Synteza, montaż i charakterystyka filmów z nanocząsteczek złota chronionych monowarstwą do elektrochemii monowarstw białek

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest synteza stabilizowanych alkilanami nanocząstek złota, znanych jako klastry chronione monowarstwą (MPC), oraz złożenie tych materiałów w cienkowarstwowe struktury służące jako interfejs absorpcyjny dla elektrochemii monowarstwy białka azaryny. Osiąga się to poprzez wstępną ochronę koloidów złota ligandami organicznymi w celu utworzenia nanocząstek złota otoczonych warstwą alkanotiolową. Następnie MPC są zakotwiczane na podłożach ze złota i szkła i sieciowane w cienkie, wielowarstwowe filmy powiązane kowalencyjnie, których wzrost jest monitorowany za pomocą pomiarów optycznych i elektrochemicznych, a także mikroskopii przekroju poprzecznego.

Następnie białko przenoszące elektrony, azaryna, jest absorbowane na granicy faz, a następnie przeprowadza się woltametrię cykliczną w celu analizy elektrochemicznej monowarstwy białkowej. Wyniki wykazują, że granice faz filmu MPC stworzone za pomocą tej procedury umożliwiają bardziej zoptymalizowaną analizę elektrochemiczną białek zaadsorbowanych na filmie MPC, zapewniając bardziej jednorodną granicę adsorpcji oraz szybką kinetykę transferu elektronów, która nie wykazuje tradycyjnej zależności od odległości. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z tradycyjną elektrochemią białek jest to, że elektrody zmodyfikowane filmami z nanocząsteczek zapewniają granicę absorpcji, która skutkuje bardziej idealnym zachowaniem elektrochemicznym, mierzonym za pomocą woltamperometrii cyklicznej.

Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ synteza obejmuje istotne wskazówki wizualne, a konstrukcja i charakterystyka filmu wymagają wielu skomplikowanych etapów oraz technik analitycznych. Filmy NPC można osadzać na modyfikowanych elektrodach złotych lub szkiełkach przedmiotowych, stosując metodę cykli zanurzania z naprzemiennymi warstwami MPC i cząsteczek łączących dile. W konsekwencji warstwy te można monitorować elektrochemicznie lub optycznie, aż do uzyskania pożądanej grubości filmu.

Aby zsyntetyzować klastry złota pod dygestorium z odpowiednią wentylacją, należy rozpocząć od rozpuszczenia 1,1 g bromku tetraoksonu amonu w 30 ml toluenu. Następnie rozpuścić 0,38 g borowodorku sodu w około 20 ml ultra czystej wody o oporności 18 MΩ i pozostawić do schłodzenia w lodzie przez co najmniej 30 minut. Następnie ilościowo przenieść roztwór kwasu tetrachlorozłotowego(III) do roztworu bromku tetraoksonu amonu w toluenie, używając dodatkowych 5 ml ultra czystej wody. Aby przeprowadzić transfer fazowy wodnego roztworu złota do roztworu nie wodnego, należy lekko zakryć naczynie i intensywnie mieszać przez 30 minut.

W ten sposób ciemnopomarańczowa faza wodna i przezroczysta faza nie wodna zostają dobrze wymieszane. Przenieść obie fazy – przezroczystą wodną i ciemnopomarańczową nie wodną – do rozdzielacza. Odrzucić warstwę wodną, a warstwę nie wodną odlać do czystej kolby.

Do niewodnego roztworu zawierającego tetrachloroplaninian wodoru dodać C six w stosunku dwa do jednego. Mieszać przez 30 minut do czasu utworzenia się polimeru złota(I), co zostanie zasygnalizowane zmianą barwy z czerwonopomarańczowej na bladożółtą, niemal bezbarwną. Przenieść mieszaninę reakcyjną do izolowanej łaźni lodowej i chłodzić do 0 °C przez co najmniej 30 minut przy ciągłym mieszaniu, a następnie ilościowo i szybko dodać schłodzony roztwór borowodorku sodu do mieszaniny reakcyjnej w celu redukcji złota(I) do złota metalicznego w obecności tialów.

Po dodaniu natychmiast powstanie gęsty, czarny roztwór klastrów złota chronionych monowarstwą (MPCs). Mieszaj mieszaninę reakcyjną przez noc w temperaturze 0°C. Następnego dnia przenieś mieszaninę reakcyjną do rozdzielacza.

Warstwę wodną przelać do zlewki z odpadami i odwirować. Odparować nie wodną warstwę toluenu niemal do całkowitej suchości, aż w kolbie pozostanie gęsty, czarny osad. Wytrącić MPCs poprzez dodanie acetonitrylu i pozostawić roztwór na noc, używając szklanego frity o średniej porowatości z gumowymi uszczelkami oraz kolby z bocznym wylotem i aspiratorem.

MPC zebrać metodą filtracji próżniowej i przemyć dużą ilością acetonitrylu. Po elektrochemicznym zmontowaniu ogniwa warstwowego (tzw. sandwich cell), oczyścić złoty podłoże, przeprowadzając woltamperię cykliczną lub CV w zakresach potencjałów od 0,2 do 0,9 V, od 0,2 do 1,2 V oraz od 0,2 do 1,35 V przy prędkości skanowania 100 mV/s w roztworze 0,1 M kwasu siarkowego i 0,01 M chlorku potasu. Zmierzyć prąd ładowania warstwy podwójnej oczyszczonego, gołego złotego podłoża, przeprowadzając CV w warunkach standardowych, obejmujących zakres potencjałów od 0,1 do 0,4 V względem Ag/AgCl, skanowany z prędkością 100 mV/s w buforze fosforanowym potasu lub KPB.

Odlej bufor i dwukrotnie przemyj podłoże obficie wodą ultrapure oraz etanolem. Poddaj oczyszczone złote podłoże działaniu około 300 µL 5 mM roztworu C6 w etanolu i pozostaw go na noc w celu utworzenia uporządkowanej warstwy SAM C6. Odlej roztwór C6 z komory i przemyj ją dwukrotnie obficie etanolem oraz wodą ultrapure.

Zmier prąd ładowania SAM w warunkach standardowych. Usuń KPB i przepłucz naczynie dwukrotnie nadmiarem wody ultra czystej oraz etanolu. Prąd ładowania powinien ulec znacznemu zmniejszeniu.

Po wykonaniu pomiarów dla czystego złota, poddać zmodyfikowany SAM podłoża złotego działaniu około 300 µL 5 mM roztworu NDT w etanolu i pozostawić na jedną godzinę, aby umożliwić interdyspersję cząsteczek łączących NDT w obrębie C6 Sam. Usunąć roztwór NDT i dwukrotnie, bardzo dokładnie wypłukać podłoże etanolem i wodą ultra czystą, a następnie jednokrotnie diametanem. Poddać podłoże złotego działaniu roztworu MPC w diametanie przy jednoczesnym mieszaniu poprzez powolne przedmuchiwanie azotem przez jedną godzinę.

Jest to kotwicząca warstwa MPC zespołu filmu. Należy usunąć roztwór MPC, a następnie ponownie przepłukać sukcesywnie dichlorometanem, wodą ultra czystą i KPB. Pomierz prąd ładowania warstwy MPC w warunkach standardowych.

Odlej KPB i wypłucz nadmiar wody ultra czystej oraz DIAM metanu. Poddaj podłoże złote działaniu około 300 µL pięciomilimolarnego roztworu NDT w DIAM metanie, mieszając poprzez powolne przepuszczanie gazowego azotu przez 20 minut. Odlej NDT i dokładnie wypłucz DIAM metanem, aby osadzić drugą warstwę MPC.

Ponownie zanurz zespół z filmem w roztworze MPC z metanem DIAM i pozostaw go w warunkach mieszania, powoli przepuszczając azot gazowy przez jedną godzinę przed płukaniem. Następnie ponownie zmierz prąd ładowania warstwy MPC w warunkach standardowych i ponownie wypłucz, stosując tę samą procedurę. W razie potrzeby nanieś dodatkowe warstwy MPC.

Po zakończeniu formowania sieciowej warstwy MPC, przepłucz zmodyfikowany podłoże KPB, aby zaadsorbować białko AZ na strukturze filmu MPC. Wstrzyknij około 150 µL roztworu AZ o stężeniu od 5 do 10 µM w KPB do ogniwa kanapkowego E chem i pozostaw je zamknięte w lodówce na co najmniej jedną godzinę. Po powrocie ogniwa ECM do temperatury pokojowej, dokładnie przepłucz je KPB, ponownie napełnij ogniwo ECM KPB i przewietrzaj KPB azotem przez 10 minut.

Przeprowadź badania elektrochemiczne monowarstwy, takie jak CV, w oknie potencjałów od -0,25 V do 0,25 V. Skanowanie wykonaj z prędkością 100 mV/s w KPB Rinse A na szkiełku przedmiotowym modyfikowanym 3M PT MS z DIAM methane, a następnie umieść je w roztworze MPC z DIAM methane na jedną godzinę, mieszając na wytrząsarce z niską prędkością. Kończy to tworzenie pierwszej warstwy MPC w strukturze filmu poprzez zakotwiczenie MPC do grup końcowych ME captan w sane.

Dokładnie wypłucz szkiełko w dietylometanie, osusz je strumieniem azotu i zarejestruj widmo UV-vis szkiełka po uprzednim namoczeniu go w roztworze NDT w dietylometanie. Umieść szkiełko w roztworze MPC na jedną godzinę, wytrząsając na wytrząsarce z niską prędkością. Tym samym kończy się nanoszenie drugiej warstwy MPC w strukturze filmu.

Dokładnie wypłucz szkiełko metanem DIAM, wysusz go strumieniem azotu i zarejestruj widmo UV-Vis szkiełka. Absorbancja w całym zakresie widma powinna wzrastać wraz z adsorpcją kolejnych warstw MPC na strukturę filmu. Aby przenieść film MPC naniesiony na szkiełko szklane modyfikowane 3M PT MS na standardowe szkiełko mikroskopowe.

Przygotować żywicę epoksydową EmbedEight 12 i pozostawić ją do zgęstnienia na co najmniej 12 godzin. Wypełnić kapsułę wiązki żywicą epoksydową i odwrócić ją nad próbką folii MPC. Wywrzeć nacisk na kapsułę tak, aby pęcherzyk powietrza uniósł się do góry, tworząc uszczelnienie między żywicą epoksydową a próbką folii MPC.

Pozostaw do polimeryzacji na co najmniej 18 godzin w temperaturze 60 °C, a następnie schłodź zamontowane preparaty do temperatury pokojowej. Podgrzewaj zamontowane preparaty przez 20 sekund na aluminiowej płycie grzejnej w temperaturze 200 °C, aby ułatwić usunięcie bloku z przymocowanym MPC na szybkiej folii. Odetnij próbkę zawierającą folię od bloku kapsuły wiązki za pomocą piły jubilerskiej, a następnie umieść usuniętą część w płaskiej formie silikonowej stroną z folią MPC skierowaną do góry, w stronę wnętrza silikonu.

Wypełniamy otwór silikonowy żywicą epoksydową w temperaturze pokojowej i pozostawiamy do polimeryzacji przez co najmniej 18 godzin w temperaturze 60 °C. Następnie schładzamy próbkę do temperatury pokojowej. Za pomocą ultramikrotomu Leica UCT i noża diamentowego wycinamy cienkie sekcje próbki o grubości od 60 do 80 nm, wykonując cięcia prostopadle do krawędzi noża. Wycięte sekcje umieszczamy na węglowej folii wspierającej Formvar na miedzianych siatkach o gęstości 400 mesh, a następnie wykonujemy obrazy TEM przekrojów zaprezentowanych zestawów filmów MPC.

Poniżej przedstawiono wyniki monitorowania prądu ładowania podwójnej warstwy podczas wzrostu filmu MPC w ciągu łącznie pięciu cykli zanurzania, obejmujących naprzemienną ekspozycję na roztwory MPC i NDT. Prądy ładowania wzrastają systematycznie z każdym cyklem zanurzania, co świadczy o dodawaniu kolejnych warstw MPC do filmu.

Poniżej przedstawiono typowy woltamperogram cykliczny dla adsorpcji AZ do zestawu z filmem MPC, zarejestrowany w oknie potencjału od -0,25 do +0,25 V przy szybkości skanowania 100 mV/s w 4,4 mM buforze fosforanowym potasu. Tutaj pokazano reprezentatywne monitorowanie widm UV-vis wzrostu filmu MPC wiązanego diolem na szkiełku przedmiotowym modyfikowanym 3M PT MS. Cykl zanurzenia składa się z ekspozycji szkiełka na roztwór łącznika NDT, a następnie ekspozycji na roztwór MPC.

Każde kolejne zanurzenie prowadzi do wzrostu grubości filmu oraz jednoczesnego zwiększenia absorbancji. Rysunek ten przedstawia analizę przekroju poprzecznego wykonaną za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej dla zestawu filmu MPC powiązanego z DIA. Wstawka przedstawia typowy obraz TEM funkcjonalizowanych heksametolem MPC użytych w analizie TEM zestawu filmu.

Za pomocą programu Image J ustalono, że średnica rdzenia złota w MPC wynosi około dwóch nanometrów. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak syntetyzować, charakteryzować i składać cienkie warstwy MPC ze złota, które pełnią funkcję interfejsu do adsorpcji i późniejszej analizy elektrochemicznej białek redoks. Proces składania warstwy można łatwo dostosować poprzez modyfikację procedury syntezy MPC oraz mechanizmu wiązania wewnętrznych cząstek, aby umożliwić adsorpcję szerokiej gamy białek.

Choć metoda ta może dostarczyć wiedzy na temat elektrochemii adsorpcji białek na zmodyfikowanych platformach syntetycznych, może ona zostać zastosowana również w opracowywaniu systemów modelowania transferu elektronów, schematów biosensingu oraz syntetycznych materiałów biokompatybilnych.