Pomiar wewnątrzkomórkowego napływu wapnia sterowanego zapasami w żywych komórkach z wykorzystaniem fluorescencji: od hodowlanych komórek nowotworowych po włókna mięśni szkieletowych

Niniejsza metoda eksperymentalna jest wykorzystywana do ujawnienia właściwości wapniowego wejścia sterowanego zapasami (SOCE) w komórkach nowotworowych oraz komórkach mięśni szkieletowych przy użyciu metod opartych na fluorescencji. Osiąga się to poprzez rejestrację fluorescencji URA two w żywych komórkach, która jest czuła na wewnątrzkomórkowe stężenie wapnia. Ponadto, w celu zbadania SOCE, mierzy się szybkość gaszenia fluorescencji po dodaniu manganu przy długości fali niewrażliwej na stężenie wapnia, co bezpośrednio odzwierciedla aktywację SOCE.

W strukturalnie wyspecjalizowanych komórkach mięśni szkieletowych przeprowadza się wycięcie i usuwanie błon komórkowych (skinning) mięśni. Przygotowuje się włókna mięśniowe. Następnie włókna traktuje się wskaźnikami wapnia o niskim powinowactwie i monitoruje ich wewnętrzną fluorescencję.

Metody te wykazują, że SOCE występuje zarówno w komórkach niewzbudzalnych, jak i w mięśniach szkieletowych, charakteryzując się stopniowalną aktywacją i ścisłym powiązaniem z zawartością wewnątrzkomórkowych magazynów wapnia. Główną zaletą tej techniki opartej na fluoresceinie w porównaniu z innymi metodami, takimi jak elektrofizjologia czy patch-clamp, jest łatwość użycia oraz możliwość zastosowania w badaniach populacji komórek lub wysokoprzepustowym screeningu. Ważne jest zastosowanie odpowiednich warunków dla środowiska pomiarowego i testu magconing.

Kalibracja poszczególnych instrumentów jest zatem kluczowa, ponieważ każde urządzenie różni się od innych. Wizualna demonstracja tej metody ma krytyczne znaczenie, gdyż proces mechanicznego oddzielania błony pojedynczych włókien mięśniowych jest trudny do opanowania, ponieważ wymaga specjalistycznego treningu praktycznego, dogłębnego zrozumienia i nauki technik mikrodisekcji, uważnej obserwacji oraz dużej dozy cierpliwości. Przed rozpoczęciem należy skalibrować zestaw mikroskopowy do pomiaru fluorescencji URA two. Chociaż długości fal wzbudzenia dla wiązania wapnia i URA two wynoszą odpowiednio 340 i 380 nanometrów, najlepszy zakres dynamiki stosunku URA two dla pomiaru wapnia w konkretnym systemie mikroskopowym może występować przy innych długościach fal.

Takie przesunięcia długości fal wynikają ze zmian drogi optycznej spowodowanych dodatkowymi, różnymi komponentami optycznymi. Podobnie zmienia się również punkt izospastyczny ISO dla każdego układu. Dlatego ważne jest określenie tych długości fal poprzez skanowanie widma.

Alternatywnie, przesiewanie Ming można rejestrować za pomocą fluorescencji przy dowolnych dwóch długościach fal w taki sposób, aby wartość końcowa była niezależna od stężenia wapnia. Należy rozpocząć od transfekcji hodowanych komórek K Ys SE one 50 plazmidami ekspresyjącymi RFP i zawierającymi albo HRNA specyficzny przeciwko I one, albo sekwencję scrambled przez 48 godzin. Transfekowane komórki należy hodować na szalkach z szklanym dnem.

Następnie usunąć medium i wypłukać komórki zrównoważonym roztworem soli lub BSS. Po wypłukaniu dodać 1 mL BSS zawierającego 2 µM RA 2:00 AM i inkubować naczynie w temperaturze 37 °C przez 40 minut. Pozostawić komórki w temperaturze pokojowej przez 15 minut, aby umożliwić konwersję wewnątrzkomórkowej formy URA 2:00 AM do URA two.

Następnie wypłucz płytkę dwukrotnie roztworem BSS pod mikroskopem. W trybie wizualizacji wybierz komórki wykazujące ekspresję RFP. Wybierz tryb stosunku wzbudzenia, ustawiając długość fali emisji na 510 nanometrów oraz długości fal wzbudzenia na 350 i 390 nanometrów.

Stosunek jest wyświetlany w trzecim oknie. Następnie należy rozpocząć rejestrację fluorescencji wybranych komórek przy określonych długościach fal, podczas gdy komórki są perfundowane czterema różnymi roztworami.

Podobnie, komórki KYSE 150 są obciążone ferra 2 i poddawane rejestracji. W trybie stosunku wzbudzenia, w przeciwieństwie do poprzedniej procedury, jako długość fali wzbudzenia wybrano punkt izospastyczny 360 nm. Następnie rejestruje się jednocześnie fluorescencję przy 360 i 390 nm, podczas gdy komórki są perfundowane pięcioma różnymi roztworami BSS.

Do realizacji tego protokołu komórki C2C12, mysia linia komórkowa miogenna, muszą zostać wyhodowane na szalkach z dna szklanego do osiągnięcia konfluencji, a następnie zróżnicowane w miotuby w medium do różnicowania zawierającym 2,5% surowicy końskiej. Miotuby C2C12 należy poddać inkubacji z RA 2:00 AM w roztworze BSS w końcowym stężeniu 5 µM przez 40 minut. Następnie należy dodać benzo-p-toluenosulfonamid (BTS) w końcowym stężeniu 20 µM, aby zahamować skurcze mięśni oraz wywołane przez nie artefakty ruchowe.

Inkubować komórki przez 15 minut w temperaturze pokojowej, utrzymując je w roztworze BTS. Następnie wprowadzić do systemu perfuzyjnego cztery objętości zrównoważonego roztworu soli.

Zgodnie z wcześniejszym opisem. Podczas każdej perfuzji należy rejestrować fluorescencję wybranych komórek przy 360 i 390 nanometrach. W tej serii magnez oraz thap argen są aplikowane jednocześnie w celu monitorowania gaszenia jonów magnezu.

Podczas wyczerpywania się zapasów wapnia w siateczce śródplazmatycznej. Aby wypreparować mięsień prostownik palców długi (EDL), ułóż nogę uśpionej myszy bokiem i usuń skórę z okolicy kostki aż do kolana. Przetnij powierzchowne warstwy tkanki mięśniowej, aby odsłonić EDL, a następnie przetnij ścięgna górne i dolne, aby uwolnić nienaruszony mięsień EDL.

Ważne jest, aby zachować jak największą długość ścięgien. Aby zapobiec jakimkolwiek skurczom, przenieś mięsień EDL do roztworu T road zawierającego 0,1 mM EGTA i pozbawionego wapnia, korzystając z mikroskopu stereoskopowego. Rozdziel ścięgna przyczepu kolanowego na dwie połowy i podziel mięsień EDL na dwa pęczki.

Powtarzaj proces do uzyskania ośmiu wiązek. Jeśli z którejkolwiek wiązki wypadną ścięgna, należy ją odrzucić. Następnie chwyć oba ścięgna paska wiązki mięśnia EDL i ostrożnie rozciągaj pasek, aż pozostaną nienaruszone trzy lub cztery oddzielne pojedyncze włókna mięśniowe z tkanką ścięgnistą po obu stronach.

Nanieś kroplę buforu Tyro pozbawionego wapnia do szalki z szklanym dnem. Połóż paski EDL prosto na szalce i szybko usuń jak największą ilość roztworu. Następnie mocno przymocuj oba ścięgna za pomocą wodoodpornej taśmy klejącej.

Włókno należy najpierw przemyć roztworem wolnym od wapnia, a następnie dwukrotnie roztworem wapnia o stężeniu 2.5 mM. Jeśli wystąpi hiperkontrakcja i zauważone zostaną uszkodzenia, należy odrzucić włókno, wybrane zdrowe włókna mięśniowe przemyć trzykrotnie roztworem płuczącym nr 1, a następnie zanurzyć je na pięć minut w zmodyfikowanym roztworze do skinningu imitującym środowisko wewnątrzkomórkowe. Za pomocą igły wolframowej przymocowanej do uchwytu należy mechanicznie przeprowadzić skinning włókna pod mikroskopem stereoskopowym; włókna ulegną ponownemu zamknięciu, więżąc rhodamaninę sprzężoną z wapniem w kanalikach poprzecznych.

Uzyskanie zdrowych, pojedynczych i nienaruszonych włókien mięśniowych lub przynajmniej pęczków tego typu włókien, które wciąż mają przyczepiony fragment ścięgna, jest w mojej opinii jednym z najtrudniejszych etapów, po którym następuje zawsze bardzo trudny transfer tych włókien do końcowej komory eksperymentalnej. W trakcie tego procesu włókna mogą ulec hiperkontrakcji lub nawet pęknąć. Zatem w przypadku posiadania zdrowych włókien, mechaniczne usuwanie sarkolemmy będzie znacznie łatwiejsze. Inkubuj włókna w roztworze do usuwania sarkolemmy z dodatkiem 20 µM fluro-5-NAM.

Po inkubacji przeprowadź dokładne przemycia roztworem płuczącym numer dwa, a następnie inkubuj przez kolejne 30 minut, aby umożliwić całkowitą deestryfikację barwnika. Włókna w wybranych obszarach zainteresowania można następnie zwizualizować za pomocą mikroskopu konfokalnego z obiektywem 60 x. Jednocześnie rejestruj fluorescencję każdego barwnika podczas perfuzji włókna roztworami SR loading oraz SR Depletion.

Aktywność SOCE w komórkach KYS, SE one 50 zbadano za pomocą pomiaru wewnątrzkomórkowego poziomu wapnia. Komórki zostały kotransfekowane RFP oraz krótkim kasetowym RNA (shRNA) przeciwko genowi OR I one, który koduje kanał A-S-O-C-E, w porównaniu z kontrolami reprezentowanymi przez czarną linię. Wyciszenie ekspresji OR I one doprowadziło do spadku aktywności SOCE. Obecność SOCE w komórkach KYC one 50 została również potwierdzona za pomocą testu wygaszania manganem. Po całkowitym opróżnieniu zapasów wapnia w ER przez TG, perfuzja manganu spowodowała znaczący spadek fluorescencji.

Stromsze nachylenie spadku sygnału URA dwa wskazuje na bardziej aktywny proces SOCE. Zatem powolny spadek fluorescencji w komórkach traktowanych związkiem dwa A PB wskazuje na to, że aktywność SOCE została zablokowana przez ten związek. Szybkość gaszenia manganem określono na podstawie pierwszych 10 sekund, kiedy gaszenie znajdowało się nadal w zakresie liniowym bez nasycenia; podobny test gaszenia manganem przeprowadzono w hodowlanych komórkach mięśniowych.

W tym przypadku mangan zastosowano wraz z tg. Podczas gdy TG wyczerpywało zapasy wapnia w SR, nachylenie wygaszania fluorescencji stopniowo ulegało zmianie, aż osiągnęło swoją maksymalną wartość. Krzywa sigmoidalna wskazała na stopniową aktywację SOCE w tych warunkach eksperymentalnych.

W obrazowaniu konfokalnym uwięzienie rhod5 i dye w przedziale TT w obrączkowanym włóknie wykazało charakterystyczny dla ssaków wzór podwójny, widoczny w kanale czerwonym. Po załadowaniu SR rhod5N, w kanale zielonym widoczny był typowy punktowy wzór SR podczas perfuzji obrączkowanego włókna roztworem do ładowania TTSR; intensywność fluorescencji zarówno rhod5N, jak i rhod5 wzrosła podczas perfuzji roztworem do uszczuplania SR, a poziomy fluorescencji w przedziale SR i przedziale TT zaczęły spadać. Wskazywało to na istnienie sprzężenia odpowiednio między uszczupleniem zapasów wapnia w SR a aktywacją SOCE.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać bardzo dobrą wiedzę na temat tego, jak pozyskać pierwsze żywotne, zdrowe i nienaruszone włókna mięśniowe. Muszą one posiadać odpowiedni fragment ścięgna na końcach, aby umożliwić skuteczny proces przytwierdzania, co w ostateczności pozwoli eksperymentatorowi na uzyskanie preparatu o znaczeniu fizjologicznym, który daje ogromną przewagę. Należy pamiętać, że wszystkie barwniki fluorescencyjne stosowane w tym badaniu są zazwyczaj światłoczułe, dlatego podczas wykonywania tej procedury należy zawsze przestrzegać środków ostrożności, takich jak ładowanie w ciemnych naczyniach oraz przemywanie w ciemni.

Opanowanie tej techniki zajmuje kilka godzin. Sugerujemy, aby najpierw pozyskać kilka nienaruszonych włókien, co pozwoli na zwiększenie odsetka sukcesów podczas etapów mechanicznego rozdzielania, a także w przypadku chęci hodowli tych włókien przez noc po ich wyizolowaniu. Technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie sygnalizacji wapniowej do zbadania roli wewnątrzkomórkowego uwalniania wapnia (SOCE) w procesach wzrostu i śmierci komórek nowotworowych.

Funkcja fizjologiczna i patologiczna w mięśniach.