Test ponownego fałdowania wewnątrzkomórkowego
24 stycznia 2012
W tym protokole opisana jest metoda pomiaru ponownego fałdowania białek wewnątrzkomórkowych po szoku cieplnym. Metoda ta może być stosowana do badania fałd, takich jak molekularne białka opiekuńcze i ich kofaktory lub związki, które mogą wpływać na ich aktywność. Aktywność lucyferazy świetlika jest używana jako reporter do pomiaru aktywności ponownego fałdowania białka opiekuńczego.
Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest pomiar zależnego od białek opiekuńczych wewnątrzkomórkowego refoldingu białek po szoku termicznym. Wykorzystując reporter lukiferyzowy, należy najpierw przetransfekować komórki plazmidami kodującymi gen reportera lukiferyzowego oraz interesującą nas białko opiekuńcze. Następnie przetransfekowane komórki należy podzielić na grupy odpowiadające punktom czasowym regeneracji przewidzianym w planie eksperymentalnym.
Następnego dnia poddaj komórki szokowi termicznemu, aby wywołać rozfałdowanie białek. Pozostaw je do regeneracji w celu przywrócenia wewnątrzkomórkowego fałdowania białek, a następnie zmierz aktywność reportera lucyferazy. Wyniki pozwalają ocenić zależne od czasu i zależne od białek opiekuńczych refałdowanie białek na podstawie testu lucyferazy.
Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak testy refoldingowe in vitro, jest możliwość uzyskania fizjologicznego odczytu wpływu związków lub białek na aktywność chaperonów. Zastosowanie tej techniki rozszerza się na terapię szerokiego spektrum schorzeń, takich jak choroby neurodegeneracyjne czy nowotwory, ponieważ chaperony odgrywają istotną rolę w rozwoju tych patologii. W pierwszej kolejności należy ogrzać pożywkę hodowlaną, PBS oraz trypsynę do 37 °C w kąpieli wodnej.
Przemyj konfluencyjną hodowlę komórek HEK 2 93 pięcioma mililitrami PBS. Następnie nanieś jeden mililitr trypsyny zawierającej 0,025% EDTA, delikatnie obróć płytkę, aby równomiernie rozprowadzić trypsynę, i inkubuj w temperaturze 37 °C. Okresowo potrząsaj płytką, aby sprawdzić, czy komórki odłączyły się od podłoża.
Następnie resuspenduj komórki w 10 mililitrach kompletnego medium DMEM i przenieś je do probówki Falcon o pojemności 50 mililitrów. Następnie policz komórki za pomocą licznika Beckman. Wysiej komórki przy konfluencji około 60 do 70% i inkubuj przez sześć do ośmiu godzin.
Doprowadzić odczynnik extreme gene, nine oraz alikwot medium bezsurowiczego do odpowiednich temperatur: odczynnik do temperatury pokojowej, a medium do 37 °C. Przenieść medium bezsurowicze pipetą do dwóch probówek einor. Następnie dodać odczynnik extreme gene nine, unikając dotykania ścianek probówek einor, i inkubować przez pięć minut w temperaturze pokojowej.
W międzyczasie przygotuj mieszaniny do transfekcji 2D NA w probówce pierwszej, a do probówki drugiej dodaj ran vanilla firefly oraz pusty wektor kontrolny. Dodaj ran vanilla firefly oraz chaperonę molekularną. Dodaj DNA do mieszaniny odczynnika do transfekcji, wymieszaj w wortexie i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 20 minut.
Kontynuuj dodawanie tej mieszaniny do wysianych komórek i inkubuj przez 24 godziny. Zbierz przetransfekowane komórki przy użyciu trypsyny; wysiej komórki w płytkach sześciodołkowych przy konfluencji 60-70% i pozostaw je w inkubatorze na noc. Odsuń medium z przetransfekowanych komórek.
Następnie dodaj 1 ml buforu do szoku termicznego i inkubuj przez 30 minut. Aby zatrzymać syntezę białek de novo, zabezpiecz pokrywki paskami parafilmowymi i inkubuj w kąpieli wodnej o temperaturze 45 °C przez 30 minut. Następnie usuń parafilm i umieść komórki z powrotem w inkubatorze w celu regeneracji w określonych punktach czasowych.
Zebrać komórki i przemyć je raz w PBS. Aby zapewnić efektywną lizę komórek, zamrozić pellet komórkowy w ciekłym azocie, a następnie dodać 200 µL rozcieńczonego buforu do pasywnej lizy. Następnie podzielić próbkę na trzy powtórzenia, nakładając po 30 µL lizatu komórkowego do każdej studzienki płytki 96-dołkowej.
Aby ocenić wydajność transfekcji, należy rozpocząć od próbek referencyjnych niepoddanych impulsowi elektrycznemu. W celu pomiaru aktywności lucyferazy Ran, przygotować świeży bufor reakcyjny 0,2 mM Lucifer w buforze gliny (gly Gly) zawierający 1 mM ATP oraz 0,2 µM buforu reakcyjnego eziny. Włożyć płytkę 96-dołkową do luminometru i uruchomić program.
Stanowisko robocze Wallach 1420. Wprowadź pompę pierwszą do probówki Falcon zawierającej 0,2 µM buforu reakcyjnego ezyny. Wybierz z menu opcję konserwacji dozownika i zaznacz pompę pierwszą.
Wybierz opcję wypełniania, aby edytować układ płytki. Wybierz opcję eksploracji protokołu i wyników w menu. Wybierz protokół.
Następnie należy wybrać doletki do odczytu. Powróć do menedżera Wallach i kliknij start, aby zmierzyć emisję próbek. Przy 482 nanometrach przejdź do konserwacji dozownika, wybierz opcję empty and pump one, aby odprowadzić cały pozostały roztwór z powrotem do probówki.
Teraz przenieś probówkę do probówki typu Falcon zawierającej wodę i wykonaj płukanie. Następnie wybierz opcję opróżniania (empty). Potem umieść probówkę z pompy pierwszej w buforze reakcyjnym, a probówkę z pompy drugiej w roztworze LUCIFERIAN.
Zmień układ płytki. Wybierz opcję wypełniania dla pompy pierwszej i pompy drugiej. Z menu konserwacji dozownika wybierz protokół i rozpocznij pomiar reakcji lucyferazy świetlika przy długości fali 560 nanometrów.
Po zakończeniu cyklu powtórz procedurę: opróżnianie, płukanie, opróżnianie. W przypadku pompy pierwszej i pompy drugiej wyświetl wyniki w urządzeniu Wallach 1420 Explorer. Każdemu eksperymentowi przypisany jest odpowiedni test.
Wprowadź nazwę użytkownika oraz datę początkową i końcową, a następnie wyeksportuj wyniki do pliku Excel. W analizie refolding białek jest bezpośrednio powiązany z czasem regeneracji. W tym doświadczeniu komórki są oceniane w różnych punktach czasowych po szoku termicznym.
Wobec braku i w obecności chaperonu molekularnego. Zgodnie z oczekiwaniami, odsetek zrefoldowanej lucyferazy wzrasta wraz z wydłużeniem czasu rekuperacji zarówno w grupach kontrolnych, jak i w komórkach transfekowanych chaperonem molekularnym. Z kolei nieprawidłowy zestaw danych wykazuje niskie wartości R kwadrat dla korelacji między czasem a refoldingiem.
Po zastosowaniu tej techniki można przeprowadzić inne metody, takie jak test TPAs in vitro, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, na przykład dotyczące hamowania aktywności enzymatycznej chaperonu. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat pomiaru białek wewnątrzkomórkowych poy szoku termicznego.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje metodę pomiaru wewnątrzkomórkowego refoldingu białek po szoku termicznym, koncentrując się na roli chaperonów molekularnych. Aktywność lucyferazy świetlikowej służy jako reporter do oceny aktywności refoldingu chaperonów.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia komórki
- Fałdowanie białek
- Chaperony molekularne
Wstęp
- Zrozumienie procesu renaturacji białek jest kluczowe dla funkcjonowania komórki.
- Szok termiczny może prowadzić do rozfałdowania białek, co wymusza uruchomienie mechanizmów renaturacji.
- Chaperony molekularne wspomagają proces renaturacji.
- Testy lucyferazowe umożliwiają ilościowy pomiar aktywności renaturacji.
Cel badania
- Pomiar zależnego od chaperonów wewnątrzkomórkowego refoldingu białek.
- Badanie wpływu szoku termicznego na strukturę białek.
- Wykorzystanie lucyferazy jako reportera do oceny aktywności chaperonów.
Zastosowane metody
- Transfekcja komórek plazmidami zawierającymi geny lucyferazy i białek opiekuńczych.
- Ustalenie punktów czasowych rekonwalescencji po transfekcji.
- Indukcja szoku termicznego w celu promowania rozfałdowania białek.
- Pomiar aktywności lucyferazy w celu oceny wydajności refoldingowania.
Główne wyniki
- Obserwowano zależny od czasu proces refolding białek.
- Aktywność chaperonów potwierdzono za pomocą testów lucyferazowych.
- Wyniki wykazały skuteczność chaperonów w procesie regeneracji białek.
- Dane potwierdzają rolę molekularnych chaperonów w komórkowych odpowiedziach na stres.
Wnioski
- Metoda ta skutecznie mierzy renaturację białek po szoku termicznym.
- Testy lucyferazowe stanowią niezawodne narzędzie do badania aktywności chaperonów.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia homeostazy białkowej w komórkach.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ten test refoldingu wewnątrzkomórkowego zapewnia odczyt oparty na komórkach do pomiaru aktywności chaperonów molekularnych, umożliwiając walidację celów w szlakach homeostazy białek. Poprzez powiązanie funkcji chaperonów z refoldingiem lucyferazy, metoda ta wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego w procesie odkrywania leków w onkologii i neurodegeneracji. Test ułatwia przesiewową analizę związków w poszukiwaniu modulatorów aktywności chaperonów, co wspomaga identyfikację wiodących kandydatów i zwiększa pewność predykcyjną w modelach przedklinicznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biopharmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie zależnego od chaperonów refoldingu białek jako hipotezy terapeutycznej w szlakach odpowiedzi na stres.
- Wartość operacyjna: Zapewnia ilościowy odczyt oparty na lucyferazie do oceny funkcji chaperonów w żywych komórkach.
- Wartość prognostyczna: Zwiększa pewność co do wyboru celu poprzez pomiar wpływu związków na wewnątrzkomórkową aktywność refoldingu.
Przesiew i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Pozwala na generowanie danych o zależności dawka-odpowiedź dla związków, które hamują lub stymulują refolding zależny od chaperonów.
- Wartość operacyjna: Wykorzystuje znormalizowany system podwójnej lucyferazy (firefly/renilla) w celu kontroli wydajności i zmienności transfekcji.
- Skalowalność: Jest kompatybilny z formatami płytek 96-dołkowych, co umożliwia prowadzenie kampanii przesiewowych o średniej wydajności.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie w kontekście chorób: Modeluje udział chaperonów w chemooporności nowotworowej oraz neurodegeneracji, wspierając dopasowanie translacyjnych biomarkerów.
- Ciągłość przedkliniczna: Łączy walidację celu z funkcjonalną oceną aktywności chaperonów w systemach istotnych dla przebiegu choroby.
- Decyzje z uwzględnieniem ryzyka: Umożliwia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) w oparciu o wpływ związków na mechanizmy proteostazy.
Integracja potoku i przepływu pracy
Analiza ta wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków, od walidacji celu, poprzez identyfikację wiodących związków, aż po ocenę przedkliniczną, w szczególności w odniesieniu do modulatorów sieci fałdowania białek.
- Biologia odkrywcza: Testowanie hipotez dotyczących funkcji chaperonów w wewnątrzkomórkowym refoldingu po unfoldingu białek indukowanym szokiem termicznym.
- Przesiewanie: Dostarczanie powtarzalnych, ilościowych odczytów luminescencyjnych, odpowiednich do przesiewania bibliotek związków.
- Analityka: Zapewnienie zależnych od czasu i od chaperonów wskaźników refoldingowania w celu porównania warunków eksperymentalnych.
- Badania translacyjne: Powiązanie z modelami przedklinicznymi, w których chaperony wpływają na progresję chorób nowotworowych i neurodegeneracyjnych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanowienie platformy wielokrotnego użytku do oceny modulatorów chaperonów w wielu klasach celów.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Pomiar zaangażowania celu poprzez wydajność funkcjonalnego refoldingu, co zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w modulacji chaperonów.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja warunków testu przy użyciu określonych protokołów transfekcji i regeneracji w celu zapewnienia powtarzalności między laboratoriami.
- Wartość strategiczna: Ulepszenie priorytetyzacji portfela poprzez identyfikację związków o pożądanym działaniu na szlaki proteostazy.
- Wpływ na portfolio: Wsparcie rozwoju kandydatów celujących w chaperony w onkologii i obszarach terapeutycznych OUN z uwzględnieniem analizy ryzyka.
Kwestie dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna w zakresie transfekcji komórek ssaków oraz testów reporterowych z lucyferazą.
- Metoda jest zależna od kompatybilności luminometru z detekcją lucyferazy o dwóch długościach fal.
- Konieczne jest zastosowanie ustandaryzowanych warunków szoku termicznego i regeneracji we wszystkich partiach eksperymentalnych.
- Adaptacja do innych par chaperon-klient może wymagać walidacji zależności od refoldingu.
- Metoda ogranicza się do rozpuszczalnych, zdolnych do refoldingu białek reporterowych, takich jak lucyferaza; nie nadaje się do klientów podatnych na agregację bez wprowadzenia modyfikacji.
