Synteza, montaż i charakterystyka jednowarstwowych folii nanocząstek złota chronionych w elektrochemii monowarstw białkowych

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest synteza stabilizowanych alkilatem nanocząstek złota, znanych jako klastry chronione jedną warstwą lub MPC, i złożenie tych materiałów w cienkowarstwowe zespoły, które są używane jako interfejs absorpcyjny dla elektrochemii monowarstwy białka azaryny. Osiąga się to poprzez uprzednią ochronę koloidów złota za pomocą ligandów organicznych w celu wytworzenia nanocząstek złota otoczonych folią alkanowo-foliową. Następnie MPC są zakotwiczane w podłożach złotych i szklanych i łączone w sieć w cienkie, wielowarstwowe, kowalencyjnie połączone folie, których wzrost jest śledzony za pomocą pomiarów optycznych i elektrochemicznych, a także mikroskopii przekrojowej.

Następnie białko przenoszące elektrony azaryna jest absorbowane na granicy faz i wykonywana jest telemetria cyklicznego sklepienia dla elektrochemii monowarstw białkowych. Wyniki pokazują, że interfejsy folii MPC utworzone w tej procedurze pozwalają na bardziej zoptymalizowaną analizę elektrochemiczną białka adsorpcyjnego opartego na folii MPC, zapewniając bardziej jednorodny interfejs adsorpcji i szybką kinetykę transferu elektronów, która nie jest tradycyjna zależność od odległości. Główną przewagą tej techniki nad tradycyjną elektrochemią białek jest to, że elektrody są modyfikowane, gdy warstwy nanocząstek zapewniają interfejs absorpcyjny, który skutkuje bardziej idealnym zachowaniem elektrochemicznym, mierzonym za pomocą fotometrii cyklicznej.

Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ synteza zawiera ważne wskazówki wizualne, podczas gdy konstrukcja i charakterystyka filmu obejmuje wiele skomplikowanych etapów i technik analitycznych. Folie NPC można montować na zmodyfikowanych złotych elektrodach lub szkiełkach przy użyciu metody cyklu zanurzeniowego polegającej na naprzemiennym nakładaniu warstw MPC i cząsteczek łączących dole. W związku z tym warstwy te mogą być śledzone elektrochemicznie lub optycznie do żądanej grubości powłoki.

Aby zsyntetyzować klastry złota pod wyciągiem z odpowiednią wentylacją, zacznij od rozpuszczenia 1,1 grama czterotlenkowego bromku amonu w 30 mililitrach toluenu, rozpuść 0,38 grama wodorku borah sodu w około 20 mililitrach ultra oczyszczonej wody o mocy 18 megaomów i pozwól mu schłodzić się na lodzie przez co najmniej 30 minut. Następnie przenieś ilościowo roztwór wodoru tetra chloro oranżującego wodę do roztworu toluenu bromku amonu tetra ide za pomocą dodatkowych pięciu mililitrów ultra oczyszczonej wody. W celu fazowego przeniesienia wodnego roztworu złota do roztworu niewodnego, lekko zakręć i dokładnie mieszaj przez 30 minut.

Tak więc spalona pomarańczowa faza wodna i klarowne fazy niewodne są dobrze wymieszane. Przenieść zarówno klarowną, wodną, jak i spaloną pomarańczową fazę niewodną do rozdzielacza rozdzielającego. Odrzucić warstwę wodną i zdekantować warstwę niewodną do czystej kolby.

Dodać C sześć i stosunek dwa do jednego do wodoru tetrachloro lub dawki zawierającej roztwór niewodny. Mieszaj przez 30 minut, aby utworzyć złoty polimer, który wykryto po zmianie koloru z czerwonawo-pomarańczowego na bladożółty, prawie bezbarwny roztwór. Przenieść mieszaninę reakcyjną do izolowanej łaźni lodowej i schłodzić do zera stopni Celsjusza przez co najmniej 30 minut, mieszając ilościowo i szybko dodać schłodzony roztwór borowodorku sodu do mieszaniny reakcyjnej w celu zredukowania złota jeden do złota metalicznego w obecności ud.

Po dodaniu natychmiast utworzy gęsty roztwór jednowarstwowych chronionych klastrów złota lub MPC. Następnego dnia mieszaj reakcję przez noc w temperaturze zero stopni Celsjusza. Przenieść mieszaninę reakcyjną do rozdzielacza rozdzielającego.

Wyrzuć warstwę wodną do zlewki na odpady i obracaj. Odparować niewodną warstwę toluenu do prawie całkowitego wyschnięcia, pozostawiając ciężki szlam w kolbie. Wytrącić MPC, dodając acetonyl i pozostawić roztwór na noc, używając fryty szklanej o średniej porowatości z gumowymi łącznikami i kolby bocznej z aspiratorem.

Zebrać MPC przez filtrację próżniową i spłukać dużą ilością acetonitrylu. Po elektrochemicznym zmontowaniu ogniwa warstwowego oczyść złote podłoże, wykonując cykliczną telemetrię objętościową lub CV w potencjalnych oknach od 0,2 do 0,9 wolta, 0,2 do 1,2 wolta i 0,2 do 1,35 wolta to 100 miliwoltów na sekundę w roztworze 0,1 molowego kwasu siarkowego i 0,01 molowego chlorku potasu. Zmierz prąd ładowania dwuwarstwowej oczyszczonego podłoża z gołego złota, wykonując CV w standardowych warunkach, które obejmują okno potencjału od 0,1 do 0,4 V w porównaniu z chlorkiem srebra Cy skanowanym z prędkością 100 miliwoltów na sekundę w buforze fosforanu potasu lub KPB.

Wyrzucić bufor i dwukrotnie nadmiernie spłukać ultra oczyszczoną wodą i etanolem. Wystawić oczyszczone złote podłoże na działanie około 300 mikrolitrów pięciomilimolowego roztworu C 6 w etanolu i pozostawić na noc, aby utworzyć uporządkowany C 6 Sam. Wyrzuć roztwór C 6 z komórki i przepłucz go dwukrotnie nadmiernie etanolem i ultra oczyszczoną wodą.

Zmierz prąd ładowania SAM w standardowych warunkach. Wyrzuć KPB i dwukrotnie nadmiernie spłucz ultra oczyszczoną wodą i etanolem. Prąd ładowania powinien być znacznie zmniejszony.

Na podstawie pomiarów gołego złota należy wystawić zmodyfikowany przez SAM złoty substrat na działanie około 300 mikrolitrów pięciomilimolowego roztworu NDT w etanolu i pozostawić go na godzinę w celu rozproszenia cząsteczek łączących NDT w C six Sam. Wyrzuć roztwór NDT i spłucz dwukrotnie nadmiernie i dokładnie etanolem i ultra oczyszczoną wodą niż raz metanem. Wystawić złoty substrat na działanie roztworu MPC metanu DIAM z mieszaniem, powoli bulgocząc go gazowym azotem przez jedną godzinę.

Jest to kotwiąca warstwa MPC zespołu folii. Wyrzucić roztwór MPC i ponownie spłukać kolejno di chlorometanem, ultra oczyszczoną wodą i KPB. Zmierz prąd ładowania warstwy MPC w standardowych warunkach.

Wyrzuć KPB i nadmiernie spłucz ultra oczyszczoną wodą i metanem DIAM. Wystawić złoty substrat na działanie około 300 mikrolitrów pięciomilimolowego roztworu NDT w metanie DIAM z mieszaniem, powoli bulgocząc nim azotem przez 20 minut. Wyrzuć NDT i dokładnie spłucz metanem DIAM, aby zdeponować drugą warstwę MPC.

Ponownie zanurz zespół folii w roztworze MPC metanu DIAM i pozwól mu usiąść z mieszaniem, powoli bulgocząc nim azotem przez godzinę płukania. Następnie ponownie zmierz prąd ładowania warstwy MPC w standardowych warunkach i ponownie spłucz, stosując tę samą procedurę. W razie potrzeby zdeponuj dodatkowe warstwy MPC.

Po zakończeniu usieciowionej folii MPC, przepłucz podłoże zmodyfikowane folią KPB, aby wchłonąć białko AZ na zespół folii MPC. Wstrzyknąć około 150 mikrolitrów od pięciu do 10 mikromolowych roztworów AZ w KPB do komórki kanapkowej E chem i pozostawić do zamknięcia i schłodzienia przez co najmniej godzinę. Po tym, jak cela ECM powróci do temperatury pokojowej, dokładnie przepłucz ją KPB, napełnij komórkę ECM KPB i bąbelkuj KPB gazowym azotem przez 10 minut.

Wykonaj jednowarstwowe badania elektrochemiczne, takie jak CV w oknie potencjału od minus 0,25 V do 0,25 V. Skanowane z prędkością 100 miliwoltów na sekundę w KPB Wypłucz zmodyfikowane szkło 3M PT MS metanem DIAM i umieść je w roztworze MPC metanu DIAM na jedną godzinę, mieszając na wytrząsarce z niską prędkością. Na tym kończy się pierwsza warstwa MPC zespołu folii poprzez zakotwiczenie MPC do grup końcowych kaptanu ME w zdrowym rozsądku.

Dokładnie przepłukać szkiełko metanem Dior, osuszyć go gazowym azotem i pobrać widmo UV szkiełka Po namoczeniu szkiełka w roztworze NDT w diam metanie. Umieść szkiełko w roztworze MPC na jedną godzinę, mieszając na wytrząsarce z małą prędkością. Na tym kończy się druga warstwa MPC zespołu folii.

Dokładnie wypłukać szkiełko metanem DIAM, osuszyć gazowym azotem i pobrać widmo UV vis szkiełka. Absorpcja w całym widmie powinna rosnąć w miarę wchłaniania dodatkowych warstw MPC do zespołu folii. Do mocowania folii MPC zamontowanej na szkiełku modyfikowanym 3M PT MS na standardowym szkiełku mikroskopowym.

Przygotuj żywicę epoksydową Embed eight 12 i pozwól jej zgęstnieć przez co najmniej 12 godzin. Napełnij kapsułę wiązki żywicą epoksydową i odwróć ją na próbkę folii MPC. Wywieraj nacisk na kapsułkę tak, aby pęcherzyk uniósł się do górnej części kapsułki, tworząc uszczelnienie między żywicą epoksydową a próbką folii MPC.

Pozostaw do polimeryzacji przez co najmniej 18 godzin w temperaturze 60 stopni Celsjusza, a następnie schłodzić zamontowane szkiełka do temperatury pokojowej. Podgrzej zamontowane szkiełka przez 20 sekund na odlewanej aluminiowej płycie grzejnej w temperaturze 200 stopni Celsjusza, aby ułatwić wyjęcie bloku z dołączonym MPC na szybkiej folii. Odetnij próbkę zawierającą folię z bloku kapsuły belki za pomocą piły jubilerskiej, przetrzyj usuniętą część w płaskiej formie silikonowej, stroną z folii MPC skierowaną do wnętrza krzemu.

Dobrze wypełnij silikon żywicą epoksydową w temperaturze pokojowej i pozwól mu polimeryzować przez co najmniej 18 godzin w temperaturze 60 stopni Celsjusza. Następnie wezwij próbkę do temperatury pokojowej. Wytnij cienkie odcinki próbki o długości od 60 do 80 nanometrów na ultramikrotomie Leica UCT za pomocą noża diamentowego do cięcia odcinków prostopadłych do krawędzi noża, umieść pokrojone sekcje na węglowej folii nośnej VAR na miedzianych siatkach o siatce 400 i wykonaj obrazy TEM pokazanych przekrojów poprzecznych zespołów folii MPC.

Poniżej przedstawiono wyniki monitorowania wzrostu warstwy MPC za pomocą prądu ładowania dwuwarstwowego, w sumie przez pięć cykli zanurzania obejmujących naprzemienne narażenie na roztwory MPC i NDT. Prądy ładowania rosną systematycznie z każdym cyklem zanurzania. Dodawanie warstw MPC do folii.

Oto typowy cykliczny Volta Graham dla AZ add absorb do zespołu folii MPC zebranego przy użyciu okna potencjału od minus 0,25 do plus 0,25 wolta skanowanego z prędkością 100 miliwoltów na sekundę w 4,4 milimolowym buforze fosforanu potasu. Reprezentatywny monitoring spektralny UV/vis wzrostu filmu MPC połączonego z diolem na szkiełku modyfikowanym 3M PT MS przedstawiono tutaj. Cykl zanurzania składa się z wystawienia szkiełka na działanie roztworu łącznika NDT, a następnie na wystawieniu na działanie roztworu MPC.

Każde kolejne zanurzenie powoduje wzrost grubości warstwy i jednoczesny wzrost absorbancji. Rysunek ten przedstawia analizę przekroju poprzecznego obrazu zespołu folii MPC połączonego z DIA za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Wstawka przedstawia typowy obraz TEM MPC funkcjonalizowanych hexa metolem używanych w analizie TEM montażu folii.

Korzystając z obrazu J, określiliśmy średnią średnicę złotego rdzenia MPC na około dwa nanometry. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak syntetyzować, charakteryzować i składać złote wąskie folie MPC, które działają jako interfejs do absorpcji i późniejszej analizy elektrochemicznej białek redoks. Proces składania folii można łatwo dostosować, manipulując procedurą syntezy MPC, a także mechanizmem wiązania cząstek wewnętrznych, aby dostosować się do wchłaniania różnorodnych białek.

Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w elektrochemię absorpcji białek na zmodyfikowane platformy syntetyczne, może być również zastosowana do rozwoju systemów modelowania transferu elektronów, schematów biodetekcji i syntetycznych materiałów biokompatybilnych.