Name: Synteza, montaż i charakterystyka jednowarstwowych folii nanocząstek złota chronionych w elektrochemii monowarstw białkowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 18 s
Description: Poznaj syntezę i montaż nanocząstek złota chronionych monowarstwami do elektrochemii białkowej. Ta metoda umożliwia badanie kinetyki transferu elektronów w białkach redoks z wykorzystaniem MPC.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Z wdzięcznością dziękujemy National Science Foundation (CHE-0847145) oraz programowi Henry Dreyfus Teacher-Scholar Awards za hojne wsparcie tych badań. Chcielibyśmy szczególnie wyróżnić Christine Davis, dyrektor ds. mikroskopii i obrazowania w Departamencie Biologii na Uniwersytecie w Richmond, za pomoc w obrazowaniu przekrojowym. Specjalne podziękowania kierujemy do dr T. Leopolda, R. Kanters, D. Kelloga, R. Millera i W. Case'a, a także do Russa Collinsa, Phila Josepha, Carolyn Marks, Mandy Mallory i Johna Wimbusha – osób, dzięki którym badania studenckie na Uniwersytecie w Richmond są możliwe. Bardzo osobiste podziękowania kierujemy do wszystkich obecnych, byłych i przyszłych studentów prowadzących badania w Leopold Research Lab.

1. Synteza klastrów złota chronionych monowarstwą heksanotiolanową
Monowarstwy chronionych klastrów złota (MPCs) funkcjonalizowane heksanotiolanami są syntetyzowane przy zachowaniu stosunku molowego 1-heksanotiolu (C6) do złota wynoszącego 2:1, w celu otrzymania średniej struktury Au225(C6)75. 4-9 Specyficzne modyfikacje reakcji Brusta, takie jak rodzaj ligandu, konkretne stosunki tiolu do złota, temperatura i szybkość dozowania reagentów w reakcji lub obróbka po syntezie, 9-11 mogą pozwolić na uzyskanie różnorodnej gamy MPCs o zróżnicowanych rozmiarach rdzenia i odpowiednio różnych funkcjonalnych grup ochronnych.4 Przybliżony (średni) skład MPCs funkcjonalizowanych różnymi grupami alkanotiolowymi można określić za pomocą analizy protonowego (1H) rezonansu magnetycznego jądrowego (NMR) próbek rozkładanych jodem.
<ol>
	<li>Rozpuścić 1,1 g bromku tetraoktyloamoniowego (TOABr) w 30 mL toluenu w odpowiednio wentylowanej komorze z dygestorium.</li>
	<li>Rozpuścić 0,38 g borowodorku sodu (NaBH4) w ok. 20 mL ultraczystej wody (UP H2O) o oporności 18 MΩ i schładzać w łaźni lodowej przez co najmniej 30 min.</li>
	<li>Rozpuścić 0,31 g kwasu tetrachlorozłotowego (HAuCl4) w ok. 20 mL UP H2O i ilościowo przenieść mieszaninę roztworów do roztworu TOABr w toluenie, używając dodatkowych ok. 5 mL UP H2O, aby przeprowadzić transfer fazowy wodnego roztworu złota do fazy niewodnej. Mieszać intensywnie przy lekko zamkniętym naczyniu przez 30 min, aż do dokładnego wymieszania ciemnopomarańczowej fazy wodnej i bezbarwnej fazy niewodnej.</li>
	<li>Przenieść obie fazy – bezbarwną wodną i ciemnopomarańczową niewodną – do rozdzielacza. Odrzucić warstwę wodną (dolną) i odlać warstwę niewodną (górną) do czystej kolby.</li>
	<li>Do roztworu niewodnego dodać C6 w stosunku 2:1 w stosunku do HAuCl4. Mieszać przez 30 min w celu utworzenia polimeru Au(I), co objawia się zmianą barwy z czerwonopomarańczowej na bladożółtą, niemal bezbarwną.</li>
	<li>Przenieść mieszaninę reakcyjną do izolowanej łaźni lodowej i schładzać do 0°C przez co najmniej 30 min przy ciągłym mieszaniu.</li>
	<li>Ilościowo i szybko dodać schłodzony roztwór NaBH4 do mieszaniny reakcyjnej, aby zredukować Au(I) do złota metalicznego w obecności tioli, co spowoduje natychmiastowe powstanie gęstego, czarnego roztworu MPCs. Mieszać mieszaninę reakcyjną przez noc w temperaturze 0°C.</li>
	<li>Przenieść mieszaninę reakcyjną do rozdzielacza, odlać warstwę wodną (dolną) do zlewki na odpady, a niewodną warstwę toluenu (górną) odparować w rotavaporze niemal do suchości, aż w kolbie pozostanie gęsty, czarny osad.</li>
	<li>Wytrącić MPCs poprzez dodanie acetonitrylu i pozostawić na noc.</li>
	<li>Zebrać MPCs poprzez filtrację próżniową za pomocą szklanego frity o średniej porowatości z gumowymi uszczelkami i kolby z bocznym wylotem podłączonej do aspiratora, a następnie przemyć obficie acetonitrylem.</li>
	<li>Pozostawić MPCs do wyschnięcia na powietrzu, zważyć produkt, scharakteryzować go za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) oraz analizy NMR, a następnie przechowywać w zamkniętym naczyniu do przyszłego użycia. Obrazy TEM uzyskać poprzez naniesienie kroplą MPCs rozpuszczonych w toluenie na folię wsporczą formvar/węgiel na siatce miedzianej (400 mesh), pracując na urządzeniu TEM przy napięciu 80-100 kV. Średnią wielkość rdzenia można oszacować przy użyciu oprogramowania do analizy obrazów, np. Image J (oprogramowanie bezpłatne).</li>
</ol>
2. Formowanie filmu: Formowanie filmu MPC sieciowanego ditiolami do elektrochemii monowarstw białkowych
Podłoże złote jest najpierw oczyszczane elektrochemicznie i modyfikowane za pomocą SAM C6 przed zanurzeniem w naprzemiennych roztworach cząsteczek łączących ditiolowych i zmodyfikowanych C6 MPC w celu przeprowadzenia „cyklu zanurzania”, który jest powtarzany kilkukrotnie, aby ostatecznie utworzyć zespół filmu MPC połączonego ditiolem. Jak opisano w poprzednich badaniach,2 oryginalny plazmid dla białka azuryny (AZ) Pseudomonas aeruginosa został uprzejmie przekazany przez dr. Coreya Wilsona z Rice University, natomiast AZ został dostarczony w formie oczyszczonego i liofilizowanego proszku przez profesora University of Richmond, dr. Jonathana Dattelbauma; następnie go rehydratowano w 4,4 mM buforze fosforanowym potasu (KPB, pH = 7.0, μ = 10 mM), aby przygotować roztwór o stężeniu 5-10 μM, co zweryfikowano za pomocą analizy spektroskopowej w zakresie ultrafioletu i światła widzialnego (UV-Vis).
<ol>
	<li>Zmontuj elektrochemiczną (echem) celę kanapkową w następującej kolejności, od dołu do góry: pierwsza płyta mocująca z Lucitu, podłoże złote jako elektroda robocza, mosiężny styk elektryczny do złotej elektrody roboczej, pierwsza uszczelka gumowa, o-ring z Vitonu definiujący obszar elektrody (0,32 cm2), szklany korpus celi, druga uszczelka gumowa oraz druga płyta mocująca z Lucitu. Cała cela jest utrzymywana w całości przez pręty gwintowane i starannie dokręcone nakrętki motylkowe. Cela jest wyposażona w zakupioną komercyjnie elektrodę odniesienia, która zawiera szklany cylinder z 1 M nasyconym KCl, drut odniesienia Ag/AgCl oraz drut elektrody pomocniczej z Pt.</li>
	<li>Oczyść elektrochemicznie złote podłoże, wykonując woltampetrię cykliczną (CV) w oknach potencjału od 0,2 do 0,9 V, 0,2 do 1,2 V oraz 0,2 do 1,35 V (względem Ag/AgCl, KCl) przy prędkości 100 mV/s w roztworze 0,1 M H2SO4 i 0,01 M KCl.</li>
	<li>Zmierz prąd ładowania oczyszczonego, gołego złotego podłoża, wykonując CV w „standardowych warunkach”, obejmujących okno potencjału od 0,1 do 0,4 V (względem Ag/AgCl, KCl) przy skanowaniu 100 mV/s w KPB.1 Odlej KPB i płucz sukcesywnie UP H2O, etanolem (EtOH), UP H2O i EtOH.</li>
	<li>Poddaj oczyszczone złote podłoże działaniu ˜300 μl 5 mM roztworu C6 w EtOH i pozostaw go na noc w celu utworzenia uporządkowanej SAM C6. Odlej roztwór C6 z celi i płucz sukcesywnie EtOH, UP H2O, EtOH i UP H2O.</li>
	<li>Zmierz prąd ładowania SAM w standardowych warunkach. Odlej KPB i płucz sukcesywnie UP H2O, EtOH, UP H2O i EtOH. Prąd ładowania powinien być wyraźnie niższy niż w przypadku pomiaru dla gołego złota (krok 2.3).1</li>
	<li>Poddaj złote podłoże zmodyfikowane SAM działaniu ˜300 μl 5 mM roztworu 1,9-nonanditiolu (NDT) w EtOH i pozostaw na 1 h, aby cząsteczki łączące NDT wbudowały się w SAM C6. Odlej roztwór NDT i płucz sukcesywnie i dokładnie EtOH, UP H2O, EtOH, UP H2O oraz chlorkiem metylenu (CH2Cl2).</li>
	<li>Poddaj złote podłoże działaniu roztworu MPC w CH2Cl2 (˜1 mg/mL) przy mieszaniu poprzez powolne przesycanie gazem N2 przez 1 h. W razie potrzeby uzupełnij odparowany roztwór MPC dodatkowym CH2Cl2. Jest to kotwicząca warstwa MPC zespołu filmu. Odlej roztwór MPC i ponownie płucz sukcesywnie CH2Cl2, UP H2O oraz KPB.</li>
	<li>Zmierz prąd ładowania warstwy MPC w standardowych warunkach. Odlej KPB i płucz sukcesywnie UP H2O oraz CH2Cl2.</li>
	<li>Poddaj złote podłoże działaniu ˜300 μl 5 mM roztworu NDT w CH2Cl2 przy mieszaniu poprzez powolne przesycanie gazem N2 przez 20 min.</li>
	<li>Odlej NDT i płucz dokładnie CH2Cl2. Powtórz kroki 2.7 i 2.8, aby nanieść drugą warstwę MPC zespołu filmu.</li>
	<li>Aby nanieść dodatkowe warstwy MPC, powtórz kroki 2.9 i 2.10. Przy każdej dodatkowej warstwie MPC obserwuje się odpowiadający jej wzrost prądu ładowania.</li>
	<li>Po utworzeniu sieciowego filmu MPC wypłucz zmodyfikowane podłoże za pomocą KPB. Białko AZ adsorbuj na zespole filmu MPC, wstrzykując ˜150 μL ˜5-10 μM roztworu AZ w KPB do elektrochemicznej celi kanapkowej i pozostawiając ją zamkniętą w lodówce przez co najmniej 1 h.</li>
	<li>Wyjmij celę elektrochemiczną z lodówki i pozwól jej powrócić do temperatury bliskiej pokojowej. Wypłucz dokładnie KPB, napełnij ponownie celę KPB i przesycaj KPB gazem N2 przez 10 min.</li>
	<li>Elektrochemiczne badania monowarstwy białkowej wykonuje się jako CV w oknie potencjału od -0,25 V do 0,25 V (względem Ag/AgCl, KCl) przy skanowaniu 100 mV/sec w KPB.</li>
</ol>
3. Montaż filmu: Montaż filmu MPC powiązanego ditiolem do śledzenia optycznego
Przed hodowlą filmów MPC do oceny optycznej, fragmenty szkiełek przedmiotowych są wstępnie oczyszczane roztworem Piranha (UWAGA! stężony H2SO4 i H2O2 w stosunku 2:1) i traktowane (3-merkaptopropyl)-trimetoksysilanem (3-MPTMS).1-2 Następnie filmy MPC są osadzane na tych zmodyfikowanych szkiełkach szklanych przy użyciu techniki „cyklu zanurzeniowego” (dip cycle), zgodnie z wcześniejszym opisem.
<ol>
	<li>Opłucz szkiełko modyfikowane 3-MPTMS przy użyciu CH2Cl2 i umieść je w roztworze MPC w CH2Cl2 (˜1 mg/mL) na 1 hr, wytrząsając na wytrząsarce z niską prędkością. Dopełnia to formowanie pierwszej warstwy MPC w strukturze filmu poprzez zakotwiczenie MPC do grup końcowych merkaptanów silanu. Dokładnie opłucz szkiełko CH2Cl2 i wysusz strumieniem gazu N2. Wykonaj widmo UV-Vis (od 400 do 1000 nm) szkiełka, a następnie ponownie opłucz je CH2Cl2.</li>
	<li>Umieść szkiełko w 5 mM roztworze NDT w CH2Cl2 na 1 hr, wytrząsając na wytrząsarce z niską prędkością. Opłucz szkiełko CH2Cl2.</li>
	<li>Umieść szkiełko w roztworze MPC na 1 hr, wytrząsając na wytrząsarce z niską prędkością. Dopełnia to formowanie drugiej warstwy MPC w strukturze filmu. Dokładnie opłucz szkiełko CH2Cl2, wysusz strumieniem gazu N2 i wykonaj widmo UV-Vis (od 400 do 1000 nm) szkiełka. Absorbancja w całym widmie powinna wzrastać wraz z adsorpcją kolejnych warstw MPC do struktury filmu.</li>
	<li>Aby osadzić dodatkowe warstwy MPC, powtarza się kroki 3.2-3.3.</li>
</ol>
4. Charakterystyka struktur filmu z klastrów złota chronionych monowarstwą za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej w przekroju poprzecznym
Przekroje poprzeczne do TEM przygotowuje się poprzez ponowne zatopienie w żywicy filmów zatopionych en face.2, 12 W tym celu najpierw przymocowuje się film MPC osadzony na szkiełku przedmiotowym zmodyfikowanym 3-MPTMS do czystego, standardowego szkiełka przedmiotowego, używając żywicy epoksydowej Embed 812, aby ułatwić manipulację podczas poniższej procedury. Należy zachować ostrożność przy stosowaniu ciepła, ponieważ wyższe temperatury spowodują rozkład MPC w filmie.
<ol>
	<li>Wymieszać żywicę epoksydową Embed 812 i pozostawić do zagęszczenia na co najmniej 12 hr.</li>
	<li>Wypełnić kapsułkę BEEM typu „00” żywicą epoksydową i odwrócić ją na próbce filmu MPC (przygotowanej w sekcji 3). Przyłożyć nacisk do kapsułki tak, aby pęcherzyk powietrza uniósł się do góry, tworząc uszczelnienie między żywicą epoksydową a próbką filmu MPC. Pozostawić do polimeryzacji na co najmniej 18 hr w temperaturze 60°C, a następnie schłodzić zamontowane szkiełka do temperatury pokojowej.</li>
	<li>Podgrzewać zamontowane szkiełka przez 20 sec na aluminiowej płycie grzejnej w temperaturze 200°C, aby ułatwić usunięcie bloku z przymocowanym filmem MPC en face.</li>
	<li>Odciąć próbkę zawierającą film od bloku kapsułki BEEM za pomocą piłki jubilerskiej.</li>
	<li>Ponownie zatopić usuniętą część w płaskiej formie silikonowej, stroną z filmem MPC skierowaną do góry, w stronę wnętrza wgłębienia silikonowego. Wypełnić wgłębienie silikonowe żywicą epoksydową w temperaturze pokojowej i pozostawić do polimeryzacji na co najmniej 18 hr w temperaturze 60°C. Schłodzić próbkę do temperatury pokojowej.</li>
	<li>Przygotować cienkie sekcje próbki o grubości 60-80 nm na ultramikrotomie Leica UCT, używając noża diamentowego do cięcia sekcji prostopadle do krawędzi noża.</li>
	<li>Nanieść wycięte sekcje na nośną folię formvar/węgiel na siatce miedzianej (400 mesh) i wykonać obrazy TEM przygotowanych przekrojów poprzecznych struktur filmu MPC.</li>
</ol>
5. Reprezentatywne wyniki:
<img alt="Wykres woltamperometrii cyklicznej; potencjał względem natężenia prądu; analiza elektrochemiczna; elektroda odniesienia Ag/AgCl." src="/files/ftp_upload/3441/3441fig1.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1 Monitorowanie prądu ładowania warstwy podwójnej podczas wzrostu filmu MPC przez łącznie 5 cykli zanurzania (naprzemienna ekspozycja na roztwory MPC i NDT). Prąd ładowania systematycznie wzrastał z każdym cyklem zanurzania, dodając „warstwy” MPC do filmu (Ryc. 2). Woltamperogramy cykliczne zarejestrowano w oknie potencjałów od 0,1 do 0,4 V (względem Ag/AgCl, KCl) przy prędkości skanowania 100 mV/s w 4,4 mM buforze fosforanowym potasu (pH = 7,0, μ = 10 mM). Przedrukowano za zgodą M.L. Vargo, C.P. Gulka, J.K. Gerig, C.M. Manieri, J.D. Dattelbaum, C.B. Marks, N.T. Lawrence, M.L. Trawick i M.C. Leopold, Langmuir 26(1), 560-569. Copyright 2010 American Chemical Society.
<img alt="Schemat interfejsu warstwy białkowej z zestawem MPC; wykres woltamperometrii cyklicznej do analizy elektrochemicznej." src="/files/ftp_upload/3441/3441fig2.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2 (a) Schematyczne przedstawienie białka AZ zaadsorbowanego na zestawieniu filmu MPC połączonego ditiolem. (b) Typowy woltamperogram cykliczny dla białka AZ zaadsorbowanego na zestawieniu filmu MPC, zarejestrowany w oknie potencjałów od -0.25 do +0.25 V (względem Ag/AgCl, KCl) przy szybkości skanowania 100 mV/s w 4.4 mM buforze fosforanowym potasu (pH = 7.0, μ = 10 mM).
<img alt="Wykres absorbancji w funkcji długości fali; badania fotoniczne; analiza emisji; analiza danych spektralnych." src="/files/ftp_upload/3441/3441fig3.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3 Reprezentatywny monitoring widm UV-Vis wzrostu filmu MPC połączonego ditiolem na szkiełku modyfikowanym 3-MPTMS. Cykl zanurzania składa się z ekspozycji szkiełka na roztwór łącznika NDT, a następnie na roztwór MPC. Każde kolejne zanurzenie prowadzi do wzrostu grubości filmu i jednoczesnego wzrostu absorbancji. Wraz ze wzrostem liczby cykli zanurzania, prążek plazmonu powierzchniowego stopniowo kształtuje się przy ˜520 nm. Przedrukowano za zgodą M.L. Vargo, C.P. Gulka, J.K. Gerig, C.M. Manieri, J.D. Dattelbaum, C.B. Marks, N.T. Lawrence, M.L. Trawick i M.C. Leopold, Langmuir 26(1), 560-569. Copyright 2010 American Chemical Society.
<img alt="Obraz z mikroskopii elektronowej nanocząsteczek. Schemat analizy struktury nanomateriału." src="/files/ftp_upload/3441/3441fig4.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4 Analiza obrazu przekroju w transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) struktury filmu MPC połączonego ditiolami. Wstawka: Typowy obraz TEM MPC funkcjonalizowanych heksanotiolanem użytych w strukturze filmu. Analiza TEM przy użyciu programu Image J pozwoliła określić średnicę rdzenia złota MPC na poziomie ˜2 nm. Przedrukowano za zgodą M.L. Vargo, C.P. Gulka, J.K. Gerig, C.M. Manieri, J.D. Dattelbaum, C.B. Marks, N.T. Lawrence, M.L. Trawick oraz M.C. Leopold, Langmuir 26(1), 560-569. Copyright 2010 American Chemical Society.

<ol><li>Loftus, A. F., Reighard, K. P., Kapourales, S. A., Leopold, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monolayer-Protected+Nanoparticle+Film+Assemblies+as+Platforms+for+Controlling+Interfacial+and+Adsorption+Properties+in+Protein+Monolayer+Electrochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Monolayer-Protected Nanoparticle Film Assemblies as Platforms for Controlling Interfacial and Adsorption Properties in Protein Monolayer Electrochemistry.</a> J. Am. Chem. Soc. 130, 1649-1661 (2008).</li>
<li>Vargo, M. L., Gulka, C. P., Gerig, J. K., Manieri, C. M., Dattelbaum, J. D., Marks, C. B., Lawrence, N. T., Trawick, M. L., Leopold, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distance+Dependence+of+Electron+Transfer+Kinetics+for+Azurin+Protein+Adsorbed+to+Monolayer+Protected+Nanoparticle+Film+Assemblies%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Distance Dependence of Electron Transfer Kinetics for Azurin Protein Adsorbed to Monolayer Protected Nanoparticle Film Assemblies.</a> Langmuir. 26, 560-569 (2010).</li>
<li>Doan, T. T., Vargo, M. L., Gerig, J. K., Gulka, C. P., Trawick, M. L., Dattelbaum, J. D., Leopold, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrochemical+analysis+of+azurin+thermodynamic+and+adsorption+properties+at+monolayer-protected+cluster+film+assemblies+-+Evidence+for+a+more+homogeneous+adsorption+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Colloid+and+Interface+Science%22%5BJournal%5D)">Electrochemical analysis of azurin thermodynamic and adsorption properties at monolayer-protected cluster film assemblies - Evidence for a more homogeneous adsorption interface.</a> Journal of Colloid and Interface Science. 352, 50-58 (2010).</li>
<li>Brust, M., Walker, M., Bethell, D., Schriffrin, D. J., Whyman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+Thiol-derivatised+Gold+Nanoparticles+in+a+Two-phase+Liquid-Liquid+System%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chem.+Soc.+Chem.+Commun%22%5BJournal%5D)">Synthesis of Thiol-derivatised Gold Nanoparticles in a Two-phase Liquid-Liquid System.</a> J. Chem. Soc. Chem. Commun. , 801-802 (1994).</li>
<li>Scouten, W. H., Luong, J. H., Brown, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme+or+protein+immobilization+techniques+for+applications+in+biosensor+design%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Enzyme or protein immobilization techniques for applications in biosensor design.</a> Trends Biotechnol. 13, 178-185 (1995).</li>
<li>Davis, J., Vaughan, D. H., Cardosi, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elements+of+biosensor+construction%5BTitle%5D)+AND+%22Enzyme+Microb.+Technol%22%5BJournal%5D)">Elements of biosensor construction.</a> Enzyme Microb. Technol. 17, 1030-1035 (1995).</li>
<li>Ramsay, G., Ed, In Commercial Biosensors - Applications to Clinical, Bioprocess, and Environmental Samples. , John Wiley & Sons. New York. (1998).</li>
<li>Ghindilis, A. L., Atanasov, P., Wilkins, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunosensors%3A+electrochemical+sensing+and+other+engineering+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Immunosensors: electrochemical sensing and other engineering approaches.</a> Biosens. Bioelectron. 13, 113-131 (1998).</li>
<li>Templeton, A. C., Wuelfing, W. P., Murray, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monolayer-Protected+Cluster+Molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Accounts.+Chem.+Res%22%5BJournal%5D)">Monolayer-Protected Cluster Molecules.</a> Accounts. Chem. Res. 33, 27-36 (2000).</li>
<li>Aguila, A., Murray, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monolayer-Protected+Clusters+with+Fluorescent+Dansyl+Ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Monolayer-Protected Clusters with Fluorescent Dansyl Ligands.</a> Langmuir. 16, 5949-5954 (2000).</li>
<li>Hostetler, M. J., Templeton, A. C., Murray, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+Place-Exchange+Reactions+on+Monolayer-Protected+Gold+Cluster+Molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Dynamics of Place-Exchange Reactions on Monolayer-Protected Gold Cluster Molecules.</a> Langmuir. 15, 3782-3789 (1999).</li>
<li>Wanunu, M., Popovitz-Biro, R., Cohen, H., Vaskevich, A., Rubenstein, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordination-Based+Gold+Nanoparticle+Layers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Coordination-Based Gold Nanoparticle Layers.</a> J. Am. Chem. Soc. 127, 9207-9215 (2005).</li>
<li>Gaylean, A. A., Day, R. W., Malinowski, J., Kittredge, K. W., Leopold, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyelectrolyte-linked+film+assemblies+of+nanoparticles+and+nanoshells%3A+Growth%2C+stability%2C+and+optical+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Colloid+and+Interface+Science%22%5BJournal%5D)">Polyelectrolyte-linked film assemblies of nanoparticles and nanoshells: Growth, stability, and optical properties.</a> Journal of Colloid and Interface Science. 331, 532-542 (2009).</li>
<li>Campbell-Rance, D. S., Doan, T. T., Leopold, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sweep%2C+Step%2C+Pulse%2C+and+Frequency-Based+Techniques+Applied+to+Protein+Monolayer+Electrochemistry+at+Nanoparticle+Interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Sweep, Step, Pulse, and Frequency-Based Techniques Applied to Protein Monolayer Electrochemistry at Nanoparticle Interfaces.</a> , Forthcoming Forthcoming.</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Elektrochemia monowarstw białkowych jest skuteczną techniką stosowaną do badania oddziaływań między białkami redoks a syntetycznymi platformami adsorpcyjnymi. Skuteczność tej strategii zależy jednak od możliwości zaprojektowania interfejsu adsorpcyjnego z wysokim stopniem kontroli na poziomie molekularnym. Platformy oparte na MPC stworzone zgodnie z tym protokołem stanowią specjalnie zaprojektowane układy, które są w stanie zapewnić bardziej jednorodne środowisko adsorpcji białek3 oraz ułatwić ET na większym d...

<table><tbody><tr><td>Bromek tetraoktyloamoniu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>294136</td><td></td></tr><tr><td>Borowodorek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>213462</td><td></td></tr><tr><td>Tetrachloroauran(III) wodoru</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>254169-5G</td><td></td></tr><tr><td>1-Heksanotiol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>234192</td><td></td></tr><tr><td>Transmisyjny mikroskop elektronowy</td><td>JEOL</td><td>1010</td><td></td></tr><tr><td>Spektrometr magnetycznego rezonansu jądrowego</td><td>Bruker Corporation</td><td>300 MHz</td><td></td></tr><tr><td>Siatka miedziana (400 mesh) z warstwą Formvar/węgiel</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>FCF400-Cu</td><td></td></tr><tr><td>Podłoże złote</td><td>Evaporated Metal Films Corp.</td><td>Custom</td><td></td></tr><tr><td>Elektroda odniesienia Ag/AgCl</td><td>Microelectrodes, Inc.</td><td>MI-401F</td><td></td></tr><tr><td>Potencjostaty</td><td>CH Instruments, Inc.</td><td>CHI650A, CHI610B</td><td></td></tr><tr><td>1,9-Nonanoditiol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N29805</td><td></td></tr><tr><td>(3-merkaptopropyl)-trimetoksysilan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>175617</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr UV-Vis</td><td>Agilent Technologies</td><td>8453</td><td></td></tr><tr><td>Żywica epoksydowa Embed 812</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>14120</td><td></td></tr><tr><td>&quot;00&quot; kapsułka BEEM</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>70000-B</td><td></td></tr><tr><td>Krzemowa forma płaska</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>70900</td><td></td></tr><tr><td>Nóż diamentowy</td><td>Diatome</td><td>21-ULE, S12801</td><td></td></tr></tbody></table>

synteza, montaż i charakterystyka filmów z nanocząsteczek złota chronionych monowarstwą do elektrochemii monowarstw białek

Synthesis, Assembly, and Characterization of Monolayer Protected Gold Nanoparticle Films for Protein Monolayer Electrochemistry

Koloidalne nanocząstki złota chronione ligandami alkanotiolanowymi, nazywane monowarstwowymi chronionymi klastrami złota (MPCs), są syntetyzowane, a następnie włączane do struktur filmowych, które służą jako platformy adsorpcyjne dla elektrochemii monowarstw białkowych (PME). PME jest wykorzystywane jako system modelowy do badania właściwości elektrochemicznych białek redoks poprzez ograniczenie ich do platformy adsorpcyjnej na modyfikowanej elektrodzie, która służy również jako partner redoks w reakcjach przeniesienia elektronów (ET). Badania wykazały, że struktury filmowe z nanocząstek złota tego typu zapewniają bardziej jednorodne środowisko adsorpcji białek i wspomagają ET bez zależności od odległości w porównaniu do bardziej tradycyjnych systemów modyfikowanych samoorganizującymi się monowarstwami (SAM) alkanotioli.1-3 W niniejszej pracy MPC funkcjonalizowane ligandami heksanotiolanowymi są syntetyzowane przy użyciu zmodyfikowanej reakcji Brusta4 i charakteryzowane za pomocą spektroskopii ultrafioletowej i widzialnej (UV-Vis), transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) oraz protonowego (1H) rezonansu magnetycznego jądrowego (NMR). Filmy MPC są osadzane na powierzchniach elektrod złota modyfikowanych SAM przy użyciu metody „cyklu zanurzeń” polegającej na naprzemiennym nakładaniu warstw MPC i cząsteczek łączących z ditiolu. Wzrost filmu na elektrodzie złotej jest monitorowany elektrochemicznie poprzez pomiar zmian prądu ładowania warstwy podwójnej układu. Analogiczne filmy osadzone na szklanych płytkach modyfikowanych silanami umożliwiają optyczne monitorowanie wzrostu filmu, a analiza TEM w przekroju pozwala na oszacowanie grubości filmu. Podczas formowania filmu manipulacja ochroną ligandów MPC, a także mechanizm wiązania międzycząsteczkowego, pozwalają na uzyskanie sieciowych filmów, które są łatwo adaptowalne do interfejsu z białkami redoks o różnych mechanizmach adsorpcji. Na przykład azuryna (AZ) z Pseudomonas aeruginosa może być adsorbowana hydrofobowo do filmów z MPC heksanotiolanowych łączonych ditiolem, a cytochrom c (cyt c) może być immobilizowany elektrostatycznie na warstwie interfejsowej MPC modyfikowanej kwasem karboksylowym. W niniejszym raporcie skupiamy się wyłącznie na protokole tworzenia filmu dla systemu AZ. Badania dotyczące adsorpcji białek na syntetycznych platformach modyfikowanych MPC mogą pogłębić zrozumienie oddziaływań między biomolekułami a materiałami sztucznymi i w konsekwencji pomóc w opracowaniu schematów biosensorów, systemów modelowania ET oraz syntetycznych materiałów biokompatybilnych.5-8

Koloidy złota stabilizowane alkanotiolanami, znane jako klastry chronione monowarstwą (MPCs), są syntetyzowane, charakteryzowane i montowane w cienkie filmy służące jako interfejs adsorpcyjny dla elektrochemii monowarstw białkowych w przypadku prostych białek redoks, takich jak azuryna (AZ) z Pseudomonas aeruginosa oraz cytochrom c (cyt c).

Synteza, montaż i charakterystyka filmów z nanocząsteczek złota chronionych monowarstwą do elektrochemii monowarstw białek

Koloidalne nanocząsteczki złota chronione ligandami alkanotiolanowymi, nazywane złotymi klastrami chronionymi monowarstwą (MPCs), są syntetyzowane, a następnie...

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest synteza stabilizowanych alkilanami nanocząstek złota, znanych jako klastry chronione monowarstwą (MPC), oraz złożenie tych materiałów w cienkowarstwowe struktury służące jako interfejs absorpcyjny dla elektrochemii monowarstwy białka azaryny. Osiąga się to poprzez wstępną ochronę koloidów złota ligandami organicznymi w celu utworzenia nanocząstek złota otoczonych warstwą alkanotiolową. Następnie MPC są zakotwiczane na podłożach ze złota i szkła i sieciowane w cienkie, wielowarstwowe filmy powiązane kowalencyjnie, których wzrost jest monitorowany za pomocą pomiarów optycznych i elektrochemicznych, a także mikroskopii przekroju poprzecznego.Następnie białko przenoszące elektrony, azaryna, jest absorbowane na granicy faz, a następnie przeprowadza się woltametrię cykliczną w celu analizy elektrochemicznej monowarstwy białkowej. Wyniki wykazują, że granice faz filmu MPC stworzone za pomocą tej procedury umożliwiają bardziej zoptymalizowaną analizę elektrochemiczną białek zaadsorbowanych na filmie MPC, zapewniając bardziej jednorodną granicę adsorpcji oraz szybką kinetykę transferu elektronów, która nie wykazuje tradycyjnej zależności od odległo

synthesis-assembly-characterization-monolayer-protected-gold

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Synteza, montaż i charakterystyka jednowarstwowych folii nanocząstek złota chronionych w elektrochemii monowarstw białkowych

Opisujemy techniki mikrotworzenia cienkich warstw nanoporowatego złota za pomocą druku szablonowego i fotolitografii, a także metody hodowli komórek na mikrofabrykowanych wzorach. Ponadto opisano metody analizy obrazu w celu scharakteryzowania morfologii materiału i hodowanych komórek przy użyciu technik skaningowej mikroskopii elektronowej i fluorescencyjnej.

Mikrofabrykacja nanoporowatych wzorów złota do badań interakcji komórka-materiał

Prosta, solidna i skalowalna technika funkcjonalizacji i samodzielnego montażu makroskopowych warstw nanocząstek-ligandów na podłożach bez szablonów jest opisana w tym protokole.

Technika funkcjonalizacji i samoorganizacji makroskopowych warstw monowarstwowych nanocząstek-ligand na podłożach bez szablonów

Przeprowadzana jest synteza jednolitych nanocząstek złota pokrytych półprzewodnikowymi powłokami CdS lub ZnS. Powłoka półprzewodnikowa jest przeprowadzana przez pierwsze osadzenie powłoki siarczku srebra i wymianę kationów srebra na kationy lub kadmu.

Synteza, charakterystyka i funkcjonalizacja hybrydowych nanocząstek rdzenia/powłoki Au/CdS i Au/ZnS

Przedstawiono protokół koloidalnej syntezy nanokostek srebra i wytwarzania plazmonicznych nanoskalowych anten krosowych z przerwami poniżej 10 nm.

Synteza koloidalna anten nanopatchowych do zastosowań w plazmonice i nanofotonice

Pokazujemy wytwarzanie okresowych matryc nanokubków złotych za pomocą technik litograficznych koloidalnych i omawiamy znaczenie warstw nanoplazmonowych.

Wytwarzanie okresowych matryc złotych nanokubków przy użyciu litografii koloidalnej

Ten protokół szczegółowo opisuje nowatorską technikę nano-produkcji, która może być wykorzystana do tworzenia kontrolowanych i konfigurowalnych folii nanocząsteczkowych na dużych obszarach, w oparciu o samoorganizację odwilżania zasklepionych folii metalowych.

Nanowytwarzanie nanocząstek złota na dużej powierzchni w oparciu o podłoże poprzez odwilżanie

Amfifilowe nanocząstki złota mogą być używane w wielu zastosowaniach biologicznych. Przedstawiono protokół syntezy nanocząstek złota pokrytych binarną mieszaniną ligandów oraz szczegółową charakterystykę tych cząstek.

Synteza i charakterystyka amfifilowych nanocząstek złota

Tutaj prezentujemy protokół do badania molekularnego mechanizmu translokacji protonów przez błony lipidowe pojedynczych liposomów, używając cytochromu bo3 jako przykładu. Łącząc elektrochemię i mikroskopię fluorescencyjną, zmiany pH w świetle pojedynczych pęcherzyków, zawierających jeden lub wiele enzymów, mogą być wykrywane i analizowane indywidualnie.

Pomiary pojedynczych liposomów do badania enzymów błonowych pompujących protony przy użyciu elektrochemii i mikroskopii fluorescencyjnej

Ta praca przedstawia protokół umożliwiający osiągnięcie dynamicznego, nieinwazyjnego monitorowania transferu ciepła z napromieniowanych laserowo nanocząstek złota do tBLM. System łączy spektroskopię impedancji do pomiaru zmian przewodności w czasie rzeczywistym w tBLM z poziomo skupioną wiązką laserową, która napędza oświetlenie nanocząstek złota, w celu produkcji ciepła.

Dwuwarstwowe membrany lipidowe na uwięzi do monitorowania wymiany ciepła między nanocząstkami złota a błonami lipidowymi

Przedstawiono protokół syntezy nanocząstek złota o średnicy ~12 nm (nanocząstek Au) w rozpuszczalniku organicznym. Nanocząstki złota są pokryte ligandami oleiloaminy, aby zapobiec aglomeracji. Nanocząstki złota są rozpuszczalne w rozpuszczalnikach organicznych, takich jak toluen.

Synteza nanocząstek złota

Obecny protokół opisuje technologię znakowania za pomocą klonowalnego mikroskopu elektronowego do wykrywania białek znakowanych metalotioneiną w komórkach za pomocą nowatorskiej techniki syntezy nanocząstek złota opartej na mechanizmie tłumienia autonukleacji.

Bezpośrednia synteza widocznych dla EM-widocznych nanocząstek złota w komórkach do analizy lokalizacji białek z dobrze zachowaną ultrastrukturą

Poznaj syntezę i montaż nanocząstek złota chronionych monowarstwami do elektrochemii białkowej. Ta metoda umożliwia badanie kinetyki transferu elektronów w białkach redoks z wykorzystaniem MPC.

Synteza, montaż i charakterystyka filmów z nanocząsteczek złota chronionych monowarstwą do elektrochemii monowarstw białek

Przeglądaj więcej filmów