Test ponownego fałdowania wewnątrzkomórkowego
January 24th, 2012
W tym protokole opisana jest metoda pomiaru ponownego fałdowania białek wewnątrzkomórkowych po szoku cieplnym. Metoda ta może być stosowana do badania fałd, takich jak molekularne białka opiekuńcze i ich kofaktory lub związki, które mogą wpływać na ich aktywność. Aktywność lucyferazy świetlika jest używana jako reporter do pomiaru aktywności ponownego fałdowania białka opiekuńczego.
Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest zmierzenie białka wewnątrzkomórkowego zależnego od białka opiekuńczego, zwijającego się po szoku cieplnym. Za pomocą reportera lucyferazy najpierw transfekuj komórki plazmidami pokrywającymi gen reporterowy lucyferazy i opiekuna będącego przedmiotem zainteresowania. Następnie podziel transfekowane komórki na punkty czasowe odzyskiwania w projekcie eksperymentalnym.
Następnego dnia komórki poddają się szokowi cieplnemu, aby wywołać rozwijanie się białka. Pozwól na regenerację, aby odzyskać wewnątrzkomórkowe fałdowanie białek, a następnie zmierz aktywność reporterową lucyferazy. Wyniki mierzą zależne od czasu i zależne od białka opiekuńczego ponowne fałdowanie białek w oparciu o test lucyferazy.
Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak test ponownego fałdowania in vitro, jest możliwość uzyskania fizjologicznego odczytu wpływu związków lub białek na aktywność białka opiekuńczego. Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię szerokiego zakresu chorób, takich jak choroby neurodegeneracyjne lub nowotwory, ponieważ białka opiekuńcze odgrywają ważną rolę w rozwoju tych patologii. Najpierw podgrzej pożywkę hodowlaną, PBS i trypsynę do 37 stopni Celsjusza w łaźni wodnej.
Przemyj zlewającą się kulturę komórek HEK 2 93 pięcioma mililitrami PBS. Następnie nałóż jeden mililitr trypsyny zawierającej 0,025% EDTA, delikatnie obróć płytkę, aby równomiernie rozprowadzić trypsynę i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Okresowo potrząsaj płytką, aby sprawdzić, czy komórka się odkleiła.
Teraz ponownie zawiesić komórki w 10 mililitrach kompletnego podłoża DMEM i przenieść do 50-mililitrowej probówki Falcon. Następnie wylicz komórki za pomocą płytki licznika Beckmana. Komórki mają około 60 do 70% płynności CO i inkubują przez sześć do ośmiu godzin.
Zrównoważyć ekstremalny gen, dziewięć odczynników do temperatury pokojowej i podwielokrotność wolnej pożywki surowicy do 37 stopni Celsjusza. Odpipetować pożywkę wolną od surowicy do dwóch probówek einor. Następnie dodaj skrajny odczynnik genu dziewiątego bez dotykania ścianki probówki einor, inkubuj przez pięć minut w temperaturze pokojowej.
W międzyczasie przygotuj mieszanki transfekcyjne 2D NA w pierwszej tubie, dodaj świetlika waniliowego i pustą kontrolkę wektorową w drugiej tubie. Dodaj świetlik waniliowy i molekularny chaperon. Dodaj DNA do odczynnika do transfekcji, wymieszaj wir i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 20 minut.
Kontynuuj dodawanie tej mieszanki do posianych komórek i inkubuj przez 24 godziny. Zbierz transfekowane komórki za pomocą komórek nasiennych trypsyny o płynności od 60 do 70% CO na płytkach sześciodołkowych i pozostaw je na noc w inkubatorze. Odessać pożywkę z transfekowanych komórek.
Następnie dodaj jeden mililitr buforu szoku cieplnego i inkubuj przez 30 minut. Aby zatrzymać syntezę białek Denovo, uszczelnij pokrywki paskami paraform i inkubuj w łaźni wodnej o temperaturze 45 stopni Celsjusza przez 30 minut. Teraz usuń paraformę i umieść komórki z powrotem w inkubatorze w celu odzyskania w określonych punktach czasowych.
Zbierz komórki i umyj raz w PBS Aby uzyskać efektywną lizę komórek, zamroź osad komórek w ciekłym azocie, dodaj 200 mikrolitrów rozcieńczonego pasywnego buforu do lizy. Teraz podwielokrotność w trzech egzemplarzach. 30 mikrolitrów lizatu komórkowego na studzienkę płytki 96-dołkowej.
Aby ocenić skuteczność transfekcji, należy rozpocząć od próbek referencyjnych bez wstrząsów. Aby zmierzyć aktywność lucyferazy run, przygotuj świeży 0,2 milimolowy Lucyfer w buforze reakcyjnym gly Gly zawierającym jeden milimolowy A TP i 0,2 mikromolowy bufor reakcyjny eziny. Włóż 96-dołkową płytkę do luminometru i uruchom program.
Stacja robocza Wallach 1420. Wprowadzić pompę do probówki Falcon zawierającej 0,2 mikromolowy bufor reakcyjny eziny. Wybierz z menu opcję konserwacja dozownika i zaznacz pompę jeden.
Wybierz opcję wypełnienia, aby edytować układ blachy. Wybierz opcję, zapoznaj się z protokołem i wynikami w menu. Wybierz protokół.
Teraz wybierz studnie do odczytania. Wróć do menedżera Wallach i kliknij start, aby zmierzyć emisje próbki. Przy 482 nanometrach przystąp do konserwacji dozownika i wybierz pusty i pompuj jeden, aby uwolnić cały pozostały roztwór z powrotem do probówki.
Teraz przenieś rurkę do sokoła zawierającego wodę i zaznacz, spłucz. Kontynuuj, wybierając pozycję puste. Następnie umieścić probówkę z pompy pierwszej w buforze reakcyjnym, a probówkę z pompy drugiej w roztworze LUCIFERIAN.
Zmień układ blachy. Wybierz napełnienie dla pompy pierwszej i pompy drugiej. Z menu konserwacji dozownika wybierz protokół i rozpocznij pomiar długości fali reakcji lucyferazy świetlika wynoszącej 560 nanometrów.
Pod koniec powtarzania powtórz procedurę, opróżnij, spłucz, pusty. Dla pompy pierwszej i drugiej view wyniki w Wallach 1420 Explorer. Każdy eksperyment jest powiązany z testem.
Liczba, nazwa użytkownika, data rozpoczęcia i zakończenia, wyniki eksportu jako plik Excel. Dla analizy ponowne fałdowanie białek jest bezpośrednio związane z czasem rekonwalescencji. W tym eksperymencie komórki są oceniane w różnych punktach czasowych po szoku cieplnym.
Pod nieobecność i w obecności molekularnego białka opiekuńczego. Zgodnie z oczekiwaniami, odsetek ponownie sfałdowanej lucyferazy wzrasta wraz z wydłużonym czasem rekonwalescencji zarówno w grupie kontrolnej, jak i w komórkach transfekowanych molekularnym chaperonem. Z kolei nieprawidłowy zestaw danych wyświetla słabe wartości R kwadrat dla korelacji między czasem a ponownym składaniem.
Podążając za tą techniką, można przeprowadzić inne metody, takie jak test TPA in vitro, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak hamowanie aktywności enzymatycznej białka opiekuńczego. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak mierzyć białko wewnątrzkomórkowe. Podążamy za szokiem stopa.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overview
Ten protokół opisuje metodę pomiaru ponownego zwijania się białek w komórkach, skupiając się na roli białkowych szaperonów. Aktywność lucyferazy świetlnej służy jako wskaźnik oceny aktywności szaperonów w procesie ponownego zwijania się.
Kluczowe Elementy Badania
Dziedzina Nauki
- Biologia komórkowa
- Zwijaanie białek
- Białkowe szaperony
Wprowadzenie
- Zrozumienie ponownego zwijania się białek jest kluczowe dla prawidłowego funkcjonowania komórki.
- Stres cieplny może prowadzić do rozwijania się białek, co wymaga mechanizmów ponownego zwijania.
- Białkowe szaperony wspomagają proces ponownego zwijania.
- Testy lucyferazy zapewniają ilościową miarę aktywności ponownego zwijania.
Cel Badania
- Pomiar ponownego zwijania się białek zależnego od szaperonów w komórkach.
- Badanie wpływu stresu cieplnego na strukturę białek.
- Wykorzystanie lucyferazy jako wskaźnika oceny aktywności szaperonów.
Wykorzystane Metody
- Transfekcja komórek plazmidami zawierającymi lucyferazę i geny szaperonów.
- Ustalenie punktów czasowych obserwacji po transfekcji.
- Wywołanie stresu cieplnego w celu promowania rozwijania się białek.
- Pomiar aktywności lucyferazy w celu oceny wydajności ponownego zwijania.
Główne Wyniki
- Obserwano zależny od czasu ponowny proces zwijania się białek.
- Aktywność szaperonów została potwierdzona za pomocą testów lucyferazy.
- Wyniki wskazywały na skuteczność szaperonów w przywracaniu prawidłowej struktury białek.
- Dane potwierdzają rolę białkowych szaperonów w odpowiedzi komórki na stres.
Wnioski
- Metoda skutecznie mierzy ponowne zwijanie się białek po stresie cieplnym.
- Testy lucyferazy są niezawodnym narzędziem do badania aktywności szaperonów.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia homeostazy białek w komórkach.
Często Zadawane Pytania
Executive Industry Relevance
This intracellular refolding assay provides a cell-based readout for measuring molecular chaperone activity, enabling target validation in protein homeostasis pathways. By linking chaperone function to luciferase refolding, it supports mechanistic de-risking in oncology and neurodegeneration drug discovery. The assay facilitates compound screening for modulators of chaperone activity, informing lead identification and predictive confidence in preclinical models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of chaperone-dependent protein refolding as a therapeutic hypothesis in stress response pathways.
- Operational Value: Provides a quantitative, luciferase-based readout for assessing chaperone function in live cells.
- Predictive Value: Supports target confidence by measuring compound effects on intracellular refolding activity.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates dose-response data for compounds that inhibit or stimulate chaperone-mediated refolding.
- Operational Value: Uses a normalized dual-luciferase system (firefly/renilla) to control for transfection efficiency and variability.
- Scalability: Compatible with 96-well plate formats for medium-throughput screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models chaperone involvement in cancer chemoresistance and neurodegeneration, supporting translational biomarker alignment.
- Preclinical Continuity: Bridges target validation to functional assessment of chaperone activity in disease-relevant systems.
- Risk-Adjusted Decisions: Enables go/no-go decisions based on compound effects on proteostasis mechanisms.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical evaluation, particularly for modulators of protein folding networks.
- Discovery Biology: Tests hypotheses about chaperone function in intracellular refolding after heat shock-induced protein unfolding.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative luminescence readouts suitable for compound library screening.
- Analytics: Provides time-dependent and chaperone-dependent refolding metrics for comparing experimental conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical models where chaperones influence disease progression in cancer and neurodegeneration.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for assessing chaperone modulators across multiple target classes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Measures target engagement through functional refolding output, reducing mechanistic ambiguity in chaperone modulation.
- Operational Value: Standardizes assay conditions using defined transfection and recovery protocols for cross-lab reproducibility.
- Strategic Value: Improves portfolio prioritization by identifying compounds with desired effects on proteostasis pathways.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement of chaperone-targeted candidates in oncology and CNS therapeutic areas.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mammalian cell transfection and luciferase reporter assays.
- Dependent on luminometer compatibility for dual-wavelength luciferase detection.
- Necessitates standardized heat shock and recovery conditions across experimental batches.
- Adaptation to other chaperone-client pairs may require validation of refolding dependence.
- Limited to soluble, refoldable protein reporters like luciferase; not suitable for aggregation-prone clients without modification.
