Name: Obrazowanie MALDI Spektrometria mas neuropeptydów w chorobie Parkinsona (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 57 s
Description: Poznaj obrazowanie MALDI spektrometrią mas do wykrywania zmian poziomów neuropeptydów w mózgu szczura. Ta metoda pozwala badać przyczyny dyskinezji w chorobie Parkinsona z wysoką specyficznością molekularną.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Hannie Wärner za dostarczenie danych do Ryciny 3 oraz prof. Jonasowi Bergquistowi za cenny wkład. Wyrażamy wdzięczność za wsparcie finansowe Szwedzkiej Rady Badań (Grant 522-2006-6416 (MA), 521-2007-5407 (MA)), Fundacji Åke Wiberga (MA, JH), Królewskiej Szwedzkiej Akademii Nauk (MA, JH) oraz Szwedzkiego Towarzystwa Chemicznego (JH).

<ol><li>Obeso, J. A., Olanow, C. W., Nutt, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Levodopa+motor+complications+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Levodopa motor complications in Parkinson's disease.</a> Trends Neurosci. 23, S2-S7 (2000).</li>
<li>Caprioli, R. M., Farmer, T. B., Gile, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+imaging+of+biological+samples%3A+localization+of+peptides+and+proteins+using+MALDI-TOF+MS%5BTitle%5D)+AND+%22MALDI-TOF+MS.+Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Molecular imaging of biological samples: localization of peptides and proteins using MALDI-TOF MS.</a> MALDI-TOF MS. Anal. Chem. 69, 4751-4760 (1997).</li>
<li>Obeso, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolution+and+origin+of+motor+complications+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">The evolution and origin of motor complications in Parkinson's disease.</a> Neurology. 55, S13-S20 (2000).</li>
<li>O, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noncommunicable+Diseases+and+Mental+Health+Cluster%2C+Noncommunicable+Disease+Prevention+and+Health+Promotion+Department%2C+Ageing+and+Life+Course%5BTitle%5D)+AND+%22Active+Ageing%3A+A+Policy+framework%22%5BJournal%5D)">Noncommunicable Diseases and Mental Health Cluster, Noncommunicable Disease Prevention and Health Promotion Department, Ageing and Life Course.</a> Active Ageing: A Policy framework. , (2002).</li>
<li>Schapira, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Movement+disorders%3A+advances+in+cause+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurology%22%5BJournal%5D)">Movement disorders: advances in cause and treatment.</a> Lancet Neurology. , 6-7 (2010).</li>
<li>Obeso, J. A., Rodriguez-Oroz, M. C., Rodriguez, M., DeLong, M. R., Olanow, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiology+of+levodopa-induced+dyskinesias+in+Parkinson%27s+disease%3A+problems+with+the+current+model%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Pathophysiology of levodopa-induced dyskinesias in Parkinson's disease: problems with the current model.</a> Ann. Neurol. 47, S22-S32 (2000).</li>
<li>Cenci, M. A., Lee, C. S., Bjorklund, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-DOPA-induced+dyskinesia+in+the+rat+is+associated+with+striatal+overexpression+of+prodynorphin-+and+glutamic+acid+decarboxylase+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">L-DOPA-induced dyskinesia in the rat is associated with striatal overexpression of prodynorphin- and glutamic acid decarboxylase mRNA.</a> Eur. J. Neurosci. 10, 2694-2706 (1998).</li>
<li>Andersson, M., Hilbertson, A., Cenci, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Striatal+fosB+expression+is+causally+linked+with+l-DOPA-induced+abnormal+involuntary+movements+and+the+associated+upregulation+of+striatal+prodynorphin+mRNA+in+a+rat+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Striatal fosB expression is causally linked with l-DOPA-induced abnormal involuntary movements and the associated upregulation of striatal prodynorphin mRNA in a rat model of Parkinson's disease.</a> Neurobiol Dis. 6, 461-474 (1999).</li>
<li>Hanrieder, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+of+striatal+neuropeptides+revealed+by+imaging+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Alterations of striatal neuropeptides revealed by imaging mass spectrometry.</a> Molecular & Cellular Proteomics. , (2011).</li>
<li>Cornett, D. S., Reyzer, M. L., Chaurand, P., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MALDI+imaging+mass+spectrometry%3A+molecular+snapshots+of+biochemical+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">MALDI imaging mass spectrometry: molecular snapshots of biochemical systems.</a> Nat. Methods. 4, 828-833 (2007).</li>
<li>Ljungdahl, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Mass+Spectrometry+Reveals+Elevated+Nigral+Levels+of+Dynorphin+Neuropeptides+in+L-DOPA-Induced+Dyskinesia+in+Rat+Model+of+Parkinson%27s+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Imaging Mass Spectrometry Reveals Elevated Nigral Levels of Dynorphin Neuropeptides in L-DOPA-Induced Dyskinesia in Rat Model of Parkinson's Disease.</a> PLoS ONE. 6, e25653(2011).</li>
<li>Groseclose, M. R., Andersson, M., Hardesty, W. M., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+proteins+directly+from+tissue%3A+in+situ+tryptic+digestions+coupled+with+imaging+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mass.+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Identification of proteins directly from tissue: in situ tryptic digestions coupled with imaging mass spectrometry.</a> J. Mass. Spectrom. 42, 254-262 (2007).</li>
<li>Andersson, M., Groseclose, M. R., Deutch, A. Y., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+mass+spectrometry+of+proteins+and+peptides%3A+3D+volume+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging mass spectrometry of proteins and peptides: 3D volume reconstruction.</a> Nat. Methods. 5, 101-108 (2008).</li>
<li>Deininger, S. -O. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDeininger%2C+S-O+%22Imaging+Mass+Spectrometry%22">Imaging Mass Spectrometry</a>. Setou, M. , Springer. Japan. 199-208 (2010).</li>
<li>Norris, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+MALDI+Mass+Spectra+to+Improve+Mass+Spectral+Direct+Tissue+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Mass.+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Processing MALDI Mass Spectra to Improve Mass Spectral Direct Tissue Analysis.</a> Int. J. Mass. Spectrom. 260, 212-221 (2007).</li>
<li>Ihaka, R., Gentleman, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Language+for+Data+Analysis+and+Graphics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Computational+and+Graphical+Statistics%22%5BJournal%5D)">A Language for Data Analysis and Graphics.</a> Journal of Computational and Graphical Statistics. 5, 299-314 (1996).</li>
<li>Mass Spectrometry Binning Software GAB. , Vanderbilt Center for Quantitative Sciences. Nashville, TN. Available from:
		
	 <a target="_blank" href="http://www.vicc.org/biostatistics/software.php">http://www.vicc.org/biostatistics/software.php</a> (2012).</li>
<li>Tusher, V. G., Tibshirani, R., Chu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Significance+analysis+of+microarrays+applied+to+the+ionizing+radiation+response%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Significance analysis of microarrays applied to the ionizing radiation response.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 5116-5121 (2001).</li>
<li>Bergstrom, L., Christensson, I., Folkesson, R., Stenstrom, B., Terenius, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ion+exchange+chromatography+and+radioimmunoassay+procedure+for+measuring+opioid+peptides+and+substance+P%5BTitle%5D)+AND+%22Life.+Sci%22%5BJournal%5D)">An ion exchange chromatography and radioimmunoassay procedure for measuring opioid peptides and substance P.</a> Life. Sci. 33, 1613-1619 (1983).</li>
<li>Falth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropeptidomics+strategies+for+specific+and+sensitive+identification+of+endogenous+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Neuropeptidomics strategies for specific and sensitive identification of endogenous peptides.</a> Mol. Cell. Proteomics. 6, 1188-1197 (2007).</li>
<li>Falth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SwePep%2C+a+database+designed+for+endogenous+peptides+and+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">SwePep, a database designed for endogenous peptides and mass spectrometry.</a> Mol. Cell. Proteomics. 5, 998-1005 (2006).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Zastosowanie obrazowania spektrometrią mas MALDI w badaniu neuropeptydów niesie ze sobą szereg zalet. Obiektywna analiza danych MS może wykazać, że jedynie specyficzne jądra mózgu – lub, jak w przedstawionych tutaj wynikach, tylko grzbietowo-boczna część prążkowia – są powiązane z określonym stanem patofizjologicznym. Dzięki zachowaniu informacji przestrzennych możliwe jest ponowne zdefiniowanie obszarów zainteresowania w celu przeprowadzenia analizy statystycznej o wyższej czułości i mniejszej zmienności w porównaniu z analizą całych przekrojów mózgu lub tradycyjnymi badaniami peptydomicznymi na ekstraktach peptydowych. Ponadto należy zauważyć, że MALDI IMS pozwala na łatwe wykrywanie wcześniej nieznanych modyfikacji potranslacyjnych, jednak konieczne jest przeprowadzenie analiz strukturalnych w celu określenia dokładnych pozycji zmodyfikowanych aminokwasów.
Typowe błędy w wizualizacji danych MALDI IMS obejmują przypisywanie maksymalnej intensywności piku do liniowej skali optycznej od koloru czarnego (0%) do kolorowego (100%) dla każdego z przekrojów w serii eksperymentalnej (Rysunek 3), zamiast przypisania wszystkich przekrojów do wspólnej skali bezwzględnej, w której 100% odpowiada maksymalnej intensywności piku we wszystkich przekrojach (Rysunek 5). Ta druga metoda umożliwia porównanie danych grupowych oraz wizualizację różnic między grupami badawczymi.
Główną przeszkodą w analizie MALDI IMS jest przypisanie peptydów do konkretnych piku masowych. Tandemowa spektrometria mas bezpośrednio na tkance jest czasem możliwa, jednak często okazuje się dość trudna13,14. Stwierdziliśmy, że bardziej tradycyjne podejście, obejmujące preparatywne frakcjonowanie za pomocą chromatografii wymiany kationowej w silnym stopniu, a następnie LC-MS/MS w fazie odwróconej, może być skutecznie wykorzystane do sekwencjonowania wielu neuropeptydów, a w szczególności peptydów opioidowych. Nadal nie jest rzadkością uzyskanie wysokiej jakości widm MS/MS, które nie pasują do żadnych wpisów w bazach danych przy użyciu popularnych wyszukiwarek, takich jak MASCOT. W takich przypadkach jedyną opcją jest ręczne sekwencjonowanie de novo. Ostatecznego potwierdzenia tożsamości piku można uzyskać za pomocą MALDI IMS przekrojów tkankowych z odpowiedniego myszy typu knockout; nie zawsze jest to jednak dostępne lub możliwe. Alternatywą jest walidacja wyników za pomocą diametralnie innej metody, na przykład poprzez western immunoblotting lub immunohistochemię. Może to często wiązać się z wytwarzaniem przeciwciał i znaczną ilością pracy przy walidacji nowych przeciwciał.
Ogólna strategia przedstawiona w niniejszym protokole została zoptymalizowana pod kątem wielkoskalowych eksperymentów MALDI IMS w zakresie neuropeptydów, obejmujących kilka sekcji i warunków doświadczalnych. Protokół został zoptymalizowany szczególnie dla peptydów opioidowych i będzie miał istotny wpływ na przyszłe badania, stosowane w różnych dziedzinach nauki, w tym w badaniach nad mechanizmami leżącymi u podstaw bólu oraz endogenną odpowiedzią na leki uzależniające.

obrazowanie spektrometrią mas maldi neuropeptydów w chorobie parkinsona

MALDI Imaging Mass Spectrometry of Neuropeptides in Parkinson's Disease

Obrazowanie spektrometrią mas MALDI (IMS) jest potężnym podejściem, które umożliwia analizę przestrzenną gatunków molekularnych w próbkach tkanek biologicznych2 (Rys.1). Przekrój tkanki o grubości 12 μm pokrywa się macierzą MALDI, która ułatwia desorpcyjne jonizowanie nienaruszonych peptydów i białek, które mogą być wykrywane przez analizator masy, zazwyczaj z wykorzystaniem spektrometru mas MALDI TOF/TOF. Zazwyczaj w jednym przekroju tkanki mózgu szczura można ocenić setki pików. W przeciwieństwie do powszechnie stosowanych technik obrazowania, podejście to nie wymaga wcześniejszej wiedzy na temat analizowanych cząsteczek i pozwala na nienadzorowaną oraz kompleksową analizę wielu gatunków molekularnych przy zachowaniu wysokiej specyficzności molekularnej i czułości2. W niniejszej pracy opisujemy metodę opartą na MALDI IMS służącą do wyjaśnienia profili rozmieszczenia neuropeptydów specyficznych dla poszczególnych regionów w mózgu szczura w modelu zwierzęcym choroby Parkinsona (PD). 
PD to powszechna choroba neurodegeneracyjna, której rozpowszechnienie wynosi 1% u osób powyżej 65 roku życia3,4. Najczęstsze leczenie objawowe opiera się na uzupełnianiu dopaminy z zastosowaniem L-DOPA5. Wiąże się to jednak z poważnymi skutkami ubocznymi, w tym z mimowolnymi, nieprawidłowymi ruchami, określanymi jako dyskinezie indukowane L-DOPA (LID)1,3,6. Jedną z najbardziej znaczących zmian molekularnych w LID jest zwiększona ekspresja mRNA prodynorfiny, prekursora opioidów7. Peptydy dynorfiny modulują neuroprzekaźnictwo w obszarach mózgu zaangażowanych w kontrolę ruchu7,8. Do tej pory nie scharakteryzowano jednak dokładnie peptydów opioidowych powstających w wyniku przetwarzania tego prekursora neuropeptydowego. W związku z tym wykorzystaliśmy MALDI IMS w modelu zwierzęcym eksperymentalnej choroby Parkinsona oraz dyskinez indukowanych L-DOPA.
Obrazowanie spektrometrią mas MALDI okazało się szczególnie korzystne w odniesieniu do charakterystyki neuropeptydów, ponieważ powszechnie stosowane podejścia oparte na przeciwciałach celują w znane sekwencje peptydowe i wcześniej zaobserwowane modyfikacje potranslacyjne. W przeciwieństwie do nich, MALDI IMS może ujawnić nowe produkty przetwarzania peptydów, a tym samym odsłonić nowe molekularne mechanizmy modulowania przekaźnictwa neuronalnego przez neuropeptydy. Chociaż za pomocą MALDI IMS nie można określić bezwzględnej ilości neuropeptydów, z widm mas można wyznaczyć względną obfitość jonów peptydowych, co pozwala uzyskać wgląd w zmiany ich poziomów w stanie zdrowia i choroby. W przedstawionych tutaj przykładach stwierdzono, że intensywności piku dynorfiny B, alfa-neoendorfiny i substancji P były znacznie zwiększone w grzbietowo-bocznej, ale nie w grzbietowo-przyśrodkowej części prążkowia u zwierząt z ciężką dyskinezą obejmującą mięśnie twarzy, tułowia i języka (Ryc. 5). Co więcej, MALDI IMS ujawniło korelację między stopniem nasilenia dyskinezji a poziomem des-tyrozyny alfa-neoendorfiny, co reprezentuje wcześniej nieznany mechanizm funkcjonalnej inaktywacji dynorfin w prążkowiu, ponieważ usunięcie tyrozyny z końca N-terminalnego zmniejsza zdolność wiązania dynorfiny z receptorami opioidowymi9. Jest to pierwsze badanie nad charakterystyką neuropeptydów w LID z zastosowaniem MALDI IMS, a wyniki podkreślają potencjał tej techniki do zastosowania we wszystkich dziedzinach badań biomedycznych.

Farmakoterapia polegająca na zastępowaniu dopaminy za pomocą L-DOPA jest najczęściej stosowanym leczeniem objawowym choroby Parkinsona, jednak wiąże się z efektami ubocznymi, w tym z mimowolnymi, nieprawidłowymi ruchami, określanymi mianem dyskinezy 1. W niniejszym materiale przedstawiono protokół obrazowania metodą spektrometrii mas MALDI, który pozwala wykryć zmiany w poziomach neuropeptydów w mózgu szczura związane z dyskinezą.

Obrazowanie spektrometrią mas MALDI neuropeptydów w chorobie Parkinsona

Obrazowanie masowe MALDI (IMS) to potężna metoda ułatwiająca analizę przestrzenną gatunków molekularnych w próbkach tkanek biologicznych2 ...

Głównym celem niniejszej procedury jest wyjaśnienie rozkładu przestrzennego neuropeptydów, a konkretnie peptydów opioidowych, bezpośrednio w cienkich przekrojach mózgu przy użyciu obrazowania spektrometrią mas. Jest to realizowane poprzez wstępne pobranie 12 µm cienkich przekrojów tkanek z błyskawicznie zamrożonego mózgu szczura i ich osadzenie na przewodzących szkiełkach przedmiotowych. Drugim krokiem jest naniesienie macierzy Matrixx w układach macierzowych na przekroje za pomocą chemicznej drukarki atramentowej, a następnie pozyskanie jednego widma masowego z każdego punktu macierzy.Następnie wizualizuje się kolejne piki peptydowe, aby upewnić się co do ogólnego sukcesu eksperymentu. Po tym następuje analiza i przetwarzanie wyeksportowanych widm mas oraz postprocessing danych peptydowych i ocena statystyczna. Ostatnim krokiem jest analiza i walidacja danych peptydowych uzyskanych za pomocą obrazowania spektrometrią mas pleśni.Ostatecznie wyniki wykazują istotne różnice w względnych poziomach peptydów opioidowych w różnych obszarach mózgu pomiędzy różnymi grupami badawczymi. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak podejścia oparte na radioimmunologicznych żelach SAO, jest to, że obrazowanie wielopunktowe pozwala na lokalizację zmian wywołanych leczeniem przy zachowaniu wysokiej specyficzności molekularnej. Z kolei daje nam to możliwość wykrycia wcześniej nieidentyfikowanych skrócenia modyfikacji potranslacyjnych.Osoby początkujące w tej metodzie mogą napotkać trudności na początku, ponieważ technika ta wymaga starannego przygotowania próbek oraz przetwarzania danych. W tej części skupiono się na jakości tkanki, matrycy, protokole aplikacji, ocenie danych oraz następujących po nich eksperymentach walidacyjnych. Podczas sekcji tkanek niezbędna jest szybkość i rzetelność pracy, aby uniknąć degradacji proteolitycznej.Po uśmierceniu szczura zgodnie z zatwierdzonymi protokołami, należy niezwłocznie wyjąć mózg, przenieść go na suchy lód w proszku i pozwolić mu zamarznąć stosunkowo powoli, a następnie przechowywać mózg w zamrażarce w temperaturze -80 °C. Całe mózgi mogą być przechowywane przez kilka lat przed sekcjonowaniem bez utraty jakości sygnału MS. Przed rozpoczęciem procedury należy zamocować mózg w uchwycie, używając medium do zatapiania Tissue Tech, unikając zanieczyszczenia części mózgu przeznaczonej do cięcia, ponieważ medium do zatapiania zakłóca jonizację i desorpcję peptydów.Wyciąć mrożoną tkankę za pomocą mikrotomu w kriostacie w plastry o grubości 12 mikronów i zamocować przekroje tkankowe na przewodzących szkiełkach do MALDI. Na tym etapie można przeprowadzić barwienie przekrojów tkankowych i ocenić jakość tkanki. Rysunek przedstawia barwienie fioletem krystalicznym tkanki mózgowej zamrożonej błyskawicznie w ciekłym azocie, co spowodowało pękanie i rozrywanie tkanki.Ta tkanka nie byłaby odpowiednia do obrazowania masowego spektrometrii o wysokiej rozdzielczości, ponieważ matryca rozprzestrzeni się i nie skrystalizuje równomiernie. Wysuszyć skrawki przez 15 minut w próżni i przechowywać preparaty w temperaturze -80 °C do czasu dalszego użycia. Skrawki tkanki powinny zostać przeanalizowane w jak najkrótszym czasie po ich wykonaniu, nawet jeśli były przechowywane w -80 °C. Najpierw rozmrozić skrawki w eksykatorem przez jedną godzinę, następnie przemyć preparaty ze skrawkami w 70% etanolu w temperaturze pokojowej przez 10 sekund, a następnie dwukrotnie przemyć w 95% etanolu w temperaturze pokojowej po 10 sekund each. Po przemyciu wysuszyć preparaty w eksykatorze przez 10 minut.Obejrzyj skrawki pod mikroskopem, aby upewnić się, że są one dobrej jakości, bez deformacji tkanki, mikro-rozerwań lub małych pęknięć, które mogłyby pogorszyć jakość mold EMS. Następnie przygotuj świeży roztwór matrycy składający się z 50 mg/mL DHB i 50% metanolu, 10% 150 mM octanu amonu oraz 0,3% kwasu trifluorooctowego w wodzie. Zeskanuj uchwyt do szkiełek z naniesionym skrawkiem tkanki i dopasuj uchwyt do odpowiednich punktów odniesienia, korzystając z funkcji analizy obrazu w oprogramowaniu chipa.Następnie wybierz odpowiednie parametry aplikacji macierzy zarówno dla obszaru mózgu, jak i dla analizowanych substancji. Dalej określ rozdzielczość przestrzenną. Teraz nanieś macierz, stosując zoptymalizowany protokół na drukarce Chemical Link Jett.Zeskanuj sekcje z naniesioną macierzą i zapisz obraz przed pobraniem danych wielopunktowych. Służyć to będzie później do odniesienia depozytów macierzy do współrzędnych silnika stolika MALDI. Jeśli sekcje z naniesioną macierzą nie zostaną wykorzystane natychmiast, można je przechowywać w eksyكاتهcie pod próżnią do czasu ich użycia.W większości eksperymentów jednocześnie analizuje się kilka przekrojów, tak jak pokazano tutaj. Każdy uchwyt na preparaty mieści dwa szkiełka przedmiotowe, dlatego dla wszystkich uchwytów należy przeanalizować wiele zestawów po dwa szkiełka. Metody i parametry akwizycji TOF dla matrycy powinny być takie same, jednak dla każdego szkiełka należy sprawdzić kalibrację masy peptydów.Następnie zoptymalizuj parametry akwizycji na próbce tkanki, w tym ogniskowanie i intensywność lasera. Potem wprowadź liczbę impulsów niezbędną do uzyskania optymalnego sygnału MS, bez podnoszenia linii bazowej, obniżania rozdzielczości pików, nasycania detektora ani ablacji matrycy z sąsiednich punktów nanoszenia matrycy, i wybierz sposób przemieszczania lasera.Oszacuj maksymalną liczbę strzałów, jakie można wykonać na jedną plamkę macierzy, aż do momentu wykrycia samego szumu. Z każdej depozycji macierzy akumuluje się 600 strzałów w krokach po 25 strzałów, co daje łącznie 24 kroki, stosując losowy wzór ruchów. Porównaj skany wszystkich naniesionych sekcji z współrzędnymi silników stolika MALDI, korzystając z oprogramowania do obrazowania flex.Następnie, korzystając z oprogramowania do automatycznego uruchamiania partii zadań, przeprowadź akwizycję danych w trybie wsadowym. Użyj narzędzi do wizualizacji danych, takich jak Flex imaging, aby wizualnie przejrzeć obrazy z obrazowania spektrometrycznego (IMS) w celu oceny rozkładu intensywności piku oraz ustalenia, czy rozkłady te są powiązane z cechami tkanki, jakością naniesienia próbki czy efektami normalizacji. Ten przykład przedstawia rozkład 10 różnych pików peptydowych u dziewięciu różnych zwierząt.Całkowity prąd jonowy (TIC) wykorzystywany do normalizacji jest wyświetlony na biało. TIC stanowi sumę wszystkich wartości intensywności w widmie mas. W przypadku trzeciego zwierzęcia wartość TIC jest bardzo niska, a obrazy peptydowe wykazują więcej szumu niż specyficznych informacji.Mózg zwierzęcia numer sześć wykazuje obszar w dolnej części przekroju z bardzo wysokimi wartościami TIC. Przejawia się to w postaci nienaturalnie wysokich intensywności w tym obszarze na obrazach peptydowych C i D. Jest to potencjalny efekt nadmiernej normalizacji, który może wpłynąć na analizę danych. Efekty nadmiernej normalizacji mogą prowadzić do błędnych wyników, jeśli występują one specyficznie tylko w jednej grupie badawczej.W tym przykładzie TIC jest znacznie wyższy dla grupy C, co może nienaturalnie wpływać na intensywności poszczególnych pików. Na przykład w surowych danych średnia intensywność piku dla cytochromu C jest wyższa dla grupy C niż dla grupy B, ale po normalizacji intensywność piku jest teraz niższa. W przypadku grupy C może to prowadzić do poważnych błędnych interpretacji wyników.Przed przystąpieniem do szczegółowej walidacji danych ważne jest, aby zawsze obliczyć średnią wartość TIC dla każdej grupy traktowanej. Następnie, aby zdefiniować obszar zainteresowania, należy wziąć pod uwagę, że mRNA pro-dynorfiny jest translacyjnie przekształcane w 14 kilodaltonowy propeptyd pro-dynorfiny. W neuronach prążkowia pro-dynorfina jest pakowana do pęcherzyków, które są transportowane przez dendryty w celu dotarcia do innych neuronów prążkowia lub przez aksony do istoty czarnej, oddalonej o kilka milimetrów od ciała komórki.Pęcherzyki zawierają enzymy, które przetwarzają propeptyd w peptydy dinorfiny, takie jak alfa-neoendorfina dinorfina A lub dinorfina B. Każdy z nich może aktywować różne receptory opiadowe po uwolnieniu w strukturze docelowej, istocie czarnej; dinorfiny są następnie dalej przetwarzane i usuwane przez endo- i egzopeptydazy. Niektóre z tych peptydów można wykryć wyłącznie za pomocą spektrometrii mas, ponieważ istniejące przeciwciała celują jedynie w koniec C-końcowy peptydów, a nie w koniec N-końcowy. Sekwencja Y-G-G-F-L odpowiada za aktywację receptorów opioidowych; komórki produkujące dinorfiny znajdują się w rozproszonym AUM i wysyłają projekcje do istoty czarnej.W związku z tym, w poniższym eksperymencie, zarówno prążkowie (AUM), jak i substancja czarna (subs nigra) zostały przeanalizowane za pomocą IMS, a widma pozyskano z każdego z obszarów zainteresowania. W oprogramowaniu flex analysis zdefiniowano grzbietowo-przyśrodniowe i grzbietowo-boczne prążkowie oraz przyśrodkową i boczną część substancji czarnej, a następnie wyeksportowano je do analizy danych. W celu redukcji danych przeprowadzono detekcję pików, wykorzystując narzędzia do wyszukiwania pików zawarte w różnych programach.Na przykład należy wykorzystać analizę piku w programie Origin lub MS Peaks w programie Matlab. Wyeksportuj listę pików ze wszystkich widm do jednego pliku tekstowego z rozdzielaczem tabulacji, określ granice początku i końca piku, a następnie, korzystając z oprogramowania takiego jak darmowy P bin, oblicz pole pod krzywą między granicami piku i wykorzystaj te dane do analizy statystycznej MS. Powtarzalność MS między grupami traktowanymi można ocenić, obliczając średni ślad MS oraz błąd standardowy dla każdej wartości masy.W tym przykładzie średnie widma dla nienaruszonej kontrolnej istoty czarnej zostaną wykorzystane do oceny zmienności w analizowanym zakresie mas. Dobrą powtarzalność można zaobserwować dzięki temu, że intensywności pików są równe w obu grupach kontrolnych, a odchylenie standardowe jest niskie. Zapewnia to poprawność analizy statystycznej.Jeśli zestawy danych wykazują wysoki stopień zmienności, niemal zawsze konieczne jest powtórzenie eksperymentu Maori IMS, redukując w możliwie największym stopniu eksperymentalne źródła zmienności. Zazwyczaj przetwarzamy tak wiele przekrojów i zwierząt, jak to możliwe, podczas jednej sesji, czasem z udziałem kilku osób pracujących na zmiany. Jednak w niektórych przypadkach to wciąż nie wystarcza i można zastosować inne strategie.Na przykład, jeśli niektóre widma składają się z szumów, można je zidentyfikować poprzez wykreślenie rozkładu częstotliwości TIC i zastosowanie wartości progu odcięcia w celu wyeliminowania nieoptymalnych danych. Inną metodą oceny danych jest zestawienie wszystkich pików dla dwóch zwierząt z tej samej grupy. Jeśli natężenia pików są w obu zwierzętach równe, wykres natężenia przeciwko natężeniu przedstawia prostą, wąską linię.Jeśli dane spektralne jednego zwierzęcia są niskiej jakości, na wykresie zazwyczaj pojawiają się asymetryczne odchylenia od linii prostej, widoczne po prawej stronie. W celu identyfikacji sekwencji peptydów należy przeprowadzić analizę domen peptydowych w ekstraktach z tkanki mózgu szczura, wykorzystując wielowymiarową chromatografię cieczową sprzężoną z wysokorozdzielczą spektrometrią mas. W skrócie, neuropeptydy są ekstrahowane z przekrojów mózgu szczura, a następnie wstępnie frakcjonowane za pomocą silnie zasadowej chromatografii kationowej.Poszczególne frakcje są następnie dodatkowo rozdzielane przy użyciu nanoflowowej wysokosprawnej chromatografii cieczowej w fazie odwróconej (HPLC). Następnie neuropeptydy charakteryzuje się za pomocą tandemowej spektrometrii mas z jonizacją w rozpylaniu, wykorzystując hybrydowe instrumenty łączące liniową pułapkę jonową i rezonans cyklotronowy jonów z transformatą Fouriera; na koniec przeprowadza się identyfikację sekwencji peptydów poprzez dopasowanie do bazy danych. Dla niektórych neuropeptydów dostępne są specyficzne przeciwciała, a eksperymenty z zakresu immunohistochemii mogą potwierdzić identyfikację peptydów, jak również wyniki eksperymentalne. Rozdzielczość jest wyższa niż w przypadku obrazowania spektrometrią mas MALDI, co pozwala na uzyskanie dodatkowych informacji.W tym przykładzie immunoreaktywne włókna nerwowe Dior bee można dostrzec w hipokampie (panel górny lewy) oraz w istocie czarnej (panel dolny lewy), natomiast obraz Maori IMS w prawym dolnym rogu ujawnia lokalizację na poziomie różnych obszarów mózgu. Ostatecznym dowodem na to, że konkretny pik masy można jednoznacznie przypisać do określonego peptydu, jest przeprowadzenie moldy IMS na zwierzętach z knockoutem peptydu u myszy z knockoutem proniny. Kilka pików, wskazanych strzałkami, nie występuje u osobników z knockoutem, natomiast jest obecnych w kontroli typu dzikiego.Szczyty peptydów niezwiązanych, takich jak substancja P i P ink, nie wykazują różnic między zwierzętami z nokautem a zwierzętami kontrolnymi. Intensywności szczytów dinorfiny B oraz alfa-neoendorfiny są znacznie zwiększone w zmianach wywołanych 6-hydroksydopaminą. Striatalne AUM w modelu parkinsonowskim u zwierząt z wysoką dyskinezą, wskazane strzałkami, w porównaniu z grupą z niską dyskinezą oraz grupą kontrolną z uszkodzeniem.Analiza statystyczna wykazała również istotny wzrost masy peptydu odpowiadającego uciętym alfaneoendorfinom, w których usunięto tyrozynę terminalną. Rzeczywiście, inspekcja wizualna wyników obrazowania wykazuje wysoką kolokalizację macierzystych peptydów dinorfinowych zaznaczonych na zielono oraz ich pokrewnych metabolitów DES-tyrozyny zaznaczonych na czerwono; kolor żółty na panelu nakładkowym po prawej stronie oznacza regionalne nakładanie się tych sygnałów. Ogromny potencjał tej techniki podkreślają odkrycia dotyczące selektywnego przetwarzania peptydów w różnych strukturach mózgu, których nie można wykryć za pomocą innych metod.Tutaj specyficzne metabolity tyrozyny DES, zaznaczone na czerwono, współlokalizowały się z peptydem macierzystym zaznaczonym na zielono i były obserwowane wyłącznie w prążkowiu, a nie w istocie czarnej szczurów z dyskinezą. Analiza obrazu istoty czarnej wykazała, że produkt degradacji lu i kelin arch zaznaczony na czerwono był lokalizowany odwrotnie niż di norfina B zaznaczona na zielono, co wskazuje, że podczas dyskinezy di norfina B była uwalniana lokalnie w bocznej części istoty czarnej, a następnie metabolizowana do lu i careful in AR One. Pojedynczy eksperyment z wykorzystaniem obrazowania MALDI można przeprowadzić w jeden lub dwa dni, obejmując przygotowanie próbek i akwizycję danych.Następnie poświęcono kolejny dzień lub dwa na ewaluację danych. W zależności od wielkości próby, eksperymenty walidacyjne wymagałyby kolejnego dnia lub dwóch pracy laboratoryjnej, pod warunkiem ich prawidłowego przeprowadzenia. Należy zachować szczególną staranność w poniższych krokach.Disekcję i mrożenie tkanek należy przeprowadzić szybko, aby uniknąć degradacji peptydów, natomiast protokół płukania i nakładania macierzy musi zostać zoptymalizowany dla każdego eksperymentu. Ewaluację danych i analizę statystyczną należy przeprowadzić starannie, aby uniknąć wyników fałszywie dodatnich wynikających z efektów nadmiernej normalizacji lub błędnej detekcji pików.

maldi-imaging-mass-spectrometry-neuropeptides-parkinson-s

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Obrazowanie masowe spektrometrii MALDI neuropeptydów w chorobie Parkinsona

W niniejszej pracy opisujemy protokół przygotowania skrawków siatkówki zatopionych w agarze, które nadają się do elektrofizjologii oraz obrazowania Ca2+. Metoda ta pozwala na badanie synaps wstążkowych w mikroobwodach siatkówki przy użyciu bezpośrednich rejestracji patch-clamp z pojedynczych przedsynaptycznych zakończeń nerwowych.

Pomiary pojemności metodą patch-clamp oraz obrazowanie Ca2+ w pojedynczych zakończeniach nerwowych w skrawkach siatkówki

Opisano zostało ELISA oferujące nowatorskie podejście ilościowe. Specyficznie wykrywa związane z chorobą α-synukleina (αSD) w transgennym modelu myszym (M83) synucleinopatii za pomocą kilku przeciwciał skierowanych albo przeciw fosforylowanej w Ser129 formie αS, albo przeciwko C-końcowej części białka.

Wykrywanie białka α-synucleiny związanego z chorobą za pomocą ulepszonego testu ELISA w mózgu transgenicznych myszy nadmiernie ekspresujących ludzkie α-synucleinę z mutacją A53T

Mutacje w genie bogatej w leucynę kinazy powtórzeniowej 2 (LRRK2) powodują dziedziczną chorobę Parkinsona. Opracowaliśmy łatwą i solidną metodę oceny kontrolowanej przez LRRK2 fosforylacji Rab10 w ludzkich neutrofilach krwi obwodowej. Może to pomóc w identyfikacji osób ze zwiększoną aktywnością szlaku kinazy LRRK2.

Izolacja neutrofili ludzkiej krwi obwodowej w celu zbadania szlaku kinazy LRRK2 związanego z chorobą Parkinsona poprzez ocenę fosforylacji Rab10

Tutaj prezentujemy zautomatyzowaną metodę półilościowego określania liczby neuronów dopaminergicznych u szczurzej istoty czarnej pars compacta.

Półilościowe oznaczanie gęstości neuronów dopaminergicznych w istocie czarnej modeli gryzoni przy użyciu automatycznej analizy obrazu

Ten protokół pokazuje, jak pozyskać dane z rezonansu magnetycznego wrażliwego na neuromelaninę istoty czarnej.

Standaryzowane pozyskiwanie danych do obrazowania metodą rezonansu magnetycznego wrażliwego na neuromelaninę istoty czarnej

Solidny protokół jest tutaj prezentowany do izolowania granulek neuromelaniny z ludzkiej tkanki pośmiertnej istoty czarnej pars compacta za pomocą mikrodysekcji laserowej. Ten zmieniony i zoptymalizowany protokół znacznie minimalizuje wymagany czas pobierania próbek, zmniejsza wymaganą ilość próbki oraz usprawnia identyfikację i kwantyfikację białek za pomocą analizy LC-MS/MS.

Protokół oparty na mikrodysekcji laserowej do analizy LC-MS/MS profilu proteomicznego granulek neuromelaniny

Charakterystyka spektrometryczna mas neuropeptydów dostarcza informacji o sekwencji, kwantyfikacji i lokalizacji. Ten zoptymalizowany przepływ pracy jest przydatny nie tylko w badaniach neuropeptydów, ale także innych endogennych peptydów. Przedstawione tutaj protokoły opisują przygotowanie próbki, akwizycję MS, analizę MS i generowanie bazy danych neuropeptydów za pomocą LC-ESI-MS, MALDI-MS spotting i obrazowania MALDI-MS.

Wieloaspektowe badania neuropeptydów metodą spektrometrii mas u Callinectes sapidus

Prezentowana jest wygodna metoda perfuzji grawitacyjnej do analizy histologicznej ośrodkowego układu nerwowego myszy. Immunofluorescencyjne wykrywanie fosforylowanej α-synukleiny wykazano w mysim modelu choroby Parkinsona. Praca ta kompleksowo opisuje również etapy perfuzji przezsercowej, rozwarstwienia, zamrażania/osadzania tkanek i zamrażania sekcji.

Grawitacyjna metoda perfuzji przezsercowej do analizy histologicznej ośrodkowego układu nerwowego myszy

To badanie przedstawia metodę analizy morfologii mitochondriów na podstawie barwienia immunologicznego i analizy obrazu w tkance mózgowej myszy in situ. Opisano również, w jaki sposób pozwala to na wykrycie zmian w morfologii mitochondriów wywołanych przez agregację białek w modelach choroby Parkinsona.

Badanie histologiczne morfologii mitochondriów w modelu choroby Parkinsona

Opisano protokół wykonywania jednostronnych uszkodzeń wiązki przedniej części mózgu (MFB) za pomocą 6-OHDA u myszy. Metoda ta charakteryzuje się niskim wskaźnikiem śmiertelności (13,3 %), przy czym u 89% przeżywających zwierząt stwierdzono &gt;95% ubytku dopaminy w prążkowiu oraz tendencję do rotacji ipsypsilaternej w stronę strony uszkodzenia na poziomie 90,63±-4,02 %.

Opracowanie jednostronnego modelu choroby Parkinsona u myszy z wykorzystaniem lekcji 6-OHDA

Poznaj obrazowanie MALDI spektrometrią mas do wykrywania zmian poziomów neuropeptydów w mózgu szczura. Ta metoda pozwala badać przyczyny dyskinezji w chorobie Parkinsona z wysoką specyficznością molekularną.

Obrazowanie spektrometrią mas MALDI neuropeptydów w chorobie Parkinsona

Przeglądaj więcej filmów