Przygotowanie tkanek i barwienie immunologiczne czuciowych włókien nerwowych myszy unerwiających skórę i kości kończyn

Ogólnym celem tej procedury jest uzyskanie wglądu w organizację anatomiczną, a także profile ekspresji i lokalizacji określonych białek w obwodowych włóknach nerwowych, które unerwiają tkanki, takie jak skóra i kości. Osiąga się to poprzez wykonanie najpierw perfuzji całego zwierzęcia za pomocą utrwalacza, a następnie wycięcie lub usunięcie tkanki będącej przedmiotem zainteresowania. Następnie izolowane tkanki są postfiksowane, a kości są odwapniane za pomocą kriostatu, generowane są drobne skrawki skóry i tkanki kostnej, które są montowane na szkiełkach.

Ostatnim etapem procedury jest wykonanie jedno- lub wieloznakowego barwienia immunologicznego tych skrawków tkanek przeciwciałami przeciwko białkom, które uległy ekspresji i lokalizacji na obwodowych włóknach nerwowych. Ostatecznie można uzyskać wyniki, które pokazują wzorzec dystrybucji określonych typów obwodowych włókien nerwowych, a także wzorzec ekspresji i/lub lokalizacji określonych białek w obwodowych włóknach nerwowych za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej przy użyciu mikroskopu epifluorescencyjnego lub konfokalnego. Podejście to można wykorzystać do udzielenia odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące obwodowego układu nerwowego, takie jak: jakie są wzorce innowacji w tkankach takich jak skóra i kości?

Podejście to można rozszerzyć na narządy trzewne i inne tkanki. Może również powiedzieć nam o zmianach w ekspresji białek w tych podzbiorach czuciowych włókien nerwowych oraz o zmianach, które mogą wystąpić w ekspresji tych białek. Podczas procesów patologicznych lub rozwojowych należy umieścić zwierzę, które zostało przekrwione 4% PFA, na macie do cięcia lub innej stabilnej powierzchni, aby pobrać próbki tkanek z tylnej łapy.

Przytrzymaj stopę powierzchnią podeszwową skierowaną do góry i mocno dociśnij trzymilimetrowym narzędziem do biopsji umieszczonym na środku stopy. Obróć narzędzie do biopsji do przodu i do tyłu o 180 stopni, aby upewnić się, że narzędzie do biopsji przecięło całą stopę. Delikatnie wyjmij narzędzie do biopsji ze stopy i wyrzuć tkankę do sterylnej dwumililitrowej probówki zawierającej jeden mililitr 4% roztworu PFA lub 5% PA, aby pobrać próbki kości kończyny, w tym przypadku z kości udowej.

Wykonaj boczne nacięcie wzdłuż grzbietu zwierzęcia na poziomie miednicy, które może być kontynuowane w dół wzdłuż obu tylnych kończyn. Wciąć w miednicę i otaczający mięsień, aby oddzielić kość udową od miednicy, pozostawiając nienaruszoną bliższą głowę kości udowej. Następnie naciąć kość piszczelową lub strzałkową, aby pozostawić nienaruszoną dystalną głowę i usunąć otaczający mięsień i okostną z trzonu kostnego.

Umieść kość udową w dwumililitrowej probówce zawierającej jeden mililitr 4% roztworu PFA lub 5% PA, a następnie pozwól obu próbkom na utrwalenie z delikatnym mieszaniem na kołysce przez 16 do 18 godzin w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po utrwaleniu odwapnić obie próbki, przenosząc je do sterylnych dwumililitrowych probówek zawierających 1,5 mililitra roztworu odwapniającego. Pozwól ciosowi podeszwowemu delikatnie kołysać się w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 16 do 18 godzin, a kości udowej przez sześć do siedmiu dni.

Zmieniaj roztwór co 24 godziny i monitoruj tkankę kostną pod kątem utraty sztywności za pomocą kleszczy po odwapnieniu. Przenieś próbki tkanek do sterylnej dwumililitrowej probówki z 1,5 mililitra roztworu krioprotektantu i umieść probówkę z powrotem na kołysce na 16 do 18 godzin delikatnego mieszania w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Aby przygotować tkankę do cięcia, umieść złoże związku o optymalnej temperaturze cięcia na bloku montażowym tkanek kriostatu i pozostaw do zamrożenia w komorze kriostatu w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza.

W razie potrzeby spryskaj OCT aerozolem kriogenicznym, aby przyspieszyć proces zamrażania. Umieść próbkę tkanki na łóżku OCT dla tkanki dziurkowania podeszwowego. Ustawić próbki tak, aby można było uzyskać jednolite przekroje poprzeczne tkanki kostnej.

Ustaw próbkę tak, aby uzyskać odcinki biegnące wzdłużnie do długości kości. Przykryj obie próbki dodatkową cienką warstwą OCT. Następnie delikatnie spryskaj aerozolem kriogenicznym, aż tkanka zostanie zamrożona.

Umieścić próbkę na głowicy tnącej w komorze kriostatu i pozwolić, aby blok próbki tkanki zrównoważył się z temperaturą cięcia przez co najmniej jedną godzinę, aby uniknąć kruchych odcinków. Gdy tkanka osiągnie optymalną temperaturę, rozpocznij cięcie próbki, aby wygenerować skrawki o grubości 40 mikronów dla tkanki dziurkowania podeszwy. Zebrać skrawki kriogeniczne na 12-dołkowych płytkach do hodowli tkankowych zawierających 0,1 mola PB z 10 milimolowym azydkiem sodu.

Upewnij się, że skrawki pozostają zanurzone i przechowuj je w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aż będą gotowe do barwienia immunologicznego tkanki kostnej. Zbierz skrawki kriogeniczne bezpośrednio na wstępnie zakodowane szkiełka żelatynowe, a następnie pozostaw je do wyschnięcia na powietrzu przez godzinę przed przechowywaniem w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Skrawki kostne na tak przechowywanych szkiełkach mogą być wykorzystane do celów barwienia immunologicznego w ciągu dwóch do trzech miesięcy.

Za pomocą żyletki wytnij od sześciu do siedmiu milimetrów od końca jednomililitrowej końcówki mikropipety, przygotuj wnętrze końcówki, kilkakrotnie odsysając 1% płodową surowicę bydlęcą w 0,1 molowym PB, aby sekcje tkanki nie przyklejały się do ścianek końcówki. Przenieś od ośmiu do 10 sekcji stempla podeszwowego do każdej studzienki 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej. Następnie umyj je trzykrotnie 500 mikrolitrami 0,1 mola PB na studzienkę przez pięć minut z energicznym mieszaniem na bujaczku w temperaturze pokojowej.

Następnie inkubować skrawki w roztworze blokującym, delikatnie mieszając przez godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza, a następnie kontynuować inkubację przeciwciał pierwszorzędowych i wtórnych. Po końcowym umyciu w pb użyj świeżej, przyciętej mikropipety nasączonej FBS, aby przenieść sekcje na szkiełka. Ułóż sekcje pędzlem i wchłonij nadmiar wilgoci, unikając ekspozycji na światło.

Inkubować szkiełka w temperaturze pokojowej, aby wysuszyć skrawki na powierzchni przez pięć do 30 minut. Po wyschnięciu nałóż kilka kropli podłoża montażowego i powoli. Umieść szklaną szkiełko nakrywkowe na sekcjach.

Pozostaw szkiełka w ciemności przez pięć minut, a następnie uszczelnij krawędzie szkiełka nakrywkowego przezroczystym lakierem do paznokci Przed obrazowaniem po rozmrożeniu szkiełek w temperaturze pokojowej użyj hydrofobowego pisaka barierowego, aby oznaczyć obszar na szkiełku zawierającym sekcje kostne, a następnie wysusz na powietrzu przez 10 do 15 minut. Za pomocą pipety. Nałóż 250 mikrolitrów 0,1 mola PB w okolicy i myj skrawki kości przez pięć minut.

Opróżnij PB, przechylając szkiełko i powtórz jeszcze dwa razy. Następnie nałóż 250 mikrolitrów roztworu blokującego i inkubuj skrawki przez godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po zablokowaniu przejdź do inkubacji przeciwciał pierwotnych i wtórnych, upewniając się, że szkiełka są przechowywane w wilgotnej komorze do inkubacji przez noc.

Na koniec myć 500 mikrolitrami 0,05 molowego PB przez 15 minut. W temperaturze pokojowej zanurz na krótko w destylowanej wodzie dejonizowanej, aby wypłukać szkiełka, a następnie pozostaw skrawki kości do wyschnięcia na powietrzu w temperaturze pokojowej przez pięć do 30 minut, unikając długotrwałej ekspozycji na światło. Nałożyć podłoże montażowe i umieścić szklaną szkiełko nakrywkowe na sekcjach Po pozostawieniu szkiełek w ciemności na pięć minut.

Uszczelnij krawędzie szkiełka nakrywkowego lakierem do paznokci za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej epi. Liczne włókna dodatnie CGRP i NF 200 są tutaj widoczne jako czerwone obszary rozmieszczone w błonach podstawnych na skrzyżowaniu naskórka w okolicy podeszwowej, które zostały zabarwione antykolagenem cztery na zielono, zarówno CGRP, jak i NF 200 dodatnie włókna w okolicy podeszwowej są również widoczne za pomocą mikroskopii konfokalnej pokazanej ponownie na czerwono, jak wskazują groty strzałek. Podczas gdy marker neuronalny beta trzy tubulina ulega szerokiej ekspresji w okolicy podeszwowej.

Barwienie TRP V one ogranicza się głównie do włókien o małej średnicy, które są również CG RRP dodatnie, zarówno włókna CGRP, jak i NF 200 dodatnie można wykryć w tkance kostnej kończyny, jak pokazano tutaj rozmieszczone w całej macierzy kostnej w gąbczastym obszarze głowy kości udowej myszy na czerwono przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej i konfokalnej epi. T RRP V jeden występuje również w kończynie. Tkanka kostna pokazana tutaj na czerwono przy użyciu mikroskopii konfokalnej i współlokalizuje się z anty CGRP na zielono.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, w jaki sposób uzyskać wgląd w anatomiczne cechy innowacji w zakresie czucia obwodowego w tkankach takich jak skóra i kości, a także ekspresję i lokalizację różnych białek w tych czuciowych włóknach nerwowych. Cały proces od sekcji do analizy mikroskopowej powinien trwać około czterech dni w przypadku skóry i 11 dni w przypadku tkanki kostnej.