Name: Test częstości adhezji do analizy kinetyki in situ interakcji molekularnych na styku krzyżowym na granicy komórka (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 22 s
Description: Poznaj test częstości adhezji do analizy kinetyki interakcji receptor-ligand na powierzchni komórek z wykorzystaniem funkcjonalizowanych erytrocytów jako czujników. Ta metoda umożliwia precyzyjne określenie powinowactwa wiązania i stałej dysocjacji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Niniejsze badanie zostało sfinansowane z grantów NIH o numerach R01HL091020, R01HL093723, R01AI077343 oraz R01GM096187.

<ol><li>Chesla, S. E., Selvaraj, P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+two-dimensional+receptor-ligand+binding+kinetics+by+micropipette%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Measuring two-dimensional receptor-ligand binding kinetics by micropipette.</a> Biophys. J. 75, 1553-1572 (1998).</li>
<li>Chesla, S. E., Li, P., Nagarajan, S., Selvaraj, P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+membrane+anchor+influences+ligand+binding+two-dimensional+kinetic+rates+and+three-dimensional+affinity+of+FcgammaRIII+%28CD16%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The membrane anchor influences ligand binding two-dimensional kinetic rates and three-dimensional affinity of FcgammaRIII (CD16).</a> J. Biol. Chem. 275, 10235-10246 (2000).</li>
<li>Williams, T. E., Nagarajan, S., Selvaraj, P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concurrent+and+independent+binding+of+Fcgamma+receptors+IIa+and+IIIb+to+surface-bound+IgG%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Concurrent and independent binding of Fcgamma receptors IIa and IIIb to surface-bound IgG.</a> Biophys. J. 79, 1867-1875 (2000).</li>
<li>Williams, T. E., Selvaraj, P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concurrent+binding+to+multiple+ligands%3A+kinetic+rates+of+CD16b+for+membrane-bound+IgG1+and+IgG2%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Concurrent binding to multiple ligands: kinetic rates of CD16b for membrane-bound IgG1 and IgG2.</a> Biophys. J. 79, 1858-1866 (2000).</li>
<li>Williams, T. E., Nagarajan, S., Selvaraj, P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+the+impact+of+membrane+microtopology+on+effective+two-dimensional+affinity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Quantifying the impact of membrane microtopology on effective two-dimensional affinity.</a> J. Biol. Chem. 276, 13283-13288 (2001).</li>
<li>Huang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+the+effects+of+molecular+orientation+and+length+on+two-dimensional+receptor-ligand+binding+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Quantifying the effects of molecular orientation and length on two-dimensional receptor-ligand binding kinetics.</a> J. Biol. Chem. 279, 44915-44923 (2004).</li>
<li>Long, M., Zhao, H., Huang, K. S., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+measurements+of+cell+surface+E-selectin%2Fcarbohydrate+ligand+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Kinetic measurements of cell surface E-selectin/carbohydrate ligand interactions.</a> Ann. Biomed. Eng. 29, 935-946 (2001).</li>
<li>Chen, W., Evans, E. A., McEver, R. P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+receptor-ligand+interactions+between+surfaces+by+thermal+fluctuations%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Monitoring receptor-ligand interactions between surfaces by thermal fluctuations.</a> Biophys. J. 94, 694-701 (2008).</li>
<li>Wu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+carrier+stiffness+and+microtopology+on+two-dimensional+kinetics+of+P-selectin+and+P-selectin+glycoprotein+ligand-1+%28PSGL-1%29+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Impact of carrier stiffness and microtopology on two-dimensional kinetics of P-selectin and P-selectin glycoprotein ligand-1 (PSGL-1) interactions.</a> J. Biol. Chem. 282, 9846-9854 (2007).</li>
<li>Waugh, R. E., Lomakina, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+site+formation%2C+not+bond+kinetics%2C+limits+adhesion+rate+between+human+neutrophils+and+immobilized+vascular+cell+adhesion+molecule+1%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Active site formation, not bond kinetics, limits adhesion rate between human neutrophils and immobilized vascular cell adhesion molecule 1.</a> Biophys. J. 96, 268-275 (2009).</li>
<li>Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+kinetics+regulation+of+alphaLbeta2-ICAM-1+interaction+by+conformational+changes+of+the+alphaL-inserted+domain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional kinetics regulation of alphaLbeta2-ICAM-1 interaction by conformational changes of the alphaL-inserted domain.</a> J. Biol. Chem. 280, 42207-42218 (2005).</li>
<li>Lomakina, E. B., Waugh, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+between+human+neutrophils+and+immobilized+endothelial+ligand+vascular+cell+adhesion+molecule+1%3A+divalent+ion+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Adhesion between human neutrophils and immobilized endothelial ligand vascular cell adhesion molecule 1: divalent ion effects.</a> Biophys. J. 96, 276-284 (2009).</li>
<li>Chen, W., Lou, J., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forcing+switch+from+short-+to+intermediate-+and+long-lived+states+of+the+alphaA+domain+generates+LFA-1%2FICAM-1+catch+bonds%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Forcing switch from short- to intermediate- and long-lived states of the alphaA domain generates LFA-1/ICAM-1 catch bonds.</a> J. Biol. Chem. 285, 35967-35978 (2010).</li>
<li>Chien, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+stage+cadherin+kinetics+require+multiple+extracellular+domains+but+not+the+cytoplasmic+region%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Two stage cadherin kinetics require multiple extracellular domains but not the cytoplasmic region.</a> J. Biol. Chem. 283, 1848-1856 (2008).</li>
<li>Huang, J., Edwards, L. J., Evavold, B. D., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+MHC-CD8+interaction+at+the+T+cell+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Kinetics of MHC-CD8 interaction at the T cell membrane.</a> J. Immunol. 179, 7653-7662 (2007).</li>
<li>Wasserman, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MHC+variant+peptide-mediated+anergy+of+encephalitogenic+T+cells+requires+SHP-1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">MHC variant peptide-mediated anergy of encephalitogenic T cells requires SHP-1.</a> J. Immunol. 181, 6843-6849 (2008).</li>
<li>Huang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+kinetics+of+two-dimensional+TCR+and+pMHC+interactions+determine+T-cell+responsiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The kinetics of two-dimensional TCR and pMHC interactions determine T-cell responsiveness.</a> Nature. 464, 932-936 Forthcoming.</li>
<li>Sabatino, J. J., Huang, J., Zhu, C., Evavold, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+prevalence+of+low+affinity+peptide-MHC+II+tetramer-negative+effectors+during+polyclonal+CD4%2B+T+cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">High prevalence of low affinity peptide-MHC II tetramer-negative effectors during polyclonal CD4+ T cell responses.</a> J. Exp. Med. 208, 81-90 (2011).</li>
<li>Jiang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-stage+cooperative+T+cell+receptor-peptide+major+histocompatibility+complex-CD8+trimolecular+interactions+amplify+antigen+discrimination%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Two-stage cooperative T cell receptor-peptide major histocompatibility complex-CD8 trimolecular interactions amplify antigen discrimination.</a> Immunity. 34, 13-23 (2011).</li>
<li>Spillmann, C. M., Lomakina, E., Waugh, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+adhesive+contact+dependence+on+impingement+force%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Neutrophil adhesive contact dependence on impingement force.</a> Biophys. J. 87, 4237-4245 (2004).</li>
<li>Zhu, C., Williams, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+concurrent+binding+of+multiple+molecular+species+in+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Modeling concurrent binding of multiple molecular species in cell adhesion.</a> Biophys. J. 79, 1850-1857 (2000).</li>
<li>Downey, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retention+of+leukocytes+in+capillaries%3A+role+of+cell+size+and+deformability%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Retention of leukocytes in capillaries: role of cell size and deformability.</a> J. Appl. Physiol. 69, 1767-1778 (1990).</li>
<li>Li, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affinity+and+kinetic+analysis+of+Fcgamma+receptor+IIIa+%28CD16a%29+binding+to+IgG+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Affinity and kinetic analysis of Fcgamma receptor IIIa (CD16a) binding to IgG ligands.</a> J. Biol. Chem. 282, 6210-6221 (2007).</li>
<li>Chen, W., Zarnitsyna, V. I., Sarangapani, K. K., Huang, J., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+Receptor-Ligand+Binding+Kinetics+on+Cell+Surfaces%3A+From+Adhesion+Frequency+to+Thermal+Fluctuation+Methods%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Measuring Receptor-Ligand Binding Kinetics on Cell Surfaces: From Adhesion Frequency to Thermal Fluctuation Methods.</a> Cell. Mol. Bioeng. 1, 276-288 (2008).</li>
<li>Thoumine, O., Kocian, P., Kottelat, A., Meister, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-term+binding+of+fibroblasts+to+fibronectin%3A+optical+tweezers+experiments+and+probabilistic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Short-term binding of fibroblasts to fibronectin: optical tweezers experiments and probabilistic analysis.</a> Eur. Biophys. J. 29, 398-408 (2000).</li>
<li>Ounkomol, C., Xie, H., Dayton, P. A., Heinrich, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatile+horizontal+force+probe+for+mechanical+tests+on+pipette-held+cells%2C+particles%2C+and+membrane+capsules%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Versatile horizontal force probe for mechanical tests on pipette-held cells, particles, and membrane capsules.</a> Biophys. J. 96, 1218-1231 (2009).</li>
<li>Piper, J. W., Swerlick, R. A., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+force+dependence+of+two-dimensional+receptor-ligand+binding+affinity+by+centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Determining force dependence of two-dimensional receptor-ligand binding affinity by centrifugation.</a> Biophys. J. 74, 492-513 (1998).</li>
<li>Li, P., Selvaraj, P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+competition+binding+between+soluble+and+membrane-bound+ligands+for+cell+surface+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Analysis of competition binding between soluble and membrane-bound ligands for cell surface receptors.</a> Biophys. J. 77, 3394-3406 (1999).</li>
<li>Long, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probabilistic+modeling+of+rosette+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Probabilistic modeling of rosette formation.</a> Biophys. J. 91, 352-363 (2006).</li>
<li>Lou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-enhanced+adhesion+regulated+by+a+selectin+interdomain+hinge%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Flow-enhanced adhesion regulated by a selectin interdomain hinge.</a> J. Cell. Biol. 174, 1107-1117 (2006).</li>
<li>Yago, T., Zarnitsyna, V. I., Klopocki, A. G., McEver, R. P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transport+governs+flow-enhanced+cell+tethering+through+L-selectin+at+threshold+shear%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Transport governs flow-enhanced cell tethering through L-selectin at threshold shear.</a> Biophys. J. 92, 330-342 (2007).</li>
<li>Evans, E., Berk, D., Leung, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detachment+of+agglutinin-bonded+red+blood+cells.+I.+Forces+to+rupture+molecular-point+attachments%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Detachment of agglutinin-bonded red blood cells. I. Forces to rupture molecular-point attachments.</a> Biophys. J. 59, 838-848 (1991).</li>
<li>Zarnitsyna, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Memory+in+receptor-ligand-mediated+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Memory in receptor-ligand-mediated cell adhesion.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 18037-18042 (2007).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano konfliktów interesów.

Aby skutecznie przeprowadzić test częstotliwości adhezji za pomocą mikropipety, należy wziąć pod uwagę kilka krytycznych kroków. Po pierwsze, należy upewnić się, że zarejestrowano specyficzną interakcję dla badanego układu receptor-ligand. Pomiary kontrolne niespecyficzne (por. Ryc. 3, 4) zapewniają specyficzność badania. W idealnym przypadku prawdopodobieństwa adhezji niespecyficznej powinny być niższe niż 0,05 dla wszystkich czasów kontaktu, a różnica między prawdopodobieństwem adhezji specyficznej a niespecyficznej po...

<table><tbody><tr><td>10x PBS</td><td>BioWhittaker</td><td>&lt;p align=&quot;center">17-517Q&lt;/p&gt;</td><td>Rozcieńczyć do 1x wodą dejonizowaną przed użyciem</td></tr><tr><td>Vacutainer EDTA</td><td>BD Biosciences</td><td>366643</td><td>izolacja RBC</td></tr><tr><td>10ML PK100</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Histopaque 1077</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10771</td><td>izolacja RBC</td></tr><tr><td>Adenina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2786</td><td>przygotowanie EAS-45</td></tr><tr><td>D-glukoza (dekstroza)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td>przygotowanie EAS-45</td></tr><tr><td>D-mannitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>6360</td><td>przygotowanie EAS-45</td></tr><tr><td>Chlorek sodu (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td>przygotowanie EAS-45</td></tr><tr><td>Fosforan sodu, dwuzasadowy (Na&lt;sub&gt;&amp;#8322;&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;&amp;#8324;&lt;/sub&gt;)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S374</td><td>przygotowanie EAS-45</td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5763</td><td>przygotowanie EAS-45</td></tr><tr><td>Biotyna-X-NHS</td><td>Calbiochem</td><td>203188</td><td>biotynylacja RBC</td></tr><tr><td>Dimetyloformamid (DMF)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>20673</td><td>biotynylacja RBC</td></tr><tr><td>Bufor boratowy (0,1M)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>11455-90</td><td>biotynylacja RBC</td></tr><tr><td>Streptawidyna</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>21125</td><td>funkcjonalizacja ligandu</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0336</td><td>funkcjonalizacja ligandu</td></tr><tr><td>Kuleczki Quantibrite PE</td><td>BD Biosciences</td><td>340495</td><td>ilościowe oznaczenie gęstości</td></tr><tr><td>Cytometr przepływowy</td><td>BD Biosciences</td><td>&lt;p align=&quot;center">BD LSR II&lt;/p&gt;</td><td>ilościowe oznaczenie gęstości</td></tr><tr><td>&lt;p align=&quot;center">Kapilara&lt;/p&gt; 0,7-1,0mm x 30&quot;</td><td>Kimble Chase</td><td>46485-1</td><td>wyciąganie mikropipety</td></tr><tr><td>Olej mineralny</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2629-1</td><td>montaż komory</td></tr><tr><td>Szkiełko cover glass do mikroskopu</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-G</td><td>montaż komory</td></tr><tr><td>&lt;p align=&quot;center">PE &amp;alpha;-ludzki CD11a &lt;/p&gt;Klon HI 111</td><td>eBioscience</td><td>12-0119-71</td><td>Odczynnik do Rys. 1</td></tr><tr><td>PE anty-ludzki CD54</td><td>eBioscience</td><td>12-0549</td><td>Odczynnik do Rys. 1</td></tr><tr><td>Kontrola izotypowa mysia IgG1 PE</td><td>eBioscience</td><td>12-4714</td><td>Odczynnik do Rys. 1</td></tr><tr><td>hydrauliczny mikromanipulator</td><td>Narishige International</td><td>MO-303</td><td>system mikropipety</td></tr><tr><td>Manipulator mechaniczny</td><td>Newport Corp.</td><td>461-xyz-m, SM-13, DM-13</td><td>system mikropipety</td></tr><tr><td>translatory piez&amp;#8211;elektryczny</td><td>Physik Instruments</td><td>P-840</td><td>system mikropipety</td></tr><tr><td>LabVIEW</td><td>National Instruments</td><td>Wersja 8.6</td><td>system mikropipety</td></tr><tr><td>Karta DAQ</td><td>National Instruments</td><td>USB-6008</td><td>system mikropipety</td></tr><tr><td>Stół optyczny</td><td>Kinetic Systems</td><td>Seria 5200</td><td>system mikropipety</td></tr></tbody></table>

analiza częstotliwości adhezji w celu badania kinetyki in situ międzykomórkowych oddziaływań molekularnych w obrębie złączy komórkowych

Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface

Test adhezji z użyciem mikropipety został opracowany w 1998 roku w celu pomiaru kinetyki dwuwymiarowego (2D) wiązania receptor-ligand1. W teście tym ludzki erytrocyt (RBC) służy jako sensor adhezji oraz komórka prezentująca jedną z oddziałujących cząsteczek. Metoda wykorzystuje mikromanipulację, aby doprowadzić erytrocyt do kontaktu z inną komórką wykazującą obecność drugiej oddziałującej cząsteczki, przy precyzyjnie kontrolowanej powierzchni i czasie kontaktu w celu umożliwienia powstania wiązań. Zdarzenie adhezyjne jest wykrywane jako elongacja erytrocyta podczas rozdzielania obu komórek. Poprzez kontrolę gęstości ligandów unieruchomionych na powierzchni erytrocyta, prawdopodobieństwo adhezji utrzymuje się w zakresie średnim między 0 a 1. Prawdopodobieństwo adhezji szacuje się na podstawie częstotliwości zdarzeń adhezyjnych w serii powtarzalnych cykli kontaktu między dwiema komórkami dla danego czasu kontaktu. Zmieniając czas kontaktu, otrzymuje się krzywą wiązania. Dopasowanie probabilistycznego modelu kinetyki reakcji receptor-ligand1 do krzywej wiązania pozwala wyznaczyć powinowactwo 2D oraz stałą dysocjacji (off-rate).
Metodę analizy zwalidowano, badając oddziaływania receptorów Fcγ z Fc1-6 IgG, selektyn z ligandami glikokonjugatami6-9, integryn z ligandami10-13, wiązania homotypowe kadheryn14 oraz receptora i koreceptora limfocytów T z kompleksami peptyd-główny układ zgodności tkankowej15-19.
Metodę tę wykorzystano do ilościowego określenia regulacji kinetyki 2D przez czynniki biofizyczne, takie jak mikrotopografia błony5, kotwiczenie w błonie2, orientacja i długość cząsteczek6, sztywność nośnika9, krzywizna20 oraz siła uderzenia20, a także czynniki biochemiczne, takie jak modulatory cytoszkieletu i mikrośrodowiska błony, w którym znajdują się oddziałujące cząsteczki, oraz organizacja powierzchniowa tych cząsteczek15,17,19.
Metodę tę wykorzystano również do badania jednoczesnego wiązania podwójnych gatunków receptor-ligand3,4 oraz oddziaływań trimolekularnych19 z zastosowaniem zmodyfikowanego modelu21.
Główną zaletą tej metody jest to, że pozwala ona na badanie receptorów w ich naturalnym środowisku błonowym. Wyniki mogą znacznie różnić się od tych uzyskanych z wykorzystaniem oczyszczonych receptorów17. Metoda ta umożliwia również badanie oddziaływań receptor-ligand w skali subsekundowej, z rozdzielczością czasową znacznie wyższą niż w przypadku typowych metod biochemicznych.
Aby zilustrować metodę pomiaru częstotliwości adhezji za pomocą mikropipety, przedstawiamy pomiar kinetyki wiązania cząsteczki adhezyjnej międzykomórkowej 1 (ICAM-1) unieruchomionej na erytrocytach (RBCs) z integryną αLβ2 na neutrofilach, przy obecności dimerycznej E-selektyny w roztworze w celu aktywacji αLβ2.

Opisano test częstotliwości adhezji służący do pomiaru kinetyki oddziaływań receptor-ligand w sytuacjach, gdy obie cząsteczki są zakotwiczone na powierzchniach oddziałujących komórek. Ten oparty na mechanice test został zilustrowany z wykorzystaniem ludzkiego erytrocyta poddanego ciśnieniu za pomocą mikropipety jako sensora adhezji oraz integryny αLβ2 i cząsteczki adhezyjnej międzykomórkowej 1 jako oddziałujących receptorów i ligandów.

Analiza częstotliwości adhezji w celu badania kinetyki in situ międzykomórkowych oddziaływań molekularnych w obrębie złączy komórkowych

Test adhezji za pomocą mikropipety opracowano w 1998 roku w celu pomiaru kinetyki wiązania receptor-ligand w dwóch wymiarach (2D)1. W teście wykorzystuje się ludzkie krwinki czerwone...

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest pomiar kinetyki oddziaływania między receptorem a ligandem w sytuacji, gdy obie cząsteczki są zakotwiczone na powierzchniach oddziałujących komórek. Osiąga się to poprzez najpierw funkcjonalizację erytrocytów, które stanowią sensory adhezji, za pomocą ligandów, oraz przygotowanie komórek wykazujących ekspresję receptorów. W drugim kroku montowana jest komora mikropipety i przeprowadzane są testy adhezji w celu zarejestrowania zdarzeń adhezyjnych.Następnie wykreśla się krzywą prawdopodobieństwa adhezji w funkcji czasu kontaktu komórek i dopasowuje ją do modelu. W celu oszacowania parametrów kinetycznych uzyskuje się wyniki przedstawiające dwuwymiarową efektywną powinowactwo wiązania oraz stałą szybkości dysocjacji oszacowane na podstawie danych. Skąd zatem wzięła się koncepcja tego testu?Badacze analizują oddziaływania między receptorem a ligandem. Większość z nich mierzy siły rozrywania i my robimy to samo, jednak pewnego dnia zastanowiliśmy się, czy nie można po prostu mierzyć wyniku binarnego: zero dla braku adhezji i jeden dla wystąpienia adhezji, a następnie na podstawie tych pomiarów zero-jedynkowych wyznaczyć kinetykę, aby zaprezentować test częstotliwości z wykorzystaniem mikroprzewodów. Dr Veronica Zana Zina, naukowiec z mojego laboratorium, zaprezentuje Państwu ten eksperyment.Krwinki czerwone wyizolowane z krwi pełnej poddaje się biotinylacji w celu przeprowadzenia testu częstości adhezji. Aby rozpocząć tę procedurę, odwiruj probówkę zawierającą wyizolowane krwinki czerwone, przenieś 10 µL osadu krwinek czerwonych do każdej z kilku fiolek i dodaj do każdej fiolki odpowiednią ilość PBS, aby przygotować kilka stężeń elucji biotyny krwinek czerwonych. Następnie dodaj 10 µL 0,1 molarnego buforu borate do każdej fiolki.Następnie do każdej fiolki należy dodać wyliczoną ilość roztworu biotyny i natychmiast wymieszać w wstrząsarzu typu vortex. Przez kilka sekund każdą fiolkę z erytrocytami należy umieścić w stożkowej probówce o pojemności 50 ml i inkubować na rotatorze przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Po 30 minutach do każdej fiolki należy dodać bufor EAS 45 i wirować przez dwie minuty przy 2000 obr./min. Płukanie buforem EAS 45 należy powtórzyć dwukrotnie, aby łącznie przeprowadzić trzy etapy płukania.Na koniec do każdej fiolki należy dodać 100 µL buforu EAS 45 i przechowywać w temperaturze 4 °C w celu funkcjonalizacji ligandów na powierzchni erytrocytów. Po procesie opisanym w poprzednim kroku erytrocyty inkubuje się z nasyconym stężeniem strep TTR przez 30 minut w temperaturze 4 °C, a następnie płucze trzykrotnie buforem EAS 45 przez dwie minuty przy prędkości 2000 obr./min. Następnie erytrocyty inkubuje się bezpośrednio z biotynylowanym ligandem lub inkubuje erytrocyty z odpowiednim biotynylowanym przeciwciałem wychwytującym, a następnie z ligandami. Protokół przedstawiony w tym filmie wykorzystuje biotynylowane przeciwciało wychwytujące.Mikropipety wykonuje się z kapilarnych rurek borokrzemianowych o niskiej temperaturze topnienia. Najpierw należy użyć wyciągacza mikrokapilar do rozciągnięcia rurek kapilarnych. Następnie, za pomocą mikromanipulatora z mikrokuźnią, należy przyciąć końcówkę mikropipety do pożądanej wielkości otworu.Wymagana średnica zazwyczaj mieści się w przedziale od jednej do pięciu mikronów, w zależności od wielkości komórek wykorzystywanych w badaniu. Aby przygotować komorę komórkową, należy użyć dwóch kawałków szkiełka podstawowego wyciętych do pożądanego rozmiaru, oczyścić szkiełka z kurzu za pomocą sprężonego powietrza, dodać pożywkę do komory komórkowej i uszczelnić komorę z obu stron za pomocą oleju mineralnego, aby zapobiec odparowaniu pożywki. Zapobiegnie to zmianie osmolarności podczas eksperymentu.System mikropipet wykorzystany w tym badaniu składa się z trzech podsystemów: podsystemu obrazowania służącego do obserwacji, rejestracji i analizy ruchów komórki aspirowanej do mikropipety, podsystemu mikromanipulacyjnego umożliwiającego wybór komórek z komory oraz podsystemu ciśnieniowego służącego do aspiracji komórek do mikropipet. Centralnym elementem podsystemu obrazowania jest mikroskop odwrócony z obiektywem imersyjnym 100x. Obrazy z obiektywu są wykrywane przez kamerę CCD i przesyłane do rejestratora wideo.Do systemu podłączono timer wideo w celu monitorowania czasu. Po napełnieniu mikropipety wodą dejonizowaną, należy umieścić ją w uchwycie na napędzie mechanicznym zamontowanym na mikroskopie. Mikropipeta może być precyzyjnie pozycjonowana za pomocą trójosiowego hydraulicznego mikromanipulatora.Jeden z uchwytów mikropipet jest zamontowany na programowanym komputerowo translatorem piezoelektrycznym. Pozwala to na precyzyjne przemieszczanie pipety w cyklu testu adhezji. Podsystem regulacji ciśnienia służy do kontroli ssania.Podczas eksperymentu linia hydrauliczna łączy uchwyt mikropipety z rezerwuarem płynu. Precyzyjny mechaniczny pozycjoner umożliwia dokładną regulację wysokości rezerwuaru. Po zmontowaniu komory ustawiane są mikropipety, następnie do komory wstrzykuje się komórki w celu rozpoczęcia analizy, a za pomocą odpowiednich pipet aspiruje się oddziałujące komórki. Do przesuwania erytrocytu w stronę neutrofila i odsuwania go od niego, przy zachowaniu kontrolowanego czasu i powierzchni kontaktu, używa się elektrycznego translacyjnego urządzenia PSO.Zdarzenie adhezji obserwuje się, gdy erytrocyt wydłuża się podczas oddzielania komórek; brak adhezji odpowiada brakowi wydłużenia erytrocyta. Zapisz zaobserwowane zdarzenia adhezji w kolumnie arkusza Excel, wpisując jedynkę dla adhezji lub zero dla braku adhezji.Zarejestruj krzywą częstotliwości adhezji w funkcji czasu kontaktu, wykorzystując co najmniej trzy różne pary komórek dla każdego czasu kontaktu. Aby uzyskać średnią i błąd standardowy średniej (SEM) jako kontrolę, zarejestruj krzywą wiązania niespecyficznego, używając erytrocytów pokrytych odpowiednimi ligandami i/lub blokując ligandy lub receptory za pomocą ich specyficznej blokady funkcjonalnej. Przy użyciu przeciwciał monoklonalnych specyficzną częstotliwość adhezji dla każdego punktu czasowego kontaktu można obliczyć poprzez odjęcie częstotliwości adhezji niespecyficznej.Dane dotyczące specyficznej częstotliwości adhezji w funkcji czasu kontaktu są dopasowane do modelu probabilistycznego, który opisuje drugiego rzędu interakcję w kierunku prostym oraz pierwszego rzędu interakcję w kierunku odwrotnym w pojedynczym kroku między pojedynczym gatunkiem receptorów a pojedynczym gatunkiem ligandów. W tym równaniu KA oznacza dwuwymiarową powinowactwo, a KA dwuwymiarową stałą szybkości dysocjacji.MR i ML to odpowiednio gęstości receptora i liganda, a AC to powierzchnia kontaktu. Dopasowanie krzywej posiada dwa parametry: ac, k, a oraz K off, ponieważ AC i KA są połączone i określane zbiorczo jako efektywna powinowactwo 2D; ich iloczyn z szybkością dysocjacji (off rate) stanowi efektywną szybkość asocjacji (on rate) 2D: AC K on równa się AC KA razy K off. Przedstawiono tutaj przykład oznaczenia integryny alpha L beta two.Gęstość miejsc na neutrofilach. Neutrofile inkubowano najpierw z 1 µg/mL E-selektyny IG, a następnie zastosowano stężenia nasycające PE- sprzężonego przeciwciała anty-ludzkiego CD11, przeciwciała monoklonalnego lub odpowiedniej mysiej IgG1 w celu kontroli. Po 30 minutach inkubacji próbki przemyto i analizowano na cytometrze przepływowym z zastosowaniem standardowej ilości.Jasne kulek kalibracyjnych PE. Panel A przedstawia histogramy fluorescencji kulek kalibracyjnych wraz z histogramami komórek traktowanych lub nietraktowanych E-selektyną IG. Specyficzne barwienie przeciwciałem monoklonalnym CD 11 A przedstawiono liniami ciągłymi, a odpowiednie barwienie kontrolnymi przeciwciałami izotypowymi liniami przerywanymi.Panel B przedstawia proces kwantyfikacji gęstości. Obliczono log10 dla średniej intensywności fluorescencji każdego z czterech koralików. Wartość szczytu kalibracyjnego z panelu A oraz liczba cząsteczek PE na koralik specyficzna dla danej partii.Wykreślono regresję liniową log 10 cząsteczek PE na kuleczkę w funkcji log 10 fluorescencji dla ponownie wyselekcjonowanych komórek intruzyjnych. Wartość log 10 fi wyniosła 3,99, co zaznaczono niebieskim pełnym kołem, oraz 2,23, co zaznaczono niebieskim pustym kołem, odpowiednio dla specyficznego przeciwciała monoklonalnego i przeciwciała kontrolnego. Po rozwiązaniu równania liniowego dla X, całkowita liczba alpha L beta two lub neutrofili została obliczona na 9 587.Gęstość powierzchniową obliczono na 43 miejsca na mikron kwadratowy, przyjmując średnicę neutrofilów wynoszącą 8,4 mikronów. Kolejny wykres przedstawia bieżącą częstotliwość adhezji fi dla wiązania specyficznego w pierwszej oraz dziesiątej sekundzie. Czas kontaktu mierzony podczas powtarzanych cykli testów adhezji pomiędzy erytrocytami pokrytymi ICAM-1 a ludzkimi neutrofilami wykazującymi integrinę alpha L beta two.W przeciwieństwie do powyższego, przedstawiono tutaj częstotliwość przylegania fi dla wiązania niespecyficznego przy czasie kontaktu wynoszącym jedną i dziesięć sekund, zmierzoną w powtarzalnych cyklach testów adhezji pomiędzy ludzkimi erytrocytami powlekanymi IgG a ludzkimi neutrofilami wykazującymi ekspresję integryny alfa L beta dwa. Ten końcowy wykres ilustruje kinetykę wiązania I A one do integryny alfa L beta dwa neutrofili; prawdopodobieństwa adhezji zmierzone dla trzech par komórek przy każdym czasie kontaktu zostały uśrednione i naniesione na wykres w funkcji czasu kontaktu w celu skontrolowania wiązania niespecyficznego. Zastosowano dwa różne warunki.Jedne erytrocyty pokryte przeciwciałem wychwytującym anty-TFC i inkubowane z ludzkim IgG zamiast ICAM-1 oraz dwie neutrofile wiążące się z erytrocytami niepokrytymi przeciwciałem wychwytującym. Wiązanie niespecyficzne, zapisane jako krzywa kontrolna dla ludzkiego IgG, zostało wykorzystane do uzyskania krzywej specyficznego prawdopodobieństwa adhezji. Zastosowano wcześniej przedstawione równanie korekcji wiązania niespecyficznego.Skorygowaną krzywą prawdopodobieństwa adhezji specyficznej dopasowano za pomocą dopasowania modelowego. Krzywa prawdopodobieństwa adhezji specyficznej pozwoliła wyznaczyć efektywną powinowactwo wiązania. Wartość CKA wynosi 1,4 × 10⁻⁴ µm⁴, a koff wynosi 0,3 s⁻¹.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć, jak mierzyć kinetykę oddziaływań receptor-ligand w sytuacji, gdy obie cząsteczki są zakotwiczone na powierzchniach oddziałujących komórek. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, aby w pierwszych próbach dobrać zakres gęstości ligandów tak, aby częstotliwość adhezji znajdowała się w zakresie średnim; należy również pamiętać, że praca z krwią oraz niektórymi odczynnikami do specyficznych obróbek, np. sodem NaN3 i DMSO, może być niezwykle niebezpieczna. W związku z tym wymagane jest przestrzeganie środków ostrożności, takich jak uważne zapoznanie się z kartami charakterystyki (MSDS) odczynników oraz noszenie rękawiczek podczas wykonywania tej procedury.

adhesion-frequency-assay-for-situ-kinetics-analysis-cross-junctional

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Test częstotliwości adhezji do in situ analizy kinetyki interakcji molekularnych w punktach styku komórki w interfejsie komórka-komórka

W tym filmie demonstrujemy technikę pomiaru interakcji międzykomórkowych między cząsteczkami adhezyjnymi komórek synaptycznych za pomocą testu agregacji komórek HEK. W tym teście równa liczba komórek HEK wyrażających pożądaną cząsteczkę adhezyjną komórek presynaptycznych i białko fluorescencyjne jest mieszana z komórkami HEK wyrażającymi postsynaptyczną cząsteczkę adhezyjną komórek i inne białko fluorescencyjne. Interakcja między cząsteczkami adhezyjnymi komórek zmusza komórki do agregacji, co...

Test agregacji komórek w celu wykrycia interakcji trans między cząsteczkami adhezyjnymi komórek

Ten protokół omawia Wykrywanie Impedancji Elektrycznej Komórki, metodę rejestrowania i analizy widma impedancji przylegających komórek do ilościowego określenia przyczepienia, proliferacji, ruchliwości i reakcji komórkowych na bodźce farmakologiczne i toksyczne. Położono nacisk na wykrywanie przepuszczalności śródbłonka oraz ocenę kontaktów komórka-komórka i komórka-substrat.

Wykrywanie impedancji substratu elektrycznego podłoża komórkowego w celu ilościowego określenia proliferacji śródbłonka, funkcji bariery i ruchliwości

Ta prezentacja demonstruje metodę, za pomocą której elektroporacja przylegających, hodowanych komórek jest używana do badania komunikacji międzykomórkowej, połączeniowej, podczas gdy komórki rosną na szkiełku pokrytym przewodzącym i przezroczystym tlenkiem indu i cyny.

Test funkcjonalny do badania łączenia luk; Elektroporacja ogniw adherentnych na tlenku indu i cyny

Tutaj opisujemy protokół, który łączy dwie techniki proteomiczne, mianowicie dwuwymiarową elektroforezę (2DE) i spektrometrię mas (MS), w celu identyfikacji różnie wyrażonych/potranslacyjnych zmodyfikowanych białek wśród dwóch lub więcej grup próbek pierwotnych. Takie podejście, wraz z eksperymentami funkcjonalnymi, pozwala na identyfikację i charakterystykę markerów prognostycznych/celów terapeutycznych.

Od plamki 2DE-Gel do funkcji białka: lekcja wyciągnięta z HS1 w przewlekłej białaczce limfocytowej

Opisujemy technikę jednoczesnego pomiaru kinetyki wiązania pojedynczego receptora-liganda o regulowanej sile oraz obrazowania w czasie rzeczywistym sygnalizacji wapniowej w pojedynczym limfocycie T.

Sonda siły biomembrany fluorescencyjnej: jednoczesna kwantyfikacja kinetyki receptor-ligand i sygnalizacji wewnątrzkomórkowej indukowanej wiązaniem na pojedynczej komórce

Ten test adhezji przepływu dostarcza prostego, bardzo efektownego modelu interakcji limfocytów T z komórkami nabłonkowymi. Pompa strzykawkowa służy do generowania naprężeń ścinających, a mikroskopia konfokalna rejestruje obrazy w celu określenia ilościowego. Celem tych badań jest skuteczne ilościowe określenie adhezji limfocytów T przy użyciu warunków przepływu.

Test adhezji pod wpływem naprężenia ścinającego do badania oddziaływań cząsteczki adhezyjnej limfocytów T

To badanie pokazuje użyteczność i łatwość ilościowego pomiaru wydłużenia błony komórkowej oraz jego korelację ze zdolnością adhezyjną komórek. Jako reprezentatywny przykład pokazujemy tutaj, że białko 3 związane z Dickkopfem (DKK3) sprzyja zwiększonemu tworzeniu lobopodiów i adhezji komórek w komórkach raka kory nadnerczy in vitro.

Charakterystyka rozszerzeń błon komórkowych i badanie ich roli w dynamice adhezji komórek nowotworowych

Dynamiczne przyleganie komórek odpornościowych do ściany naczynia jest warunkiem wstępnym dla naprowadzania jelit. W tym miejscu przedstawiamy protokół funkcjonalnego testu in vitro do analizy wpływu przeciwciał antyintegrynowych, chemokin lub innych czynników na dynamiczną adhezję komórek ludzkich za pomocą naczyń włosowatych pokrytych adresiną.

Dynamiczny test adhezyjny do analizy funkcjonalnej terapii przeciwadhezyjnych w nieswoistych zapaleniach jelit

Ten protokół opisuje podejście oparte na spektroskopii fluktuacji fluorescencji, mające na celu badanie interakcji między białkami pośredniczącymi w interakcjach komórka-komórka, tj. białkami zlokalizowanymi w połączeniach komórkowych, bezpośrednio w żywych komórkach. Zapewniamy szczegółowe wytyczne dotyczące kalibracji, akwizycji i analizy przyrządów, w tym korekty możliwych źródeł artefaktów.

Test spektroskopii fluktuacji fluorescencji interakcji białko-białko na styku komórka-komórka

Tutaj prezentujemy zoptymalizowany protokół do szybkiego i półilościowego pomiaru interakcji ligand-receptor w trans w heterologicznym systemie komórkowym za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Pomiar interakcji międzykomórkowych poprzez agregację białek w heterologicznym systemie komórkowym

Ten protokół przedstawia eksperymentalne procedury przeprowadzania testu śladu adhezyjnego w celu zobrazowania zdarzeń adhezji podczas szybkiej adhezji toczenia komórek.

Obrazowanie adhezji molekularnej w walcowaniu komórek za pomocą testu śladu adhezyjnego

Poznaj test częstości adhezji do analizy kinetyki interakcji receptor-ligand na powierzchni komórek z wykorzystaniem funkcjonalizowanych erytrocytów jako czujników. Ta metoda umożliwia precyzyjne określenie powinowactwa wiązania i stałej dysocjacji.

Analiza częstotliwości adhezji w celu badania kinetyki in situ międzykomórkowych oddziaływań molekularnych w obrębie złączy komórkowych

Przeglądaj więcej filmów