Name: Wizualizacja sygnalizacji naczyniowej Ca2+ wyzwalanej przez ROS pochodzące z parafiny (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: Poznaj metodę wizualizacji sygnalizacji wapniowej w komórkach śródbłonka wywołanej przez ROS pochodzące z makrofagów. Wykorzystuje się współkulturę, barwniki wrażliwe na utlenianie oraz czujniki fluorescencyjne do obserwacji w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Praca ta była wspierana przez granty National Institutes of Health (R01 HL086699, HL086699-01A2S1, 1S10RR027327-01) przyznane dla MM. Nasz artykuł został częściowo wsparty przez Carl Zeiss Microimaging LLC.

Poziom reaktywnych form tlenu w żywych komórkach można zmierzyć za pomocą barwników wrażliwych na utlenianie (1 i 2) lub czujników plazmidowych (3 i 4) przy użyciu mikroskopii konfokalnej.
1. Wizualizacja wewnątrzkomórkowych ROS w komórkach J774
<ol>
	<li>Hodować makrofagi pochodzące z monocytów mysich J774.1 (106 komórek/ml) na szalkach 35-mm z szklanym dnem (Harvard Apparatus) przez 48 h. </li>
	<li>Stymulować komórki agonistami TLR (2 μg/ml, kwas lipoteichowy – agonista TLR2; 10μg/ml, Poly (I:C) – agonista TLR3; 1 μg/ml LPS – agonista TLR4) przez 6 h w temperaturze 37°C. 
	Uwaga: Makrofagi traktowane w podobnych warunkach zostały wykorzystane do mobilizacji Ca2+ w modelu kokultury.</li>
	<li>Do szalek z ECM (pożywka zewnątrzkomórkowa: 121 mM NaCl, 5 mM NaHCO3, 10 mM Na-HEPES, 4.7 mM KCl, 1.2 mM KH2PO4, 1.2 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 10 mM glukoza i 2.0% dekstran, pH 7.4; wszystkie odczynniki otrzymane od Sigma) zawierającej 2%BSA dodać barwnik wrażliwy na utlenianie H2DCF-DA (Invitrogen) do uzyskania stężenia końcowego 10 μM i inkubować komórki przez 20 min przed wizualizacją pod mikroskopem konfokalnym. </li>
	<li>Po obciążeniu barwnikiem wizualizować komórki umieszczone na stoliku z kontrolą temperatury odpowiedniego systemu obrazowania. Używamy konfokalnego systemu obrazowania Carl Zeiss LSM 510 Meta sprzężonego z argonowym laserem jonowym przy pobudzeniu 488 nm dla fluorescencji DCF, stosując obiektyw olejowy 40x13 (Ryc. 1A i D).</li>
	<li>Analizować obrazy za pomocą oprogramowania ImageJ (1.44), dostępnego bezpłatnie z National Institutes of Health (Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/">http://rsb.info.nih.gov/ij/</a>, 1997-2009).</li>
</ol>
2. Wizualizacja mROS w komórkach J774
<ol>
	<li>Hodować makrofagi pochodzące z monocytów mysich linii J774.1 (106 komórek/ml) na szalkach 35-mm z szklanym dnem (Harvard Apparatus) przez 48 h. </li>
	<li>Stymulować komórki ligandami TLR w celu indukcji produkcji mROS (2 μg/ml kwasu lipoteichowego-TLR2; 10 μg/ml Poly (I:C)-TLR3; 1 μg/ml LPS-TLR4) przez 6 h w temperaturze 37°C. </li>
	<li>Do szalek dodać wskaźnik anionorodnika ponadtlenkowego mitochondrialnego MitoSOX Red (Invitrogen), aby uzyskać stężenie końcowe 5 μM w ECM zawierającym 2%BSA, a następnie inkubować komórki przez 30 min w temperaturze 37°C w celu załadowania MitoSOX Red. </li>
	<li>Po załadowaniu barwnika wizualizować komórki na stoliku z kontrolą temperatury systemu obrazowania konfokalnego Carl Zeiss LSM 510 Meta z Argonowym laserem jonowym przy wzbudzeniu 561 nm dla fluorescencji MitoSOX Red, używając obiektywu olejowego 40x (Ryc. 1B i E).</li>
	<li>W eksperymentach kontrolnych, po załadowaniu barwnika, dodać do komórek PBS lub DMSO (kontrola negatywna) bądź 2 μM Antomycyny A (jako generatora anionorodnika ponadtlenkowego mitochondrialnego – kontrola pozytywna) przed obrazowaniem próbki zgodnie z opisem w punkcie 2.4 (Ryc. 1C).</li>
	<li>Analizować obrazy przy użyciu oprogramowania ImageJ (1.44).</li>
</ol>
3. Wizualizacja cytozolowych ROS w stabilnych liniach HyPer-cyto MPMVECs
<ol>
	<li>Używamy pHyPer-cyto (Evrogen), ssaczego wektora ekspresyjnego kodującego fluorescencyjny sensor HyPer, który lokalizuje się w cytoplazmie i specyficznie wykrywa submikromolarne stężenia H2O214.</li>
	<li>Transfekujemy mysie komórki śródbłonka mikrokrążenia płucnego (MPMVECs) wektorem pHyPer-cyto, wykorzystując elektroporację lub odczynniki do transfekcji. Używamy 10 x 106 komórek i przeprowadzamy transfekcję 10μg pHyPer-cyto poprzez elektroporację przy użyciu systemu elektroporatora BioRad Gene pulser (250V; 500 μF). Hodujemy MPMVECs w pożywce DMEM uzupełnionej o 10% FBS, niezasadnicze aminokwasy, dodatek wzrostowy dla komórek śródbłonka oraz antybiotyki. 
	Uwaga: Po transfekcji wysiewamy komórki przy niskiej gęstości, aby ułatwić wzrost kolonii.</li>
	<li>48 godzin po transfekcji wymieniamy pożywkę na pełną pożywkę hodowlaną uzupełnioną o 500 μg/ml G418. Przesiewamy klony o najwyższym procencie komórek pozytywnych pod kątem HyPer i pasażujemy klony pozytywne, aby zwiększyć liczbę komórek wykazujących ekspresję HyPer (Rys. 2). 
	Uwaga: Do klonalnej selekcji pojedynczych komórek stosujemy seryjne rozcieńczanie komórek i przesiewamy stabilne linie komórkowe o wysokiej ekspresji HyPer.</li>
	<li>Hodujemy stabilne linie MPMVECs z HyPer-cyto na szkiełkach podstawkowych pokrytych 0,2% żelatyną (80% konfluencji). Następnego dnia poddajemy komórki stymulacji ligandami TLR (2 μg/ml kwasu lipoteichowego-TLR2; 10μg/ml Poly (I:C)-TLR3; 1 μg/ml LPS-TLR4) przez 6 h w 37°C. Komórki niepoddane działaniu ligandów służą jako kontrola.</li>
	<li>Po zakończeniu inkubacji montujemy szkiełka w komorze do komórek Attofluor (Invitrogen). Do komory dodajemy 1ml uprzednio ogrzanego zrównoważonego roztworu soli Hanksa (HBSS) i umieszczamy komorę na stoliku z kontrolą temperatury konfokalnego systemu obrazowania Carl Zeiss LSM 510 Meta. Wizualizujemy i rejestrujemy zmiany fluorescencji przy pobudzeniu 488 nm, korzystając z obiektywu olejowego 40x (Rys. 3A i D).</li>
	<li>Obrazy analizujemy przy użyciu oprogramowania ImageJ (1.44) (patrz sekcja 6).</li>
</ol>
4. Wizualizacja mitochondrialnych ROS w stabilnych MPMVECach HyPer-dMito
<ol>
	<li>Używamy pHyPer-dMito (Evrogen), wektora ekspresyjnego dla ssaków kodującego ukierunkowany na mitochondria sensor HyPer, który lokalizuje się w mitochondriach i specyficznie wykrywa submikromolarne stężenia H2O2.</li>
	<li>Transfekujemy MPMVECs wektorem pHyPer-dMito i generujemy stabilne linie HyPer-dMito MPMVECs zgodnie z krokami opisanymi w sekcjach 3.2-3.3.</li>
	<li>Hodujemy stabilne HyPer-dMito MPMVECs na szkiełkach podstawowych pokrytych 0,2% żelatyną (do osiągnięcia 80% konfluencji).</li>
	<li>Następnego dnia poddajemy komórki działaniu ligandów TLR (2 μg/ml kwasu lipoteichowego-TLR2; 10μg/ml Poly (I:C)-TLR3; 1 μg/ml LPS-TLR4) przez 6 h w 37°C. Komórki niepoddane działaniu ligandów służą jako kontrola negatywna. Przed wizualizacją próbki dodajemy 2μM antymycyny A (induktor nadtlenku dwutlenku siarki mitochondrialnego – kontrola pozytywna).</li>
	<li>Po zakończeniu inkubacji montujemy szkiełka podstawowe w komorze do komórek Attofluor (Invitrogen). Do komory dodajemy 1ml uprzednio ogrzanego zrównoważonego roztworu soli Hanksa (HBSS), a następnie umieszczamy komorę na stoliku z kontrolą temperatury systemu obrazowania konfokalnego Carl Zeiss LSM 510 Meta. Obserwujemy i obrazujemy zmiany fluorescencji przy pobudzeniu 488 nm, korzystając z obiektywu olejowego 40x (Rys. 3B, C i E).</li>
	<li>Analizujemy obrazy przy użyciu oprogramowania ImageJ (1.44) (patrz sekcja 6).</li>
</ol>
5. Model kokultury do wizualizacji sygnalizacji Ca2+ w komórkach śródbłonka wywołanej przez ROS pochodzenia parakrynnego
Do wizualizacji i pomiaru zmian [Ca2+]i stosujemy fluorescencyjny barwnik wrażliwy na Ca2+ fluo-4 AM (Invitrogen).
<ol>
	<li>Hodować MPMVEC na szklanych lamellkach o średnicy 25 mm pokrytych 0,2% żelatyną (do osiągnięcia 80% konfluencji).</li>
	<li>Komórki wyhodowane na lamellkach inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 min w ECM zawierającym 2% BSA i 0,003% kwasu pluronicznego z końcową stężeniem 5 μM fluo-4 AM (Invitrogen), aby umożliwić obciążenie fluo-4 AM. Po obciążeniu przemyć komórki eksperymentalnym roztworem obrazującym (ECM zawierający 0,25% BSA) z dodatkiem sulfinpyrazonu w celu zminimalizowania utraty barwnika.</li>
	<li>Po obciążeniu fluo-4 zamocować lamellki w komorze do komórek Attofluor (Invitrogen). Do komory dodać 800 μl uprzednio ogrzanego eksperymentalnego roztworu obrazującego i umieścić ją na stole z kontrolą temperatury systemu obrazowania konfokalnego Carl Zeiss LSM 510 Meta.</li>
	<li>W oddzielnej probówce oznakować nieaktywowane lub aktywowane makrofagi wyizolowane z myszy typu dzikiego lub gp91phox-/- (traktowane LPS przez 6 hr) za pomocą cell tracker red CMTPX (500 ng/ml) (Invitrogen) w ECM zawierającym 2% BSA i 0,003% kwasu pluronicznego. Przemyć i resuspendować komórki w 200 μl eksperymentalnego roztworu obrazującego.</li>
	<li>Dodać oznakowane makrofagi do obciążonych fluo-4 AM komórek MPMVEC w zmontowanej komorze.</li>
	<li>Rejestrować fluorescencję zieloną i czerwoną co 3 s przez 10-20 min przy użyciu systemu obrazowania konfokalnego Carl Zeiss LSM510 Meta z argonowym laserem jonowym z wzbudzeniem odpowiednio przy 488 i 561 nm dla fluo-4 AM i fluorescencji cell tracker red (Rys. 4 A-C). 
	Uwaga: Alternatywnie, do wywołania mobilizacji Ca2+ w MPMVEC można użyć linii komórkowej J774.1.</li>
	<li>Analizować zmiany intensywności fluorescencji fluo-4 przy użyciu oprogramowania ImageJ (1.44) (patrz sekcja 6).</li>
</ol>
6. Analiza danych przy użyciu oprogramowania ImageJ
Przenieś obrazy uzyskane z systemu konfokalnego w formacie pliku .lsm w celu analizy danych. Oprogramowanie ZEN 2009 i ZEN 2010, dostarczane odpowiednio z mikroskopem konfokalnym LSM 510 Meta lub mikroskopem konfokalnym wielofotonowym LSM 710, zapisuje pliki w formacie .lsm. Zalecamy stosowanie natywnych plików .lsm do analizy obrazu, aby zachować oryginalną jakość. Ten format pliku można bezpośrednio otworzyć w programie do analizy obrazu Image J. Poniższe kroki stanowią przykład ilościowej analizy pojedynczego obrazu. Do tej analizy danych nie są wymagane żadne dodatkowe wtyczki.
<ol>
	<li>Otwórz plik .lsm lub .TIFF w programie Image J, korzystając z opcji FILE&gt;OPEN</li>
	<li>Kliknij zakładkę IMAGE&gt;COLOR&gt;SPLIT CHANNELS i rozdziel kanał zielony oraz kanał DIC. Do dalszych analiz wykorzystaj obraz z kanału zielonego.</li>
	<li>Kliknij dwukrotnie i wybierz zakładkę „Elliptical brush selection”, a następnie ustaw wartość piksela na 20.</li>
	<li>W przypadku obrazów Hyper-cyto kliknij pojedynczą komórkę, aby zdefiniować okrągły obszar pomiarowy. Następnie naciśnij klawisz „M”, aby zmierzyć intensywność wybranego obszaru. Wartości zostaną zapisane w nowym oknie wyników.</li>
	<li>Następnie, trzymając klawisz „Shift”, kliknij inną komórkę, aby zaznaczyć kolejny obszar, a potem naciśnij klawisz „M”. Intensywność zostanie odnotowana w oknie wyników. Powtórz kroki 4-5 dla 50 różnych komórek.</li>
	<li>W przypadku obrazów Hyper d-mito ustaw wartość piksela na 10 w opcji Elliptical brush selection. Obszar zainteresowania (ROI) należy obrysować ręcznie, obejmując mitochondria konkretnych komórek.</li>
	<li>Używając narzędzia freehand, obrysuj obszar wokół mitochondriów, a następnie naciśnij „M”. Powtórz kroki 6-7 dla 50 różnych komórek.</li>
	<li>Skopiuj wartości średnie z okna wyników i wklej je do arkusza Excel lub dowolnego oprogramowania do wykreślania wyników. Do przedstawienia danych w formie wykresu używamy programu SigmaPlot lub Graphpad PRISM.</li>
</ol>
7. Reprezentatywne wyniki
Rysunek 1 przedstawia produkcję ROS w cytozolu i mitochondriach po stymulacji ligandami TLR. Reprezentatywne obrazy konfokalne pokazują wzrost fluorescencji DCF (cytozolowej) i MitoSOX Red (mitochondrialnej) po 6 h stymulacji. Zmiany fluorescencji zostały znormalizowane i wyrażone jako krotność zmiany.
Rycina 2 przedstawia generowanie stabilnych linii komórek śródbłonka HyPer-cyto i HyPer-dMito. Komórki śródbłonka mysiego poddano transfekcji konstruktami plazmidowymi pHyPer-cyto lub pHyPer-dMito za pomocą elektroporacji. Komórki stabilnie eksprimujące plazmidy selekcjonowano przy użyciu G418 przez dwa tygodnie. Po selekcji rozcieńczone komórki wysiano na płytki 96-dołkowe. Izolowano pojedyncze kolonie i obrazowano je w celu potwierdzenia homogenicznej ekspresji.
Rycina 3 przedstawia pomiar poziomu H2O2 w cytozolu i mitochondriach komórek śródbłonka. Reprezentatywne obrazy konfokalne ukazują wzrost fluorescencji HyPer-cyto (cytozolowej) i HyPer-dMito (mitochondrialnej) po 6 h stymulacji. Zmiany natężenia fluorescencji znormalizowano i wyrażono jako krotność zmiany.
Rysunek 4 przedstawia ocenę mobilizacji cytozolowego Ca2+ w komórkach śródbłonka indukowanej przez reaktywne formy tlenu (ROS) pochodzące z makrofagów. Makrofagi stymulowane LPS dodano do komórek śródbłonka naczyniowych płuc (PMVEC), które wcześniej obciążono barwnikiem wskaźnikowym Ca2+ wewnątrzkomórkowego ([Ca2+]i) Fluo-4. Przyłożenie aktywowanych LPS makrofagów typu dzikiego wywołało wzrost [Ca2+]i w komórkach PMVEC, który został osłabiony przez knockout funkcjonalnejy oksydazy NADPH (gp91phox-/-).
<img src="/files/ftp_upload/3511/3511fig1.jpg" alt="Analiza stresu oksydacyjnego, obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej DCF, MitoSOX Red; wykresy słupkowe wyników zmian krotności." data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Wizualizacja komórkowych ROS i nadtlenku mitochondrialnego generowanych przez makrofagi. Komórki J774.1 poddano stymulacji ligandami TLR2, 3 i 4. (2 μg/ml, kwas lipoteichoikowy-TLR2; 10μg/ml, Poly (I:C)-TLR3; 1 μg/ml LPS-TLR4) przez 6 h w 37°C. Po traktowaniu komórki obciążono (A) wskaźnikiem ROS komórkowych (H2DCF-DA; fluorescencja zielona) lub (B) wskaźnikiem nadtlenku mitochondrialnego (MitoSOX Red; fluorescencja czerwona). (C) Antymycynę A wykorzystano jako kontrolę pozytywną produkcji mitochondrialnych ROS. Zmiany intensywności fluorescencji oceniano za pomocą mikroskopii konfokalnej. (D) i (E) Ilościowe oznaczenie średniej zmiany fluorescencji.
<img src="/files/ftp_upload/3511/3511fig2.jpg" alt="Schemat metody elektroporacji: transfekcja komórek śródbłonka, selekcja klonalna G418, obrazowanie konfokalne." data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Schematyczna prezentacja generowania stabilnej ekspresji wskaźników ROS cytozolowych i mitochondrialnych w komórkach śródbłonka.
<img src="/files/ftp_upload/3511/3511fig3.jpg" alt="Obrazowanie fluorescencyjne i wykresy słupkowe przedstawiające odpowiedź komórkową na traktowanie LTA, Poly(IC) i LPS." data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Wizualizacja poziomów H2O2 w cytozolu i mitochondriach komórek śródbłonka. Komórki MPMVECs stabilnie eksponujące (A) HyPer-cyto lub (B) HyPer-dMito poddano działaniu ligandów TLR2, 3 i 4 (2 μg/ml kwasu lipoteichowego-TLR2; 10μg/ml Poly (I:C)-TLR3; 1 μg/ml LPS-TLR4) przez 6 h w 37°C. (C) Antymycynę A zastosowano jako kontrolę pozytywną produkcji mitochondrialnych ROS. Po traktowaniu zmiany intensywności fluorescencji oceniono za pomocą mikroskopii konfokalnej. (D) i (E) Ilościowe oznaczenie średniej zmiany fluorescencji.
<img src="/files/ftp_upload/3511/3511fig4.jpg" alt="Obrazowanie konfokalne kokultury komórek śródbłonka i makrofagów; analiza wykresu czasu fluorescencji Fluo-4." data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4. ROS pochodzące z makrofagów wywołują upośledzoną mobilizację Ca2+ w komórkach śródbłonka. (A) Schematyczne przedstawienie modelu badania kokultury komórek śródbłonka i makrofagów. (B) Świeżo wyizolowane makrofagi mysie od myszy WT oraz gp91phox null (The Jackson Laboratory) aktywowano za pomocą 1 μg/ml LPS przez 6 h. Makrofagi znakowano barwnikiem cell-tracker Red (czerwony) i dodano do PMVECs obciążonych Fluo-4 (zielony), aby ocenić parakrynową sygnalizację O2•-. (C) Makrofagi aktywowane LPS wyizolowane z myszy WT wywołały dużą i szybką mobilizację Ca2+ w PMVECs w porównaniu do makrofagów z myszy gp91phox null. Walidacja aktywacji makrofagów została wykazana wcześniej.

<ol><li>Madesh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+role+for+superoxide+in+InsP3+receptor-mediated+mitochondrial+dysfunction+and+endothelial+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Selective role for superoxide in InsP3 receptor-mediated mitochondrial dysfunction and endothelial apoptosis.</a> J. Cell. Biol. 170, 1079-1090 (2005).</li>
<li>Droge, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free+radicals+in+the+physiological+control+of+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Free radicals in the physiological control of cell function.</a> Physiol. Rev. 82, 47-95 (2002).</li>
<li>Hamanaka, R. B., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+reactive+oxygen+species+regulate+cellular+signaling+and+dictate+biological+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem.+Sci%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial reactive oxygen species regulate cellular signaling and dictate biological outcomes.</a> Trends Biochem. Sci. 35, 505-513 Forthcoming.</li>
<li>Hawkins, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S-glutathionylation+activates+STIM1+and+alters+mitochondrial+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">S-glutathionylation activates STIM1 and alters mitochondrial homeostasis.</a> J. Cell. Biol. 190, 391-405 (2010).</li>
<li>Madesh, M., Hajnoczky, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VDAC-dependent+permeabilization+of+the+outer+mitochondrial+membrane+by+superoxide+induces+rapid+and+massive+cytochrome+c+release%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">VDAC-dependent permeabilization of the outer mitochondrial membrane by superoxide induces rapid and massive cytochrome c release.</a> J. Cell Biol. 155, 1003-1015 (2001).</li>
<li>Finkel, T., Holbrook, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidants+oxidative+stress+and+the+biology+of+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Oxidants oxidative stress and the biology of ageing.</a> Nature. 408, 239-247 (2000).</li>
<li>Rittirsch, D., Flierl, M. A., Ward, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harmful+molecular+mechanisms+in+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Harmful molecular mechanisms in sepsis.</a> Nat. Rev. Immunol. 8, 776-787 (2008).</li>
<li>Sanlioglu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipopolysaccharide+induces+Rac1-dependent+reactive+oxygen+species+formation+and+coordinates+tumor+necrosis+factor-alpha+secretion+through+IKK+regulation+of+NF-kappa%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Lipopolysaccharide induces Rac1-dependent reactive oxygen species formation and coordinates tumor necrosis factor-alpha secretion through IKK regulation of NF-kappa.</a> 276, 30188-30198 (2001).</li>
<li>Hawkins, B. J., Madesh, M., Kirkpatrick, C. J., Fisher, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superoxide+flux+in+endothelial+cells+via+the+chloride+channel-3+mediates+intracellular+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Superoxide flux in endothelial cells via the chloride channel-3 mediates intracellular signaling.</a> Mol. Biol. Cell. 18, 2002-2012 (2007).</li>
<li>Vliet, A. vander <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NADPH+oxidases+in+lung+biology+and+pathology%3A+host+defense+enzymes+and+more%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic.+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">NADPH oxidases in lung biology and pathology: host defense enzymes and more.</a> Free Radic. Biol. Med. 44, 938-955 (2008).</li>
<li>Babior, B. M., Kipnes, R. S., Curnutte, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+defense+mechanisms.+The+production+by+leukocytes+of+superoxide%2C+a+potential+bactericidal+agent%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Biological defense mechanisms. The production by leukocytes of superoxide, a potential bactericidal agent.</a> J. Clin. Invest. 52, 741-744 (1973).</li>
<li>Lambeth, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NOX+enzymes+and+the+biology+of+reactive+oxygen%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">NOX enzymes and the biology of reactive oxygen.</a> Nat. Rev. Immunol. 4, 181-189 (2004).</li>
<li>Mukhopadhyay, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+detection+of+apoptosis+and+mitochondrial+superoxide+production+in+live+cells+by+flow+cytometry+and+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Simultaneous detection of apoptosis and mitochondrial superoxide production in live cells by flow cytometry and confocal microscopy.</a> Nat. Protoc. 2, 2295-2301 (2007).</li>
<li>Niethammer, P., Grabher, C., Look, A. T., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tissue-scale+gradient+of+hydrogen+peroxide+mediates+rapid+wound+detection+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A tissue-scale gradient of hydrogen peroxide mediates rapid wound detection in zebrafish.</a> Nature. 459, 996-999 (2009).</li>
<li>Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptors+and+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptors and innate immunity.</a> Nat. Rev. Immunol. 1, 135-145 (2001).</li>
</ol>

Brak declaredowanych konfliktów interesów.

Opisana tutaj metoda umożliwia szybki i ilościowy pomiar reaktywnych form tlenu w żywych komórkach, z wykorzystaniem barwników wrażliwych na utlenianie lub sensorów plazmidowych. Agoniści TLR (receptorów Toll-podobnych) to związki, które stymulują komórki poprzez obecne na ich powierzchni receptory TLR i wyzwalają kaskady sygnałowe15. W naszym protokole, w celu zademonstrowania pomiaru ROS, jako układ modelowy wykorzystaliśmy trzy różne agoniści TLR, które według doniesień indukują powstawanie ROS: kwas lipote...

<table><tbody><tr><td>Komora komórkowa Attofluor</td><td>Invitrogen</td><td>A7816</td><td></td></tr><tr><td>Antymycyna A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8674</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka DMEM z niską zawartością glukozy</td><td>Invitrogen</td><td>10567-014</td><td></td></tr><tr><td>Suplement czynnika wzrostu śródbłonka (ECGS)</td><td>Upstate, Millipore</td><td>02-102</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Invitrogen</td><td>12662011</td><td></td></tr><tr><td>G418</td><td>Invitrogen</td><td>10131-027</td><td></td></tr><tr><td>Żelatyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1393</td><td></td></tr><tr><td>H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;DCFDA</td><td>Invitrogen</td><td>D-399</td><td></td></tr><tr><td>LPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4516</td><td></td></tr><tr><td>LTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2515</td><td></td></tr><tr><td>MitoSOX Red</td><td>Invitrogen</td><td>M36008</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka Opti-MEM I z obniżoną zawartością surowicy</td><td>Invitrogen</td><td>51985091</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep (10x)</td><td>Invitrogen</td><td>15140163</td><td></td></tr><tr><td>pHyPer-cyto</td><td>Evrogen</td><td>FP941</td><td></td></tr><tr><td>pHyPer-dMito</td><td>Evrogen</td><td>FP942</td><td></td></tr><tr><td>Poly(I:C)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0913</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie Prism 5.0</td><td>GraphPad Software Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SigmaPlot 11.0</td><td>Systat software, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA (10x)</td><td>Invitrogen</td><td>15400054</td><td></td></tr><tr><td> Kolby T-25</td><td>Corning</td><td>430639</td><td></td></tr><tr><td> Kolby T-75</td><td>BD Biosciences</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka mikrodołkowa TC</td><td>BD Biosciences</td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie Zen 2009</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

wizualizacja sygnalizacji wazkularnego ca2+ wywołanej przez ros pochodzenia parakrynnego

Visualization of Vascular Ca2+ Signaling Triggered by Paracrine Derived ROS

Stres oksydacyjny jest implikowany w szeregu stanów patologicznych, w tym w uszkodzeniach niedokrwienno-reperfuzyjnych oraz w sepsie. Pojęcie stresu oksydacyjnego odnosi się do nieprawidłowego powstawania ROS (reaktywnych form tlenu), do których należą O2•-, H2O2 oraz rodniki hydroksylowe. Reaktywne formy tlenu wpływają na liczne procesy komórkowe, w tym na transdukcję sygnału, proliferację komórek i śmierć komórkową1-6. ROS mają potencjał do bezpośredniego uszkadzania komórek naczyniowych i narządowych oraz mogą inicjować wtórne reakcje chemiczne i zmiany genetyczne, które ostatecznie prowadzą do amplifikacji pierwotnego uszkodzenia tkanki pośredniczonego przez ROS. Kluczowym elementem kaskady amplifikacji, która nasila nieodwracalne uszkodzenia tkanki, jest rekrutacja i aktywacja krążących komórek zapalnych. Podczas stanu zapalnego komórki zapalne produkują cytokiny, takie jak czynnik martwicy nowotworu-α (TNFα) i IL-1, które aktywują komórki śródbłonka (EC) oraz komórki nabłonkowe, co dodatkowo nasila odpowiedź zapalną7. Dysfunkcja śródbłonka naczyniowego jest uznaną cechą ostrego stanu zapalnego. Makrofagi przyczyniają się do dysfunkcji śródbłonka podczas zapalenia poprzez mechanizmy, które pozostają niejasne. Aktywacja makrofagów skutkuje pozakomórkowym uwalnianiem O2•- oraz różnych cytokin prozapalnych, co wyzwala patologiczne przesyłanie sygnałów w sąsiednich komórkach8. Oksydazy NADPH są głównym i podstawowym źródłem ROS w większości typów komórek. Niedawno my oraz inni autorzy wykazaliśmy9,10, że ROS produkowane przez oksydazy NADPH indukują mitochondrialną produkcję ROS w wielu warunkach patofizjologicznych. Zatem pomiar mitochondrialnej produkcji ROS jest równie istotny, co pomiar ROS cytozolowych. Makrofagi produkują ROS za pomocą enzymu flawoproteinowego, oksydazy NADPH, która odgrywa główną rolę w zapaleniu. Po aktywacji fagocytarna oksydaza NADPH produkuje obfite ilości O2•-, które są istotne w mechanizmach obronnych organizmu11,12. Chociaż O2•- pochodzenia parakrynnego odgrywa ważną rolę w patogenezie chorób naczyniowych, wizualizacja indukowanego parakrynowo przez ROS przesyłania sygnałów wewnątrzkomórkowych, w tym mobilizacji Ca2+, pozostaje w sferze hipotez. Opracowaliśmy model, w którym aktywowane makrofagi są wykorzystywane jako źródło O2•- do przekazania sygnału do sąsiednich komórek śródbłonka. Wykorzystując ten model, wykazujemy, że pochodzący z makrofagów O2•- prowadzi do sygnalizacji wapniowej w sąsiednich komórkach śródbłonka.

Opisano wydajną metodę pozwalającą na wizualizację indukcji sygnalizacji Ca2+ w komórkach śródbłonka wywołanej przez pochodne parakrynne ROS. Metoda ta wykorzystuje pomiar mobilizacji Ca2+ wyzwalanej przez pochodne parakrynne ROS w komórkach śródbłonka naczyniowego w modelu kokultury.

Wizualizacja sygnalizacji wazkularnego Ca2+ wywołanej przez ROS pochodzenia parakrynnego

Stres oksydacyjny jest uwikłany w szereg stanów patologicznych, w tym w uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjne oraz sepsę. Koncepcja oksydacyjnego ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wizualizacja sygnałowania wapniowego w naczyniach krwionośnych wywołanego przez reaktywne formy tlenu (ROS) pochodzenia perykrynnego. Osiąga się to poprzez wstępną wizualizację ROS z wykorzystaniem barwników wrażliwych na utlenianie w aktywnych makrofagach. ROS można również wizualizować w komórkach śródbłonka przy użyciu fluorescencyjnych sensorów opartych na plazmidach.Następnie należy przejść do jednoczesnej wizualizacji makrofagów aktywowanych, znakowanych barwnikiem Cell Tracker Red, oraz komórek śródbłonka znakowanych barwnikiem Fluo-4 w modelu kokultury. Na koniec, przy użyciu systemu obrazowania konfokalnego, należy zmierzyć sygnalizację wapniową w komórkach śródbłonka wywołaną przez ROS pochodzące z makrofagów.Wyniki te mogą wykazać poziomy ROS niezależnie, a także jednocześnie ocenić wewnątrzkomórkową mobilizację wapnia wywołaną przez ROS pochodzące z Peregrine. Metoda ta umożliwia jednoczesną ocenę dwóch różnych cząsteczek sygnałowych, które ściśle wywołują sygnalizację naczyniową i symulują warunki patofizjologiczne. Dwaj postdoktoranci z mojego laboratorium, Karthik i Raj, zademonstrują procedurę pomiarów ROS i wapnia oraz intera

visualization-vascular-ca2-signaling-triggered-paracrine-derived

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Wizualizacja sygnalizacji skurczowej wapnia wywołanej przez pochodne parakrynne ROS

Niniejszy artykuł opisuje prosty model stymulacji angiogenezy w krezce szczura. Model ten powoduje gwałtowny wzrost pączkowania naczyń włosowatych, powierzchni naczyniowej oraz gęstości naczyń w stosunkowo krótkim czasie, w tkance umożliwiającej wizualizację en face całych sieci mikronaczyniowych aż do poziomu pojedynczej komórki.

Eksterioryzacja krezki szczura: model do badania dynamiki komórkowej zaangażowanej w angiogenezę

Opisujemy test czopa matrigelowego, aby zilustrować potencjał angiogenny puli czynników wydzielanych przez komórki nowotworowe za pomocą dwóch uzupełniających się metod obrazowania, ultradźwięków i endomikroskopii. Matrigel, żel naśladujący macierz zewnątrzkomórkową (ECM), jest wykorzystywany do wprowadzenia gospodarza (myszy) z czynnikami angiogennymi wydzielanymi do kondycjonowanego podłoża (CM).

Monitorowanie funkcjonalności i morfologii układu krwionośnego rekrutowanego przez czynniki wydzielane przez szybko rosnące komórki nowotworowe

Tutaj opisujemy półinwazyjną metodę mikroskopii optycznej do indukcji skrzepu fotozakrzepowego Rose Bengal w korze somatosensorycznej myszy in vivo.  Opisano techniczne aspekty procedury obrazowania, począwszy od indukcji zdarzenia fotozakrzepowego, a skończywszy na zastosowaniu i gromadzeniu danych.

Fotozakrzepica różana bengalska za pomocą konfokalnego obrazowania optycznego in vivo: model udaru pojedynczego naczynia

Progenitorzy śródbłonka pochodzący z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC-EPs) mają potencjał, aby zrewolucjonizować leczenie chorób sercowo-naczyniowych i umożliwić tworzenie bardziej wiernych modeli chorób sercowo-naczyniowych. W artykule opisano enkapsulację iPSC-EP w trójwymiarowych (3D) mikrośrodowiskach kolagenu oraz analizę ilościową potencjału naczyniowego tych komórek.

Model 3D in vitro i potok obliczeniowy do ilościowego określenia potencjału naczyniopochodnego progenitorów śródbłonka pochodzących z iPSC

Modele angiogenezy wieńcowej in vitro mogą być wykorzystane do odkrycia komórkowych i molekularnych mechanizmów angiogenezy wieńcowej. Hodowle eksplantatów in vitro tkanek zatok żylnych i wsierdzia wykazują silny wzrost w odpowiedzi na VEGF-A i wykazują podobny wzór ekspresji COUP-TFII jak in vivo.

Model angiogenezy wieńcowej in vitro

Zmodyfikowane tkanki w dużym stopniu polegają na odpowiednich sieciach naczyniowych, które dostarczają niezbędnych składników odżywczych i gazów oraz usuwają odpady metaboliczne. W tej pracy protokół stopniowego wysiewu komórek śródbłonka i komórek podporowych tworzy wysoce zorganizowane sieci naczyniowe na wysokoprzepustowej platformie do badania rozwijającego się zachowania naczyń w kontrolowanym środowisku 3D.

Stopniowe wysiewanie komórek na mozaikowych rusztowaniach w celu zbadania kiełkujących naczyń krwionośnych

Zewnątrzkomórkowa systemowa sygnalizacja wapniowa wywołana glutaminianem jest kluczowa dla indukcji reakcji obronnych roślin na mechaniczne zranienia i ataki roślinożerców u roślin. W artykule opisano metodę wizualizacji przestrzennej i czasowej dynamiki obu tych czynników przy użyciu roślin Arabidopsis thaliana wykazujących ekspresję wrażliwych na wapń i glutaminian biosensorów fluorescencyjnych.

Szerokokątne obrazowanie w czasie rzeczywistym lokalnych i układowych sygnałów rany u rzodkiewnika

Ten test wykorzystuje embrionalne komórki macierzyste myszy zróżnicowane w ciała embrionalne hodowane w żelu 3D-collagen do analizy procesów biologicznych, które kontrolują angiogenezę kiełkowania in vitro. Technika ta może być stosowana do testowania leków, modelowania chorób oraz do badania określonych genów w kontekście delecji, które są śmiertelne dla zarodka.

In vitro Trójwymiarowy test angiogenezy w kiełkowaniu przy użyciu embrionalnych komórek macierzystych myszy do modelowania chorób naczyniowych i testowania leków

Niniejsze badanie przedstawia wysoce powtarzalną i wykonalną metodę badania parakrynnych niekanonicznych zdarzeń sygnalizacyjnych Wnt in vitro. Protokół ten zastosowano do oceny wpływu parakrynnej sygnalizacji Wnt5a w mysich komórkach grzebienia nerwowego i mioblastach.

Modelowanie parakrynnej niekanonicznej sygnalizacji Wnt in vitro

To badanie przedstawia dwuwymiarowy (2D) test migracji ran drapanych i trójwymiarowy (3D) test kiełkowania sferoidów, wraz z odpowiednimi metodami analizy, w tym ekstrakcją RNA i immunocytochemią, jako odpowiednie testy do badania angiogenezy in vitro.

Badanie angiogenezy na poziomie funkcjonalnym i molekularnym poprzez wykorzystanie testu migracji ran drapanych i testu kiełkowania sferoidalnego

Poznaj metodę wizualizacji sygnalizacji wapniowej w komórkach śródbłonka wywołanej przez ROS pochodzące z makrofagów. Wykorzystuje się współkulturę, barwniki wrażliwe na utlenianie oraz czujniki fluorescencyjne do obserwacji w czasie rzeczywistym.

Wizualizacja sygnalizacji wazkularnego Ca²⁺ wywołanej przez ROS pochodzenia parakrynnego

Przeglądaj więcej filmów