Analiza częstotliwości adhezji w celu badania kinetyki in situ międzykomórkowych oddziaływań molekularnych w obrębie złączy komórkowych

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest pomiar kinetyki oddziaływania między receptorem a ligandem w sytuacji, gdy obie cząsteczki są zakotwiczone na powierzchniach oddziałujących komórek. Osiąga się to poprzez najpierw funkcjonalizację erytrocytów, które stanowią sensory adhezji, za pomocą ligandów, oraz przygotowanie komórek wykazujących ekspresję receptorów. W drugim kroku montowana jest komora mikropipety i przeprowadzane są testy adhezji w celu zarejestrowania zdarzeń adhezyjnych.

Następnie wykreśla się krzywą prawdopodobieństwa adhezji w funkcji czasu kontaktu komórek i dopasowuje ją do modelu. W celu oszacowania parametrów kinetycznych uzyskuje się wyniki przedstawiające dwuwymiarową efektywną powinowactwo wiązania oraz stałą szybkości dysocjacji oszacowane na podstawie danych. Skąd zatem wzięła się koncepcja tego testu?

Badacze analizują oddziaływania między receptorem a ligandem. Większość z nich mierzy siły rozrywania i my robimy to samo, jednak pewnego dnia zastanowiliśmy się, czy nie można po prostu mierzyć wyniku binarnego: zero dla braku adhezji i jeden dla wystąpienia adhezji, a następnie na podstawie tych pomiarów zero-jedynkowych wyznaczyć kinetykę, aby zaprezentować test częstotliwości z wykorzystaniem mikroprzewodów. Dr Veronica Zana Zina, naukowiec z mojego laboratorium, zaprezentuje Państwu ten eksperyment.

Krwinki czerwone wyizolowane z krwi pełnej poddaje się biotinylacji w celu przeprowadzenia testu częstości adhezji. Aby rozpocząć tę procedurę, odwiruj probówkę zawierającą wyizolowane krwinki czerwone, przenieś 10 µL osadu krwinek czerwonych do każdej z kilku fiolek i dodaj do każdej fiolki odpowiednią ilość PBS, aby przygotować kilka stężeń elucji biotyny krwinek czerwonych. Następnie dodaj 10 µL 0,1 molarnego buforu borate do każdej fiolki.

Następnie do każdej fiolki należy dodać wyliczoną ilość roztworu biotyny i natychmiast wymieszać w wstrząsarzu typu vortex. Przez kilka sekund każdą fiolkę z erytrocytami należy umieścić w stożkowej probówce o pojemności 50 ml i inkubować na rotatorze przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Po 30 minutach do każdej fiolki należy dodać bufor EAS 45 i wirować przez dwie minuty przy 2000 obr./min. Płukanie buforem EAS 45 należy powtórzyć dwukrotnie, aby łącznie przeprowadzić trzy etapy płukania.

Na koniec do każdej fiolki należy dodać 100 µL buforu EAS 45 i przechowywać w temperaturze 4 °C w celu funkcjonalizacji ligandów na powierzchni erytrocytów. Po procesie opisanym w poprzednim kroku erytrocyty inkubuje się z nasyconym stężeniem strep TTR przez 30 minut w temperaturze 4 °C, a następnie płucze trzykrotnie buforem EAS 45 przez dwie minuty przy prędkości 2000 obr./min. Następnie erytrocyty inkubuje się bezpośrednio z biotynylowanym ligandem lub inkubuje erytrocyty z odpowiednim biotynylowanym przeciwciałem wychwytującym, a następnie z ligandami. Protokół przedstawiony w tym filmie wykorzystuje biotynylowane przeciwciało wychwytujące.

Mikropipety wykonuje się z kapilarnych rurek borokrzemianowych o niskiej temperaturze topnienia. Najpierw należy użyć wyciągacza mikrokapilar do rozciągnięcia rurek kapilarnych. Następnie, za pomocą mikromanipulatora z mikrokuźnią, należy przyciąć końcówkę mikropipety do pożądanej wielkości otworu.

Wymagana średnica zazwyczaj mieści się w przedziale od jednej do pięciu mikronów, w zależności od wielkości komórek wykorzystywanych w badaniu. Aby przygotować komorę komórkową, należy użyć dwóch kawałków szkiełka podstawowego wyciętych do pożądanego rozmiaru, oczyścić szkiełka z kurzu za pomocą sprężonego powietrza, dodać pożywkę do komory komórkowej i uszczelnić komorę z obu stron za pomocą oleju mineralnego, aby zapobiec odparowaniu pożywki. Zapobiegnie to zmianie osmolarności podczas eksperymentu.

System mikropipet wykorzystany w tym badaniu składa się z trzech podsystemów: podsystemu obrazowania służącego do obserwacji, rejestracji i analizy ruchów komórki aspirowanej do mikropipety, podsystemu mikromanipulacyjnego umożliwiającego wybór komórek z komory oraz podsystemu ciśnieniowego służącego do aspiracji komórek do mikropipet. Centralnym elementem podsystemu obrazowania jest mikroskop odwrócony z obiektywem imersyjnym 100x. Obrazy z obiektywu są wykrywane przez kamerę CCD i przesyłane do rejestratora wideo.

Do systemu podłączono timer wideo w celu monitorowania czasu. Po napełnieniu mikropipety wodą dejonizowaną, należy umieścić ją w uchwycie na napędzie mechanicznym zamontowanym na mikroskopie. Mikropipeta może być precyzyjnie pozycjonowana za pomocą trójosiowego hydraulicznego mikromanipulatora.

Jeden z uchwytów mikropipet jest zamontowany na programowanym komputerowo translatorem piezoelektrycznym. Pozwala to na precyzyjne przemieszczanie pipety w cyklu testu adhezji. Podsystem regulacji ciśnienia służy do kontroli ssania.

Podczas eksperymentu linia hydrauliczna łączy uchwyt mikropipety z rezerwuarem płynu. Precyzyjny mechaniczny pozycjoner umożliwia dokładną regulację wysokości rezerwuaru. Po zmontowaniu komory ustawiane są mikropipety, następnie do komory wstrzykuje się komórki w celu rozpoczęcia analizy, a za pomocą odpowiednich pipet aspiruje się oddziałujące komórki. Do przesuwania erytrocytu w stronę neutrofila i odsuwania go od niego, przy zachowaniu kontrolowanego czasu i powierzchni kontaktu, używa się elektrycznego translacyjnego urządzenia PSO.

Zdarzenie adhezji obserwuje się, gdy erytrocyt wydłuża się podczas oddzielania komórek; brak adhezji odpowiada brakowi wydłużenia erytrocyta. Zapisz zaobserwowane zdarzenia adhezji w kolumnie arkusza Excel, wpisując jedynkę dla adhezji lub zero dla braku adhezji.

Zarejestruj krzywą częstotliwości adhezji w funkcji czasu kontaktu, wykorzystując co najmniej trzy różne pary komórek dla każdego czasu kontaktu. Aby uzyskać średnią i błąd standardowy średniej (SEM) jako kontrolę, zarejestruj krzywą wiązania niespecyficznego, używając erytrocytów pokrytych odpowiednimi ligandami i/lub blokując ligandy lub receptory za pomocą ich specyficznej blokady funkcjonalnej. Przy użyciu przeciwciał monoklonalnych specyficzną częstotliwość adhezji dla każdego punktu czasowego kontaktu można obliczyć poprzez odjęcie częstotliwości adhezji niespecyficznej.

Dane dotyczące specyficznej częstotliwości adhezji w funkcji czasu kontaktu są dopasowane do modelu probabilistycznego, który opisuje drugiego rzędu interakcję w kierunku prostym oraz pierwszego rzędu interakcję w kierunku odwrotnym w pojedynczym kroku między pojedynczym gatunkiem receptorów a pojedynczym gatunkiem ligandów. W tym równaniu KA oznacza dwuwymiarową powinowactwo, a KA dwuwymiarową stałą szybkości dysocjacji.

MR i ML to odpowiednio gęstości receptora i liganda, a AC to powierzchnia kontaktu. Dopasowanie krzywej posiada dwa parametry: ac, k, a oraz K off, ponieważ AC i KA są połączone i określane zbiorczo jako efektywna powinowactwo 2D; ich iloczyn z szybkością dysocjacji (off rate) stanowi efektywną szybkość asocjacji (on rate) 2D: AC K on równa się AC KA razy K off. Przedstawiono tutaj przykład oznaczenia integryny alpha L beta two.

Gęstość miejsc na neutrofilach. Neutrofile inkubowano najpierw z 1 µg/mL E-selektyny IG, a następnie zastosowano stężenia nasycające PE- sprzężonego przeciwciała anty-ludzkiego CD11, przeciwciała monoklonalnego lub odpowiedniej mysiej IgG1 w celu kontroli. Po 30 minutach inkubacji próbki przemyto i analizowano na cytometrze przepływowym z zastosowaniem standardowej ilości.

Jasne kulek kalibracyjnych PE. Panel A przedstawia histogramy fluorescencji kulek kalibracyjnych wraz z histogramami komórek traktowanych lub nietraktowanych E-selektyną IG. Specyficzne barwienie przeciwciałem monoklonalnym CD 11 A przedstawiono liniami ciągłymi, a odpowiednie barwienie kontrolnymi przeciwciałami izotypowymi liniami przerywanymi.

Panel B przedstawia proces kwantyfikacji gęstości. Obliczono log10 dla średniej intensywności fluorescencji każdego z czterech koralików. Wartość szczytu kalibracyjnego z panelu A oraz liczba cząsteczek PE na koralik specyficzna dla danej partii.

Wykreślono regresję liniową log 10 cząsteczek PE na kuleczkę w funkcji log 10 fluorescencji dla ponownie wyselekcjonowanych komórek intruzyjnych. Wartość log 10 fi wyniosła 3,99, co zaznaczono niebieskim pełnym kołem, oraz 2,23, co zaznaczono niebieskim pustym kołem, odpowiednio dla specyficznego przeciwciała monoklonalnego i przeciwciała kontrolnego. Po rozwiązaniu równania liniowego dla X, całkowita liczba alpha L beta two lub neutrofili została obliczona na 9 587.

Gęstość powierzchniową obliczono na 43 miejsca na mikron kwadratowy, przyjmując średnicę neutrofilów wynoszącą 8,4 mikronów. Kolejny wykres przedstawia bieżącą częstotliwość adhezji fi dla wiązania specyficznego w pierwszej oraz dziesiątej sekundzie. Czas kontaktu mierzony podczas powtarzanych cykli testów adhezji pomiędzy erytrocytami pokrytymi ICAM-1 a ludzkimi neutrofilami wykazującymi integrinę alpha L beta two.

W przeciwieństwie do powyższego, przedstawiono tutaj częstotliwość przylegania fi dla wiązania niespecyficznego przy czasie kontaktu wynoszącym jedną i dziesięć sekund, zmierzoną w powtarzalnych cyklach testów adhezji pomiędzy ludzkimi erytrocytami powlekanymi IgG a ludzkimi neutrofilami wykazującymi ekspresję integryny alfa L beta dwa. Ten końcowy wykres ilustruje kinetykę wiązania I A one do integryny alfa L beta dwa neutrofili; prawdopodobieństwa adhezji zmierzone dla trzech par komórek przy każdym czasie kontaktu zostały uśrednione i naniesione na wykres w funkcji czasu kontaktu w celu skontrolowania wiązania niespecyficznego. Zastosowano dwa różne warunki.

Jedne erytrocyty pokryte przeciwciałem wychwytującym anty-TFC i inkubowane z ludzkim IgG zamiast ICAM-1 oraz dwie neutrofile wiążące się z erytrocytami niepokrytymi przeciwciałem wychwytującym. Wiązanie niespecyficzne, zapisane jako krzywa kontrolna dla ludzkiego IgG, zostało wykorzystane do uzyskania krzywej specyficznego prawdopodobieństwa adhezji. Zastosowano wcześniej przedstawione równanie korekcji wiązania niespecyficznego.

Skorygowaną krzywą prawdopodobieństwa adhezji specyficznej dopasowano za pomocą dopasowania modelowego. Krzywa prawdopodobieństwa adhezji specyficznej pozwoliła wyznaczyć efektywną powinowactwo wiązania. Wartość CKA wynosi 1,4 × 10⁻⁴ µm⁴, a koff wynosi 0,3 s⁻¹.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć, jak mierzyć kinetykę oddziaływań receptor-ligand w sytuacji, gdy obie cząsteczki są zakotwiczone na powierzchniach oddziałujących komórek. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, aby w pierwszych próbach dobrać zakres gęstości ligandów tak, aby częstotliwość adhezji znajdowała się w zakresie średnim; należy również pamiętać, że praca z krwią oraz niektórymi odczynnikami do specyficznych obróbek, np. sodem NaN3 i DMSO, może być niezwykle niebezpieczna. W związku z tym wymagane jest przestrzeganie środków ostrożności, takich jak uważne zapoznanie się z kartami charakterystyki (MSDS) odczynników oraz noszenie rękawiczek podczas wykonywania tej procedury.