzymów regulowanych przez cykl komórkowy, można ją również zastosować w innych systemach wymagających warunków bezziełniowych, takich jak testy proliferacji komórek. W celu monitorowania ludzkiego cyklu komórkowego komórki U2 OS są transfekowane sondą aktywności PK1 opartą na technice FRET. Z zastosowaniem standardowej metody transfekcji fosforanem wapnia, komórki są selekcjonowane w puromycynie przez co najmniej siedem dni.Pozwala to wzbogacić populację komórek wykazujących ekspresję sondy i ograniczyć liczbę komórek o toksycznych poziomach ekspresji lub poziomach, które silnie wpływają na cykl komórkowy. Następnie, poprzez ograniczające rozcieńczenia, wyselekcjonowano stabilne klony i zbadano ekspresję CFP oraz YFP, aby zweryfikować, czy są one obecne we wszystkich komórkach w zbliżonym stosunku. Jeśli niektóre komórki zawierają tylko CFP lub YFP, prawdopodobnie doszło do rekombinacji; w takim przypadku należy powtórzyć przygotowanie plazmidu z wykorzystaniem bakterii mniej podatnych na rekombinację homologiczną, takich jak szczepy Sure 2, a następnie zlinearyzować plazmid i powtórzyć transfekcję.Gdy komórki zaczną stabilnie ekspresować sondę, wysiej je na szalki z dnem szklanym o grubości nr 1,5 po tym, jak przywrą i osiągną 30 do 50% konfluencji. Wymień medium na takie, które jest niezależne od CO2 i nie zawiera czerwieni fenolowej, a następnie umieść komórki na zmotoryzowanym mikroskopie epifluorescencyjnym z kontrolą temperatury ustawioną na 37 °C. Mikroskop powinien być wyposażony w filtry wzbudzenia i emisji dla CFP oraz YFP.Lustro ROIC odpowiednie do monitorowania CFP i YFP oraz obiektyw zapewniający wymaganą rozdzielczość. W tym przypadku zastosowano obiektyw powietrzny 20 x NA 0,75. Używając światła przechodzącego, ustaw ostrość na komórkach.Na tym etapie nie należy używać światła fluorescencyjnego, ponieważ wywoła ono reakcję stresową, która może zaburzyć cykl komórkowy. Aby uniknąć fototoksyczności, ustaw ugięcie na maksymalną dostępną wartość, która pozwala na uzyskanie wymaganej rozdzielczości subkomórkowej. W tym doświadczeniu powinno być możliwe rozróżnienie jądra komórkowego i cytoplazmy.Ustaw krótki czas ekspozycji i wprowadź filtr neutralnej gęstości o wysokim współczynniku. Następnie wykonaj 12- lub 16-bitowy obraz testowy przy użyciu wzbudzenia i emisji YFP, dostosowując czas ekspozycji oraz filtry neutralnej gęstości tak, aby średnia intensywność w komórce była w przybliżeniu równa intensywności tła plus pięciokrotność różnicy między minimalną a maksymalną intensywnością tła. Aby zweryfikować, czy obrazy nie są nasycone, sprawdź intensywność fluorescencji dla obrazu próbki.Maksymalna intensywność na obrazie powinna być mniejsza niż połowa zakresu dynamicznego, aby uwzględnić różnice w intensywności w momencie wejścia komórek w fazę mitozy. Następnie powtórz ten proces, stosując filtry wzbudzenia CFP i emisji YFP. Wybierz kilka obszarów z komórkami po transfekcji, z wyłączeniem obszarów wykorzystanych do ustawienia ostrości i optymalizacji warunków ekspozycji.Ponieważ procedury te mogły wywołać odpowiedź stresową, należy upewnić się, że maksymalna intensywność we wszystkich komórkach stanowi mniej niż połowę zakresu dynamicznego. Skonfigurować oprogramowanie tak, aby co 45 minut rejestrowało dwa obrazy, wykorzystując wzbudzenie YFP, emisję YFP oraz wzbudzenie CFP i filtry emisji YFP.Należy również ustawić całkowity czas trwania eksperymentu tak, aby przekraczał on czas trwania cyklu komórkowego. Po skonfigurowaniu wszystkich parametrów rozpocząć akwizycję obrazów; po zakończeniu akwizycji otworzyć uzyskane obrazy i monitorować czas cyklu komórkowego od jednej mitozy do drugiej. W przypadku komórek wykazujących ekspresję przetransfekcyjnej sondy czas cyklu komórkowego wynosił w przybliżeniu od 20 do 25 godzin.Porównaj to z danymi kontrolnymi dla użytego typu komórek. Jeśli czas cyklu komórkowego odpowiada czasom referencyjnym, można przeprowadzić analizę FRET. Po zweryfikowaniu czasu można przystąpić do analizy obrazów.Analizę można przeprowadzić za pomocą większości oprogramowania przeznaczonego do mikroskopii. W tym przypadku wykorzystano bezpłatny program ImageJ z wtyczką Ratio Plus. Analizę należy rozpocząć od otwarcia obrazów w programie ImageJ. Jeśli obrazy znajdują się w formacie wielokolorowego stosu (stack), należy rozdzielić poszczególne kanały, konwertując je na hiperstos (hyperstack) poprzez wybranie obrazu.Następnie wybierz hyper stack, a potem stack to hyper stack. Otworzy się okno convert to hyper stack z wyświetlonymi ustawieniami; kliknij okay. Obraz zostanie teraz wyświetlony z dwoma suwakami poniżej.Aby rozdzielić obrazy na stosy jednokanałowe, kliknij obraz i wybierz opcję „Hyperstack reduce dimensionality”. Otworzy się okno redukcji; upewnij się, że zaznaczone są opcje „Frames” oraz „Keep source”. Następnie kliknij Okay.Pojawi się nowy obraz zawierający tylko jeden kanał. Powtórz ten proces, aby wyświetlić nowy obraz z drugim kanałem. Następnie, w celu zwiększenia klarowności wizualnej końcowych obrazów, wybierz stos YFP excitation YFP emission.Kliknij proces, a następnie kliknij matematyka. Następnie wybierz mnożenie. Po otwarciu okna mnożenia wprowadź wartość trzy, aby pomnożyć stos YFP excitation YFP emission przez trzy. Krok ten jest opcjonalny i zapewnia, że współczynniki nie znajdują się w zakresie od zera do jednego.Następnie na pasku narzędzi obrazu J wybierz narzędzie do rysowania swobodnego. Następnie w stosie wzbudzenia YFP i emisji YFP wyznacz obszar zainteresowania (ROI) w miejscu pozbawionym komórek, ale blisko komórki, która będzie mierzona; aby dodać ROI do menedżera ROI, kliknij narzędzia analizy (analyze tools), a następnie menedżera ROI (ROI manager).Pojawi się okno menedżera ROI. Kliknij przycisk add, aby zapisać współrzędne ROI w celu pomiaru średniej intensywności ROI w stosie obrazów dla wzbudzenia YFP i emisji YFP. Kliknij analyze, a następnie wybierz measure.Otworzy się okno wyników. Wybierz stos obrazów z wzbudzeniem CFP i emisją YFP. Następnie dwukrotnie kliknij interesujący obszar (ROI) w menedżerze ROI i powtórz pomiar.Pomiar zostaje dodany do okna wyników. Przewiń do innych obszarów stosu, aby powtórzyć ten proces w wielu punktach czasowych. Zweryfikuj, czy intensywność tła w pobliżu analizowanej komórki jest podobna w całym filmie, porównując pomiary w oknie wyników.Aby ustawić pomiary tak, aby uwzględniały minimalną intensywność, kliknij Analyze, następnie kliknij Set Measurements i określ minimalną oraz maksymalną wartość szarości. Następnie pojawi się okno z alternatywnymi opcjami pomiaru. Po dostosowaniu jasności i kontrastu w razie potrzeby, wyznacz ROI obejmujący większość komórki i zmierz minimalną intensywność w obu stosach obrazów.Następnie przeprowadź pomiary w taki sam sposób jak wcześniej, tym razem używając komórki zamiast tła. Na podstawie wartości z sekcji wyników oblicz różnicę między zmierzoną intensywnością minimalną a intensywnością tła i podziel wynik przez dwa. Pozwoli to uzyskać wstępną szacunkową wartość przycinania dla stosunku otwarcia w wybranych wtyczkach.Następnie wybierz ratio plus. W przypadku stosunku FRET wybierz stos CFP excitation YFP emission S stack one lub, dla odwróconego stosunku FRET przy wizualizacji sond, w których wydajność FRET spada podczas fosforylacji, wybierz stos YFP excitation YFP emission S stack one, aby wprowadzić zmierzone intensywności tła oraz wartości przycinania.Użyj wartości z okna wyników i wklej je w okno ratio plus. Ustaw skalowanie otrzymanego stosu proporcji (ratio stack) i zastosuj odpowiednią tabelę wyszukiwania (lookup table), aby zwizualizować zmiany proporcji. Komórki U2 OS wykazujące ekspresję sondy opartej na FRET, monitorującej aktywność PLK1, były filmowane przez 60 godzin, zgodnie z opisem w tym filmie.Na tym obrazie przedstawiono skumulowane wejście w fazę mitozy 50 komórek wykazujących ekspresję sondy FRET, wliczając w to podziały komórek potomnych. Większość komórek wykazujących ekspresję sondy proliferuje przy czasie cyklu komórkowego wynoszącym od 20 do 25 godzin, co wskazuje, że warunki obrazowania i poziomy ekspresji sondy nie wpływają na czas trwania cyklu komórkowego. Reprezentacja w fałszywych barwach odwróconego stosunku FRET, śledząca jedną komórkę przez cztery podziały, wykazuje, że mimo znacznego szumu, widoczny jest trend, w którym aktywność PK1 wzrasta w fazie G2 i osiąga szczyt podczas mitozy.Po zastosowaniu filtru średniej do surowych danych i przedstawieniu ich na wykresie, czas między szczytami aktywności jest łatwy do oszacowania. Ten rysunek przedstawia kwantyfikację odwróconego stosunku FRET dla komórki pokazanej na poprzednich obrazach na podstawie wykresu. Można oszacować czas aktywacji i, jak widać tutaj, fosforylacja sondy staje się widoczna mniej więcej na cztery godziny przed osiągnięciem szczytu fosforylacji w mitozie.Podczas wykonywania tej procedury ważne jest utrzymanie komórek w stanie braku stresu, co osiąga się poprzez minimalizację ekspozycji na światło oraz ograniczenie zmian temperatury lub pH. Należy również pamiętać, że metoda ta monitoruje równowagę między aktywnością kinaz a fosfataz w komórce. Procedurę tę można połączyć z interferencją RNA lub badaniami inhibitorów w celu zidentyfikowania regulatorów nadrzędnych tych kinaz i fosfataz.

monitoring-kinase-phosphatase-activities-through-cell-cycle

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Monitorowanie aktywności kinazy i fosfatazy podczas cyklu komórkowego za pomocą ratiometrycznego FRET

Wyznaczanie pozycji w cyklu komórkowym populacji komórek lub zrozumienie wpływu sygnałów na proliferację można łatwo zmierzyć za pomocą cytometrii przepływowej, stosując niniejszy protokół. Przedstawiamy proste podejście eksperymentalne do barwienia komórek i ilościowego określania ich pozycji w cyklu komórkowym.

Analiza pozycji cyklu komórkowego w komórkach ssaków

Mikroskopia oparta na transferze energii fluorescencji (FRET) jest potężną techniką monitorowania w czasie rzeczywistym zdarzeń sygnalizacyjnych w żywych komórkach z wykorzystaniem różnych biosensorów jako reporterów. W niniejszej pracy opisujemy sposób budowy spersonalizowanego systemu obrazowania FRET w epifluorescencji z komponentów dostępnych w handlu oraz sposób jego wykorzystania w eksperymentach FRET.

Mikroskopia FRET do monitorowania w czasie rzeczywistym zdarzeń sygnalizacyjnych w żywych komórkach przy użyciu unimolekularnych biosensorów

Ten film opisuje czasowo-rozdzielczy transfer energii rezonansu Förstera lub test TR-FRET w celu określenia endogennej fosforylacji białek za pomocą fluoroforów donorowych i akceptorowych oznaczonych na przeciwciałach specyficznych dla badanego białka. Technika ta ma na celu pomiar fosforylacji badanych białek w lizatach komórkowych.

Czasowo-rozdzielczy transfer energii rezonansu Forstera do monitorowania fosforylacji białek w komórkach

Kinazy białkowe to wysoce rozwinięte enzymy sygnalizacyjne i rusztowania, które są kluczowe dla między- i wewnątrzkomórkowej transdukcji sygnału. Przedstawiamy protokół pomiaru aktywności kinazy za pomocą znakowanego radioaktywnie trifosforanu adenozyny ([γ-32P] ATP), niezawodnej metody pomagającej w wyjaśnieniu regulacji sygnalizacji komórkowej.

Oznaczanie aktywności kinazy białkowej za pomocą znakowanego radioaktywnie ATP

Kinaza zależna od cykliny 1 (Cdk1) jest aktywowana w fazie G2 cyklu komórkowego i reguluje wiele szlaków komórkowych. W tym miejscu przedstawiamy protokół testu kinazy in vitro z Cdk1, który umożliwia identyfikację miejsc fosforylacji specyficznych dla Cdk1 w celu ustalenia celów komórkowych tej ważnej kinazy.

Identyfikacja miejsc fosforylacji specyficznych dla kinazy 1 zależnej od cykliny za pomocą testu kinazy in vitro

Aktywacja wielofunkcyjnej kinazy Ser/Thr AURKA jest charakterystyczna dla jej autofosforylacji na Thr288. Sondy fluorescencyjne polegające na FRET mogą rozróżniać między jego stanem nieaktywnym i aktywowanym. Tutaj ilustrujemy niektóre strategie inżynierii sondy, wraz z szybkim protokołem FRET, aby śledzić aktywację kinazy przez cały czas trwania mitozy.

Monitorowanie w czasie rzeczywistym aktywacji kinazy A zorzy polarnej za pomocą konformacyjnych biosensorów FRET w żywych komórkach

Protokoły testów opartych na komórkach rezonansu rezonansu Förstera z rozdzielczością czasową są opisane dla prostej, specyficznej, czułej i solidnej kwantyfikacji endogennych fosforylowanych białek przetwornika sygnału i aktywatora transkrypcji (STAT) 1/3/4/5/6 w lizatach komórkowych w formacie 384-dołkowym.

Czasowo-rozdzielcze rezonansowe testy transferu energii Förstera do pomiaru endogennych fosforylowanych białek STAT w komórkach ludzkich

Tutaj prezentujemy protokół wzbogacania endogennych fosfataz fosfoproteinowych i ich oddziałujących białek z komórek i tkanek oraz ich identyfikacji i kwantyfikacji za pomocą proteomiki opartej na spektrometrii mas.

Podejście oparte na spektrometrii mas do identyfikacji fosfataz fosfoproteinowych i ich interaktorów

Protokół przedstawiony w tym badaniu ilustruje skuteczność detektora różnic cAMP In Situ w pomiarze cAMP za pomocą dwóch metod. Jedna z metod wykorzystuje 96-dołkowy spektrofotometr do odczytu płytek z ogniwami HEK-293. Druga metoda polega na demonstracji pojedynczych komórek HASM pod mikroskopem fluorescencyjnym.

Dynamika cAMP w czasie rzeczywistym w żywych komórkach przy użyciu fluorescencyjnego detektora różnic cAMP in situ

W tym miejscu przedstawiamy protokół ilościowego określenia czasoprzestrzennej dynamiki aktywacji i fosforylacji Akt w żywych komórkach HepG2. Obrazowanie metodą rezonansowego transferu energii metodą Förster (FRET) jest potężnym narzędziem, które dostarcza cennych informacji na temat szlaków sygnalizacji insuliny i regulacji metabolicznej w komórkach nowotworowych.

Obrazowanie transferu energii rezonansu Förstera w żywych komórkach metabolicznie regulowanej dynamiki aktywacji Akt w komórkach HepG2

Poznaj metodę monitorowania aktywności kinaz i fosfataz w całym cyklu komórkowym za pomocą ratiometrycznego FRET w żywych komórkach U2 OS. Technika ta umożliwia wizualizację zmian fosforylacji w czasie rzeczywistym.

Monitorowanie aktywności kinaz i fosfataz w cyklu komórkowym za pomocą ratiometrycznego FRET

Przeglądaj więcej filmów