Propagowanie i wykrywanie zakaźnego klonu molekularnego wirusa maedi-visna wykazującego ekspresję zielonego białka fluorescencyjnego

Ogólnym celem niniejszej procedury jest namnażanie i wykrywanie zakaźnego klonu wirusa Mildy vs. No, który wykazuje ekspresję zielonego białka fluorescencyjnego. Zielone białko fluorescencyjne zostało sklonowane do genu kodującego D utp Ace w genomie wirusa Myy Ner.

Klon infekcyjny jest zawarty w dwóch plazmidach. Po pierwsze, dwa plazmidy zawierające sekwencje myy Ner są cięte enzymem restrykcyjnym xpa one, a następnie ligowane. Po drugie, komórki splotu naczyniówkowego owcy są transfektowane otrzymanym konstruktem.

Na koniec, zainfekowane wirusem myy vino komórki są wykrywane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i cytometrii przepływowej. Cześć, jestem Stefano Neron z Instytutu Patologii Eksperymentalnej TER na Uniwersytecie Islandzkim. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę namnażania i wykrywania zakaźnego klonu molekularnego wirusa naczyniowego, który wykazuje ekspresję zielonego białka fluorescencyjnego.

Klon molekularny znajduje się w plazmidach P8XSP5EGFP oraz P67or o wielkości odpowiednio 12 kb i 4,5 kb. Przed transfekcją należy trawić ekvimolarne ilości obu plazmidów, mianowicie 4,4 µg P8XSP5EGFP oraz 1,6 µg P67or za pomocą XPA1, a następnie przeprowadzić ligację. Po zakończeniu ligacji mieszaninę inkubować w temperaturze 65 °C przez 15 minut. Na dwa dni przed transfekcją wysiać 10⁶ komórek SCP do kolby hodowlanej T25 i hodować je przez dwa dni w 5 mL DMEM z dodatkiem 10% surowicy jagnięcej oraz 2 mM glutaminy, bez antybiotyków, aż do uzyskania monowarstwy o 90% konfluencji.

Jeśli po dwóch dniach komórki nie osiągnęły 90% konfluencji, należy pozostawić je do dalszego wzrostu przez jeden dodatkowy dzień. Serum jagnięce można zastąpić płodową surowicą bydlęcą FBS. Rutynowo stosujemy serum jagnięce, ponieważ niektóre szczepy MVV są hamowane przez FBS.

Ten szczep MVV nie jest jednak hamowany przez FBS. Gdy komórki będą gotowe do transfekcji, należy wymienić medium na DMEM z 1% surowicy jagnięcej lub FBS bez antybiotyków. Do transfekcji stosujemy Lipofectamine 2000; DNA rozcieńczamy w 500 µL medium Opti-MEM, a 20 µL Lipofectamine 2000 rozcieńczamy w 500 µL medium Opti-MEM i pozostawiamy w temperaturze pokojowej na pięć minut.

Po pięciominutowej inkubacji połącz rozcieńczone DNA z rozcieńczoną lipofectaminą 2000 do uzyskania całkowitej objętości 1000 µL. Delikatnie wymieszaj i inkubuj przez 20–30 minut. W temperaturze pokojowej dodaj mieszaninę do transfekcji do kolby T 25 zawierającej komórki SCP i mieszaninę pożywki, delikatnie kołysząc naczyniem.

Inkubacja w temperaturze 37 °C i 5% dwutlenku węgla przez noc. Następnego dnia wymienić medium na DMEM z 1% surowicy, 2 mM glutaminy, 100 IU/ml penicyliny oraz 100 IU/ml streptomycyny. Monitorować produkcję GFP w komórkach SCP za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego.

W przypadku tych komórek pierwotnych można spodziewać się niskiej wydajności transfekcji, zazwyczaj od 5% do 15%. Inkubować dalej w temperaturze 37°C, przy 5% CO2 przez kilka dni, aby umożliwić rozprzestrzenienie się wirusa w kolbie. Pełna infekcja trwa zazwyczaj od 7 do 14 dni. Zebrać wirusa, przenosząc nadsącz do probówek typu Eppendorf.

Wirować w mikrocentryfudze przy 3000 rpm przez pięć minut w celu usunięcia szczątków komórkowych. Przenieść supernatant zawierający wirusa do nowych probówek.

Przechowywać w temperaturze -80 °C. Wysiać 3 × 10⁴ komórek SCP w 100 µL pożywki DMEM uzupełnionej o 10% surowicy, 2 mM glutaminy, 100 IU/mL penicyliny i 100 IU/mL streptomycyny na każdą studzienkę.

W płytce 96-dołkowej inkubować w temperaturze 37°C, w atmosferze 5% dwutlenku węgla. Jeśli następnego dnia komórki osiągną pełną konfluencję, zmienić medium na DMEM z 1% surowicy. W każdym dołku, zawierającym 100 µL, przeprowadzić rozcieńczenie wirusa w następujący sposób.

Do czterech zestawów po 10 dołków w płytce 96-dołkowej z okrągłym lub V-kształtnym dnem dodaj 180 µL DMEM z 1% serum na każdy dołek, w celu przeprowadzenia czterokrotnego seryjnego rozcieńczenia dziesięciokrotnego. Do każdego z czterech dołków w pierwszej kolumnie płytki dodaj 20 µL wirusa. Następnie, używając pipety czterokanałowej, wykonaj kilka cykli zasysania i wypuszczania cieczy, aby zapewnić dokładne wymieszanie próbek.

Wymień końcówki pipety i przenieś 20 µL do kolejnych czterech studni i tak dalej. Pozostaw ostatnie studnie bez wirusa w celu uzyskania kontroli negatywnej. Dodaj 100 µL rozcieńczenia wirusa do komórek SEP i inkubuj w inkubatorze.

37 °C i 5% carbon dioxide. Obserwować pod kątem fluorescencji GFP oraz efektów cytopatycznych przez dwa tygodnie. Efekty cytopatyczne obejmują zaokrąglenie komórek, zmniejszenie ich przejrzystości w porównaniu do normalnych komórek z wypustkami, kończące się pojawieniem się komórek wielojądrzastych oraz śmiercią komórek.

Oblicz miano wirusa metodą Reida-Muncha w celu szybkiego monitorowania replikacji wirusa. Zainfekowane komórki można badać za pomocą cytometrii przepływowej z użyciem trypsyny. Wyniki wskazują na około 10⁵ zainfekowanych komórek.

Przemyj raz roztworem PBS i RESUSPENDUJ w 500 µL PBS. Dodaj 500 µL 4% roztworu paraformaldehydu (stężenie końcowe 2%) i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Odwiruj komórki przy 3000 rpm przez pięć minut.

Przemyć dwukrotnie buforem PBS przez pięć minut i przeanalizować na analizatorze FACS. Policzyć 10 000 zdarzeń. Przedstawiony tutaj klon molekularny mojego wirusa wykazujący ekspresję GFP może być użyteczny do analizy interakcji wirus-gospodarz oraz patogenności mojego neurowirusa, zarówno in vivo, jak i in vitro.

Choć nie wykazano, aby mój neurowirus mógł wpływać na ludzkie komórki, ważne jest przestrzeganie wszelkich środków ostrożności dotyczących poziomu bezpieczeństwa biologicznego; zarówno komórki, jak i plazmid można uzyskać z naszego laboratorium. Powodzenia w eksperymentach.