Name: Rozmnażanie i wykrywanie zakaźnego klonu molekularnego wirusa Maedi-visna, który wykazuje ekspresję białka zielonej fluorescencji (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Poznaj metodę rozmnażania zakaźnego klonu wirusa Maedi-visna z ekspresją białka GFP w komórkach splotu naczyniówkowego owiec. Technika ta umożliwia wizualizację replikacji wirusa za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i cytometrii przepływowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta została sfinansowana przez Islandzki Fundusz Badawczy (Icelandic Research Fund) oraz Fundusz Badawczy Uniwersytetu Islandzkiego (University of Iceland Research Fund).

1. Transfekcja
Klon molekularny znajduje się w dwóch plazmidach, p8XSp5-egfp i p67r, o wielkościach odpowiednio 12 kb i 4,5 kb.9,10
<ol>
 <li>Przetnij ekvimolarności ilości dwóch plazmidów, tj. 4,4 μg p8XSp5-egfp oraz 1,6 μg p67r za pomocą XbaI, a następnie przeprowadź ligację przed transfekcją.</li>
 <li>Do ligacji użyj 1 jednostki Weissa ligazy w reakcji o objętości 50 μl i inkubuj przez noc w temperaturze 16°C.</li>
 <li>Po zakończeniu ligacji inkubuj mieszaninę ligacyjną w temperaturze 65°C przez 15 min w celu inaktywacji ligazy. Ten krok można pominąć.</li>
 <li>Na dwa dni przed transfekcją wysiej 106 komórek SCP do kolby hodowlanej T25 i hoduj komórki przez dwa dni w 5 ml DMEM + 10% surowicy jagnięcej i 2mM glutaminy bez antybiotyków, aż do uzyskania monowarstwy o 90% konfluencji. Jeśli komórki nie osiągną 90% konfluencji po dwóch dniach, pozostaw je do wzrostu na jeden dodatkowy dzień.</li>
</ol>
Uwaga: Surowicę jagnięcą można zastąpić płodową surowicą bydlęcą (FBS). Rutynowo stosujemy surowicę jagnięcą, ponieważ niektóre szczepy MVV są hamowane przez FBS; ten szczep MVV nie jest jednak hamowany przez FBS.
<ol start="5">
 <li>Gdy komórki będą gotowe do transfekcji, należy wymienić pożywkę na DMEM z 1% surowicy (surowica jagnięca lub FBS) bez antybiotyków. 
 Do transfekcji wykorzystujemy Lipofectamin 2000 (Invitrogen). </li>
 <li>Rozcieńczyć DNA w 500μl pożywki Opti-MEM. </li>
 <li>Rozcieńczyć 20μl Lipofectamin 2000 w 500μl pożywki Opti-MEM i pozostawić w temperaturze pokojowej (RT) na 5 min.</li>
 <li>Po 5-minutowej inkubacji połączyć rozcieńczone DNA z rozcieńczonym Lipofectamine 2000 (objętość całkowita = 1000 μl). Delikatnie wymieszać i inkubować przez 20-30 min w RT.</li>
 <li>Dodać mieszaninę do transfekcji (1 ml) do kolby T25 zawierającej komórki SCP i pożywkę (5 ml). Wymieszać, delikatnie kołysząc kolbą.</li>
 <li>Inkubować w 37°C i 5% CO2 przez noc (18 – 24 h). </li>
 <li>Następnego dnia wymienić pożywkę na DMEM z 1% surowicy, 2mM glutaminy, 100IU penicyliny i 100IU streptomycyny.</li>
 <li>Monitorować produkcję GFP w komórkach SCP za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego. W przypadku tych komórek pierwotnych można spodziewać się niskiej wydajności transfekcji, zazwyczaj na poziomie 5 – 15%.</li>
 <li>Kontynuować inkubację w 37°C, 5% CO2 przez kilka dni, aby umożliwić rozprzestrzenienie się wirusa w kolbie. Pełna infekcja trwa zazwyczaj od 7 do 14 dni.</li>
 <li>Zebrać wirusa, przenosząc supernatant do probówek Eppendorf. Wirować w mikrowirówce przy 3000 rpm przez 5 min w celu usunięcia szczątków komórkowych. Przenieść supernatant zawierający wirusa do nowych probówek. Przechowywać w -80°C.</li>
</ol>
2. Miareczkowanie wirusa
<ol>
 <li>Zasiać 3x104 komórek SCP w 100 μl pożywki DMEM uzupełnionej o 10% serum, 2mM glutaminy, 100IU/ml penicyliny i 100IU/ml streptomycyny na każdą studzienkę płytki 96-dołkowej. Inkubować w temperaturze 37°C, w atmosferze 5% CO2.</li>
 <li>Jeśli następnego dnia komórki osiągną konfluencję, wymienić pożywkę na DMEM z 1% serum, 2mM glutaminy, 100IU/ml penicyliny i 100IU/ml streptomycyny, wlewać po 100 μl do każdej studzienki.</li>
 <li>Rozcieńczyć wirusa w następujący sposób: 
 <ol>
 <li>Do 4 x 10 studzienek w 96-dołkowej płytce z okrągłym lub V-kształtnym dnem dodać po 180 μl DMEM z 1% serum, 2mM glutaminy, 100IU/ml penicyliny i 100IU/ml streptomycyny na studzienkę.</li>
 <li>Aby przygotować seryjne rozcieńczenia dziesięciokrotne w czterech powtórzeniach, dodać 20 μl wirusa do każdej z 4 studzienek w pierwszej kolumnie płytki, a następnie, używając pipety czterokanałowej, pipetować w górę i w dół, aby zapewnić dokładne wymieszanie próbek. Zmienić końcówki pipety i przenieść 20 μl do kolejnych 4 studzienek i tak dalej. Ostatnie studzienki pozostawić bez wirusa jako kontrolę negatywną.</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Dodać 100 μl rozcieńczeń wirusa do komórek SCP i pożywki.</li>
 <li>Inkubować w temperaturze 37°C i 5% CO2. Obserwować pod kątem fluorescencji GFP oraz efektów cytopatycznych przez dwa tygodnie. 
 Efekty cytopatyczne objawiają się zaokrąglaniem komórek, które stają się mniej przezroczyste niż zdrowe komórki z wydłużonymi wypustkami, co kończy się pojawieniem się komórek wielojądrzastych i śmiercią komórkową.</li>
 <li>Obliczyć miano wirusa (TCID50) metodą Reeda-Muencha11.</li>
</ol>
3. Analiza FACS zakażonych komórek
Uwaga: W celu szybkiego monitorowania replikacji wirusa zainfekowane komórki można badać za pomocą cytometrii przepływowej.
<ol>
 <li>Poddać zainfekowane komórki (ok. 105) trypsynizacji, przemyć 1x w PBS i resuspendować w 500μl PBS.</li>
 <li>Dodać 500 μl 4% roztworu paraformaldehydu (stężenie końcowe 2%) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 min.</li>
 <li>Odwirować komórki w mikrowirówce przy 3000 rpm przez 5 min.</li>
 <li>Przemyć PBS 2x przez 5 min i przeanalizować za pomocą analizatora FACScan. Zliczyć 10 000 zdarzeń.</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki:
Wirus ten powinien być w pełni zakaźny i namnażać się do miana 106 – 107 TCID50/ml. Zainfekowane komórki wykazują fluorescencję i mogą być wykrywane za pomocą cytometrii przepływowej oraz mikroskopii fluorescencyjnej. Zazwyczaj GFP można wykryć w ponad 60% komórek w zainfekowanych kulturach komórkowych przy użyciu cytometrii przepływowej (Ryc. 1). Podobnie, podczas wizualizacji za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, większość komórek wykazuje fluorescencję (Ryc. 2A i B).
<img src="/files/ftp_upload/3483/3483fig1.jpg" alt="Wykres kropkowy z cytometrii przepływowej; analiza ekspresji GFP; wizualizacja danych eksperymentalnych." data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Analiza FACScan komórek SCP zainfekowanych wirusem KV1772-egfp po 7 dniach od infekcji.
<img src="/files/ftp_upload/3483/3483fig2.jpg" alt="Porównanie hodowli komórkowych; obrazy mikroskopowe A) komórki niebarwione, B) komórki barwione fluorescencyjnie." data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Mikroskopia kontrastowa komórek SCP zainfekowanych KV1772-egfp po 7 dniach inkubacji (A). Te same komórki obrazowane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej (B).

<ol><li>Sigurdsson, B., Palsson, P. A., Grimsson, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visna%2C+a+demyelinating+transmissable+disease+of+sheep%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuropathol.+Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Visna, a demyelinating transmissable disease of sheep.</a> J. Neuropathol. Exp. Neurol. 14, 389-403 (1957).</li>
<li>Gorrell, M. D., Brandon, M. R., Sheffer, D., Adams, R. J., Narayan, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovine+lentivirus+is+macrophagetropic+and+does+not+replicate+productively+in+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Ovine lentivirus is macrophagetropic and does not replicate productively in T lymphocytes.</a> J. Virol. 66, 2679-2688 (1992).</li>
<li>Andresdottir, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+and+genetic+differences+between+lung-+and+brain-derived+isolates+of+maedi-visna+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Genes%22%5BJournal%5D)">Biological and genetic differences between lung- and brain-derived isolates of maedi-visna virus.</a> Virus Genes. 16, 281-293 (1998).</li>
<li>Georgsson, G., Houwers, D. J., Palsson, P. A., Petursson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+viral+antigens+in+the+central+nervous+system+of+visna-infected+sheep%3A+an+immunohistochemical+study+on+experimental+visna+induced+by+virus+strains+of+increased+neurovirulence%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Expression of viral antigens in the central nervous system of visna-infected sheep: an immunohistochemical study on experimental visna induced by virus strains of increased neurovirulence.</a> Acta Neuropathol. 77, 299-306 (1989).</li>
<li>Turelli, P., Guiguen, F., Mornex, J. F., Vigne, R., Querat, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((dUTPase-minus+caprine+arthritis-encephalitis+virus+is+attenuated+for+pathogenesis+and+accumulates+G-to-A+substitutions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">dUTPase-minus caprine arthritis-encephalitis virus is attenuated for pathogenesis and accumulates G-to-A substitutions.</a> J. Virol. 71, 4522-4530 (1997).</li>
<li>Petursson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visna+virus+dUTPase+is+dispensable+for+neuropathogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Visna virus dUTPase is dispensable for neuropathogenicity.</a> J. Virol. 72, 1657-1661 (1998).</li>
<li>Sigurdsson, B., Thormar, H., Palsson, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultivation+of+visna+virus+in+tissue+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Gesamte+Virusforsch%22%5BJournal%5D)">Cultivation of visna virus in tissue culture.</a> Arch Gesamte Virusforsch. 10, 368-380 (1960).</li>
<li>Gudmundsdottir, H. S., Olafsdottir, K., Franzdottir, S. R., Andresdottir, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+and+characterization+of+an+infectious+molecular+clone+of+maedi-visna+virus+that+expresses+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Construction and characterization of an infectious molecular clone of maedi-visna virus that expresses green fluorescent protein.</a> J. Virol. Methods. 168, 98-102 (2010).</li>
<li>Andresson, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleotide+sequence+and+biological+properties+of+a+pathogenic+proviral+molecular+clone+of+neurovirulent+visna+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Nucleotide sequence and biological properties of a pathogenic proviral molecular clone of neurovirulent visna virus.</a> Virology. 193, 89-105 (1993).</li>
<li>Skraban, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naturally+occurring+mutations+within+39+amino+acids+in+the+envelope+glycoprotein+of+maedi-visna+virus+alter+the+neutralization+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Naturally occurring mutations within 39 amino acids in the envelope glycoprotein of maedi-visna virus alter the neutralization phenotype.</a> J. Virol. 73, 8064-8072 (1999).</li>
<li>Reed, L. J., Muench, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+of+estimating+fifty+percent+endpoints%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Hygiene%22%5BJournal%5D)">A simple method of estimating fifty percent endpoints.</a> American Journal of Hygiene. 27, 493-497 (1938).</li>
<li>Berkowitz, R. D., Ilves, H., Plavec, I., Veres, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+systems+derived+from+Visna+virus%3A+analysis+of+virus+production+and+infectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Gene transfer systems derived from Visna virus: analysis of virus production and infectivity.</a> Virology. 279, 116-129 (2001).</li>
</ol>

Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.

Przedstawiony tutaj ekspresujący GFP klon molekularny MVV powinien być użyteczny do analizowania interakcji z komórkami gospodarza oraz patogeniczności MVV zarówno in vitro, jak i in vivo. Wirus uzyskany po 7–14 dniach replikacji z pewnością nabył pewne mutacje ze względu na niedokładność odwrotnej transkryptazy. Istnieją jednak ograniczenia w stosowaniu tego klonu jako wektora jednocyklowego. Jednym z nich jest fakt, że użycie tego klonu ogranicza się do komórek pochodzenia owczego i koziego. Wydajność transfekcji tych ...

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO, od Life Technologies</td><td>10938025</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>GIBCO, od Life Technologies</td><td>51985018</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td></td></tr></tbody></table>

propagowanie i wykrywanie zakaźnego klonu molekularnego wirusa maedi-visna wykazującego ekspresję zielonego białka fluorescencyjnego

Propagating and Detecting an Infectious Molecular Clone of Maedi-visna Virus that Expresses Green Fluorescent Protein

Wirus Maedi-visna (MVV) jest lentiwirusem owiec, wywołującym powoli postępujące zapalenie śródmiąższowe płuc oraz zapalenie mózgu i rdzenia1. Uważa się, że głównymi komórkami docelowymi MVV in vivo są komórki linii monocytów2. Niektóre szczepy MVV mogą jednak replikować się w innych typach komórek3,4. Zielone białko fluorescencyjne jest powszechnie stosowanym markerem do badania lentiwirusów w żywych komórkach. Wprowadziliśmy gen egfp do genu dUTPazy MVV. Gen dUTPazy jest dobrze zachowany w większości szczepów lentiwirusów owiec i kóz i wykazano jego istotną rolę w replikacji CAEV5. Wykazano jednak, że dUTPaza jest zbędna dla replikacji klonu molekularnego MVV użytego w niniejszym badaniu, zarówno in vitro, jak i in vivo6. Replikacja MVV jest ściśle ograniczona do komórek pochodzenia owczego lub koziego. Do transfekcji i propagacji wirusa wykorzystujemy pierwotną linię komórkową z splotu naczyniówkowego owiec (komórki SCP)7. Fluorescencyjny MVV jest w pełni zakaźny, a ekspresja EGFP pozostaje stabilna przez co najmniej 6 pasażów8. Istnieje dobra korelacja między pomiarami TCID50 a EGFP. Wirus ten powinien być zatem przydatny do szybkiego wykrywania zainfekowanych komórek w badaniach tropizmu komórkowego i patogenności in vitro oraz in vivo8.

Opisujemy klon molekularny wirusa maedi-visna, który wykazuje ekspresję GFP i jest w pełni zakaźny. Replikację tego wirusa można wykryć za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej oraz cytometrii przepływowej.

Propagowanie i wykrywanie zakaźnego klonu molekularnego wirusa maedi-visna wykazującego ekspresję zielonego białka fluorescencyjnego

Wirus maedi-visna (MVV) jest lentiwirusem owiec, powodującym powoli postępujące śródmiąższowe zapalenie płuc oraz zapalenie mózgu1. Głównymi komórkami docelowymi MVV w ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest namnażanie i wykrywanie zakaźnego klonu wirusa Mildy vs. No, który wykazuje ekspresję zielonego białka fluorescencyjnego. Zielone białko fluorescencyjne zostało sklonowane do genu kodującego D utp Ace w genomie wirusa Myy Ner.Klon infekcyjny jest zawarty w dwóch plazmidach. Po pierwsze, dwa plazmidy zawierające sekwencje myy Ner są cięte enzymem restrykcyjnym xpa one, a następnie ligowane. Po drugie, komórki splotu naczyniówkowego owcy są transfektowane otrzymanym konstruktem.Na koniec, zainfekowane wirusem myy vino komórki są wykrywane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i cytometrii przepływowej. Cześć, jestem Stefano Neron z Instytutu Patologii Eksperymentalnej TER na Uniwersytecie Islandzkim. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę namnażania i wykrywania zakaźnego klonu molekularnego wirusa naczyniowego, który wykazuje ekspresję zielonego białka fluorescencyjnego.Klon molekularny znajduje się w plazmidach P8XSP5EGFP oraz P67or o wielkości odpowiednio 12 kb i 4,5 kb. Przed transfekcją należy trawić ekvimolarne ilości obu plazmidów, mianowicie 4,4 µg P8XSP5EGFP oraz 1,6 µg P67or za pomocą XPA1, a następnie przeprowadzić ligację. Po zakończeniu ligacji mieszaninę inkubować w temperaturze 65 °C przez 15 minut. Na dwa dni przed transfekcją wysiać 10⁶ komórek SCP do kolby hodowlanej T25 i hodować je przez dwa dni w 5 mL DMEM z dodatkiem 10% surowicy jagnięcej oraz 2 mM glutaminy, bez antybiotyków, aż do uzyskania monowarstwy o 90% konfluencji.Jeśli po dwóch dniach komórki nie osiągnęły 90% konfluencji, należy pozostawić je do dalszego wzrostu przez jeden dodatkowy dzień. Serum jagnięce można zastąpić płodową surowicą bydlęcą FBS. Rutynowo stosujemy serum jagnięce, ponieważ niektóre szczepy MVV są hamowane przez FBS.Ten szczep MVV nie jest jednak hamowany przez FBS. Gdy komórki będą gotowe do transfekcji, należy wymienić medium na DMEM z 1% surowicy jagnięcej lub FBS bez antybiotyków. Do transfekcji stosujemy Lipofectamine 2000; DNA rozcieńczamy w 500 µL medium Opti-MEM, a 20 µL Lipofectamine 2000 rozcieńczamy w 500 µL medium Opti-MEM i pozostawiamy w temperaturze pokojowej na pięć minut.Po pięciominutowej inkubacji połącz rozcieńczone DNA z rozcieńczoną lipofectaminą 2000 do uzyskania całkowitej objętości 1000 µL. Delikatnie wymieszaj i inkubuj przez 20–30 minut. W temperaturze pokojowej dodaj mieszaninę do transfekcji do kolby T 25 zawierającej komórki SCP i mieszaninę pożywki, delikatnie kołysząc naczyniem.Inkubacja w temperaturze 37 °C i 5% dwutlenku węgla przez noc. Następnego dnia wymienić medium na DMEM z 1% surowicy, 2 mM glutaminy, 100 IU/ml penicyliny oraz 100 IU/ml streptomycyny. Monitorować produkcję GFP w komórkach SCP za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego.W przypadku tych komórek pierwotnych można spodziewać się niskiej wydajności transfekcji, zazwyczaj od 5% do 15%. Inkubować dalej w temperaturze 37°C, przy 5% CO2 przez kilka dni, aby umożliwić rozprzestrzenienie się wirusa w kolbie. Pełna infekcja trwa zazwyczaj od 7 do 14 dni. Zebrać wirusa, przenosząc nadsącz do probówek typu Eppendorf.Wirować w mikrocentryfudze przy 3000 rpm przez pięć minut w celu usunięcia szczątków komórkowych. Przenieść supernatant zawierający wirusa do nowych probówek.Przechowywać w temperaturze -80 °C. Wysiać 3 × 10⁴ komórek SCP w 100 µL pożywki DMEM uzupełnionej o 10% surowicy, 2 mM glutaminy, 100 IU/mL penicyliny i 100 IU/mL streptomycyny na każdą studzienkę.W płytce 96-dołkowej inkubować w temperaturze 37°C, w atmosferze 5% dwutlenku węgla. Jeśli następnego dnia komórki osiągną pełną konfluencję, zmienić medium na DMEM z 1% surowicy. W każdym dołku, zawierającym 100 µL, przeprowadzić rozcieńczenie wirusa w następujący sposób.Do czterech zestawów po 10 dołków w płytce 96-dołkowej z okrągłym lub V-kształtnym dnem dodaj 180 µL DMEM z 1% serum na każdy dołek, w celu przeprowadzenia czterokrotnego seryjnego rozcieńczenia dziesięciokrotnego. Do każdego z czterech dołków w pierwszej kolumnie płytki dodaj 20 µL wirusa. Następnie, używając pipety czterokanałowej, wykonaj kilka cykli zasysania i wypuszczania cieczy, aby zapewnić dokładne wymieszanie próbek.Wymień końcówki pipety i przenieś 20 µL do kolejnych czterech studni i tak dalej. Pozostaw ostatnie studnie bez wirusa w celu uzyskania kontroli negatywnej. Dodaj 100 µL rozcieńczenia wirusa do komórek SEP i inkubuj w inkubatorze.37 °C i 5% carbon dioxide. Obserwować pod kątem fluorescencji GFP oraz efektów cytopatycznych przez dwa tygodnie. Efekty cytopatyczne obejmują zaokrąglenie komórek, zmniejszenie ich przejrzystości w porównaniu do normalnych komórek z wypustkami, kończące się pojawieniem się komórek wielojądrzastych oraz śmiercią komórek.Oblicz miano wirusa metodą Reida-Muncha w celu szybkiego monitorowania replikacji wirusa. Zainfekowane komórki można badać za pomocą cytometrii przepływowej z użyciem trypsyny. Wyniki wskazują na około 10⁵ zainfekowanych komórek.Przemyj raz roztworem PBS i RESUSPENDUJ w 500 µL PBS. Dodaj 500 µL 4% roztworu paraformaldehydu (stężenie końcowe 2%) i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Odwiruj komórki przy 3000 rpm przez pięć minut.Przemyć dwukrotnie buforem PBS przez pięć minut i przeanalizować na analizatorze FACS. Policzyć 10 000 zdarzeń. Przedstawiony tutaj klon molekularny mojego wirusa wykazujący ekspresję GFP może być użyteczny do analizy interakcji wirus-gospodarz oraz patogenności mojego neurowirusa, zarówno in vivo, jak i in vitro.Choć nie wykazano, aby mój neurowirus mógł wpływać na ludzkie komórki, ważne jest przestrzeganie wszelkich środków ostrożności dotyczących poziomu bezpieczeństwa biologicznego; zarówno komórki, jak i plazmid można uzyskać z naszego laboratorium. Powodzenia w eksperymentach.

propagating-detecting-an-infectious-molecular-clone-maedi-visna-virus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Propagacja i wykrywanie zakaźnej klonalnej formy molekularnej wirusa Maedi-visna, która ekspresuje zieloną białkową substancję fluorescencyjną

Niniejszy eksperyment w formie wizualizacji jest przewodnikiem po wykorzystaniu fluorescencyjnego klonu molekularnego HIV do eksperymentów z obrazowaniem konfokalnym żywych komórek.

Wizualizacja transferu HIV między komórkami z wykorzystaniem fluorescencyjnych klonów HIV oraz konfokalnej mikroskopii żywych komórek

Opracowaliśmy wektor lentiwirusem, który oprócz LTR reagującego na Tat posiada element odpowiedzi Rev (RRE), umożliwiający regulację ekspresji genu reporterowego w sposób zależny od Tat i Rev HIV-1. Wektor ten pozwala na specyficzne wykrywanie replikującego się HIV w żywych komórkach poprzez ekspresję GFP.

Specyficzne znakowanie komórek zakażonych HIV-1 przy użyciu zależnego od Rev wektora lentiwirusego wykazującego ekspresję zielonego białka fluorescencyjnego

Source: Jamieson, T. R., et al. Detection of SARS-CoV-2 Neutralizing Antibodies using High-Throughput Fluorescent Imaging of Pseudovirus Infection. J. Vis. Exp. (2021)This video demonstrates the procedure for infecting mammalian cells with green fluorescent protein (GFP)-encoding pseudovirus, monitoring viral replication and spread by fluorescence microscopy, and collecting virus-containing supernatant for downstream applications.

Production and Collection of Pseudovirus Particles Using Mammalian Cell Culture

Szybki i modułowy protokół generowania rekombinowanych wirusów krowianki wyrażających fluorescencyjnie znakowane białka jednocześnie przy użyciu metody przejściowej selekcji dominującej jest opisany tutaj.

Metodologia wydajnego wytwarzania znakowanych fluorescencyjnie białek wirusa krowianki

Opisujemy użycie fluorescencyjnego wirusa krowianki reporterowej, który umożliwia pomiar zakaźności wirusa i ekspresji genów w czasie rzeczywistym poprzez specyficzną dla etapu ekspresję spektralnie odrębnych fluoroforów reporterowych. Szczegółowo opisujemy metodę opartą na płytkach do dokładnej identyfikacji etapu, na którym replikacja wirusa jest zaburzona w odpowiedzi na hamowanie małych cząsteczek.

Wirusy reporterowe krowianki do ilościowego określania funkcji wirusa na wszystkich etapach ekspresji genów

Przedstawiono uproszczone podejście do badań przesiewowych pod kątem ekspresji rekombinowanych białek błonowych u Escherichia coli oparte na fuzji z białkiem zielonej fluorescencji.

Badania przesiewowe białek błonowych Escherichia coli oparte na białkach zielonej fluorescencji

Tutaj opisujemy prostą metodę domózgowego i wewnątrznaczyniowego wstrzykiwania cząsteczek wirusa lub fluorescencyjnych mikrogranulek do mózgu noworodka myszy. Wzorzec lokalizacji wirusa i nanocząstek można wykryć za pomocą oceny mikroskopowej lub hybrydyzacji in situ.

Domózgowo-komorowe i wewnątrznaczyniowe wstrzykiwanie cząstek wirusowych i mikrogranulek fluorescencyjnych do mózgu noworodka

Wirusy grypy A (IAV) są zakaźnymi patogenami układu oddechowego, które powodują coroczne epidemie i sporadyczne pandemie. W tym miejscu opisujemy protokół śledzenia infekcji wirusowych in vivo przy użyciu nowej rekombinowanej lucyferazy i bi-reporterowego IAV z ekspresją fluorescencji (BIRFLU). Takie podejście zapewnia naukowcom doskonałe narzędzie do badania IAV in vivo.

Lucyferazy-fluorescencyjny wirus reporterowy grypy do obrazowania na żywo i ilościowego oznaczania infekcji wirusowej

Ten protokół opisuje dynamikę infekcji wirusowych za pomocą rekombinowanego (r)SARS-CoV-2 z ekspresją lucyferazy i fluorescencji oraz systemów obrazowania in vivo (IVIS) u transgenicznych myszy K18 hACE2, aby przezwyciężyć potrzebę wtórnych podejść wymaganych do badania infekcji SARS-CoV-2 in vivo.

Obrazowanie na żywo i kwantyfikacja infekcji wirusowej u myszy transgenicznych K18 hACE2 przy użyciu rekombinowanego SARS-CoV-2 z ekspresją reporterową

Wirusy z pseudotypami (PV) to wiriony z wadami replikacji, które są używane do badania interakcji gospodarz-wirus w bezpieczniejszych warunkach niż obsługa autentycznych wirusów. Przedstawiono szczegółowy protokół, który pokazuje, w jaki sposób PV SARS-CoV-2 mogą być wykorzystywane do testowania zdolności neutralizacyjnej surowicy pacjentów po szczepieniu przeciwko COVID-19.

Wirusy pseudotypowane jako narzędzie molekularne do monitorowania humoralnej odpowiedzi immunologicznej przeciwko SARS-CoV-2 za pomocą testu neutralizacji

Poznaj metodę rozmnażania zakaźnego klonu wirusa Maedi-visna z ekspresją białka GFP w komórkach splotu naczyniówkowego owiec. Technika ta umożliwia wizualizację replikacji wirusa za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i cytometrii przepływowej.

Rozmnażanie i wykrywanie zakaźnego klonu molekularnego wirusa Maedi-visna, który wykazuje ekspresję białka zielonej fluorescencji (Wideo) | JoVE Journal

Propagowanie i wykrywanie zakaźnego klonu molekularnego wirusa maedi-visna wykazującego ekspresję zielonego białka fluorescencyjnego

Przeglądaj więcej filmów