Name: Testy wzrostu w celu oceny toksyczności poliglutaminy w drożdżach (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-05T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Poznaj trzy komplementarne testy wzrostu do oceny toksyczności białek poliglutaminowych w drożdżach Saccharomyces cerevisiae. Metody obejmują płytkowanie, spotting i pomiar gęstości optycznej w hodowlach ciekłych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Prace w laboratorium Duennwalda są wspierane przez granty z American Federation for Aging Research (AFAR), Hereditary Disease Foundation (HDF) oraz William Wood Foundation.

1. Ekspresja toksycznych białek z ekspansją PolyQ w drożdżach
Analiza systematyczna pozwoliła na ustalenie dokładnej sekwencji aminokwasowej białka z ekspansją polyQ, która jest niezbędna do wywołania toksyczności w drożdżach 7. To toksyczne białko z ekspansją polyQ zawiera aminokońcowy znacznik FLAG, po którym następują 17 aminokwasów z oryginalnej sekwencji białka huntingtyny, region polyQ oraz karboksykońcowe połączenie z białkiem fluorescencyjnym (GFP lub CFP, patrz Rysunek 1 a). Ekspresja białek z ekspansjami polyQ obejmującymi 46 lub więcej glutamin (np. 72 i 103 glutaminy) wywołuje toksyczność w drożdżach, gdy są one wyrażane pod kontrolą indukowalnego i stosunkowo silnego promotora GAL1 7, 9.
Jak opisano wcześniej, toksyczność polyQ u drożdży jest widoczna tylko w komórkach zawierających białko Rnq1p w konformacji prionowej, [RNQ+], np. w szczepie drożdży W303 9. Toksyczne białko z ekspansją polyQ odtwarza kluczowe aspekty biologii polyQ u drożdży, takie jak zależna od długości polyQ toksyczność (patrz poniżej) oraz agregacja (Rycina 1 b). Co istotne, toksyczne białka z ekspansją polyQ nie zabijają komórek drożdży natychmiastowo; zamiast tego upośledzają lub zatrzymują cykl komórkowy i podział komórek, spowalniając lub hamując tym samym wzrost kolonii drożdży na płytkach lub w kulturach płynnych (nasze niepublikowane dane).
2. Potencjalne problemy z komórkami drożdży ekspresującymi toksyczne białka z ekspansją PolyQ
Komórki drożdży wykazujące ekspresję w przeciwnym razie toksycznych białek z ekspansją polyQ mogą nie wykazywać żadnych zaburzeń wzrostu 9. Genetyczna natura tych supresorów toksyczności polyQ nie wydaje się opierać na prostych mutacjach mendlowskich, w związku z czym mogą one występować z relatywnie wysoką częstotliwością (nasze nieopublikowane wyniki). Przypuszczamy, że te spontaniczne supresory są spowodowane eliminacją niezidentyfikowanych prionów, które działają podobnie do [RNQ+] w określaniu toksyczności polyQ. Te spontaniczne supresory toksyczności polyQ mogą zagrozić pomyślnemu wynikowi każdego eksperymentu mającego na celu charakterystykę toksyczności polyQ lub identyfikację i charakterystykę modyfikatorów toksyczności polyQ.
Aby uniknąć częstego występowania tych spontanicznych supresorów, należy przestrzegać opisanych poniżej środków ostrożności, które okazały się bardzo skuteczne:
<ol>
	<li>Do eksperymentów nad toksycznością należy używać świeżych komórek drożdży. Nie należy przechowywać drożdży przez dłuższy czas. Należy regularnie pobierać świeże kolonie drożdży z mrożonych zapasów.</li>
	<li>Należy często monitorować ekspresję i agregację toksycznych białek z ekspansją polyQ za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.</li>
	<li>Przed rozpoczęciem jakichkolwiek pomiarów toksyczności komórki drożdży należy przez cały czas utrzymywać w pożywkach hamujących ekspresję toksycznych sekwencji polyQ (tj. w pożywkach selektywnych zawierających glukozę jako jedyne źródło węgla).</li>
	<li>Do każdego eksperymentu nad toksycznością polyQ należy użyć co najmniej trzech niezależnych transformantów.</li>
</ol>
3. Testy wzrostu
<ol>
	<li>Dla każdego warunku doświadczalnego zaszczep jedną kolonię z trzech niezależnych transformantów komórek drożdży zawierających toksyczne białko z ekspansją polyQ w 3 ml selektywnego podłoża dla drożdży z glukozą jako jedynym źródłem węgla.</li>
	<li>Inkubować te kultury przez noc w temperaturze 30 °C. W tych warunkach komórki nie wykazują ekspresji białka z ekspansją polyQ, ponieważ glukoza w podłożu hamuje ich ekspresję. Nie dopuścić do przerośnięcia kultur; utrzymać OD600 (absorbancja światła o długości fali 600 nm) kultur nocnych poniżej 1.</li>
	<li>W celu monitorowania wad wzrostu komórek drożdży wykazujących ekspresję toksycznego białka z ekspansją polyQ rutynowo stosujemy trzy różne testy:</li>
</ol>
3.1 Hodowla na płytkach
<ol>
	<li>Rozcieńczyć nocne hodowle drożdży (hodowane przy wytrząsaniu z prędkością 220 rpm) do poziomu OD600 wynoszącego 0,0005 (tj. rozcieńczenie 1:1000 hodowli o OD600 = 0,5) w pożywce selektywnej 7 zawierającej glukozę.</li>
	<li>Równomiernie rozprowadzić 50 μl (co daje ok. 700 kolonii na płytkę) każdej rozcieńczonej hodowli na jednej płytce (średnica 10 cm) z pożywką selektywną zawierającą glukozę jako jedyne źródło węgla oraz na jednej płytce z pożywką selektywną zawierającą galaktozę jako jedyne źródło węgla.</li>
	<li>Inkubować płytki przez trzy do czterech dni w temperaturze 30 °C. Po inkubacji wykonać zdjęcia każdej płytki i policzyć liczbę kolonii na płytkach z glukozą oraz liczbę kolonii na płytkach z galaktozą. W idealnych warunkach, przy użyciu komórek drożdży ekspresujących wysoce toksyczne białko z ekspansją polyQ (103Q, Ryc. 2a), na płytce z galaktozą nie powinno być kolonii lub powinno być ich bardzo mało.</li>
</ol>
3.2 Testy kropelkowe (spotting assays)
Ten test ma charakter bardziej ilościowy niż opisany powyżej test z wysiewem na płytki, dzięki czemu pozwala wykryć nawet subtelne różnice w toksyczności polyQ w ramach jednego eksperymentu na tej samej płytce.
<ol>
	<li>Rozcieńczyć hodowle nocne wyhodowane w medium z glukozą do OD600 wynoszącej 0.1.</li>
	<li>Pipetować 200 μl tych rozcieńczonych hodowli do sterylnych płytek 96-dołkowych i przygotować pięciokrotne rozcieńczenia seryjne w sterylnej wodzie przy użyciu pipety wielokanałowej.</li>
	<li>Za pomocą froggera (zwanego również spotterem, z 8 x 6 pinami do przenoszenia zawiesin komórkowych) przenieść zawiesiny komórkowe na płytki zawierające media selekcyjne z glukozą jako jedynym źródłem węgla oraz na płytki zawierające media selekcyjne z galaktozą jako jedynym źródłem węgla.</li>
	<li>Pozostawić płytki do wyschnięcia przed ich inkubacją w temperaturze 30 °C przez trzy do czterech dni.</li>
	<li>Po inkubacji wykonać zdjęcia każdej płytki (Ryc. 2b).</li>
</ol>
3.3. Monitorowanie toksyczności polyQ w drożdżach poprzez wzrost kultur w cieczy
Niniejszy protokół jest najbardziej ilościowy (wartości OD600) spośród trzech opisanych tutaj testów i pozwala nawet na wykrycie bardzo subtelnych różnic w toksyczności polyQ. Wspomniane wcześniej występowanie spontanicznych supresorów może jednak potencjalnie prowadzić do błędnych wyników. Dlatego zalecam połączenie tego testu z co najmniej jednym z dwóch opisanych powyżej testów wysiewowych. Do tych eksperymentów proponujemy użycie urządzenia BioscreenC. BioscreenC to instrument, który automatycznie mierzy gęstość optyczną kultur drożdży w płytkach 100-dołkowych podczas inkubacji w określonych temperaturach i przy zdefiniowanym wytrząsaniu. Można również zastosować inne metody hodowli komórek drożdży i pomiaru ich gęstości optycznej.
<ol>
	<li>Przemyć komórki drożdży z pożywki minimalnej zawierającej glukozę jako jedyne źródło węgla trzykrotnie w 3 ml sterylnej wody.</li>
	<li>Rozcieńczyć nocne kultury hodowane na pożywce z galaktozą do poziomu OD600 wynoszącego 0,1.</li>
	<li>Napełnić każdą dołek 100-dołkowej płytki BioscreenC 300 μl kultur drożdży.</li>
	<li>Otworzyć program Easy Bioscreen Experiment. Określić liczbę próbek do monitorowania (wliczając w to próbki ślepe i kontrole zawierające tylko pożywkę), ustawić temperaturę na 30 °C, czas trwania eksperymentów na 3 dni, odstępy między pomiarami na 15 minut, filtr na 600 nm /Brown oraz tryb wstrząsania na 15 sekund przed każdym pomiarem z umiarkowaną intensywnością.</li>
	<li>Urządzenie BioscreenC oraz dołączone oprogramowanie wygenerują arkusze Excel dla każdego punktu danych zarejestrowanego podczas eksperymentu.</li>
	<li>Przygotować w programie Excel krzywe wzrostu dla każdej próbki i porównać wzrost różnych próbek (Rysunek 2c). Szczegółowy opis analizy danych uzyskanych w eksperymentach BioscreenC został przedstawiony wcześniej 10.</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki
<img alt="Schemat struktury białka huntingtiny, region polyQ, znacznik FLAG, analiza mikroskopowa w fluorescencji." src="/files/ftp_upload/3461/3461fig1.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Drożdżowy model polyQ. a) Schematyczne przedstawienie toksycznego białka z ekspansją polyQ. b) Mikroskopia fluorescencyjna przedstawiająca komórki drożdży wykazujące ekspresję krótkiego, nietoksycznego białka z ekspansją polyQ (25Q, panel lewy) oraz komórki drożdży wykazujące ekspresję długiego, toksycznego białka z ekspansją polyQ (103Q, panel prawy).
<img alt="Efekty ekspresji huntingtiny; wzrost na płytce agarowej (103Q), rozcieńczenia seryjne; analiza krzywej wzrostu." src="/files/ftp_upload/3461/3461fig2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Reprezentatywne wyniki testów wzrostu komórek drożdży wykazujących ekspresję białek z ekspansją polyQ. a) Test wysiewu. Około 700 komórek drożdży wysiano na płytki i inkubowano przez trzy dni w temperaturze 30 °C. Górny panel przedstawia płytkę z podłożem glukozowym, tzn. ekspresja toksycznego białka z ekspansją polyQ (103Q) nie jest indukowana. Dolny panel przedstawia płytkę drożdży z podłożem galaktozowym, tzn. ekspresja toksycznego białka z ekspansją polyQ jest indukowana. Należy zauważyć, że w przedstawionym tutaj eksperymencie nie wystąpił spontaniczny supresor. b) Test kropelkowy (spotting assay). Pięć pięciokrotnych rozcieńczeń seryjnych komórek drożdży zawierających albo nietoksyczne białko polyQ (25Q), albo toksyczne białko z ekspansją polyQ (103Q) naniesiono kropelkowo na płytki glukozowe, które hamują ekspresję białek (lewy panel), lub na płytki galaktozowe, które indukują ich ekspresję. Płytki inkubowano następnie przez trzy dni w temperaturze 30 °C. c) Eksperyment BioscreenC. Wzrost kultur komórek drożdży wykazujących ekspresję albo nietoksycznego białka polyQ (25Q), albo toksycznego białka z ekspansją polyQ (103Q) monitorowano za pomocą instrumentu BioscreenC. Warunki eksperymentalne oraz analiza eksperymentów BioscreenC zostały opisane w tekście głównym.

<ol><li>Soto, C., Estrada, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+misfolding+and+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Protein misfolding and neurodegeneration.</a> Arch. Neurol. 65, 184-189 (2008).</li>
<li>Ross, C. A., Tabrizi, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntington%27s+disease%3A+from+molecular+pathogenesis+to+clinical+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurol%22%5BJournal%5D)">Huntington's disease: from molecular pathogenesis to clinical treatment.</a> Lancet Neurol. 10, 83-98 (2011).</li>
<li>Zoghbi, H. Y., Orr, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamine+repeats+and+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glutamine repeats and neurodegeneration.</a> Annu. Rev. Neurosci. 23, 217-247 (2000).</li>
<li>Meriin, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocytosis+machinery+is+involved+in+aggregation+of+proteins+with+expanded+polyglutamine+domains%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Endocytosis machinery is involved in aggregation of proteins with expanded polyglutamine domains.</a> FASEB J. 21, 1915-1925 (2007).</li>
<li>Giorgini, F., Guidetti, P., Nguyen, Q., Bennett, C. S., Muchowski, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genomic+screen+in+yeast+implicates+kynurenine+3-monooxygenase+as+a+therapeutic+target+for+Huntington+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">A genomic screen in yeast implicates kynurenine 3-monooxygenase as a therapeutic target for Huntington disease.</a> Nat. Genet. 37, 526-5231 (2005).</li>
<li>Duennwald, M. L., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+ERAD+and+ER+stress+are+early+and+specific+events+in+polyglutamine+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Impaired ERAD and ER stress are early and specific events in polyglutamine toxicity.</a> Genes Dev. 22, 3308-3319 (2008).</li>
<li>Duennwald, M. L., Jagadish, S., Muchowski, P. J., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flanking+sequences+profoundly+alter+polyglutamine+toxicity+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Flanking sequences profoundly alter polyglutamine toxicity in yeast.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 11045-1150 (2006).</li>
<li>Duennwald, M. L., Jagadish, S., Giorgini, F., Muchowski, P. J., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+network+of+protein+interactions+determines+polyglutamine+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A network of protein interactions determines polyglutamine toxicity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 11051-116 (2006).</li>
<li>Meriin, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntington+toxicity+in+yeast+model+depends+on+polyglutamine+aggregation+mediated+by+a+prion-like+protein+Rnq1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Huntington toxicity in yeast model depends on polyglutamine aggregation mediated by a prion-like protein Rnq1.</a> J. Cell. Biol. 157, 997-1004 (2002).</li>
<li>Murakami, C., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+Yeast+Chronological+Life+Span+by+Outgrowth+of+Aged+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Quantifying Yeast Chronological Life Span by Outgrowth of Aged Cells.</a> J. Vis. Exp. (27), e1156-e1156 (2009).</li>
<li>Gitler, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beer+and+bread+to+brains+and+beyond%3A+can+yeast+cells+teach+us+about+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosignals%22%5BJournal%5D)">Beer and bread to brains and beyond: can yeast cells teach us about neurodegenerative disease.</a> Neurosignals. 16, 52-62 (2008).</li>
<li>Giorgini, F., Muchowski, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+for+genetic+modifiers+of+amyloid+toxicity+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Screening for genetic modifiers of amyloid toxicity in yeast.</a> Methods Enzymol. 412, 201-222 (2006).</li>
<li>Ehrnhoefer, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+tea+%28-%29-epigallocatechin-gallate+modulates+early+events+in+huntingtin+misfolding+and+reduces+toxicity+in+Huntington%27s+disease+models%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">Green tea (-)-epigallocatechin-gallate modulates early events in huntingtin misfolding and reduces toxicity in Huntington's disease models.</a> Hum. Mol. Genet. 15, 2743-2751 (2006).</li>
<li>Cashikar, A. G., Duennwald, M., Lindquist, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chaperone+pathway+in+protein+disaggregation.+Hsp26+alters+the+nature+of+protein+aggregates+to+facilitate+reactivation+by+Hsp104%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">A chaperone pathway in protein disaggregation. Hsp26 alters the nature of protein aggregates to facilitate reactivation by Hsp104.</a> J. Biol. Chem. 280, 23869-2375 (2005).</li>
</ol>

Nie zgłoszono konfliktów interesów.

Niniejszy artykuł przedstawia trzy komplementarne podejścia eksperymentalne do pomiaru toksyczności polyQ w organizmie modelowym, jakim są drożdże, w oparciu o zahamowanie wzrostu komórek drożdży ekspresujących toksyczne białka z ekspansją polyQ. Badania na drożdżach dostarczyły cennych informacji na temat podstawowych komórkowych i molekularnych mechanizmów błędnego zwijania białek i wynikającej z tego toksyczności, w tym błędnego zwijania i toksyczności białek z ekspansją polyQ 9,11,12. Eksperymenty oparte n...

<table><tbody><tr><td>Frogger (6x8 pinów)</td><td>V&amp;amp;P Scientific</td><td>VP 407 AH</td><td></td></tr><tr><td>BioscreenC</td><td>Growth Curves USA</td><td>5101370</td><td></td></tr><tr><td>Płytki plastrem miodu 100-dołkowe</td><td>Growth Curves USA</td><td>9602550</td><td></td></tr></tbody></table>

testy wzrostu do oceny toksyczności poliglutaminy w drożdżach

Growth Assays to Assess Polyglutamine Toxicity in Yeast

Błędne fałdowanie białek wiąże się z wieloma chorobami ludzi, w szczególności z chorobami neurodegeneracyjnymi, takimi jak choroba Alzheimera, choroba Parkinsona i choroba Huntingtona 1. Choroba Huntingtona (HD) jest spowodowana nieprawidłową ekspansją regionu poliglutaminy (polyQ) w białku huntingtynie. Białko huntingtyna z ekspansją polyQ przyjmuje aberracyjną konformację (tj. ulega błędnemu fałdowaniu) i wywołuje toksyczność komórkową 2. Przynajmniej osiem kolejnych chorób neurodegeneracyjnych jest spowodowanych ekspansjami polyQ, w tym ataksje spinocerebellarne i choroba Kennedy'ego 3.
Organizm modelowy, jakim są drożdże, umożliwił uzyskanie istotnych informacji na temat komórkowych i molekularnych podstaw toksyczności polyQ, w tym wpływu wewnątrz- i międzycząsteczkowych czynników toksyczności polyQ oraz identyfikacji szlaków komórkowych, które ulegają upośledzeniu w komórkach ekspresujących białka z ekspansją polyQ 3-8. Co ważne, wiele aspektów toksyczności polyQ odkrytych u drożdży zostało odtworzonych w innych systemach eksperymentalnych oraz w pewnym stopniu w próbkach pobranych od pacjentów z chorobą Huntingtona, co dowodzi znaczenia modelu drożdżowego dla odkrywania podstawowych mechanizmów leżących u podstaw toksyczności polyQ.
Bezpośrednim i stosunkowo prostym sposobem określenia toksyczności polyQ w drożdżach jest pomiar zaburzeń wzrostu komórek drożdżowych wykazujących ekspresję białek z ekspansją polyQ. Niniejszy artykuł opisuje trzy komplementarne podejścia eksperymentalne służące do określania toksyczności polyQ w drożdżach poprzez pomiar wzrostu komórek drożdżowych wykazujących ekspresję białek z ekspansją polyQ. Pierwsze dwa podejścia eksperymentalne polegają na monitorowaniu wzrostu drożdży na płytkach, natomiast trzecie podejście polega na monitorowaniu wzrostu płynnych kultur drożdży przy użyciu urządzenia BioscreenC. 
Ponadto niniejszy artykuł opisuje trudności eksperymentalne, które mogą wystąpić podczas pracy z drożdżowymi modelami polyQ, oraz przedstawia strategie pomagające uniknąć lub zminimalizować te problemy. Opisane tutaj protokoły mogą być wykorzystane do identyfikacji i charakteryzacji szlaków genetycznych oraz małych cząsteczek modulujących toksyczność polyQ. Co więcej, opisane testy mogą służyć jako wzorce do dokładnych analiz toksyczności wywołanej przez inne białka związane z chorobami, które ulegają błędnemu sfałdowaniu w modelach drożdżowych.

Niniejszy manuskrypt opisuje trzy komplementarne protokoły służące do oceny toksyczności białek z ekspansją poliglutaminy (polyQ) w drożdżach Saccharomyces cerevisiae. Protokoły te można łatwo zmodyfikować w celu monitorowania toksyczności innych błędnie sfałdowanych białek w drożdżach.

Testy wzrostu do oceny toksyczności poliglutaminy w drożdżach

Błędne fałdowanie białek wiąże się z wieloma chorobami ludzi, w szczególności z chorobami neurodegeneracyjnymi, takimi jak choroba Alzheimera, choroba Parkinsona...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wykorzystanie drożdży jako platformy eksperymentalnej do oceny i analizy toksyczności związanej z białkami z ekspansją poliglutaminy. Następuje wzrost drożdży w warunkach tłumiących ekspresję poliglutaminy. W celu wiarygodnej oceny toksyczności w pierwszym zaprezentowanym teście wzrostu, przeprowadzono trzy komplementarne testy wzrostu komórek drożdżowych wykazujących ekspresję toksycznego białka z ekspansją poliglutaminy.W niniejszym przypadku toksyczność poliglutaminy jest monitorowana za pomocą testu wysiewowego. Jako drugi, uzupełniający test wzrostu, wykorzystuje się metodę kropelkową (spotting assay), aby wykryć nawet niewielkie różnice w przyroście komórek. Najbardziej ilościowe podejście zaprezentowano w trzecim teście, w którym komórki drożdżowe są hodowane w kulturach płynnych, a toksyczność monitoruje się poprzez pomiar gęstości optycznej przy 600 nanometrach, co pozwala na uzyskanie w pełni powtarzalnych i ilościowych wyników.Niniejszy dokument opisuje toksyczność poliglutaminy w komórkach drożdży poprzez dokładną analizę ich wzrostu na płytkach oraz w kulturach płynnych. Metoda ta pozwala odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące mechanizmów zaburzeń związanych z błędnym zwijaniem białek, takich jak rozszyfrowanie podstaw genetycznych i komórkowych toksyczności związanej z błędnie zwiniętymi białkami, w tym białkami poliglutaminowymi. Systematyczna analiza pozwoliła ustalić dokładną sekwencję aminokwasową białka z ekspansją polikQ, która jest niezbędna do wywołania toksyczności w drożdżach.To toksyczne białko z ekspansją poly Q zawiera tag flag na terminalu aminowym, po którym następują 17 aminokwasów z oryginalnej sekwencji białka Huntingtona, region poly Q oraz fuzja na terminalu karboksylowym z białkiem fluorescencyjnym. Komórki drożdży wykazujące ekspresję w przeciwnym razie toksycznych białek z ekspansją poly Q mogą nie wykazywać żadnych zaburzeń wzrostu z powodu spontanicznych supresorów toksyczności poly Q, co może zagrozić pomyślnemu wynikowi każdego eksperymentu mającego na celu charakterystykę toksyczności poly Q lub jej modyfikatorów. Aby uniknąć częstego występowania tych spontanicznych supresorów, należy podjąć środki ostrożności, w tym stosować świeże komórki drożdży w eksperymentach nad toksycznością. Należy unikać przechowywania drożdży przez dłuższy czas i regularnie pobierać świeże kolonie drożdży z zamrożonych zapasów.Regularnie monitoruj ekspresję i agregację toksycznych białek z ekspansją poly Q za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Przez cały czas utrzymuj komórki drożdży w medium tłumiącym ekspresję toksycznych białek. Przed rozpoczęciem jakichkolwiek pomiarów toksyczności.Jako końcowy środek zapobiegawczy, w każdym eksperymencie należy wykorzystać wiele niezależnych transformantów. Na początek, w testach wzrostu przedstawionych w niniejszym protokole, uzyskano komórki drożdży kodujące ekspresję białek z ekspansją poly Q, wykorzystując trzy mililitry selektywnej pożywki dla drożdży z glukozą. Jako jedyne źródło węgla zaszczepiono trzy kultury z trzech niezależnych transformantów, a następnie inkubowano kultury przez noc w temperaturze 30 °C.W tych warunkach komórki nie wykazują ekspresji białka z ekspansją poly Q ze względu na represję wywołaną przez glukozę. Aby umożliwić monitorowanie defektów poprzez wzrost na płytkach, należy zapobiegać nadmiernemu wzrostowi kultur nocnych, utrzymując gęstość optyczną przy 600 nanometrach poniżej jedności. Najpierw należy wykonać rozcieńczenie 1:1000 nocnej kultury drożdży o OD 600 wynoszącej 0,5 w pożywce selektywnej zawierającej glukozę, a następnie równomiernie rozprowadzić 50 µL każdej rozcieńczonej kultury na jednej płytce z pożywką selektywną z glukozą jako jedynym źródłem węgla, aby uzyskać około 700 kolonii na płytkę dla każdej rozcieńczonej kultury.Przesiejcie również na podłoże selekcyjne zawierające galaktozę jako jedyne źródło węgla. Inkubujcie płytki przez trzy do czterech dni w temperaturze 30 °C. Po inkubacji wykonajcie zdjęcia każdej płytki i policzcie liczbę kolonii na płytkach z glukozą i galaktozą.W idealnych warunkach na płytce z galaktozą nie powinno pojawić się żadnych lub bardzo niewielu kolonii w przypadku użycia komórek drożdży wykazujących ekspresję silnie toksycznego białka z ekspansją poly Q. Test kropelkowy (spotting assay) jest bardziej ilościowy niż test wysiewowy, dzięki czemu może ujawnić nawet subtelne różnice w toksyczności poly Q. W ramach tego samego eksperymentu na tej samej płytce, aby rozpocząć testy kropelkowe w medium z glukozą, należy rozcieńczyć kultury nocne tak, aby uzyskać OD 600 wynoszącą 0,1; następnie należy pipetować 200 µL każdej rozcieńczonej kultury do sterylnych płytek 96-dołkowych i przygotować pięć pięciokrotnych rozcieńczeń seryjnych w sterylnej wodzie, używając pipety wielokanałowej i przenosząc próbki za pomocą urządzenia typu frogger.Zawiesiny komórkowe naniesiono na płytki zawierające podłoże selektywne z glukozą jako jedynym źródłem węgla. Dodatkowo przeniesiono komórki na płytki zawierające podłoże selektywne z galaktozą jako jedynym źródłem węgla; po wysuszeniu płytek inkubowano je w temperaturze 30 °C przez trzy do czterech dni, a następnie wykonano zdjęcia każdej płytki. Test wzrostu w cieczy jest najbardziej ilościowym z trzech opisanych tutaj testów służących do monitorowania toksyczności poly Q u drożdży.Bio screen C to instrument, który automatycznie mierzy gęstość optyczną kultur drożdży w płytkach 100-dołkowych podczas inkubacji w określonych temperaturach i przy określonym mieszaniu. Można również zastosować inne metody hodowli komórek drożdży i pomiaru ich gęstości optycznej, aby rozpocząć wirowanie komórek drożdży wyhodowanych przez noc w pożywce minimalnej zawierającej glukozę jako jedyne źródło węgla. Po wirowaniu należy przemyć komórki w trzech mililitrach sterylnej wody.Powtórz płukanie dwukrotnie, każdorazowo wirując komórki po każdym płukaniu przy użyciu pożywki z galaktozą. Rozcieńcz wypłukane komórki do wartości OD 600 wynoszącej 0.1. Następnie wypełnij każdą studzienkę 100-dołkowej płytki Bio Screen C 300 µl rozcieńczonych kultur drożdży i włóż płytkę do urządzenia.Otwórz program do eksperymentów easy bio screen. Określ liczbę próbek do monitorowania. Ustaw temperaturę na 30 °C.Ustaw czas trwania eksperymentów na trzy dni oraz interwały pomiarowe na 15 minut. Następnie ustaw filtr na 600 nanometrów (brązowy) i tryb wstrząsania na 15 sekund przed każdym pomiarem przy średniej intensywności. Po ustawieniu parametrów rozpocznij eksperyment.Bio screen (patrz instrument) oraz dołączone oprogramowanie wygenerują arkusze Excel z każdym punktem danych zebranym podczas eksperymentu. Za pomocą programu Excel można przygotować krzywe wzrostu dla każdej próbki i porównać wzrost różnych próbek. Przedstawione tutaj wyniki pochodzą z testu wysiewu na płytki.Około 700 komórek drożdży wysiano na płytki i inkubowano przez trzy dni w temperaturze 30°C na płytce zawierającej podłoże z glukozą. Ekspresja toksycznego białka z ekspansją poly Q nie jest indukowana. Przeciwnie, gdy komórki drożdży wysiano na podłoże z galaktozą, ekspresja toksycznego białka z ekspansją poly Q zostaje indukowana.Należy zauważyć, że w przedstawionym eksperymencie nie wystąpiła supresja spontaniczna. Podobnie, w teście kropelkowym (spotting assay) ekspresja toksycznego białka z ekspansją Poly Q jest obserwowana na galaktozie, a nie na glukozie. Pożywka pięć, seryjne pięciokrotne rozcieńczenia komórek drożdży zawierających nietoksyczne białko poly Q lub toksyczne białko z ekspansją poly Q, naniesione na płytki z glukozą, które represują ekspresję białek, lub na płytki z galaktozą, które indukują ich ekspresję w eksperymencie bio screen C.Wzrost kultur komórek drożdży wykazujących ekspresję białka poly Q o charakterze nietoksycznym lub toksycznego białka z ekspansją poly Q był monitorowany za pomocą urządzenia Bio Screen C, zgodnie z opisem w tym filmie; wpływ ekspresji toksycznego białka z ekspansją poly Q na wzrost komórek jest tutaj widoczny. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś posiadać gruntowną wiedzę na temat monitorowania toksyczności białek poliglutaminowych w drożdżach. Test wzrostu w cieczy jest najbardziej ilościowym z trzech testów, ponieważ pozwala on wykryć nawet subtelne różnice w toksyczności poliglutaminy.Należy jednak pamiętać o połączeniu tej metody z przynajmniej jednym z dwóch testów wysiewowych, aby uniknąć problemów związanych z spontanicznymi supresorami toksyczności poliglutaminy.

growth-assays-to-assess-polyglutamine-toxicity-in-yeast

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Testy wzrostu do oceny toksyczności poliglutaminy u drożdży

W niniejszym opracowaniu opisujemy badanie przesiewowe nadekspresji plazmidowej w Saccharomyces cerevisiae, z wykorzystaniem ułożonej w matrycy biblioteki plazmidów oraz wysokoprzepustowego protokołu transformacji drożdży z użyciem robota do obsługi cieczy.

Wysokoprzepustowy screening nadekspresji plazmidowej w drożdżach

W tym filmie opisujemy metodę oceny neuroprotekcyjnego wpływu badanego związku, astragananu, na przeżycie neuronów u Caenorhabditis elegans z powodu neurotoksyczności za pośrednictwem polyQ. W teście wykorzystuje się Caenorhabditis elegans wykazujące ekspresję nieprawidłowo ekspandowanych powtórzeń polyQ połączonych z GFP w ich neuronach ASH w celu pomiaru przeżycia neuronów po leczeniu badanym związkiem.

Test do badania wpływu badanego związku na neurotoksyczność za pośrednictwem PolyQ u robaków

Modele proteinopatii drożdży są cennymi narzędziami do oceny toksyczności i agregacji białek związanych z chorobą. W tym miejscu przedstawiamy metody badań przesiewowych bibliotek wariantów Hsp104 pod kątem supresorów toksyczności. Protokół ten można dostosować do badań przesiewowych dowolnej biblioteki białek pod kątem supresorów toksyczności dowolnego białka, które jest toksyczne w drożdżach.

Izolowanie wzmocnionych wariantów Hsp104 przy użyciu modeli proteinopatii drożdżowej

Ten artykuł opisuje test oparty na wzroście drożdży do określania wymagań genetycznych dla degradacji białek. Zademonstrowano również metodę szybkiej ekstrakcji białek drożdży, nadającą się do western blot w celu biochemicznego potwierdzenia wymagań degradacji. Techniki te można dostosować do monitorowania degradacji różnych białek.

Oznaczanie na podstawie wzrostu i biochemiczne potwierdzenie wymagań genetycznych dotyczących degradacji białek u Saccharomyces cerevisiae

Ten protokół opisuje metodologię o wysokiej przepustowości do funkcjonalnego badania przesiewowego pod kątem dziedziczenia opartego na białkach u S. cerevisiae.

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe w kierunku dziedziczenia na podstawie białek u S. cerevisiae

Ten artykuł przedstawia metodę opartą na kojarzeniu, która ułatwia badanie przesiewowe nadekspresji u pączkujących drożdży przy użyciu biblioteki plazmidów z tablicą.

Badania przesiewowe biblioteki nadekspresji opartej na kryciach u drożdży

Ten artykuł opisuje protokoły do oceny wpływu białek fluorescencyjnych na agregację i toksyczność nieprawidłowo sfałdowanej ekspansji poliglutaminy w celu szybkiej oceny nowo niescharakteryzowanego białka fluorescencyjnego w kontekście reporterów fluorescencyjnych.

Wpływ białek fluorescencyjnych na partnerów fuzji za pomocą testów toksyczności poliglutaminy w drożdżach

Przedstawione są tutaj cztery protokoły do konstruowania i wykorzystywania szczepów reporterowych drożdży Saccharomyces cerevisiae do badania potencjału transaktywacji ludzkiego P53, wpływu różnych mutacji związanych z rakiem, współekspresji białek oddziałujących oraz efektów określonych małych cząsteczek.

Drożdże jako podwozie do opracowywania testów funkcjonalnych do badania ludzkiego p53

Patogeny bakteryjne wydzielają do gospodarza białka, które kierują się na kluczowe procesy biologiczne. Identyfikacja szlaków gospodarza, na które ukierunkowane są bakteryjne białka efektorowe, ma kluczowe znaczenie dla rozwiązania problemu patogenezy molekularnej. W tym miejscu opisano metodę wykorzystującą zmodyfikowany supresor drożdży i badanie przesiewowe toksyczności w celu wyjaśnienia szlaków gospodarza, do których skierowane są toksyczne bakteryjne białka efektorowe.

Identyfikacja szlaków gospodarza, do których ukierunkowane są bakteryjne białka efektorowe przy użyciu toksyczności drożdży i badań supresorowych

Tutaj prezentujemy protokół oceny neuroprotekcyjnych aktywności testowych związków u Caenorhabditis elegans, w tym agregacji poliglutaminy, śmierci neuronów i zachowania chemounikania, a także przykładowej integracji wielu fenotypów.

Caenorhabditis elegans jako modelowy system do odkrywania związków bioaktywnych przeciwko neurotoksyczności za pośrednictwem poliglutaminy

Fizjologiczny model in vivo α-synukleiny jest niezbędny do zbadania i zrozumienia patogenezy choroby Parkinsona. Opisujemy metodę monitorowania cytotoksyczności i tworzenia agregatów α-synukleiny przy użyciu humanizowanego modelu drożdży.

Metoda badania toksyczności i agregacji α-synukleiny przy użyciu humanizowanego modelu drożdży

Poznaj trzy komplementarne testy wzrostu do oceny toksyczności białek poliglutaminowych w drożdżach Saccharomyces cerevisiae. Metody obejmują płytkowanie, spotting i pomiar gęstości optycznej w hodowlach ciekłych.

Testy wzrostu do oceny toksyczności poliglutaminy w drożdżach

Przeglądaj więcej filmów