Name: Przygotowanie tkanek i barwienie immunologiczne czuciowych włókien nerwowych myszy unerwiających skórę i kości kończyn (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-26T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: Poznaj metodę immunocytochemiczną identyfikacji włókien nerwowych czuciowych w skórze i kościach kończyn myszy. Technika ta pozwala wizualizować ekspresję białek i wzorce unerwienia tkanek obwodowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy dr. Yuriyowi M. Usachevowi za pomoc w wstępnej standaryzacji mikroskopii konfokalnej i obrazowania immunostainingowych biopsji wycinanych z podeszwy łapy myszy oraz dr Donnie L. Hammond za ciągłą pomoc i konstruktywną krytykę w ramach niniejszej pracy. Praca ta została sfinansowana z grantów NINDS/NIH (NS069898) oraz z grantu Idea Development Grant przyznanego przez Department of Defense Prostate Cancer Research Program (DoD-PCRP-101096) dla D.P.M.

<ol><li>Hoffman, E. M., Schechter, R., Miller, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fixative+Composition+Alters+Distributions+of+Immunoreactivity+for+Glutaminase+and+Two+Markers+of+Nociceptive+Neurons%2C+Nav+1.8+and+TRPV1%2C+in+the+Rat+Dorsal+Root+Ganglion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+%26+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Fixative Composition Alters Distributions of Immunoreactivity for Glutaminase and Two Markers of Nociceptive Neurons, Nav 1.8 and TRPV1, in the Rat Dorsal Root Ganglion.</a> Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 58, 329-344 (2010).</li>
<li>Neves, J. D. S., Omar, N. F., Narvaes, E. A. O., Gomes, J. R., Novaes, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+different+decalcifying+agents+on+EGF+and+EGFR+immunostaining%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Histochemica%22%5BJournal%5D)">Influence of different decalcifying agents on EGF and EGFR immunostaining.</a> Acta Histochemica. 113, 484-488 (2011).</li>
<li>Watson, R. E., Wiegand, S. J., Clough, R. W., Hoffman, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+cryoprotectant+to+maintain+long-term+peptide+immunoreactivity+and+tissue+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">Use of cryoprotectant to maintain long-term peptide immunoreactivity and tissue morphology.</a> Peptides. 7, 155-159 (1986).</li>
<li>Yen, L. D., Bennett, G. J., Ribeiro-da-Silva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sympathetic+sprouting+and+changes+in+nociceptive+sensory+innervation+in+the+glabrous+skin+of+the+rat+hind+paw+following+partial+peripheral+nerve+injury%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Sympathetic sprouting and changes in nociceptive sensory innervation in the glabrous skin of the rat hind paw following partial peripheral nerve injury.</a> The Journal of Comparative Neurology. 495, 679-690 (2006).</li>
<li>Boyette-Davis, J., Xin, W., Zhang, H., Dougherty, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraepidermal+nerve+fiber+loss+corresponds+to+the+development+of+Taxol-induced+hyperalgesia+and+can+be+prevented+by+treatment+with+minocycline%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Intraepidermal nerve fiber loss corresponds to the development of Taxol-induced hyperalgesia and can be prevented by treatment with minocycline.</a> Pain. 152, 308-313 (2011).</li>
<li>Bloom, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+Cancer-Induced+Bone+Remodeling%2C+Skeletal+Pain%2C+and+Sprouting+of+Sensory+Nerve+Fibers%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Pain%22%5BJournal%5D)">Breast Cancer-Induced Bone Remodeling, Skeletal Pain, and Sprouting of Sensory Nerve Fibers.</a> The Journal of Pain. 12, 698-711 (2011).</li>
<li>Constantin, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+Tumor+Necrosis+Factor+%CE%B1+%28TNF%CE%B1%29+Requires+TNF+Receptor+Type+2+to+Generate+Heat+Hyperalgesia+in+a+Mouse+Cancer+Model%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Endogenous Tumor Necrosis Factor α (TNFα) Requires TNF Receptor Type 2 to Generate Heat Hyperalgesia in a Mouse Cancer Model.</a> J. Neurosci. 28, 5072-5081 (2008).</li>
<li>Jankowski, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitization+of+Cutaneous+Nociceptors+after+Nerve+Transection+and+Regeneration%3A+Possible+Role+of+Target-Derived+Neurotrophic+Factor+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Sensitization of Cutaneous Nociceptors after Nerve Transection and Regeneration: Possible Role of Target-Derived Neurotrophic Factor Signaling.</a> The Journal of Neuroscience. 29, 1636-1647 (2009).</li>
<li>Jimenez-Andrade, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathological+Sprouting+of+Adult+Nociceptors+in+Chronic+Prostate+Cancer-Induced+Bone+Pain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Pathological Sprouting of Adult Nociceptors in Chronic Prostate Cancer-Induced Bone Pain.</a> J. Neurosci. 30, 14649-14656 (2010).</li>
<li>Persson, A. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sodium-calcium+exchanger+and+multiple+sodium+channel+isoforms+in+intra-epidermal+nerve+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pain%22%5BJournal%5D)">Sodium-calcium exchanger and multiple sodium channel isoforms in intra-epidermal nerve terminals.</a> Molecular Pain. 6, 84-84 (2010).</li>
<li>Ohshima, M., Miyake, M., Takeda, M., Kamijima, M., Sakamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcal+Enterotoxin+B+Causes+Proliferation+of+Sensory+C-Fibers+and+Subsequent+Enhancement+of+Neurogenic+Inflammation+in+Rat+Skin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Staphylococcal Enterotoxin B Causes Proliferation of Sensory C-Fibers and Subsequent Enhancement of Neurogenic Inflammation in Rat Skin.</a> Journal of Infectious Diseases. 203, 862-869 (2011).</li>
<li>Johnson, M. S., Ryals, J. M., Wright, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+loss+of+peptidergic+intraepidermal+nerve+fibers+in+an+STZ-induced+mouse+model+of+insensate+diabetic+neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Early loss of peptidergic intraepidermal nerve fibers in an STZ-induced mouse model of insensate diabetic neuropathy.</a> Pain. 140, 35-47 (2008).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

W niniejszym materiale szczegółowo opisano metody przygotowania przekrojów skóry i tkanki kostnej myszy do immunobarwienia oraz detekcji obwodowych włókien nerwów czuciowych. Przekroje wykonane z biopsji wycinanych z podeszwy stopy zawierają zarówno skórę gładką, jak i owłosioną, co oznacza, że protokół może być stosowany dla każdego typu skóry. Techniki te mogą być również wykorzystane do barwienia innych typów komórek w tych tkankach (np. leukocytów, śródbłonka naczyniowego, mięśni gładkich i innych). Metody te stanowi...

<table><tbody><tr><td>mikro-wykrojnik Harris 3 mm</td><td>Materiał</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>15094</td><td></td></tr><tr><td>Pompa perfuzyjna</td><td>Materiały</td><td>VWR international</td><td>23609-170</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Odczynnik</td><td>Fisher Scientific</td><td>T353</td><td></td></tr><tr><td>Kwas pikrynowy</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>239801</td><td></td></tr><tr><td>Kompound do zatapiania OCT</td><td>Odczynnik</td><td>Tissue-Tek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>kriogeniczny spray aerozolowy Cyto-Freeze</td><td>Materiały</td><td>Firma Kontrolna</td><td>3118</td><td></td></tr><tr><td>Surowica kozia</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>Kuweta i pokrywka do inkubacji podczas immunobarwienia (duża)</td><td>Materiały</td><td>Research Products International Corp.</td><td>248270 (taca) 248270-A (pokrywa)</td><td></td></tr><tr><td>pisak do tworzenia bariery hydrofobowej ImmEdge</td><td>Materiały</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>Wielbłąd&amp;rsquo;szczoteczki do włosów (grubość nr 1)</td><td>Materiały</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>11859</td><td></td></tr><tr><td>Pro&amp;#8208;Medium montażowe Long Gold</td><td>Odczynnik</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td></td></tr></tbody></table>

przygotowanie tkanek i immunobarwienie włókien nerwów czuciowych myszy unerwiających skórę i kości kończyn

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Sensory Nerve Fibers Innervating Skin and Limb Bones

Detekcja i pierwotne przetwarzanie fizycznych, chemicznych i termicznych bodźców sensorycznych przez obwodowe włókna nerwów sensorycznych są kluczowe dla percepcji zmysłowej u zwierząt i ludzi. Włókna te wykazują ekspresję licznych receptorów i białek kanałów jonowych, które wykrywają i inicjują konkretne bodźce sensoryczne. Dostępne są metody charakteryzacji właściwości elektrycznych obwodowych włókien nerwów sensorycznych unerwiających skórę, które mogą być również wykorzystywane do identyfikacji funkcjonalnej ekspresji specyficznych białek kanałów jonowych w tych włóknach. Jednak podobne metody elektrofizjologiczne nie są dostępne (i są również trudne do opracowania) w celu wykrycia funkcjonalnej ekspresji receptorów i białek kanałów jonowych w obwodowych włóknach nerwów sensorycznych unerwiających inne narządy trzewne, w tym tkanki najtrudniejsze, takie jak kość. Co więcej, takie metody elektrofizjologiczne nie mogą być wykorzystywane do określania ekspresji białek niewzbudzalnych w obwodowych włóknach nerwów sensorycznych. W związku z tym immunobarwienie próbek tkanek obwodowych/trzewnych w celu wykrycia włókien nerwów sensorycznych stanowi najlepszy sposób określenia ekspresji specyficznych białek zainteresowania w tych włóknach nerwowych. Do tej pory większość badań nad ekspresją białek w neuronach sensorycznych wykorzystywała procedury immunobarwienia w zwojach sensorycznych, gdzie informacje ograniczają się do ekspresji specyficznych białek w ciele komórki konkretnych typów lub podzbiorów neuronów sensorycznych. W niniejszym opracowaniu przedstawiamy szczegółowe metody/protokoły przygotowania próbek tkanek obwodowych/trzewnych do immunobarwienia obwodowych włókien nerwów sensorycznych. Szczegółowo opisujemy metody przygotowania biopsji wycinanej (punch biopsy) skóry lub podeszwy stopy oraz skrawków kości (kość udowa) myszy do immunobarwienia obwodowych włókien nerwów sensorycznych. Metody te są nie tylko kluczowe dla jakościowego określenia ekspresji białek w obwodowych neuronach sensorycznych, ale stanowią również ilościową metodę analityczną do określania zmian w poziomach ekspresji białek w konkretnych typach lub podzbiorach włókien sensorycznych, a także do określania zmian morfologicznych i/lub anatomicznych w liczbie i gęstości włókien sensorycznych w różnych stanach patologicznych. Ponadto metody te nie ograniczają się wyłącznie do barwienia włókien nerwów sensorycznych, ale mogą być również stosowane do barwienia dowolnych typów włókien nerwowych w skórze, kościach i innych tkankach trzewnych.

Immunocytochemiczna identyfikacja podtypów włókien obwodowych nerwów czuciowych (oraz wykrywanie ekspresji białek w ich obrębie) jest kluczowa dla zrozumienia molekularnych mechanizmów leżących u podstaw czucia obwodowego. W niniejszej pracy opisujemy metody przygotowania próbek tkanek obwodowych i trzewnych, takich jak skóra i kości kończyn, do specyficznego barwienia immunologicznego obwodowych włókien nerwów czuciowych.

Przygotowanie tkanek i immunobarwienie włókien nerwów czuciowych myszy unerwiających skórę i kości kończyn

Detekcja i pierwotne przetwarzanie fizycznych, chemicznych i termicznych bodźców sensorycznych przez obwodowe włókna nerwów czuciowych są kluczowe dla percepcji sensorycznej w ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest uzyskanie wglądu w organizację anatomiczną, a także profile ekspresji i lokalizacji specyficznych białek w włóknach nerwów obwodowych unerwiających tkanki takie jak skóra i kości. Osiąga się to poprzez przeprowadzenie w pierwszej kolejności perfuzji całego zwierzęcia utrwalaczem, a następnie wycięcie lub usunięcie interesującej tkanki. Następnie wyizolowane tkanki poddawane są dofixowaniu, a kości dekalcyfikacji; przy użyciu kriosztatu przygotowuje się cienkie przekroje tkanki skóry i kości, które następnie osadza się na szkiełkach.Ostatnim krokiem procedury jest wykonanie pojedynczego lub wielokrotnego barwienia immunocytochemicznego tych przekrojów tkankowych przeciwciałami przeciwko białkom, które są specyficznie eksponowane i zlokalizowane w obwodowych włóknach nerwowych. W efekcie można uzyskać wyniki obrazujące wzorzec rozmieszczenia konkretnych typów obwodowych włókien nerwowych, a także wzorzec ekspresji i/lub lokalizacji określonych białek w tych włóknach, wykorzystując mikroskopię immunofluorescencyjną z użyciem mikroskopu epifluorescencyjnego lub konfokalnego. Podejście to może posłużyć do odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące obwodowego układu nerwowego, takie jak: jakie są wzorce innowacji w tkankach takich jak skóra i kość?Podejście to można rozszerzyć na narządy wewnętrzne i inne tkanki. Może ono również dostarczyć informacji o zmianach w ekspresji białek w obrębie tych podzbiorów włókien nerwów sensorycznych oraz o zmianach, które mogą wystąpić w ekspresji tych białek. Podczas procesów patologicznych lub rozwojowych, umieść zwierzę, które zostało poddane perfuzji 4% PFA, na macie do cięcia lub innej stabilnej powierzchni, aby pobrać próbki tkanek z tylnej części stopy.Przytrzymaj stopę powierzchnią podeszwową skierowaną do góry i mocno naciśnij narzędzie do biopsji punch o średnicy 3 mm, ustawione na środku stopy. Obracaj narzędzie do biopsji w przód i w tył o 180 stopni, aby upewnić się, że narzędzie przecięło stopę na całej jej grubości. Ostrożnie wyjmij narzędzie do biopsji ze stopy i umieść pobraną tkankę w sterylnej probówce o pojemności 2 ml zawierającej 1 ml 4% PFA lub roztworu 5% PA, aby w tym przypadku pobrać próbki kości kończyny z kości udowej.Wykonaj nacięcie boczne wzdłuż grzbietu zwierzęcia na poziomie miednicy, prowadząc je następnie w dół wzdłuż obu kończyn tylnych. Przetnij miednicę oraz otaczające mięśnie, aby oddzielić kość udową od miednicy, pozostawiając nienaruszoną bliższą część głowy kości udowej. Następnie wykonaj nacięcie w obrębie kości piszczelowej lub strzałkowej, pozostawiając nienaruszoną część dalszą, i usuń otaczające mięśnie oraz okostną z trzonu kości.Umieść kość udową w probówce o pojemności 2 ml zawierającej 1 ml 4% PFA lub 5% PA, a następnie pozostaw obie próbki do postfiksacji przy łagodnym mieszaniu na wytrząsarce obrotowej przez 16 do 18 godzin w temperaturze 4 °C. Po postfiksacji odwapnij obie próbki, przenosząc je do sterylnych probówek o pojemności 2 ml zawierających 1,5 ml roztworu do odwapniania. Pozostaw wycinek z podeszwy stopy na łagodnym mieszaniu w temperaturze 4 °C przez 16 do 18 godzin, a kość udową przez sześć do siedmiu dni.Wymieniaj roztwór co 24 godziny i po odwapnieniu monitoruj tkankę kostną pod kątem utraty sztywności za pomocą pęsety. Przenieś próbki tkanki do sterylnej probówki o pojemności 2 ml z 1,5 ml roztworu krioprotekcyjnego i umieść probówkę ponownie na wytrząsacu w celu łagodnego mieszania przez 16 do 18 godzin w temperaturze 4 °C. Aby przygotować tkankę do cięcia, nałóż warstwę OCT (optimal cutting temperature compound) na blok montażowy do kriosztatu i pozostaw do zamrożenia w komorze kriosztatu w temperaturze -20 °C.W razie potrzeby rozpylić na OCT aerozol kriogeniczny, aby przyspieszyć proces zamrażania. W przypadku tkanki pobranej wycinkiem z podeszwy stopy umieścić preparat tkankowy na warstwie OCT. W przypadku tkanki kostnej ułożyć preparaty w taki sposób, aby można było uzyskać jednorodne przekroje poprzeczne.Upozycjonuj preparat tak, aby uzyskać przekroje wzdłużne względem osi kości. Przykryj oba preparaty dodatkową cienką warstwą OCT. Następnie delikatnie rozpylaj aerozol kriogeniczny, aż do zamrożenia tkanki.Umieść preparat na głowicy tnącej w komorze kriotomatu i pozwól blokowi tkankowemu wyrównać temperaturę do temperatury cięcia przez co najmniej jedną godzinę, aby uniknąć kruchości przekrojów. Gdy tkanka osiągnie optymalną temperaturę, rozpocznij cięcie preparatu, aby uzyskać przekroje o grubości 40 micron dla tkanki pobranej za pomocą biopsji wycinającej z podeszwy stopy. Zbierz przekroje kriotomiczne do 12-dołkowych płytek hodowlanych zawierających 0,1 molar PB z 10 millimolar azotkiem sodu.Upewnij się, że skrawki pozostają zanurzone i przechowuj je w temperaturze 4 °C do momentu przeprowadzenia immunobarwienia tkanki kostnej. Zbierz krio-skrawki bezpośrednio na preparaty z wcześniej naniesioną żelatyną, a następnie pozostaw do wyschnięcia na powietrzu przez jedną godzinę przed przechowywaniem w temperaturze -20 °C. Skrawki kości na preparatach przechowywanych w ten sposób mogą być wykorzystywane do immunobarwienia w ciągu dwóch do trzech miesięcy.Za pomocą żyletki odciąć od sześciu do siedmiu milimetrów z końca końcówki mikrodozownika o pojemności 1 ml. Przygotować wnętrze końcówki, aspirując kilkakrotnie 1% płodową surowicę bydlęcą w 0,1 molarnym PB, aby zapobiec przywieraniu przekrojów tkanki do ścianek końcówki. Przenieść od ośmiu do 10 wycinków z podeszwy stopy do każdej studni 24-dołkowej płytki hodowlanej. Następnie przemyć je trzykrotnie 500 mikrolitrami 0,1 molarnego PB na studnię przez pięć minut, intensywnie mieszając na wstrząsarce w temperaturze pokojowej.Następnie inkubuj skrawki w roztworze blokującym przy delikatnym mieszaniu przez jedną godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza, a następnie przejdź do inkubacji z przeciwciałami pierwotnymi i wtórnymi. Po końcowym przemyciu w pb użyj świeżej, potraktowanej FBS przyciętej mikro pipety, aby przenieść skrawki na szkiełka. Ułóż skrawki za pomocą pędzla i wchłoń nadmiar wilgoci, unikając ekspozycji na światło.Inkubować preparaty w temperaturze pokojowej od 5 do 30 minut, aż przekroje wyschną na powierzchni. Po wyschnięciu nanieść powoli kilka kropli medium montażowego. Na przekroje położyć szklane szkiełko cover slip.Pozostaw preparaty w ciemności przez pięć minut, a następnie zabezpiecz krawędzie szkiełka nakrywki przezroczystym lakierem do paznokci. Przed obrazowaniem, po rozmrożeniu preparatów w temperaturze pokojowej, użyj hydrofobowego pisaka do barier, aby obrysować obszar na szkiełku zawierający przekroje kości, a następnie pozostaw do wyschnięcia na powietrzu przez 10 do 15 minut. Używając pipety, nanieś 250 µL 0,1 M PB w obrębie wyznaczonego obszaru i płucz przekroje kości przez pięć minut.Odlać PBS, przechylając szkiełko, i powtórzyć tę czynność jeszcze dwukrotnie. Następnie nałożyć 250 µL roztworu blokującego i inkubować skrawki przez jedną godzinę w temperaturze 4 °C. Po blokowaniu przejść do inkubacji z przeciwciałami pierwotnymi i wtórnymi, pamiętając o przechowywaniu szkiełek w komorze nawilżanej podczas inkubacji nocnej.Na koniec przemyj preparaty 500 µL 0,05 M PB przez 15 minut. W temperaturze pokojowej zanurz krótko slajdy w destylowanej wodzie dejonizowanej w celu ich opłukania, a następnie pozostaw skrawki kostne do wyschnięcia na powietrzu w temperaturze pokojowej od 5 do 30 minut, unikając długotrwałej ekspozycji na światło. Nałóż medium montażowe i nałóż szkiełko cover slip na skrawki po pozostawieniu slajdów w ciemności przez pięć minut.Krawędzie szkiełka nakrywki uszczelniono lakierem do paznokci, a następnie przeprowadzono badanie za pomocą mikroskopii epi-fluorescencyjnej. Widoczne są liczne włókna pozytywne pod kątem CGRP i NF 200 jako czerwone obszary rozproszone w błonach podstawnych w połączeniu skórno-naskórkowym w okolicy podeszwowej, które zostały zabarwione przeciwciałem przeciwko kolagenowi IV na zielono; włókna pozytywne pod kątem CGRP i NF 200 w okolicy podeszwowej są również widoczne w mikroskopii konfokalnej, ponownie zaznaczone na czerwono za pomocą grotów strzałek. Pan-neuronalny marker beta-III tubulina wykazuje szeroką ekspresję w okolicy podeszwowej.Barwienie TRPV1 ogranicza się głównie do włókien o małej średnicy, które są jednocześnie dodatnie dla CGRP; zarówno włókna dodatnie dla CGRP, jak i NF200 można wykryć w tkance kostnej kończyn, co pokazano tutaj w kolorze czerwonym przy użyciu mikroskopii epifluorescencyjnej i konfokalnej, gdzie są one rozmieszczone w całej macierzy kostnej w obszarze gąbczastym głowy kości udowej myszy. TRPV1 jest również obecne w tkance kostnej kończyn, pokazanej tutaj na czerwono przy użyciu mikroskopii konfokalnej, i kolokalizuje z przeciwciałem anty-CGRP w kolorze zielonym.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać wiedzę na temat tego, jak uzyskać wgląd w cechy anatomiczne obwodowej innowacji sensorycznej w tkankach takich jak skóra i kość, a także w ekspresję i lokalizację różnych białek w tych włóknach nerwów sensorycznych. Cały proces, od sekcji do analizy mikroskopowej, powinien zająć około czterech dni w przypadku skóry i 11 dni w przypadku tkanki kostnej.

tissue-preparation-immunostaining-mouse-sensory-nerve-fibers

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Przygotowanie tkanki i immunobarwienie mysich włókien nerwowych zmysłowych unerwiających skórę i kości kończyn

Ten film pokazuje immunohistochemiczne barwienie włókien cholinergicznych w jądrze podstawnym regionu Meynerta w sekcjach mózgu myszy. Skrawki są blokowane i leczone pierwotną przeciwko acetylotransferazie choliny, a następnie biotynylowanym przeciwciałom drugorzędowym. Dodaje się kompleksy awidyna-biotyna-peroksydaza, które wiążą się z przeciwciałami drugorzędowymi, a następnie z substratem chromogennym. Skrawki są następnie odwadniane i montowane przed wizualizacją pod mikroskopem.

Immunohistochemiczne barwienie włókien nerwowych w jądrze podstawnym Meynera mózgu myszy

Źródło: Boyer, N. P. et. al., Obrazowanie i analiza transportu neurofilamentów w wyciętym nerwie piszczelowym myszy. J. Vis. exp. (2020) Ten film przedstawia metodę fotoaktywacji fluorescencji do analizy transport neurofilamentów w mielinowanych aksonach nerwów obwodowych. Śledząc fotoaktywowane zielone neurofilamenty znakowane fluoroforem, technika ta dostarcza informacji na temat transportu aksonalnego w chorobach neurodegeneracyjnych.

Obrazowanie fotoaktywacji fluorescencyjnej transportu neurofilamentów w mielinizowanych aksonach myszy 

Przedstawiono protokół dynamicznego obrazowania podłużnego i selektywnego laserowego uszkadzania zakończeń nerwowych u reporterowych myszy transgenicznych.

In vivo (in vivo) Mikroskopia dwufotonowa pojedynczych zakończeń nerwowych w skórze

Neurony czuciowe mięśni są zaangażowane w sygnalizację proprioceptorową, a także informują o stanie metabolicznym i zdarzeniach związanych z urazami. Opisujemy preparat mięśniowo-nerwowy dorosłej myszy in vitro do badań nad mięśniami aferentnymi aktywowanymi rozciąganiem.

Preparat mięśniowo-nerwowy dorosłej myszy in vitro do badania właściwości wypalania aferentów mięśniowych

Tutaj opisujemy nowatorskie przygotowanie do obrazowania żywych lancetowatych końcówek czuciowych końcówek palisadowych, które unerwiają mieszki włosowe skóry uszu myszy podczas barwienia i odbarwiania barwnikami styrylowo-pirydyniowymi.

Monitorowanie optyczne znakowania żywych zakończeń nerwowych w lancetowatych zakończeniach mieszków włosowych skóry ucha myszy ex vivo

Ten artykuł zawiera szczegółowe protokoły genetycznego znakowania skóry myszy, chirurgicznego odnerwienia, biopsji skóry i wizualizacji oznakowanego nabłonka za pomocą barwienia β-galaktozydazą metodą całego montażu. Metody te można wykorzystać do badania zapotrzebowania na nerwy w mysich modelach normalnej i patologicznej skóry.

Chirurgiczne unerwienie skóry: metoda badania zapotrzebowania na nerwy w mysich modelach choroby skóry

To badanie ustanawia eksperymentalny model czystej neuropatii małych włókien z resiniferatoksyną (RTX). Unikalna dawka RTX (50 μg/kg) jest optymalna do opracowania modelu neuropatii małowłóknistych, który naśladuje charakterystykę pacjenta i może pomóc w zbadaniu nocyceptywnego znaczenia molekularnego leżącego u podstaw bólu neuropatycznego.

Ustalenie mysiego modelu czystej neuropatii drobnowłóknistej z ultrasilnym agonistą przejściowego potencjału receptora waniloidowego typu 1

Tutaj prezentujemy protokół do wizualizacji drobnych struktur nerwów obwodowych poprzez uzyskanie i barwienie odcinków 1-2 μm błękitem...

Barwienie błękitem toluidynowym skrawków zatopionych w żywicy w celu oceny morfologii nerwów obwodowych

Opisujemy metody fotoaktywacji fluorescencji do analizy transportu aksonalnego neurofilamentów w pojedynczych mielinizowanych aksonach nerwów obwodowych od transgenicznych myszy, które wyrażają fotoaktywowane białko neurofilamentu.

Obrazowanie i analiza transportu neurofilamentów w wyciętym nerwie piszczelowym myszy

Grubość skrawków tkanek ograniczała badanie morfologiczne unerwienia skóry. Niniejszy protokół opisuje unikalną technikę oczyszczania tkanek w celu wizualizacji włókien nerwowych skóry w grubych skrawkach tkanki o grubości 300 μm pod mikroskopią konfokalną.

Demonstrowanie owłosionego i nagiego unerwienia skóry we wzorze 3D przy użyciu wielu metod barwienia fluorescencyjnego i oczyszczania tkanek

Ten manuskrypt przedstawia protokół chirurgicznego usuwania zazwojowych neuronów współczulnych odcinka lędźwiowego u myszy. Procedura ta ułatwi wiele badań mających na celu zbadanie roli unerwienia współczulnego w dystalnych celach tkankowych.

Chirurgiczna sympatektomia lędźwiowa u myszy

Poznaj metodę immunocytochemiczną identyfikacji włókien nerwowych czuciowych w skórze i kościach kończyn myszy. Technika ta pozwala wizualizować ekspresję białek i wzorce unerwienia tkanek obwodowych.

Przygotowanie tkanek i immunobarwienie włókien nerwów czuciowych myszy unerwiających skórę i kości kończyn

Przeglądaj więcej filmów