Name: Test ponownego fałdowania wewnątrzkomórkowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: Poznaj metodę pomiaru wewnątrzkomórkowego ponownego fałdowania białek po szoku cieplnym z użyciem reportera lucyferazy. Technika ta pozwala ocenić aktywność szaperonów molekularnych w komórkach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Danilo Maddalo jest laureatem stypendium badawczego jako Young Investigator Group (YIG) z Instytutu Technologii w Karlsruhe.

1. Wysiewanie komórek

<ol> 
 <li>Przed rozpoczęciem ogrzać pożywkę hodowlaną, PBS 1X oraz trypsynę w łaźni wodnej w temperaturze 37˚C</li>
 <li>Wyjąć komórki z inkubatora i odessać pożywkę.</li>
 <li>Delikatnie nanieść 5 mL PBS 1X na komórki w celu ich przemycia.</li>
 <li>Odessać PBS 1X i nanieść 1 mL trypsyny zawierającej 0,025% EDTA.</li>
 <li>Delikatnie obrócić płytkę, aby zapewnić równomierny rozkład trypsyny.</li>
 <li>Umieścić komórki w inkubatorze w temperaturze 37˚C na 5-10 minut (w zależności od typu komórek). Okresowo sprawdzać, czy komórki odłączyły się, potrząsając płytką.</li>
 <li>Resuspendować komórki w 10-20 mL pożywki i zebrać je do probówki typu falcon o pojemności 50 mL.</li>
 <li>Policzyć komórki za pomocą licznika Beckman. Liczba komórek powinna być wystarczająca, aby zapewnić konfluencję na poziomie około 60-70%.</li>
 <li>Wysiać komórki na płytki i pozostawić je do osiadania na 6-8 godzin.</li>
 
</ol>

2. Transfekcja

<ol>
 <li>Przed transfekcją ogrzać alikwot pożywki bezsurowiczej w łaźni wodnej w temperaturze 37˚C.</li>
 <li>Doprowadzić X-treme Gene 9 do temperatury pokojowej.</li>
 <li>Pipetować pożywkę bezsurowiczą do 2 probówek typu Eppendorf (1 probówka = 1 transfekcja).</li>
 <li>Dodać X-treme Gene 9 do pożywki bezsurowiczej, dbając o to, aby końcówka pipety nie dotykała plastikowej ścianki probówki Eppendorf, i inkubować przez 5 minut. W międzyczasie przygotować dwie mieszaniny DNA: w jednej probówce zmieszać plazmidy dla renilli, firefly oraz pusty wektor kontrolny, a w drugiej probówce renillę, firefly oraz chaperonę molekularną.</li>
 <li>Dodać mieszaninę DNA do każdej probówki Eppendorf zawierającej pożywkę bezsurowiczą z X-treme Gene 9, wymieszać w wstrząsaczu wirowym i inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut.</li>
 <li>Każdą mieszaninę dodawać kroplami na odpowiednie płytki, a następnie inkubować przez 24 godziny w temperaturze 37°C i 5% CO2.</li>
</ol>

3. Pasażowanie komórek

<ol>
 <li>24 godziny po transfekcji poddaj komórki trypsynizacji zgodnie z opisem w punktach 1.4 – 1.6, a następnie rozcieńcz je do końcowej konfluencji 60-70% w płytce 6-dołkowej.</li>
 <li>Przygotuj jedną płytkę dla kontroli bez szoku oraz tyle płytek, ile punktów czasowych regeneracji ma zostać poddanych analizie, zgodnie z przedstawionym na Rys. 2.</li>
 
</ol>

4. Szok termiczny

<ol>
 <li>W celu przeprowadzenia szoku termicznego uprzednio ogrzać pożywkę z surowicą w łaźni wodnej w temperaturze 37˚C.</li>
 <li>Przygotować „bufor do szoku termicznego” poprzez rozcieńczenie w pożywce z surowicą cykloheksymidu do stężenia końcowego 20 µg/ml oraz MOPS do stężenia 20 mM.</li>
 <li>Wyjąć płytki z inkubatora i odessać pożywkę.</li>
 <li>Do każdego dołka dodać 1 mL „buforu do szoku termicznego” i inkubować przez 30 minut w 37˚C i 5% CO2 (płytkę referencyjną również poddać tej procedurze). Spowoduje to zatrzymanie syntezy białek de novo.</li>
 <li>W tym czasie włączyć łaźnię wodną i ustawić temperaturę na 45˚C.</li>
 <li>Po inkubacji uszczelnić pokrywy płytek wcześniej pociętym w paski Parafilmem. Płytkę referencyjną (100% sfałdowanej lucyferazy) pozostawić w inkubatorze.</li>
 <li>Inkubować płytki w 45˚C przez 30 minut.</li>
 <li>Wyjąć płytki z łaźni wodnej, usunąć Parafilm i umieścić płytki z powrotem w inkubatorze w celu regeneracji.</li>
 <li>W każdym wyznaczonym punkcie czasowym zebrać komórki i przemyć je w PBS 1X, wirując przy 2000Xg przez 1 minutę w 4˚C.</li>
</ol>

5. Liza komórek i pomiar aktywności lucyferazy

<ol>
 <li>Aby zapewnić efektywną lizę komórek, pellet komórkowy należy gwałtownie zamrozić w ciekłym azocie.</li>
 <li>Do probówki szklanej dodać 200 µl buforu do lizy pasywnej rozcieńczonego 1:5 w wodzie dwukrotnie destylowanej.</li>
 <li>Do płytki 96-dołkowej nanieść 30 µl lizatu komórkowego. Każda próbka jest pipetowana w trzech powtórzeniach.</li>
 <li>Tylko próbki referencyjne „niepoddane szokowi” (non shocked) zostaną wykorzystane do pomiaru aktywności lucyferazy renilla, ponieważ etap ten służy do sprawdzenia równomierności wydajności transfekcji.</li>
 <li>Przygotować roztwory do analizy. W przypadku roztworu lucyferyny rozcieńczyć lucyferynę do stężenia końcowego 0,2 mM w buforze Gly-Gly. W przypadku buforu reakcyjnego rozcieńczyć DTT i ATP do stężenia końcowego 1 mM w buforze Gly-Gly. Dla buforu reakcyjnego coelenterazyny rozcieńczyć coelenterazynę do stężenia końcowego 0,2 µM w buforze coelenterazyny. Roztwór lucyferyny oraz bufor reakcyjny coelenterazyny należy przechowywać w warunkach chroniących przed światłem.</li>
 <li>Następnie umieścić płytkę 96-dołkową w luminometrze i uruchomić program „Wallac 1420 Workstation”.</li>
 <li>Zanurzyć końcówkę Pump1 w probówce typu falcon zawierającej roztwór coelenterazyny. Zamknąć pokrywkę, aby do probówki nie docierało światło.</li>
 <li>Z menu wybrać opcję „Dispenser maintenance” i zaznaczyć Pump1.</li>
 <li>Wybrać opcję „Fill”.</li>
 <li>Aby edytować układ płytki, wybrać w menu opcję „Explore protocol and results”. Wybrać odpowiedni protokół i kliknąć go dwukrotnie. Następnie zaznaczyć dołki, które mają zostać odczytane.</li>
 <li>Powrócić do „Wallac Manager” i kliknąć „Start”. Reakcja lucyferazy renilla z jej substratem, coelenterazyną, emituje światło o długości fali szczytowej 482 nm.</li>
 <li>Po odczycie przejść do „Dispenser maintenance”, wybrać „Empty” oraz Pump1, aby odprowadzić cały pozostały roztwór z powrotem do probówki.</li>
 <li>Przenieść końcówkę do probówki typu falcon zawierającej wodę i zaznaczyć „Flush”.</li>
 <li>Po etapie płukania opróżnić probówkę, wybierając „Empty”.</li>
 <li>Umieścić końcówkę Pump1 w probówce typu falcon z buforem reakcyjnym, a końcówkę Pump2 w probówce typu falcon z lucyferyną.</li>
 <li>Zmienić układ płytki.</li>
 <li>W menu „Dispenser Maintenance” wybrać „Fill” dla Pump1 oraz Pump2.</li>
 <li>Wybrać protokół i rozpocząć odczyt. Reakcja lucyferazy Firefly z jej substratem, lucyferyną, emituje światło o długości fali szczytowej 560 nm.</li>
 <li>Po zakończeniu odczytu powtórzyć procedurę Empty-Flush-Empty dla Pump1 oraz Pump2.</li>
 <li>Wyniki są teraz dostępne w programie „Wallac 1420 Explorer”.</li>
 <li>Każdy eksperyment jest powiązany z numerem analizy, nazwą użytkownika oraz datą rozpoczęcia i zakończenia.</li>
 <li>Wyniki można teraz wyeksportować do pliku Excel.</li>
 <li>Do obliczeń komórki podzielono na trzy grupy: 1. próbki referencyjne niepoddane szokowi (przyjęte jako 100% zrefoldowanej lucyferazy firefly); 2. komórki bez chaperonów molekularnych poddane szokowi termicznemu; 3. komórki z chaperonami molekularnymi poddane szokowi termicznemu.</li>
</ol>


6. Reprezentatywne wyniki

Renaturacja białek jest bezpośrednio związana z czasem regeneracji, dlatego w celu sprawdzenia, czy układ działa prawidłowo, należy przeprowadzić test, pobierając komórki w różnych punktach czasowych. Bezpośrednia korelacja między czasem a procentem renaturacji wskazuje, że eksperyment został przeprowadzony prawidłowo i że czas ten stanowi czynnik ograniczający. Należy jednak zawsze brać pod uwagę, że renaturacja po szoku termicznym jest zjawiskiem nasycalnym, w związku z czym przed rozpoczęciem jakiegokolwiek eksperymentu należy przeprowadzić właściwą analizę przebiegu czasowego.








<img src="/files/ftp_upload/3540/3540fig1.jpg" alt="Schemat testu lucyferazy; transfekcja, szok termiczny, proces regeneracji; przebieg eksperymentu." data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> Rycina 1. 

Przegląd eksperymentu. Test refoldingu in vivo trwa od 3 do 4 dni. W dniu pierwszym komórki są wysiewane i poddawane transfekcji. Następnego dnia komórki są przesiewane do mniejszego formatu, a w dniu trzecim poddawane szokowi termicznemu. Na tym etapie możliwe jest przeprowadzenie testu lucyferazy bezpośrednio po zebraniu komórek lub zamrożenie osadu komórkowego w temperaturze -80°C i wykonanie testu w innym terminie.

<img src="/files/ftp_upload/3540/3540fig2.jpg" alt="Schemat procesu transfekcji: kontrola vs chaperony, fazy regeneracji, analiza na płytce wielodołkowej." data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> Rysunek 2. 
Pasażowanie komórek. W 2. dniu komórki są przesiewane do płytki 6-dołkowej. Każda transfekcja zostanie rozcieńczona w osobnym dołku, aby wszystkie transfekcje znajdowały się na tej samej płytce. Każda płytka będzie odpowiadać określonemu czasowi regeneracji, oprócz płytki referencyjnej bez szoku.

<img src="/files/ftp_upload/3540/3540fig3.jpg" alt="Proces renormalizacji białka; renormalizacja (%) w funkcji czasu regeneracji; wykres słupkowy z danymi dotyczącymi chaperonów molekularnych." data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> Rycina 3. 
Reprezentatywny poprawny wynik. A. Procent renormalizacji mierzony bezpośrednio za pomocą aktywności lucyferazy świetlikowej. Każdy wykres słupkowy przedstawia procent renormalizacji w nieobecności (czarne słupki) i w obecności (czerwone słupki) chaperonu molekularnego w różnych punktach czasowych regeneracji. B. Korelacja między czasem a renormalizacją w nieobecności (czarna linia) i w obecności (czerwona linia) chaperonu. Wartości r kwadrat wskazują na dobrą korelację.

Na Rys. 3A przedstawiono reprezentatywne wyniki, w których komórki zbierano 15, 30, 45, 60 i 120 minut po szoku termicznym w obecności (czerwone słupki) i w nieobecności (czarne słupki) chaperonu molekularnego. Procent zrefoldowanej lucyferazy wzrasta wraz z wydłużeniem czasu rekonwalescencji oraz po transfekcji chaperonem molekularnym. Przedstawiono korelację między refoldingiem a czasem dla grupy kontrolnej (Rys. 3B, czarna linia) oraz dla komórek transfekowanych chaperonem molekularnym (Rys. 3B, czerwona linia).

<img src="/files/ftp_upload/3540/3540fig4.jpg" alt="Analiza refoldingu białka; A: Wykres słupkowy; B: Wykres rozrzutu; Wpływ chaperonów molekularnych na regenerację." data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> Rycina 4. 
Reprezentatywny nieprawidłowy wynik. A. Procent refoldingu mierzony bezpośrednio za pomocą aktywności lucyferazy. Każdy wykres słupkowy przedstawia procent refoldingu w przypadku braku (słupki czarne) oraz obecności (słupki czerwone) chaperonu molekularnego w różnych punktach czasowych regeneracji. B. Korelacja między czasem a refoldingiem w przypadku braku oraz obecności (linia czerwona) chaperonu. Wartości r-kwadrat wskazują na słabą korelację.

Rysunek 4A. przedstawia reprezentatywny wynik niewłaściwie przeprowadzonego eksperymentu. Zarówno w grupie kontrolnej (czarne słupki), jak i w komórkach z transfekcją chaperony molekularnej (czerwone słupki) nie odnotowano wzrostu refoldingu białka w czasie. Ponadto transfekcja chaperony molekularnej nie doprowadziła do zwiększenia poziomu refoldingu. Ta słaba korelacja jest potwierdzona na Rys. 4B, gdzie wartości r-kwadrat wynoszą odpowiednio 0,6619 dla grupy kontrolnej (czarna linia) i 0,1882 dla komórek z transfekcją chaperony molekularnej (czerwona linia).

<ol><li>Bukau, B., Weissman, J., Horwich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+chaperones+and+protein+quality+control%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular chaperones and protein quality control.</a> Cell. 125, 443-443 (2006).</li>
<li>Ritossa, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+the+heat+shock+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stress+Chaperones%22%5BJournal%5D)">Discovery of the heat shock response.</a> Cell Stress Chaperones. 1, 97-97 (1996).</li>
<li>Hendrick, J. P., Hartl, F. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+chaperone+functions+of+heat-shock+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Molecular chaperone functions of heat-shock proteins.</a> Annu. Rev. Biochem. 62, 349-349 (1993).</li>
<li>Fuqua, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat+shock+proteins+and+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Breast.+Cancer.+Res.+Treat%22%5BJournal%5D)">Heat shock proteins and drug resistance.</a> Breast. Cancer. Res. Treat. 32, 67-67 (1994).</li>
<li>Guzhova, I., Margulis, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hsp70+chaperone+as+a+survival+factor+in+cell+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Rev.+Cytol%22%5BJournal%5D)">Hsp70 chaperone as a survival factor in cell pathology.</a> Int. Rev. Cytol. 254, 101-101 (2006).</li>
<li>Whitesell, L., Lindquist, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HSP90+and+the+chaperoning+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">HSP90 and the chaperoning of cancer.</a> Nat. Rev. Cancer. 5, 761-761 (2005).</li>
<li>Konstantinopoulos, P. A., Papavassiliou, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((17-AAG%3A+mechanisms+of+antitumour+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Expert.+Opin.+Investig.+Drugs%22%5BJournal%5D)">17-AAG: mechanisms of antitumour activity.</a> Expert. Opin. Investig. Drugs. 14, 1471-1471 (2005).</li>
<li>Galluzzi, L., Giordanetto, F., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+HSP70+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Targeting HSP70 for cancer therapy.</a> Mol. Cell. 36, 176-176 (2009).</li>
<li>Ozacmak, V. H., Barut, F., Ozacmak, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melatonin+provides+neuroprotection+by+reducing+oxidative+stress+and+HSP70+expression+during+chronic+cerebral+hypoperfusion+in+ovariectomized+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pineal.+Res%22%5BJournal%5D)">Melatonin provides neuroprotection by reducing oxidative stress and HSP70 expression during chronic cerebral hypoperfusion in ovariectomized rats.</a> J. Pineal. Res. 47, 156-156 (2009).</li>
<li>Schroder, H., Langer, T., Hartl, F. U., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DnaK%2C+DnaJ+and+GrpE+form+a+cellular+chaperone+machinery+capable+of+repairing+heat-induced+protein+damage%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO.+J%22%5BJournal%5D)">DnaK, DnaJ and GrpE form a cellular chaperone machinery capable of repairing heat-induced protein damage.</a> EMBO. J. 12, 4137-41 (1993).</li>
<li>Thulasiraman, V., Matts, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+geldanamycin+on+the+kinetics+of+chaperone-mediated+renaturation+of+firefly+luciferase+in+rabbit+reticulocyte+lysate%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Effect of geldanamycin on the kinetics of chaperone-mediated renaturation of firefly luciferase in rabbit reticulocyte lysate.</a> Biochemistry. 35, 13443-13443 (1996).</li>
<li>Howarth, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hsp40+molecules+that+target+to+the+ubiquitin-proteasome+system+decrease+inclusion+formation+in+models+of+polyglutamine+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Hsp40 molecules that target to the ubiquitin-proteasome system decrease inclusion formation in models of polyglutamine disease.</a> Mol. Ther. 15, 1110-1110 (2007).</li>
<li>Nollen, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bag1+functions+in+vivo+as+a+negative+regulator+of+Hsp70+chaperone+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Bag1 functions in vivo as a negative regulator of Hsp70 chaperone activity.</a> Mol. Cell. Biol. 20, 1083-1083 (2000).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W pracy przedstawiono protokół pomiaru wewnątrzkomórkowej aktywności fałdowania molekularnych białek opiekuńczych. Cały test można przeprowadzić w ciągu 3 do 4 dni, jak pokazano na przeglądzie na ryc. 1.

Solidność i liniowość sygnału świetlnego wytwarzanego przez świetlika i lucyferazy renilla stanowią solidną podstawę dla odtwarzalności protokołu. 

Krytycznym etapem testu jest wybór skutecznego odczynnika do transfekcji, aby zapewnić nadekspresję...

<table><tbody><tr><td colspan="4">Do tego eksperymentu użyto luminometru z Luminometru Perkin Elmer '1420 Luminescence Counter' Vector Light&#8242; </td></tr><tr><td colspan="4">Programy dla luminometru:</td></tr><tr><td colspan="4">Renilla: Pompa 1, 100 &mu; l iniekcja</td></tr><tr><td colspan="4">Bufor reakcyjny: Pump1, 70 &mu; l wstrzyknięcie</td></tr><tr><td colspan="4">Lucyferyna: Pump2, 30&mu; l wtrysk</td></tr><tr><td colspan="4">Dla przygotuj te roztwory podstawowe w wodzie podwójnie destylowanej:</td></tr><tr><td colspan="4"><ul style="list-style:none"> <li>- 1M MgSO4 : 246,48g MgSO4*7H2O w 1 litrze< silny></silny></li> <li>- <silny>0,5M EGTA</mocny>: 190,18g EGTA w 1 litrze</li> <li>- <silny>1M KH2PO4: 136,09g KH2PO4 w 1 litrze</li> <li>- <silny>1M K2HPO4: 228,23g K2HPO4*3H2O w 1 litrze</li> <li>- <silny>5M NaCl</mocny>: 292,2g NaCl w 1 litrze</li> <li>- 0,5M EDTA: 186,12g EDTA*2H2O w 1 litrze </li> </ul></td></tr><tr><td colspan="4">GLY-GLY-buffer: </td></tr><tr><td colspan="4"><ul style="styl-listy: brak"> <li>-25mM glicyloglicyna </li> <li>- 15mM MgSO4</li> <li>- 4mM EGTA</li> </ul></td></tr><tr><td colspan="4">Na 1 litr użyj 3,3 g glicyloglicyny, 15 ml roztworu 1M MgSO4 i 8 ml 0,5 M roztworu EGTA. Rozpuścić w wodzie, dostosować pH do 7,8 i doprowadzić do całkowitej objętości 1 litra.</td></tr><tr><td colspan="4">Bufor reakcyjny dla Renilla/C&#8211; bufor lenterazine: </td></tr><tr><td colspan="4"><ul style="list-style:none"> <li>- 13,4mM KH2PO4</li> <li>- 86,6mM KH2PO4</li> <li>- 0,5M NaCl</li> <li>- 1mM EDTA</li> </ul></td></tr><tr><td colspan="4">Na 1 litr użyj 13,4ml roztworu 1M KH2PO4, 86,6ml 1M K2HPO4, 100 ml 5M roztworu NaCl i 2 ml 0,5M roztworu EDTA. </td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium 1X)</td><td>GIBCO</td><td>41966029</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca Gold</td><td>PAA</td><td>A15-151</td><td></td></tr><tr><td>X-treme Gen 9 Odczynnik do transfekcji DNA</td><td>Roche</td><td>06365809001</td><td></td></tr><tr><td>PBS Dulbecco's Fosforan buforowany Saline 1X</td><td>GIBCO</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>MOPS 3-(N-Morfolino)Kwas propanosulfonowy</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>M1254</td><td></td></tr><tr><td>Cykloheksymid</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>C7698</td><td></td></tr><tr><td>Pasywny bufor do lizy 5X</td><td>Promega</td><td>E194A</td><td></td></tr><tr><td> Glycylglycin EGTA MgSO4 (MgSO4*7H2O)</td><td>SIGMA-ALDRICH Roth Roth</td><td>Roth G7278 3054.2 P027.1</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4 K2HPO4 (K2HPO4*3H2O) NaCl EDTA</td><td>Roth Roth Roth Roth</td><td>3904.1 6878.2 3957.1 8043.1</td><td></td></tr><tr><td>Luciferin Firefly</td><td>Biosynth</td><td>L8200</td><td></td></tr><tr><td>C&#8211; lenterazyna</silny></td><td>Biosynth</td><td>C7000</td><td></td></tr><tr><td><silny>DTT</silny> (Ditiothreitol)</td><td>Roth</td><td>6908.2</td><td></td></tr><tr><td><silny>ATP</silny> (trifosforan adenozyny)<silny></silny></td><td>Roche</td><td>10519987001<silny></silny></td><td></td></tr></tbody></table>

test ponownego fałdowania wewnątrzkomórkowego

Intracellular Refolding Assay

Ten protokół opisuje metodę pomiaru aktywności enzymatycznej molekularnych białek opiekuńczych w systemie komórkowym oraz możliwych efektów związków o działaniu hamującym/stymulującym. Molekularne białka opiekuńcze są białkami zaangażowanymi w regulację fałdowania białek1 i odgrywają kluczową rolę w promowaniu przetrwania komórek w przypadku stresu, takiego jak szok cieplny2, głód składników odżywczych i narażenie na chemikalia/trucizny3. Z tego powodu stwierdzono, że białka opiekuńcze są zaangażowane w takie zdarzenia, jak rozwój nowotworu, chemiooporność komórek rakowych4 oraz neurodegeneracja5. Projektowanie małych cząsteczek zdolnych do hamowania lub stymulowania aktywności tych enzymów jest zatem jedną z najlepiej zbadanych strategii terapii nowotworów7 i zaburzeń neurodegeneracyjnych9. Opisany tutaj test daje możliwość zmierzenia aktywności ponownego fałdowania określonego molekularnego białka opiekuńczego oraz zbadania wpływu związków na jego aktywność. W tej metodzie gen badanego opiekuńczego molekularnego jest transfekowany wraz z wektorem ekspresyjnym kodującym gen lucyferazy świetlika. Opisano już, że denaturowana lucyferazy świetlika może być ponownie fałdowana przez molekularne białka opiekuńcze10,11. Jako normalizacja kontroli transfekcji transfekcja jest transfekowana wektorem kodującym gen lucyferazy renilla. Wszystkie transfekcje opisane w tym protokole są wykonywane za pomocą X-treme Gene 11 (Roche) w komórkach HEK-293. W pierwszym etapie synteza białek jest hamowana przez traktowanie komórek cykloheksymidem. Następnie rozwijanie białek jest indukowane przez szok termiczny w temperaturze 45°C przez 30 minut. Po odzyskaniu w temperaturze 37°C białka są ponownie fałdowane do swojej aktywnej konformacji, a aktywność lucyferazy świetlika jest wykorzystywana jako odczyt: im więcej światła zostanie wyprodukowane, tym więcej białka odzyska pierwotną konformację. Komórki bez szoku cieplnego są ustawione jako odniesienie (100% ponownie złożonej lucyferazy).

W tym protokole opisana jest metoda pomiaru ponownego fałdowania białek wewnątrzkomórkowych po szoku cieplnym. Metoda ta może być stosowana do badania fałd, takich jak molekularne białka opiekuńcze i ich kofaktory lub związki, które mogą wpływać na ich aktywność. Aktywność lucyferazy świetlika jest używana jako reporter do pomiaru aktywności ponownego fałdowania białka opiekuńczego.

Test ponownego fałdowania wewnątrzkomórkowego

This protocol describes a method to measure the enzymatic activity of molecular chaperones in a cell-based system and the possible effects of compounds ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest pomiar zależnego od białek opiekuńczych wewnątrzkomórkowego refoldingu białek po szoku termicznym. Wykorzystując reporter lukiferyzowy, należy najpierw przetransfekować komórki plazmidami kodującymi gen reportera lukiferyzowego oraz interesującą nas białko opiekuńcze. Następnie przetransfekowane komórki należy podzielić na grupy odpowiadające punktom czasowym regeneracji przewidzianym w planie eksperymentalnym.Następnego dnia poddaj komórki szokowi termicznemu, aby wywołać rozfałdowanie białek. Pozostaw je do regeneracji w celu przywrócenia wewnątrzkomórkowego fałdowania białek, a następnie zmierz aktywność reportera lucyferazy. Wyniki pozwalają ocenić zależne od czasu i zależne od białek opiekuńczych refałdowanie białek na podstawie testu lucyferazy.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak testy refoldingowe in vitro, jest możliwość uzyskania fizjologicznego odczytu wpływu związków lub białek na aktywność chaperonów. Zastosowanie tej techniki rozszerza się na terapię szerokiego spektrum schorzeń, takich jak choroby neurodegeneracyjne czy nowotwory, ponieważ chaperony odgrywają istotną rolę w rozwoju tych patologii. W pierwszej kolejności należy ogrzać pożywkę hodowlaną, PBS oraz trypsynę do 37 °C w kąpieli wodnej.Przemyj konfluencyjną hodowlę komórek HEK 2 93 pięcioma mililitrami PBS. Następnie nanieś jeden mililitr trypsyny zawierającej 0,025% EDTA, delikatnie obróć płytkę, aby równomiernie rozprowadzić trypsynę, i inkubuj w temperaturze 37 °C. Okresowo potrząsaj płytką, aby sprawdzić, czy komórki odłączyły się od podłoża.Następnie resuspenduj komórki w 10 mililitrach kompletnego medium DMEM i przenieś je do probówki Falcon o pojemności 50 mililitrów. Następnie policz komórki za pomocą licznika Beckman. Wysiej komórki przy konfluencji około 60 do 70% i inkubuj przez sześć do ośmiu godzin.Doprowadzić odczynnik extreme gene, nine oraz alikwot medium bezsurowiczego do odpowiednich temperatur: odczynnik do temperatury pokojowej, a medium do 37 °C. Przenieść medium bezsurowicze pipetą do dwóch probówek einor. Następnie dodać odczynnik extreme gene nine, unikając dotykania ścianek probówek einor, i inkubować przez pięć minut w temperaturze pokojowej.W międzyczasie przygotuj mieszaniny do transfekcji 2D NA w probówce pierwszej, a do probówki drugiej dodaj ran vanilla firefly oraz pusty wektor kontrolny. Dodaj ran vanilla firefly oraz chaperonę molekularną. Dodaj DNA do mieszaniny odczynnika do transfekcji, wymieszaj w wortexie i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 20 minut.Kontynuuj dodawanie tej mieszaniny do wysianych komórek i inkubuj przez 24 godziny. Zbierz przetransfekowane komórki przy użyciu trypsyny; wysiej komórki w płytkach sześciodołkowych przy konfluencji 60-70% i pozostaw je w inkubatorze na noc. Odsuń medium z przetransfekowanych komórek.Następnie dodaj 1 ml buforu do szoku termicznego i inkubuj przez 30 minut. Aby zatrzymać syntezę białek de novo, zabezpiecz pokrywki paskami parafilmowymi i inkubuj w kąpieli wodnej o temperaturze 45 °C przez 30 minut. Następnie usuń parafilm i umieść komórki z powrotem w inkubatorze w celu regeneracji w określonych punktach czasowych.Zebrać komórki i przemyć je raz w PBS. Aby zapewnić efektywną lizę komórek, zamrozić pellet komórkowy w ciekłym azocie, a następnie dodać 200 µL rozcieńczonego buforu do pasywnej lizy. Następnie podzielić próbkę na trzy powtórzenia, nakładając po 30 µL lizatu komórkowego do każdej studzienki płytki 96-dołkowej.Aby ocenić wydajność transfekcji, należy rozpocząć od próbek referencyjnych niepoddanych impulsowi elektrycznemu. W celu pomiaru aktywności lucyferazy Ran, przygotować świeży bufor reakcyjny 0,2 mM Lucifer w buforze gliny (gly Gly) zawierający 1 mM ATP oraz 0,2 µM buforu reakcyjnego eziny. Włożyć płytkę 96-dołkową do luminometru i uruchomić program.Stanowisko robocze Wallach 1420. Wprowadź pompę pierwszą do probówki Falcon zawierającej 0,2 µM buforu reakcyjnego ezyny. Wybierz z menu opcję konserwacji dozownika i zaznacz pompę pierwszą.Wybierz opcję wypełniania, aby edytować układ płytki. Wybierz opcję eksploracji protokołu i wyników w menu. Wybierz protokół.Następnie należy wybrać doletki do odczytu. Powróć do menedżera Wallach i kliknij start, aby zmierzyć emisję próbek. Przy 482 nanometrach przejdź do konserwacji dozownika, wybierz opcję empty and pump one, aby odprowadzić cały pozostały roztwór z powrotem do probówki.Teraz przenieś probówkę do probówki typu Falcon zawierającej wodę i wykonaj płukanie. Następnie wybierz opcję opróżniania (empty). Potem umieść probówkę z pompy pierwszej w buforze reakcyjnym, a probówkę z pompy drugiej w roztworze LUCIFERIAN.Zmień układ płytki. Wybierz opcję wypełniania dla pompy pierwszej i pompy drugiej. Z menu konserwacji dozownika wybierz protokół i rozpocznij pomiar reakcji lucyferazy świetlika przy długości fali 560 nanometrów.Po zakończeniu cyklu powtórz procedurę: opróżnianie, płukanie, opróżnianie. W przypadku pompy pierwszej i pompy drugiej wyświetl wyniki w urządzeniu Wallach 1420 Explorer. Każdemu eksperymentowi przypisany jest odpowiedni test.Wprowadź nazwę użytkownika oraz datę początkową i końcową, a następnie wyeksportuj wyniki do pliku Excel. W analizie refolding białek jest bezpośrednio powiązany z czasem regeneracji. W tym doświadczeniu komórki są oceniane w różnych punktach czasowych po szoku termicznym.Wobec braku i w obecności chaperonu molekularnego. Zgodnie z oczekiwaniami, odsetek zrefoldowanej lucyferazy wzrasta wraz z wydłużeniem czasu rekuperacji zarówno w grupach kontrolnych, jak i w komórkach transfekowanych chaperonem molekularnym. Z kolei nieprawidłowy zestaw danych wykazuje niskie wartości R kwadrat dla korelacji między czasem a refoldingiem.Po zastosowaniu tej techniki można przeprowadzić inne metody, takie jak test TPAs in vitro, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, na przykład dotyczące hamowania aktywności enzymatycznej chaperonu. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat pomiaru białek wewnątrzkomórkowych poy szoku termicznego.

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Badanie oddziaływań białko-białko jest niezbędne do analizy funkcjonalności białek. W niniejszym materiale przedstawiamy test wiązania białko-białko in vitro, służący do badania interakcji między białkiem unieruchomionym w błonie a białkiem rozpuszczalnym. Test ten stanowi niezawodną metodę sprawdzania oddziaływań pomiędzy białkiem nierozpuszczalnym a białkiem w roztworze.

Analiza nakładkowa białek błonowych: protokół badania interakcji między białkami rozpuszczalnymi a nierozpuszczalnymi in vitro

Źródło: Dahl, J. i in. Wykrywanie pH-zależnej aktywności Escherichia coli Chaperone HdeB in vitro i in vivo. J. Vis. Exp. (2016)Ten film demonstruje test oparty na spektrofotometrze fluorescencyjnym, który pozwala ocenić aktywność chaperonów na białku substratu pod wpływem stresu kwasowego i cieplnego. Opisuje on kroki monitorowania rozwijającego się i agregującego się podłoża poprzez rozpraszanie światła, porównując warunki z i bez chaperone.

Ocena aktywności bakteryjnego chaperonów poprzez termiczne rozwijanie białka modelowego

Ten film opisuje test degradacji dla nieprawidłowo sfałdowanych białek za pomocą leczenia cykloheksymidem wraz z frakcjonowaniem detergentem. Metoda ta pomaga w badaniu dynamiki nieprawidłowo sfałdowanych białek i odkrywaniu dogłębnych mechanizmów obrotu białkami.

Test degradacji białek podatnych na nieprawidłowe fałdowanie: technika monitorowania nieprawidłowo sfałdowanej degradacji białek przy użyciu obróbki cykloheksymidem i frakcjonowania detergentem

Ten film opisuje test mikropłytek in vitro oparty na fluorescencji w celu zbadania kinetyki degradacji znakowanego fluorescencyjnie, nieprawidłowo sfałdowanego zmutowanego białka lucyferazy, ulegającego ekspresji w jądrach transfekowanych komórek ssaków. Test polega na traktowaniu komórek eksprymujących zmutowane białko fluorescencyjne za pomocą inhibitora translacji i inhibitora proteasomu w celu oceny degradacji nieprawidłowo sfałdowanego białka za pośrednictwem proteasomu.

Test pościgowy cykloheksymidu oparty na mikropłytkach fluorescencyjnych: technika monitorowania kinetyki degradacji fluorescencyjnych nieprawidłowo sfałdowanych białek jądrowych

Żywotność komórek zależy od szybkiego i skutecznego radzenia sobie z nieprawidłowym fałdowaniem białek.  W tym miejscu opisujemy metodę wizualizacji różnych potencjalnych losów nieprawidłowo sfałdowanego białka: ponownego fałdowania, degradacji lub sekwestracji w inkluzjach. Demonstrujemy zastosowanie czujnika składania, Ubc9ts, do monitorowania proteostazy i kontroli jakości agregacji w żywych komórkach za pomocą mikroskopii 4D.

Obrazowanie 4D agregacji białek w żywych komórkach

Tutaj opisujemy zoptymalizowaną technikę produkcji wysokiej jakości kompleksu witaminy A/RBP oraz dwie techniki monitorowania w czasie rzeczywistym do badania transportu witaminy A przez STRA6, receptor RBP.

Analizy transportu retinolu w czasie rzeczywistym przez receptor błonowy białka wiążącego retinol w osoczu

Ten artykuł opisuje użycie białka fuzyjnego lucyferazy świetlika i GFP do badania in vivo fałdowania białek u Saccharomyces cerevisiae.  Za pomocą tego odczynnika można jednocześnie monitorować fałdowanie modelowego białka zdenaturowanego termicznie za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i testu enzymatycznego w celu zbadania roli składników sieci proteostazy w kontroli jakości białka.

Sprzężone testy do monitorowania ponownego fałdowania białek u Saccharomyces cerevisiae

β-beczkowate białka błony zewnętrznej (OMP) pełnią wiele funkcji w zewnętrznych błonach bakterii Gram-ujemnych, mitochondriów i chloroplastów. W tym miejscu mamy nadzieję złagodzić znane wąskie gardło w badaniach strukturalnych poprzez przedstawienie protokołów produkcji β-beczkowych OMP w ilościach wystarczających do określenia struktury za pomocą krystalografii rentgenowskiej lub spektroskopii NMR.

Od konstruktów do kryształów – w kierunku określania struktury β-baryłkowych białek błony zewnętrznej

Ten raport opisuje protokoły pomiaru szybkości degradacji nieprawidłowo sfałdowanych białek za pomocą testów western blot lub opartych na fluorescencji. Metody te mogą być stosowane do analizy innych nieprawidłowo sfałdowanych białek oraz do wysokoprzepustowych badań przesiewowych.

Testy degradacji nieprawidłowo sfałdowanych białek w komórkach

Przedstawiono procedurę ponownego fałdowania domeny wiążącej ligand peryplazmatyczny dCACHE chemoreceptora Campylobacter jejuni Tlp3 z ciał inkluzyjnych i oczyszczania w celu uzyskania miligramowych ilości białka.

Metoda skutecznego ponownego fałdowania i oczyszczania domeny wiążącej ligand chemoreceptora

Tutaj opisujemy metodę oczyszczania enzymów pirofosfokinazy znakowanych histydyną i wykorzystanie chromatografii cienkowarstwowej radioznakowanych substratów i produktów do badania aktywności enzymatycznej in vitro. Test aktywności enzymatycznej ma szerokie zastosowanie do dowolnej kinazy, cyklazy nukleotydowej lub reakcji przenoszenia fosforu, której mechanizm obejmuje hydrolizę trifosforanu nukleotydów.

Test oczyszczania i aktywności in vitro dla syntetazy (p)ppGpp z Clostridium difficile

Poznaj metodę pomiaru wewnątrzkomórkowego ponownego fałdowania białek po szoku cieplnym z użyciem reportera lucyferazy. Technika ta pozwala ocenić aktywność szaperonów molekularnych w komórkach.

Test ponownego fałdowania wewnątrzkomórkowego

Przeglądaj więcej filmów