Wizualizacja sygnalizacji naczyniowej Ca2+ wyzwalanej przez ROS pochodzące z parafiny
21 grudnia 2011
Opisana jest skuteczna metoda uzyskiwania wglądu w wizualizację pochodzącej z pasożytnii indukcji ROS śródbłonkowej sygnalizacji Ca2+. Metoda ta wykorzystuje pomiar mobilizacji Ca2 + wywołanej przez ROS wyzwalanej przez parakrynną w komórkach śródbłonka naczyń krwionośnych w modelu kohodowli.
Ogólnym celem tej procedury jest wizualizacja naczyniowej sygnalizacji wapniowej wyzwalanej przez reaktywne formy tlenu pochodzenia perykrynnego lub r os. Osiąga się to poprzez uprzednią wizualizację R os przy użyciu barwników wrażliwych na utlenianie w aktywnych makrofagach. ROS można również wizualizować w komórkach śródbłonka za pomocą czujników fluorescencyjnych opartych na plazmidach.
Następnie przystąp do jednoczesnej wizualizacji trackera komórek, aktywowanych na czerwono aktywowanych makrofagów i grypy czterech znakowanych komórek śródbłonka w modelu kohodowli. Na koniec zmierz sygnalizację wapniową w komórkach śródbłonka wyzwalaną przez R os pochodzące z makrofagów. Za pomocą systemu obrazowania konfokalnego.
Wyniki te mogą niezależnie wykazać poziomy Rros, a także jednocześnie ocenić wewnątrzkomórkową mobilizację wapnia wywołaną przez ROM pochodzące z wędrownego źródła energii. Metoda ta umożliwia jednoczesną ocenę dwóch różnych cząsteczek sygnałowych, które ściśle wywołują sygnalizację naczyniową i symulator ustawień patofizjologicznych. Dwaj doktorzy w moim laboratorium, Karthik i Raj, zademonstrują procedurę na pomiarach surowca i wapnia oraz interakcjach komórek śródbłonka makrofagów.
Hodowla makrofagów pochodzących z monocytów myszy na szklanych dnie 35 milimetrowych szalkach. Następnie prowokuj komórki agonistami receptorów toll-podobnych i inkubuj przez sześć godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Do wizualizacji cytozolu.
ROS dodaj barwnik wrażliwy na utlenianie i inkubuj komórki przez 20 minut. Teraz wizualizuj komórki na etapie systemu obrazowania konfokalnego o kontrolowanej temperaturze. Alternatywnie, aby uwidocznić mitochondrialne ROS w komórkach aktywowanych TLR, dodaj mitochondrialny wskaźnik ponadtlenkowy i inkubuj komórki przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.
W celu kontroli ujemnej należy potraktować komórki PBS lub DMSO w celu przeprowadzenia kontroli pozytywnej. Potraktuj komórki dwumilimolową antymycyną. Przystąpienie do wizualizacji wszystkich komórek na etapie systemu obrazowania konfokalnego z kontrolowaną temperaturą.
Korzystając z oprogramowania image J, przeanalizuj wszystkie dane obrazu. Czujnik fluorescencyjny bardzo specyficznie wykrywa submikromolowe stężenia nadtlenku i w oparciu o ekspresję ssaków, projekt wektorowy może być ukierunkowany na cytoplazmę lub mitochondria. Za pomocą elektroporacji stwórz stabilne linie mysich komórek śródbłonka mikronaczyniowego płuc z nieodpowiednim plazmidem hiperekspresji.
Aby ułatwić wzrost komórek płytki wzrostu kolonii o niskiej gęstości w kompletnym TMEM i inkubować przez 48 godzin, należy zastąpić pożywkę kompletną pożywką hodowlaną uzupełnioną wybranym antybiotykiem. Przesiewaj klony pod kątem najwyższego odsetka komórek hiperdodatnich i amplifikuj kulturę, aby stworzyć stabilne linie hiperdodatnie w poszczególnych eksperymentach. Komórki nasienne na 0,2% pokrytych żelatyną szkiełkach nakrywkowych i kultura przez noc do 80% konfluencji.
Teraz aktywuj komórki ligandami TLR i inkubuj przez sześć godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza. W celu wykrycia cytoplazmatycznego RFT należy zamontować szkiełka nakrywkowe komórek na komorze komórkowej adelo. Dodaj jeden mililitr wstępnie rozgrzanych zbiorników, zrównoważ roztwór soli i umieść komorę na stopniu systemu obrazowania konfokalnego o kontrolowanej temperaturze.
Rejestruj zmiany fluorescencji w komórkach w celu wykrycia mitochondriów. ROS. Uwzględnij pozytywną kontrolę dwóch mikromolowych antymycyny A. Następnie przygotuj szkiełka nakrywkowe leczonych komórek do mikroskopii konfokalnej. Wykonaj analizę obrazu za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazu J.
Zacznij od komórek śródbłonka wyhodowanych do 80% zbiegu na szkiełkach nakrywkowych pokrytych żelatyną w celu wizualizacji i pomiaru wewnątrzkomórkowych zmian wapnia. Inkubować komórki w fluorescencyjnym barwniku grypowym o 4:00 rano w temperaturze pokojowej przez 30 minut, aby zminimalizować utratę barwnika, przemyć komórki eksperymentalnym roztworem do obrazowania zawierającym strefę suen pyro. Teraz zamontuj pokrywę na komorze komórkowej adelo na 800 mikrolitrach wstępnie podgrzanego eksperymentalnego roztworu do obrazowania i umieść komórki na stoliku systemu obrazowania konfokalnego o kontrolowanej temperaturze w oddzielnej probówce.
Użyj 500 nanogramów na mililitr czerwonego C-M-T-P-X na 15 minut, aby oznaczyć badaną populację makrofagów, umyć komórki i ponownie zawiesić granulki w 200 mikrolitrach eksperymentalnego roztworu do obrazowania. Teraz dodaj oznaczone makrofagi do grypy o 4:00 rano załadowane. Komórki śródbłonka w zespole komory konfokalnej rejestrują zieloną i czerwoną fluorescencję co trzy sekundy przez 10 minut.
W tym eksperymencie komórki J 7 74 0,1 prowokowano dwoma, trzema i czterema ligandami TLR przez sześć godzin. Reprezentatywne obrazy konfokalne pokazują zwiększony cytozolowy R os mierzony za pomocą DCF. Co ciekawe, czerwona fluorescencja skarpet mitozy wskazuje na podobny wzrost mitochondrialnych ROS.
Te zmiany fluorescencji są ilościowe. W związku z tym wyniki muszą być znormalizowane i wyrażone jako względna zmiana fałdowania na leczenie, sygnał antymycyny potwierdza pozytywną kontrolę mitochondrialnej produkcji ROS. Ten rysunek przedstawia obrazy poziomów nadtlenku śródbłonka, cytozolu i mitochondriów przy stabilnej ekspresji hipercyto lub hiper D mito.
MP ECS stymulowany agonistami TLR. Kwantyfikacja średniej zmiany fluorescencji wykazuje wzrost fluorescencji mito hipercyto i hiper D mito po sześciu godzinach stymulacji w systemie kohodowli. Aby ocenić sygnalizację Peregrine ROS, świeżo wyizolowane makrofagi mirin zarówno od typu dzikiego, jak i GP 91, myszy zerowe Fox aktywowano jednym mikrogramem na mililitr LPS przez sześć godzin.
Makrofagi oznaczono na czerwono C-M-T-P-X i dodano do czwartej zielonej grypy. Załadowany. MPM ecs. Co ciekawe, makrofagi aktywowane LPS wyizolowane od myszy typu dzikiego wywołały dużą i szybką mobilizację wapnia w MPM ECS w porównaniu z makrofagami z myszy zerowych GP 91 Fox.
Podczas gdy LI próbuje zastosować tę procedurę, ważne jest, aby pamiętać, że zarówno długotrwałe pobieranie, jak i ekspozycja na laser prowadzą do automatycznego utleniania DCF. Bardzo ważne jest, aby uniknąć fotowybielania hipercyto i hiper D mitralnego. Po opanowaniu pomiar RZS w makrofagach, a także w komórkach śródbłonka, można go wykonać w ciągu siedmiu godzin, jeśli zostanie wykonany prawidłowo.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten artykuł opisuje metodę wizualizowania wapniowego przekazywania sygnałów naczyniowych indukowanego przez reaktywne formy tlenu (ROS) pochodzące z parakryn. Podejście to wykorzystuje barwniki wrażliwe na utlenianie i czujniki fluorescencyjne do obserwacji ROS w makrofagach i komórkach śródbłonka w modelu współkultury.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Biologia naczyniowa
Tło
- Reaktywne formy tlenu (ROS) odgrywają krytyczną rolę w przekazywaniu sygnałów komórkowych.
- Komórki śródbłonka reagują na sygnały parakrynowe z makrofagów.
- Przekazywanie sygnałów wapniowych jest niezbędne dla różnych funkcji komórkowych.
- Wizualizacja tych interakcji może poprawić nasze zrozumienie biologii naczyniowej.
Cel badania
- Wizualizacja przekazywania sygnałów wapniowych w komórkach śródbłonka wywołanego przez ROS pochodzące z makrofagów.
- Wykorzystanie modelu współkultury do badania interakcji komórkowych.
- Zastosowanie zaawansowanych technik obrazowania do obserwacji w czasie rzeczywistym.
Zastosowane metody
- Barwniki wrażliwe na utlenianie do wizualizowania ROS w makrofagach.
- Fluorescencyjne czujniki oparte na plazmidach do wykrywania ROS w komórkach śródbłonka.
- Model współkultury aktywowanych makrofagów i komórek śródbłonka.
- Konfokalny system obrazowania do pomiaru przekazywania sygnałów wapniowych.
Główne wyniki
- Udana wizualizacja ROS zarówno w makrofagach, jak i w komórkach śródbłonka.
- Wykazane mobilizowanie wapnia w komórkach śródbłonka po ekspozycji na ROS.
- Podkreślenie znaczenia sygnalizacji parakrynowej w reakcjach naczyniowych.
- Dostarczenie ram dla przyszłych badań nad interakcjami przekazywania sygnałów komórkowych.
Wnioski
- Metoda skutecznie wizualizuje rolę ROS w przekazywaniu sygnałów wapniowych w komórkach śródbłonka.
- Uzyskane informacje mogą być pomocne w opracowywaniu strategii terapeutycznych ukierunkowanych na dysfunkcję naczyniową.
- Wymagane są dalsze badania, aby zbadać implikacje tych odkryć.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This method enables visualization of paracrine ROS-induced calcium signaling in vascular endothelial cells, providing a mechanistic link between inflammatory cell activation and vascular dysfunction. It supports target validation by demonstrating how macrophage-derived ROS trigger intracellular signaling pathways relevant to ischemia/reperfusion injury and sepsis. The approach offers predictive value for de-risking therapeutic candidates aimed at modulating ROS-mediated endothelial activation in preclinical disease models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates the hypothesis that paracrine ROS from activated macrophages induce calcium signaling in adjacent endothelial cells.
- Operational Value: Enables functional validation of ROS sources (e.g., NADPH oxidase) in inflammatory pathways using co-culture systems.
- Scientific Value: Supports mechanistic de-risking by linking ROS production to downstream calcium-dependent signaling in vascular cells.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares standardized endothelial and macrophage co-culture systems for quantitative assessment of ROS-triggered calcium flux.
- Operational Value: Utilizes oxidation-sensitive dyes and genetically encoded sensors to generate reproducible, normalized fluorescence readouts.
- Scientific Value: Enables simultaneous detection of ROS and calcium mobilization, supporting multiplexed assay design for pathway interrogation.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Models disease-relevant vascular inflammation by using TLR-activated macrophages to stimulate endothelial calcium responses.
- Operational Value: Provides a scalable platform to compare wild-type and genetically modified macrophages (e.g., gp91phox-null) in ROS-dependent signaling.
- Scientific Value: Supports translational biomarker alignment by quantifying calcium mobilization as a functional readout of paracrine ROS activity.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to preclinical validation, enabling iterative assessment of ROS-mediated vascular signaling in inflammatory contexts.
- Discovery Biology: Tests the mechanistic link between macrophage activation and endothelial calcium signaling via ROS.
- Screening: Delivers assay-ready co-culture systems with quantitative, simultaneous readouts of ROS and calcium flux.
- Analytics: Generates normalized fold-change fluorescence data enabling comparison across genetic or pharmacological conditions.
- Translational Research: Connects paracrine ROS signaling to endothelial dysfunction models relevant to sepsis and ischemia/reperfusion.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging-based platform for studying cell-cell communication in vascular inflammation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by visualizing causal ROS-to-calcium signaling in vascular cells.
- Operational Value: Standardizes co-culture preparation and imaging protocols for reproducible ROS and calcium measurements across laboratories.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by reducing mechanistic ambiguity in ROS-driven vascular pathways.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds targeting NADPH oxidase or ROS-scavenging mechanisms.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary cell culture, fluorescent dye loading, and confocal microscopy.
- Dependent on access to oxidation-sensitive dyes (e.g., DCF), fluorescent calcium indicators (e.g., Fluo-4), and plasmid-based ROS sensors.
- Necessitates standardization of macrophage activation (e.g., TLR ligand dose and duration) and endothelial cell confluence for consistent signaling.
- Involves adaptation considerations when extending to human primary cells or alternative vascular cell types.
- Includes practical limitations such as photobleaching of dyes and auto-oxidation risks during prolonged imaging.
