Name: Fluorescencyjny pomiar wnikania wapnia w żywych komórkach: od hodowanej komórki rakowej do włókna mięśni szkieletowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 18 s
Description: Poznaj fluorescencyjną metodę pomiaru wnikania wapnia SOCE w żywych komórkach raka i włóknach mięśni szkieletowych. Technika ta umożliwia badanie dynamiki wapnia z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy dr. Noah Weislederowi za przeczytanie i redakcję niniejszej pracy. Praca ta była wspierana przez granty badawcze UMDNJ Foundation 62-09 dla ZP, American Heart Association SDG2630086 dla XZ, 0535555N dla MB oraz National Institutes of Health RC2AR058962-01 dla MB.

<ol><li>Parekh, A. B., Putney, J. W. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Store-operated+calcium+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Store-operated calcium channels.</a> Physiol. Rev. 85, 757-810 (2005).</li>
<li>Ma, J., Pan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrograde+activation+of+store-operated+calcium+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Retrograde activation of store-operated calcium channel.</a> Cell Calcium. 33, 375-384 (2003).</li>
<li>Feske, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ORAI1+and+STIM1+deficiency+in+human+and+mice%3A+roles+of+store-operated+Ca2%2B+entry+in+the+immune+system+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Rev%22%5BJournal%5D)">ORAI1 and STIM1 deficiency in human and mice: roles of store-operated Ca2+ entry in the immune system and beyond.</a> Immunol. Rev. 231, 189-209 (2009).</li>
<li>Parekh, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Store-operated+CRAC+channels%3A+function+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Store-operated CRAC channels: function in health and disease.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 9, 399-410 (2010).</li>
<li>Pan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysfunction+of+store-operated+calcium+channel+in+muscle+cells+lacking+mg29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Dysfunction of store-operated calcium channel in muscle cells lacking mg29.</a> Nat. Cell Biol. 4, 379-383 (2002).</li>
<li>Shin, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+retrograde+signal+from+calsequestrin+for+the+regulation+of+store-operated+Ca2%2B+entry+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">A retrograde signal from calsequestrin for the regulation of store-operated Ca2+ entry in skeletal muscle.</a> J. Biol. Chem. 278, 3286-3292 (2003).</li>
<li>Ma, J., Pan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Junctional+membrane+structure+and+store+operated+calcium+entry+in+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci%22%5BJournal%5D)">Junctional membrane structure and store operated calcium entry in muscle cells.</a> Front Biosci. 8, d242-d255 (2003).</li>
<li>Pan, Z., Damron, D., Nieminen, A. L., Bhat, M. B., Ma, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+of+intracellular+Ca2%2B+by+caffeine+and+ryanodine+induces+apoptosis+of+chinese+hamster+ovary+cells+transfected+with+ryanodine+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Depletion of intracellular Ca2+ by caffeine and ryanodine induces apoptosis of chinese hamster ovary cells transfected with ryanodine receptor.</a> J. Biol. Chem. 275, 19978-19984 (2000).</li>
<li>Hirata, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncoupling+store-operated+Ca2%2B+entry+and+altered+Ca2%2B+release+from+sarcoplasmic+reticulum+through+silencing+of+junctophilin+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Uncoupling store-operated Ca2+ entry and altered Ca2+ release from sarcoplasmic reticulum through silencing of junctophilin genes.</a> Biophys. J. 90, 4418-4427 (2006).</li>
<li>Zhao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+resistance+to+fatigue+and+altered+calcium+handling+properties+of+sarcalumenin+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Genomics%22%5BJournal%5D)">Enhanced resistance to fatigue and altered calcium handling properties of sarcalumenin knockout mice.</a> Physiol. Genomics. 23, 72-78 (2005).</li>
<li>Zhao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Azumolene+inhibits+a+component+of+store-operated+calcium+entry+coupled+to+the+skeletal+muscle+ryanodine+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Azumolene inhibits a component of store-operated calcium entry coupled to the skeletal muscle ryanodine receptor.</a> J. Biol. Chem. 281, 33477-33486 (2006).</li>
<li>Launikonis, B. S., Barnes, M., Stephenson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+coupling+between+skeletal+muscle+store-operated+Ca2%2B+entry+and+the+inositol+trisphosphate+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Identification of the coupling between skeletal muscle store-operated Ca2+ entry and the inositol trisphosphate receptor.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 2941-2944 (2003).</li>
<li>Shuttleworth, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+relationships+between+Ca2%2B+store+mobilization+and+Ca2%2B+entry+in+an+exocrine+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Calcium%22%5BJournal%5D)">Temporal relationships between Ca2+ store mobilization and Ca2+ entry in an exocrine cell.</a> Cell. Calcium. 15, 457-466 (1994).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Chociaż długości fal wzbudzenia dla Fura-2 związanego z Ca2+ i wolnego od Ca2+ wynoszą odpowiednio 340 nm i 380 nm, najlepszy zakres dynamiczny stosunku Fura-2 do pomiaru stężenia Ca2+ może występować przy innych długościach fal w konkretnym systemie mikroskopowym. Takie przesunięcia długości fal wynikają zazwyczaj ze zmian w drodze optycznej po dodaniu różnych komponentów optycznych. W niniejszym badaniu długości fal wzbudzenia dla Fura-2 określono jako 350 nm i 390 nm, wykonując analizę widmową fluorescencji Fura-2.
Wewnątrzkomórkowy poziom Ca2+ w cytozolu wynika z równowagi między kilkoma źródłami, w tym uwalnianiem Ca2+ z wnętrza komórki, napływem Ca2+ z zewnątrz oraz mechanizmami usuwania Ca2+ przez retikulum endoplazmatyczne (ER) i błonę komórkową. Aby wyizolować jednokierunkowy napływ Ca2+ zależny od SOC od uwalniania Ca2+ z wewnątrzkomórkowych magazynów i usuwania Ca2+ z komórki, można zastosować test wygaszania fluorescencji przez Mn2+. Znane jest, że Mn2+ może przenikać do komórek poprzez SOCE, lecz nie jest usuwany przez błonę komórkową ani pobierany do ER przez pompy Ca2+. Zatem wygaszanie fluorescencji stanowi pomiar jednokierunkowego strumienia Mn2+ do wnętrza komórek, co pozwala oszacować stopień aktywacji SOCE. Test wygaszania przez Mn2+ przeprowadza się w punkcie izobestycznym, czyli przy takiej długości fali, przy której intensywność fluorescencji Fura-2 jest niezależna od stężenia Ca2+. Punkt izobestyczny dla każdego układu należy wyznaczyć poprzez skanowanie widma. Alternatywnie wygaszanie przez Mn2+ można rejestrować poprzez korektę fluorescencji przy dowolnych dwóch długościach fali w taki sposób, aby wartość końcowa była niezależna od stężenia Ca2+13.
Aby uzyskać informacje przestrzenne i czasowe na temat aktywności SOCE w mięśniach szkieletowych, zastosowano metodę z użyciem dwóch barwników, która umożliwia jednoczesny pomiar aktywności SOCE oraz zawartości Ca2+ w SR w odsłonionych włóknach mięśnia EDL dorosłych ssaków. Korelację między zmianami zawartości Ca2+ w SR a aktywnością SOCE można przedstawić na wykresie, aby wskazać próg i czułość aktywacji SOCE w odpowiedzi na wyczerpanie zapasów Ca2+ w SR. Roztwór do ładowania TT został zoptymalizowany pod kątem dodatkowego nasycenia kanalików T jonami Ca2+ oraz ich przygotowania (primingu), natomiast roztwór do ładowania SR został zaprojektowany tak, aby promować maksymalne ładowanie SR jonami Ca2+ i dodatkowo nasycić kanalik T stężeniem ~500 μM Ca2+. Do roztworu do ładowania TT/SR oraz roztworu do wyczerpywania SR dodano FCCP, aby wyeliminować wpływ mitochondriów.

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640</td><td>Mediatech</td><td>10-040-CV</td><td> </td></tr><tr><td>Ham's F-12</td><td>Mediatech</td><td>10-080-CV</td><td> </td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Mediatech</td><td>10-013-CV</td><td> </td></tr><tr><td>Szalki z dnem szklanym</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td> </td></tr><tr><td>Fura-2 AM</td><td>Invitrogen (Molecular Probes)</td><td>F1221</td><td>-20 &amp;deg;C, szczelnie zamknięte, chronione przed światłem, rozpuszczone w DMSO</td></tr><tr><td>Fluo-5N AM</td><td>Invitrogen (Molecular Probes)</td><td>F14204</td><td>-20 &amp;deg;C, szczelnie zamknięte, chronione przed światłem</td></tr><tr><td>Rhod-5N</td><td>Invitrogen (Molecular Probes)</td><td>R14207</td><td>-20 &amp;deg;C, szczelnie zamknięte, chronione przed światłem</td></tr><tr><td>Kuweta kwarcowa</td><td>Starna Cells</td><td>3-Q-10</td><td> </td></tr><tr><td>tapsigargin</td><td>Tocris</td><td>1138</td><td> </td></tr><tr><td>2-amin&amp;#8211;toksy-diphenylboran (2-APB)</td><td>Tocris</td><td>1224</td><td> </td></tr><tr><td>N-benzylo-p-toluenosulfonamid (BTS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>435600</td><td> </td></tr><tr><td>Kollagenaza typu I</td><td>Sigma</td><td>C0130</td><td> </td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_step">Sprzęt:&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;ol&gt; &lt;li&gt; Spektrofluorometr (Photon Technology International, NJ): lampa ksenonowa, sterowany komputerowo szybki monochromator z dostępem swobodnym, monochromator emisji oparty na kuwecie, odwrócony mikroskop fluorescencyjny Nikon TE-200, obiektyw olejowy S Fluor 40x/1.30, detektory PMT.&lt;/li&gt; &lt;li&gt; Konfokalny mikroskop skaningowy (BioRad Radiance2100): laser argonowy 453/477/488/514, laser HeNe 543nm, odwrócony mikroskop Nikon TE2000, obiektyw 60X (N.A. 1.4, olejowy).&lt;/li&gt; &lt;li&gt; Stereomikroskop o powiększeniu &amp;gt; 100 (Zeiss Stemi SV11 Apo).&lt;/li&gt; &lt;/ol&gt;</td></tr></tbody></table>

pomiar wewnątrzkomórkowego napływu wapnia sterowanego zapasami w żywych komórkach z wykorzystaniem fluorescencji: od hodowlanych komórek nowotworowych po włókna mięśni szkieletowych

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Wjazd Ca2+ zależny od magazynów (SOCE), wcześniej określany jako wjazd Ca2+ pojemnościowy, jest ściśle regulowanym mechanizmem napływu zewnątrzkomórkowego Ca2+ do komórek w celu uzupełnienia wyczerpanych zapasów Ca2+ w retikulum endoplazmatycznym (ER) lub retikulum sarkoplazmatycznym (SR)1,2. Ponieważ Ca2+ jest powszechnym wtórnym przekaźnikiem, nie jest zaskakujące, że SOCE odgrywa istotną rolę w wielu procesach komórkowych, w tym w proliferacji, apoptozie, transkrypcji genów i motoryce. Ze względu na jego szerokie występowanie w niemal wszystkich typach komórek, w tym w komórkach nabłonkowych i mięśniach szkieletowych, ścieżka ta wzbudziła duże zainteresowanie3,4. Jednakże heterogeniczność charakterystyki SOCE w różnych typach komórek oraz jego funkcja fizjologiczna nie są jeszcze w pełni wyjaśnione5-7.
Funkcjonalne właściwości kanałów SOCE można ujawnić za pomocą badań metodą patch-clamp, natomiast obszerna wiedza na temat tej ścieżki została zdobyta dzięki pomiarom wewnątrzkomórkowego Ca2+ opartym na fluorescencji, ze względu na wygodę i możliwość prowadzenia wysokoprzepustowych przesiewów. Celem niniejszego raportu jest podsumowanie kilku metod opartych na fluorescencji służących do pomiaru aktywacji SOCE w komórkach w monowarstwie, komórkach w zawiesinie oraz w włóknach mięśniowych5,8-10. Najczęściej stosowaną z tych metod fluorescencyjnych jest bezpośrednie monitorowanie dynamiki wewnątrzkomórkowego Ca2+ z wykorzystaniem stosunku F340nm do F380nm (długość fali emisji 510 nm) ratiometrycznego wskaźnika Ca2+ Fura-2. W celu wyizolowania aktywności jednokierunkowego SOCE od wewnątrzkomórkowego uwalniania Ca2+ i usuwania Ca2+ na zewnątrz komórki, często stosuje się test wygaszania Mn2+. Znane jest, że Mn2+ może przenikać do komórek poprzez SOCE, podczas gdy jest on nieprzepuszczalny dla procesów usuwania przez błonę powierzchniową lub pochłaniania przez ER za pomocą pomp Ca2+ ze względu na bardzo wysokie powinowactwo do Fura-2. W rezultacie wygaszanie fluorescencji Fura-2 wywołane przedostawaniem się zewnątrzkomórkowego Mn2+ do komórek stanowi pomiar aktywności SOCE9. Pomiary ratiometryczne oraz testy wygaszania Mn+2 można przeprowadzać na spektrofluorometrze z kuwetą w trybie populacyjnym lub w systemie opartym na mikroskopie w celu wizualizacji pojedynczych komórek. Zaletą pomiarów pojedynczych komórek jest możliwość wyselekcjonowania za pomocą reporterów GFP lub RFP poszczególnych komórek poddanych manipulacjom genetycznym, co pozwala na badania w komórkach genetycznie zmodyfikowanych lub zmutowanych. Charakterystyka czasowo-przestrzenna SOCE w strukturalnie wyspecjalizowanych mięśniach szkieletowych może zostać uzyskana w preparatach włókien mięśniowych z usuniętą błoną komórkową (skinned muscle fibers) poprzez jednoczesne monitorowanie fluorescencji dwóch wskaźników Ca2+ o niskim powinowactwie, ukierunkowanych na konkretne przedziały włókna mięśniowego, takich jak Fluo-5N w SR i Rhod-5N w kanalikach poprzecznych9,11,12.

Zakres wlotu Ca2+ zależnego od zapasów (SOCE) można monitorować przy użyciu fluorescencyjnych wskaźników Ca2+. Wygaszanie tych wskaźników przez Mn2+ pozwala na badanie SOCE w hodowlach komórkowych i włóknach mięśni szkieletowych. Opisano również technikę umożliwiającą rozdzielczość przestrzenną i czasową SOCE poprzez obrazowanie konfokalne mechanicznie odskórkowanych włókien mięśniowych.

Pomiar wewnątrzkomórkowego napływu wapnia sterowanego zapasami w żywych komórkach z wykorzystaniem fluorescencji: od hodowlanych komórek nowotworowych po włókna mięśni szkieletowych

Wjazd jonów wapnia zależny od zapasów (SOCE), wcześniej określany jako wjazd wapnia pojemnościowy, jest ściśle regulowanym mechanizmem napływu pozakomórkowych jonów Ca2+ do komórek w celu...

Niniejsza metoda eksperymentalna jest wykorzystywana do ujawnienia właściwości wapniowego wejścia sterowanego zapasami (SOCE) w komórkach nowotworowych oraz komórkach mięśni szkieletowych przy użyciu metod opartych na fluorescencji. Osiąga się to poprzez rejestrację fluorescencji URA two w żywych komórkach, która jest czuła na wewnątrzkomórkowe stężenie wapnia. Ponadto, w celu zbadania SOCE, mierzy się szybkość gaszenia fluorescencji po dodaniu manganu przy długości fali niewrażliwej na stężenie wapnia, co bezpośrednio odzwierciedla aktywację SOCE.W strukturalnie wyspecjalizowanych komórkach mięśni szkieletowych przeprowadza się wycięcie i usuwanie błon komórkowych (skinning) mięśni. Przygotowuje się włókna mięśniowe. Następnie włókna traktuje się wskaźnikami wapnia o niskim powinowactwie i monitoruje ich wewnętrzną fluorescencję.Metody te wykazują, że SOCE występuje zarówno w komórkach niewzbudzalnych, jak i w mięśniach szkieletowych, charakteryzując się stopniowalną aktywacją i ścisłym powiązaniem z zawartością wewnątrzkomórkowych magazynów wapnia. Główną zaletą tej techniki opartej na fluoresceinie w porównaniu z innymi metodami, takimi jak elektrofizjologia czy patch-clamp, jest łatwość użycia oraz możliwość zastosowania w badaniach populacji komórek lub wysokoprzepustowym screeningu. Ważne jest zastosowanie odpowiednich warunków dla środowiska pomiarowego i testu magconing.Kalibracja poszczególnych instrumentów jest zatem kluczowa, ponieważ każde urządzenie różni się od innych. Wizualna demonstracja tej metody ma krytyczne znaczenie, gdyż proces mechanicznego oddzielania błony pojedynczych włókien mięśniowych jest trudny do opanowania, ponieważ wymaga specjalistycznego treningu praktycznego, dogłębnego zrozumienia i nauki technik mikrodisekcji, uważnej obserwacji oraz dużej dozy cierpliwości. Przed rozpoczęciem należy skalibrować zestaw mikroskopowy do pomiaru fluorescencji URA two. Chociaż długości fal wzbudzenia dla wiązania wapnia i URA two wynoszą odpowiednio 340 i 380 nanometrów, najlepszy zakres dynamiki stosunku URA two dla pomiaru wapnia w konkretnym systemie mikroskopowym może występować przy innych długościach fal.Takie przesunięcia długości fal wynikają ze zmian drogi optycznej spowodowanych dodatkowymi, różnymi komponentami optycznymi. Podobnie zmienia się również punkt izospastyczny ISO dla każdego układu. Dlatego ważne jest określenie tych długości fal poprzez skanowanie widma.Alternatywnie, przesiewanie Ming można rejestrować za pomocą fluorescencji przy dowolnych dwóch długościach fal w taki sposób, aby wartość końcowa była niezależna od stężenia wapnia. Należy rozpocząć od transfekcji hodowanych komórek K Ys SE one 50 plazmidami ekspresyjącymi RFP i zawierającymi albo HRNA specyficzny przeciwko I one, albo sekwencję scrambled przez 48 godzin. Transfekowane komórki należy hodować na szalkach z szklanym dnem.Następnie usunąć medium i wypłukać komórki zrównoważonym roztworem soli lub BSS. Po wypłukaniu dodać 1 mL BSS zawierającego 2 µM RA 2:00 AM i inkubować naczynie w temperaturze 37 °C przez 40 minut. Pozostawić komórki w temperaturze pokojowej przez 15 minut, aby umożliwić konwersję wewnątrzkomórkowej formy URA 2:00 AM do URA two.Następnie wypłucz płytkę dwukrotnie roztworem BSS pod mikroskopem. W trybie wizualizacji wybierz komórki wykazujące ekspresję RFP. Wybierz tryb stosunku wzbudzenia, ustawiając długość fali emisji na 510 nanometrów oraz długości fal wzbudzenia na 350 i 390 nanometrów.Stosunek jest wyświetlany w trzecim oknie. Następnie należy rozpocząć rejestrację fluorescencji wybranych komórek przy określonych długościach fal, podczas gdy komórki są perfundowane czterema różnymi roztworami.Podobnie, komórki KYSE 150 są obciążone ferra 2 i poddawane rejestracji. W trybie stosunku wzbudzenia, w przeciwieństwie do poprzedniej procedury, jako długość fali wzbudzenia wybrano punkt izospastyczny 360 nm. Następnie rejestruje się jednocześnie fluorescencję przy 360 i 390 nm, podczas gdy komórki są perfundowane pięcioma różnymi roztworami BSS.Do realizacji tego protokołu komórki C2C12, mysia linia komórkowa miogenna, muszą zostać wyhodowane na szalkach z dna szklanego do osiągnięcia konfluencji, a następnie zróżnicowane w miotuby w medium do różnicowania zawierającym 2,5% surowicy końskiej. Miotuby C2C12 należy poddać inkubacji z RA 2:00 AM w roztworze BSS w końcowym stężeniu 5 µM przez 40 minut. Następnie należy dodać benzo-p-toluenosulfonamid (BTS) w końcowym stężeniu 20 µM, aby zahamować skurcze mięśni oraz wywołane przez nie artefakty ruchowe.Inkubować komórki przez 15 minut w temperaturze pokojowej, utrzymując je w roztworze BTS. Następnie wprowadzić do systemu perfuzyjnego cztery objętości zrównoważonego roztworu soli.Zgodnie z wcześniejszym opisem. Podczas każdej perfuzji należy rejestrować fluorescencję wybranych komórek przy 360 i 390 nanometrach. W tej serii magnez oraz thap argen są aplikowane jednocześnie w celu monitorowania gaszenia jonów magnezu.Podczas wyczerpywania się zapasów wapnia w siateczce śródplazmatycznej. Aby wypreparować mięsień prostownik palców długi (EDL), ułóż nogę uśpionej myszy bokiem i usuń skórę z okolicy kostki aż do kolana. Przetnij powierzchowne warstwy tkanki mięśniowej, aby odsłonić EDL, a następnie przetnij ścięgna górne i dolne, aby uwolnić nienaruszony mięsień EDL.Ważne jest, aby zachować jak największą długość ścięgien. Aby zapobiec jakimkolwiek skurczom, przenieś mięsień EDL do roztworu T road zawierającego 0,1 mM EGTA i pozbawionego wapnia, korzystając z mikroskopu stereoskopowego. Rozdziel ścięgna przyczepu kolanowego na dwie połowy i podziel mięsień EDL na dwa pęczki.Powtarzaj proces do uzyskania ośmiu wiązek. Jeśli z którejkolwiek wiązki wypadną ścięgna, należy ją odrzucić. Następnie chwyć oba ścięgna paska wiązki mięśnia EDL i ostrożnie rozciągaj pasek, aż pozostaną nienaruszone trzy lub cztery oddzielne pojedyncze włókna mięśniowe z tkanką ścięgnistą po obu stronach.Nanieś kroplę buforu Tyro pozbawionego wapnia do szalki z szklanym dnem. Połóż paski EDL prosto na szalce i szybko usuń jak największą ilość roztworu. Następnie mocno przymocuj oba ścięgna za pomocą wodoodpornej taśmy klejącej.Włókno należy najpierw przemyć roztworem wolnym od wapnia, a następnie dwukrotnie roztworem wapnia o stężeniu 2.5 mM. Jeśli wystąpi hiperkontrakcja i zauważone zostaną uszkodzenia, należy odrzucić włókno, wybrane zdrowe włókna mięśniowe przemyć trzykrotnie roztworem płuczącym nr 1, a następnie zanurzyć je na pięć minut w zmodyfikowanym roztworze do skinningu imitującym środowisko wewnątrzkomórkowe. Za pomocą igły wolframowej przymocowanej do uchwytu należy mechanicznie przeprowadzić skinning włókna pod mikroskopem stereoskopowym; włókna ulegną ponownemu zamknięciu, więżąc rhodamaninę sprzężoną z wapniem w kanalikach poprzecznych.Uzyskanie zdrowych, pojedynczych i nienaruszonych włókien mięśniowych lub przynajmniej pęczków tego typu włókien, które wciąż mają przyczepiony fragment ścięgna, jest w mojej opinii jednym z najtrudniejszych etapów, po którym następuje zawsze bardzo trudny transfer tych włókien do końcowej komory eksperymentalnej. W trakcie tego procesu włókna mogą ulec hiperkontrakcji lub nawet pęknąć. Zatem w przypadku posiadania zdrowych włókien, mechaniczne usuwanie sarkolemmy będzie znacznie łatwiejsze. Inkubuj włókna w roztworze do usuwania sarkolemmy z dodatkiem 20 µM fluro-5-NAM.Po inkubacji przeprowadź dokładne przemycia roztworem płuczącym numer dwa, a następnie inkubuj przez kolejne 30 minut, aby umożliwić całkowitą deestryfikację barwnika. Włókna w wybranych obszarach zainteresowania można następnie zwizualizować za pomocą mikroskopu konfokalnego z obiektywem 60 x. Jednocześnie rejestruj fluorescencję każdego barwnika podczas perfuzji włókna roztworami SR loading oraz SR Depletion.Aktywność SOCE w komórkach KYS, SE one 50 zbadano za pomocą pomiaru wewnątrzkomórkowego poziomu wapnia. Komórki zostały kotransfekowane RFP oraz krótkim kasetowym RNA (shRNA) przeciwko genowi OR I one, który koduje kanał A-S-O-C-E, w porównaniu z kontrolami reprezentowanymi przez czarną linię. Wyciszenie ekspresji OR I one doprowadziło do spadku aktywności SOCE. Obecność SOCE w komórkach KYC one 50 została również potwierdzona za pomocą testu wygaszania manganem. Po całkowitym opróżnieniu zapasów wapnia w ER przez TG, perfuzja manganu spowodowała znaczący spadek fluorescencji.Stromsze nachylenie spadku sygnału URA dwa wskazuje na bardziej aktywny proces SOCE. Zatem powolny spadek fluorescencji w komórkach traktowanych związkiem dwa A PB wskazuje na to, że aktywność SOCE została zablokowana przez ten związek. Szybkość gaszenia manganem określono na podstawie pierwszych 10 sekund, kiedy gaszenie znajdowało się nadal w zakresie liniowym bez nasycenia; podobny test gaszenia manganem przeprowadzono w hodowlanych komórkach mięśniowych.W tym przypadku mangan zastosowano wraz z tg. Podczas gdy TG wyczerpywało zapasy wapnia w SR, nachylenie wygaszania fluorescencji stopniowo ulegało zmianie, aż osiągnęło swoją maksymalną wartość. Krzywa sigmoidalna wskazała na stopniową aktywację SOCE w tych warunkach eksperymentalnych.W obrazowaniu konfokalnym uwięzienie rhod5 i dye w przedziale TT w obrączkowanym włóknie wykazało charakterystyczny dla ssaków wzór podwójny, widoczny w kanale czerwonym. Po załadowaniu SR rhod5N, w kanale zielonym widoczny był typowy punktowy wzór SR podczas perfuzji obrączkowanego włókna roztworem do ładowania TTSR; intensywność fluorescencji zarówno rhod5N, jak i rhod5 wzrosła podczas perfuzji roztworem do uszczuplania SR, a poziomy fluorescencji w przedziale SR i przedziale TT zaczęły spadać. Wskazywało to na istnienie sprzężenia odpowiednio między uszczupleniem zapasów wapnia w SR a aktywacją SOCE.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać bardzo dobrą wiedzę na temat tego, jak pozyskać pierwsze żywotne, zdrowe i nienaruszone włókna mięśniowe. Muszą one posiadać odpowiedni fragment ścięgna na końcach, aby umożliwić skuteczny proces przytwierdzania, co w ostateczności pozwoli eksperymentatorowi na uzyskanie preparatu o znaczeniu fizjologicznym, który daje ogromną przewagę. Należy pamiętać, że wszystkie barwniki fluorescencyjne stosowane w tym badaniu są zazwyczaj światłoczułe, dlatego podczas wykonywania tej procedury należy zawsze przestrzegać środków ostrożności, takich jak ładowanie w ciemnych naczyniach oraz przemywanie w ciemni.Opanowanie tej techniki zajmuje kilka godzin. Sugerujemy, aby najpierw pozyskać kilka nienaruszonych włókien, co pozwoli na zwiększenie odsetka sukcesów podczas etapów mechanicznego rozdzielania, a także w przypadku chęci hodowli tych włókien przez noc po ich wyizolowaniu. Technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie sygnalizacji wapniowej do zbadania roli wewnątrzkomórkowego uwalniania wapnia (SOCE) w procesach wzrostu i śmierci komórek nowotworowych.Funkcja fizjologiczna i patologiczna w mięśniach.

fluorescence-based-measurement-store-operated-calcium-entry-live

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Pomiar oparty na fluorescencji wejścia wapnia kontrolowanego w żywych komórkach: od hodowanej komórki rakowej do włókna mięśnia szkieletu

Przedstawiamy metodę izolacji szybkich (mikrosekundowych) zdarzeń wapniowych od wolniejszych przepływów w żywych komórkach z wykorzystaniem konfokalnej mikroskopii skanującej. Metoda ta mierzy fluktuacje intensywności fluorescencji wskaźników wapnia poprzez rejestrację skanów liniowych obejmujących kilkaset pikseli w komórce. Analiza histogramowa pozwala na wyizolowanie skal czasowych różnych przepływów wapnia.

Pomiar szybkich przepływów jonów wapnia w kardiomiocytach

Źródło: Heredia, D. J., et. al. Obrazowanie ex vivo specyficznej dla komórki sygnalizacji wapniowej w trójdzielnej synapsie przepony myszy. J. Vis. Exp. (2018) Ten film przedstawia obrazowanie fluorescencyjne dynamiki wapnia w połączeniach nerwowo-mięśniowych (NMJ) u transgenicznej myszy wykazującej ekspresję genetycznie kodowanych wskaźników wapnia. NJM jest identyfikowany przez fluorescencyjnie znakowane receptory acetylocholiny w przeponie z nerwem przeponowym . Rozdzielacz obrazu służy do...

Obrazowanie fluorescencyjne dynamiki wapnia w połączeniach nerwowo-mięśniowych w przeponie transgenicznej myszy

Opisana tutaj jest metoda bezpośredniego pomiaru iskier wapniowych, podstawowych jednostek uwalniania Ca2+ z siateczki sarkoplazmatycznej w nienaruszonych włóknach mięśni szkieletowych. Metoda ta wykorzystuje wyzwalanie za pośrednictwem stresu osmotycznego uwalniania Ca2 + z receptora ryanodine w izolowanych włóknach mięśniowych. Dynamika i zdolność homeostatyczna wewnątrzkomórkowej sygnalizacji Ca2 + można wykorzystać do oceny funkcji mięśni w zdrowiu i chorobie.

Ocena iskier wapniowych w nienaruszonych włóknach mięśni szkieletowych

Obecnie, większość dostępnych wskaźników wapnia jest używana do ilościowego określania cytoplazmatycznych stanów przejściowych wapnia jako pośrednich miar wapnia uwalnianego z retikulum sarkoplazmatycznego w hodowanych komórkach mięśni gładkich. Protokół ten opisuje użycie specyficznego wskaźnika opartego na FRET, który umożliwia bezpośredni pomiar sygnałów wapniowych w świetle retikulum sarkoplazmatycznego.

Pomiar wahań stężenia wapnia w siateczce sarkoplazmatycznej hodowanych komórek mięśni gładkich za pomocą obrazowania konfokalnego opartego na FRET

Mitochondria mogą wykorzystywać potencjał elektrochemiczny w swojej wewnętrznej błonie (ΔΨm) do sekwestracji wapnia (Ca2+), co pozwala im kształtować cytozolową sygnalizację Ca2+ w komórce. Opisano metodę jednoczesnego pomiaru wychwytu Ca2+ i ΔΨm w mitochondriach w żywych komórkach za pomocą barwników fluorescencyjnych i mikroskopii konfokalnej.

Jednoczesny pomiar mitochondrialnego wapnia i potencjału błony mitochondrialnej w żywych komórkach za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Tutaj opisujemy metodologię uzyskiwania czystej populacji ludzkich mioblastów z dorosłej tkanki mięśniowej. Komórki te są wykorzystywane do badania różnicowania mięśni szkieletowych in vitro, a w szczególności do badania białek zaangażowanych w sygnalizację Ca2 +.

Izolacja ludzkich mioblastów, ocena różnicowania miogennego i pomiar wejścia wapnia w magazynie

Ta metoda umożliwia połączenie optogenetyki i genetycznie kodowanych czujników wapnia do obrazowania wyjściowego poziomu cytozolowego wapnia i zmian w wywołanych przejściowych stanach wapnia w mięśniach ściany ciała organizmu modelowego C. elegans.

Obrazowanie wapnia in vivo w mięśniach ściany ciała C. elegans

Opisano dwie powiązane metody wizualizacji zdarzeń subkomórkowych wymaganych do transmisji synaptycznej. Protokoły te umożliwiają monitorowanie w czasie rzeczywistym dynamiki napływu presynaptycznego wapnia i fuzji błony pęcherzyków synaptycznych przy użyciu obrazowania żywych komórek neuronów hodowanych in vitro.

Fluorescencyjny pomiar funkcji synaptycznych w czasie rzeczywistym w modelach stwardnienia zanikowego bocznego

Obecny artykuł opisuje wykonywanie metody obrazowania przyżyciowego w celu obserwacji mechanicznie indukowanej sygnalizacji wapniowej osadzonych osteocytów in vivo w czasie rzeczywistym w odpowiedzi na mechaniczne obciążenie trzeciej kości śródstopia myszy na poziomie tkankowym.

Fluorescencyjne obrazowanie przyżyciowe w celu zbadania dynamiki sygnalizacji wapniowej wywołanej obciążeniem w osteocytach myszy

Funkcjonalna fluorometria ukierunkowana na miejsce to metoda badania ruchów domen białek w czasie rzeczywistym. Modyfikacja tej techniki pod kątem jej zastosowania w komórkach natywnych umożliwia teraz wykrywanie i śledzenie ruchów pojedynczego czujnika napięcia z bramkowanych napięciem kanałów Ca2+ w mysich izolowanych włóknach mięśni szkieletowych.

Funkcjonalna fluorometria ukierunkowana na miejsce w komórkach natywnych w celu zbadania pobudliwości mięśni szkieletowych

Ten artykuł przedstawia metodę ilościowego monitorowania stężenia jonów wapnia (Ca2+) w komórkach w czasie rzeczywistym za pomocą jednokomórkowego obrazowania Ca2+ barwnikiem Fura-2/AM. Technika ta umożliwia efektywne ładowanie barwnika i dokładne obliczanie poziomów Ca2+ za pomocą współczynników intensywności fluorescencji, dzięki czemu jest to proste i szybkie podejście do zastosowań badawczych.

Obrazowanie wapnia w pojedynczych komórkach do badania aktywacji kanałów jonowych wapnia

Poznaj fluorescencyjną metodę pomiaru wnikania wapnia SOCE w żywych komórkach raka i włóknach mięśni szkieletowych. Technika ta umożliwia badanie dynamiki wapnia z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową.

Pomiar wewnątrzkomórkowego napływu wapnia sterowanego zapasami w żywych komórkach z wykorzystaniem fluorescencji: od hodowlanych komórek nowotworowych po włókna mięśni szkieletowych

Przeglądaj więcej filmów