Name: Przeszczep komórek rozrodczych i ksenoprzeszczep tkanki jądra u myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-06T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: Poznaj techniki przeszczepu komórek SSC i ksenoprzeszczepu tkanki jądra u myszy. Metody te umożliwiają odtworzenie spermatogenezy od dawcy w jądrach biorcy oraz badanie biologii rozrodu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Prace w laboratorium autorów były wspierane przez USDA/CSREES/NRICGP (2007-35203-18213); NIH/NCRR (2 R01 RR17359-06), NIH/NIEHS (1 R21 ES014856-01A2) oraz Alberta Innovates – Health Solutions.

CZĘŚĆ A. Transplantacja komórek zarodkowych u myszy
1. Przygotowanie myszy biorców
<ol>
 <li>Odbiorcy powinni być immunologicznie tolerancyjni na komórki jąder dawcy (poprzez dopasowanie genetyczne do dawców lub niedobór odporności).</li>
 <li>Odbiorcy powinni być albo naturalnie pozbawieni spermatogenezy (np. myszy W/ Wv), albo pozbawieni endogennych komórek zarodkowych. Deplecja komórek zarodkowych może zostać osiągnięta poprzez napromieniowanie lub zastosowanie leków chemioterapeutycznych, takich jak Busulfan. W niniejszym protokole opisujemy metodę przygotowania myszy biorców z użyciem Busulfanu.</li>
 <li>Odbiorców w wieku 4-6 tygodni należy traktować poprzez wstrzyknięcie Busulfanu drogą i.p. Optymalna dawka Busulfanu zależy od szczepu. W powszechnie stosowanych szczepach biorców dawka 40-50 mg/kg jest wystarczająca do usunięcia endogennych komórek zarodkowych (np. 44 mg/kg dla myszy nude, 50 mg/kg dla biorców B6/129 F1).</li>
 <li>Proszek Busulfanu należy rozpuścić w DMSO, a następnie dodać taką samą objętość sterylnej wody destylowanej, aby uzyskać końcowe stężenie 4 mg/ml. Przed użyciem roztwór należy utrzymać w temperaturze 35-40°C, aby zapobiec wytrąceniu się Busulfanu. W przypadku zaobserwowania wytrącania roztwór należy odrzucić.</li>
 <li>Po podaniu Busulfanu należy odczekać co najmniej miesiąc przed wykorzystaniem biorców. Biorców można wykorzystać w okresie od 1 do 3 miesięcy po leczeniu Busulfanem.</li>
</ol>
2. Przygotowanie pipet do mikroiniekcji
<ol>
 <li>Wybierz pipety z szkła borokrzemianowego (rurki kapilarne) o średnicy zewnętrznej 1,0 mm, średnicy wewnętrznej 0,75 mm i długości 3 cali.</li>
 <li>Zasylikonizuj szklane pipety za pomocą Sigmacote, przepłucz je metanolem i osusz strumieniem powietrza.</li>
 <li>Wyciągnij końcówki pipet za pomocą wyciągacza do pipet. Różne urządzenia do wyciągania pipet mają różne ustawienia, dlatego należy przetestować kilka wariantów. Zazwyczaj skuteczne mogą być ustawienia zbliżone do tych, których używa się do tworzenia pipet do enukleacji.</li>
 <li>Przed użyciem przełam końcówki pipet pod mikroskopem stereoskopowym, aby uzyskać średnicę końcówki wynoszącą około 50 μm.</li>
</ol>
3. Przygotowanie komórek donora do transplantacji
<ol>
 <li>Wybór szczepu dawcy zależy od badanego pytania badawczego. Jeśli punktem końcowym jest kwantyfikacja spermatogenezy, należy użyć dawców z łatwo identyfikowalnym markerem genetycznym, takim jak Lac-Z (np. B6.129S7-Gt(ROSA)26Sor/J z Jackson Laboratory) lub GFP (np. C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)1Osb/J z Jackson Laboratory).</li>
 <li>Przygotować 7 ml kolagenazy w DMEM w stężeniu 1 mg/ml, 4 ml trypsyny-EDTA (0,25% trypsyny oraz 1mM EDTA) oraz 2 ml DNazy w DMEM w stężeniu 7 mg/ml. Taka ilość wystarczy do strawienia jąder dwóch myszy dawców.</li>
 <li>Pobrać jądra w warunkach aseptycznych i usunąć tunica albuginea. Delikatnie rozdzielić kanaliki nasienne za pomocą precyzyjnej pęsety, aby ułatwić trawienie enzymatyczne.</li>
 <li>Przenieść kanaliki do kolagenazy, inkubować w 37 °C przez 5-10 min i często mieszać.</li>
 <li>Przemyć kanaliki dwukrotnie poprzez wirowanie (200-300 g przez 3 min) i ponowne zawieszenie w PBS bez Ca2++.</li>
 <li>Ponownie zawiesić kanaliki w trypsynie-EDTA i wstrząsać, aż staną się lepkie i mętne. Monitorować trawienie kanalików w 37 °C; powinno ono nastąpić w ciągu 1-2 min.</li>
 <li>Dodać DNazę i dobrze wymieszać. Inkubować przez 1-2 min.</li>
 <li>Dodać 3 ml FBS, aby zatrzymać działanie enzymów.</li>
 <li>Przefiltrować zawiesinę komórkową przez nylonową siatkę o rozmiarze oczek 40-70 μm w celu usunięcia fragmentów komórek i tkanki.</li>
 <li>Zebrać komórki przez wirowanie przy 600 g przez 5 min i zawiesić je w niewielkiej ilości DMEM (&lt;100 μl).</li>
 <li>Policzyć komórki i dostosować objętość do pożądanego stężenia końcowego (zazwyczaj 100 x 106). Przed użyciem przechowywać zawiesinę komórkową na lodzie.</li>
 <li>Do każdego jądra myszy traktowanej busulfanem należy wprowadzić jedynie 10-15 μl zawiesiny komórkowej. Ze względu na potencjalne straty i wycieki, należy przygotować 30-50 μl na jedno jądro.</li>
</ol>
4. Procedura transplantacji (Rycina 1)
<ol>
 <li>Zanestezuj zwierzęta biorące udział w badaniu zgodnie z zatwierdzonymi protokołami.</li>
 <li>Ułóż zwierzę w pozycji grzbietnej i przygotuj chirurgicznie obszar brzucha. Wykonaj cięcie w linii środkowej brzucha o długości ok. 1 cm, aby odsłonić ścianę brzuszną. Unieś ścianę brzuszna za pomocą małej pęsety w obrębi białej linii, aby uniknąć przypadkowego uszkodzenia narządów brzusznych, a następnie wykonaj nacięcie o długości ok. 0,5 cm w linii środkowej ściany brzusznej, aby odsłonić jamę otrzewnej.</li>
 <li>Użyj jednej pęsety irydowej do podtrzymywania ściany brzusznej, a drugiej pary pęset irydowych do zlokalizowania poduszeczek tłuszczowych przytwierdzonych do najądrza i jądra w jamie otrzewnej. Delikatnie wyciągnij poduszkę tłuszczową, aż jądro zostanie wyewagowane, a tętnica jawodząca i najądrze staną się wyraźnie widoczne. Pracuj na jednym jądrze naraz.</li>
 <li>Pod poduszkę tłuszczową/jądro można włożyć cienką, sterylną ściereczkę wykonaną z autoklawowanych kart indeksowych w celu lepszej identyfikacji wizualnej (opcjonalnie). Ściereczka służy również do wchłaniania płynów.</li>
 <li>Dodaj kroplę barwnika Trypan Blue do zawiesiny komórkowej, a następnie ostrożnie wprowadź zawiesinę do polietylenowej rurki połączonej z strzykawką 1 ml. Podłącz dociętą pipetę do rurki i delikatnie wprowadź zawiesinę komórkową do pipety, wywierając nacisk na tłok strzykawki.</li>
 <li>Zidentyfikuj przewody odprowadzające (łączące jądro z najądrzem) i delikatnie usuń tkankę tłuszczową wokół przewodów. Postępuj ostrożnie, ponieważ przewody i otaczająca je błona są półprzezroczyste.</li>
 <li>Ostrożnie wprowadź pipetę do jednego z przewodów w pęczku przewodów odprowadzających, delikatnie przesuwając ją o kilka mm w kierunku jądra.</li>
 <li>Utrzymując pipetę iniekcyjną w miejscu, chwyć strzykawkę i delikatnie naciśnij tłok, aby zapewnić przepływ zawiesiny do sieci jądra (rete testis), tak aby kanaliki jawodzące zaczęły się wypełniać.</li>
 <li>Szybkość iniekcji i przepływ zawiesiny komórkowej reguluje się naciskiem kciuka. Unikaj nagłych wzrostów ciśnienia; monitoruj ruch zawiesiny w kanalikach.</li>
 <li>Przerwij iniekcję, gdy prawie wszystkie kanaliki powierzchniowe zostaną wypełnione, zanim jądro zacznie wykazywać objawy niedokrwienia.</li>
 <li>Wprowadź jądro z powrotem do jamy brzusznej. Powtórz procedurę na przeciwległym jądrze. Zaszyj ścianę brzuszna szwem jedwabnym 6-0 i zamknij skórę metalnymi klamrami chirurgicznymi. Monitoruj myszy na podgrzewanej podkładce aż do pełnego wybudzenia.</li>
</ol>
5. Analiza jąder biorcy
<ol>
 <li>Odczekać 2-4 miesiące po transplantacji przed przystąpieniem do analizy.</li>
 <li>Uśmiercić mysz biorcy zgodnie z wytycznymi dotyczącymi opieki i wykorzystania zwierząt, a następnie pobrać jądro oraz najduszkę do PBS. W przypadku zastosowania transgenicznej linii dawcy Lac-Z, najduszkę można wykorzystać jako pozytywną kontrolę barwienia ze względu na endogeniczną aktywność beta-galaktozydazy.</li>
 <li>W celu wykrycia komórek dawcy za pomocą barwienia Lac-Z, utrwalić jądro przez 1-2 godziny w temperaturze 4 °C w 4% paraformaldehydzie (PFA) w PBS. Płukać 3 x 30 min w temperaturze pokojowej w buforze płuczącym lacZ.</li>
 <li>Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C w roztworze barwiącym lacZ. Jądro można barwić w całości lub po rozproszeniu kanalików.</li>
 <li>Utrwalić i przechowywać w 10% neutralnej buforowanej formalinie. Jeśli wymagane są przekroje, zastosować neutral fast red jako barwnik kontrastowy.</li>
</ol>
CZĘŚĆ B. Ektopowy przeszczep ksenogeniczny u myszy
(Na podstawie Dobrinski i Rathi 200815 oraz Rodriguez-Sosa et al. 201116).
1. Pobieranie tkanki od dawcy
<ol>
 <li>Pozyskać tkankę jąder poprzez kastrację lub biopsję od samca dawcy.</li>
 <li>Umieścić jądra w PBS, a biopsjaty w pożywce hodowlanej, zachowując warunki sterylne.</li>
 <li>Przechowywać pobraną tkankę w lodzie i przetransportować do laboratorium.</li>
</ol>
2. Przygotowanie tkanki dawcy
<ol>
 <li>Procedurę należy przeprowadzić w komorze z laminarnym przepływem powietrza, aby zachować sterylność.</li>
 <li>Każdy jądro należy przemyć dwa lub trzy razy w lodowatym PBS z dodatkiem antybiotyków przed przeniesieniem do naczynia hodowlanego z PBS. W przypadku biopsji fragmenty jądra należy przemyć dwa lub trzy razy lodowatą pożywką hodowlaną z antybiotykami, wirując przy 150g przez 2 min i resuspendując w świeżej lodowatej pożywce hodowlanej.</li>
 <li>W przypadku całych jąder należy usunąć błonę pochwy poprzez wykonanie nacięcia wzdłuż powierzchni i wysunięcie jądra. Należy usunąć z jądra wszystkie struktury przyległe (sznur nasienny, najdusiek, tkankę łączną). Jądra należy przemyć raz w zimnym PBS i przenieść do naczynia hodowlanego z PBS.</li>
 <li>Należy ostrożnie usunąć białą błonę jądra, używając ostrza skalpela i nożyczek. Jeśli jądro jest bardzo małe, błonę można usunąć, wyciskając tkankę jądra przez małe nacięcie wykonane na jednym końcu, trzymając błonę małą pęsetą na drugim końcu.</li>
 <li>W zależności od wielkości jądra, całą tkankę jądra można pociąć na małe fragmenty o rozmiarze około 1 - 2 mm3 za pomocą zakrzywionej pęsety i ostrza skalpela lub najpierw wyciąć duże fragmenty tkanki jądra, a następnie pociąć je na mniejsze części. Wszystkie te czynności powinny być wykonywane w lodowatej pożywce hodowlanej, w warunkach sterylnych, w małym naczyniu hodowlanym (60 x15 mm).</li>
 <li>Przygotowane fragmenty tkanki należy przenieść do lodowatej pożywki hodowlanej w małych naczyniach hodowlanych i przechowywać na lodzie do momentu przeszczepienia.</li>
</ol>
3. Kastracja myszy biorcy
<ol>
 <li>Zanestezjować mysz zgodnie z powyższą procedurą i przygotować steryle pole operacyjne poprzez przystrzyżenie włosów (nie jest to konieczne w przypadku myszy nagi), a następnie przemycie skóry 70% Ethanol i roztworem Betadine.</li>
 <li>Wykonać nacięcie skóry o długości 0,5-1 cm wzdłuż linii środkowej brzucha, aby odsłonić ścianę brzuszną.</li>
 <li>Ostrożnie odsłonić jądro, tętnicę jądrową i najduszkę zgodnie z opisem w Części A, 4.2-4.3.</li>
 <li>Oddzielić ogon najduszki od gubernaculum za pomocą rozczepiania tępego.</li>
 <li>Podwiązać jedwabną nicią tętnicę jądrową oraz przewód nasienny wraz z naczyniem krwionośnym, a następnie przeciąć podwiązane struktury pomiędzy jądrem a wiązaniem.</li>
 <li>Powtórzyć procedurę dla drugiego jądra.</li>
 <li>Zeszyć ścianę brzuszną za pomocą jednego lub dwóch szwów chirurgicznych.</li>
 <li>Zamknąć nacięcie skóry za pomocą jednego lub dwóch klipsów Michela.</li>
</ol>
4. Ektopowe przeszczepianie ksenogeniczne
<ol>
 <li>Ułóż mysz w pozycji brzusznej i przygotuj jałowe pole operacyjne na grzbiecie zgodnie z powyższą procedurą.</li>
 <li>W zależności od liczby planowanych przeszczepów (zazwyczaj 4-8 na mysz), wykonaj nacięcia skóry o długości ok. 0,5 cm po obu stronach linii środkowej grzbietu myszy.</li>
 <li>Używając pęsety, uchwyć brzeg nacięcia skóry i wytwórz jamę podskórną, rozdzielając tkankę łączną za pomocą nożyczek.</li>
 <li>Za pomocą pęsety irydowej umieść fragment tkanki jądra głęboko w jamie podskórnej, podtrzymując brzeg nacięcia skóry drugą pęsetą irydową.</li>
 <li>Zamknij nacięcie skóry jednym klipsem Michela i trzymaj mysz na podkładce grzewczej do momentu rozpoczęcia wybudzania z anestezji.</li>
 <li>Przenieś mysz do klatki z dodatkową izolacją i przykryciem; monitoruj zwierzę aż do pełnego wybudzenia.</li>
</ol>
5. Pobieranie ksenoprzeszczepów jąder do analizy oraz pozyskiwanie plemników
<ol>
 <li>Poddać mysz gospodarza eutanazji zgodnie z wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami i ich wykorzystania, a następnie wykonać nacięcie skóry wzdłuż linii środkowej pleców od ogona do karku i rozchylić skórę. Pozwala to na odsłonięcie przeszczepów, które mogą znajdować się w tkance podskórnej lub być przytwierdzone do skóry.</li>
 <li>Ostrożnie usunąć przeszczepy, używając pęsety i nożyczek.</li>
 <li>Zanotować liczbę odzyskanych przeszczepów, ich rozmiar oraz wagę każdego z nich.</li>
 <li>Wyjąć pęcherzyki nasienne z jamy brzusznej myszy i zanotować ich wagę jako wskaźnik produkcji testosteronu przez tkankę przeszczepioną.</li>
 <li>W celu analizy histologicznej
 <ol class="lalpha">
 <li>Umieścić ksenoprzeszczepy w probówce z roztworem Bouina (lub innym utrwalaczem) w objętości około 10x większej niż objętość ksenoprzeszczepu i odpowiednio oznakować probówkę.</li>
 <li>Inkubować przez noc w lodówce, a następnie przemyć co najmniej 3 razy w 70% etanolu, najlepiej w odstępach 24-godzinnych.</li>
 <li>Przejść do etapu przetwarzania i zatopienia w parafinie.</li>
 </ol>
 </li>
 <li>W celu pozyskania plemników
 <ol class="lalpha">
 <li>Przemyć ksenoprzeszczepy, wirując je przy 300g przez 1 min i resuspendując w pożywce hodowlanej z antybiotykami.</li>
 <li>Pokroić przeszczepy na małe kawałki i starannie rozdrobić pęsetą w naczyniu do hodowli tkanek zawierającym 3 - 5 ml pożywki hodowlanej.</li>
 <li>Przefiltrować rozdrobnioną tkankę przez sitko komórkowe o rozmiarze oczek 40 μm.</li>
 </ol>
 </li>
</ol>
CZĘŚĆ C. Reprezentatywne wyniki
1. Transplantacja komórek zarodkowych
Jeśli przeszczepiona zawiesina komórek dawcy zawiera spermatogonialne komórki macierzyste z markerem genetycznym, takim jak transgen LacZ, kolonizację SSCs dawcy w jądrze biorcy można zwizualizować za pomocą barwienia X-gal jako charakterystyczne niebieskie segmenty kanalików nasiennych 2-3 miesiące po transplantacji3 (Rycina 2A). Dobrze rozwinięta kolonia powinna posiadać długi, ciemnoniebieski odcinek całkowicie wypełnionych segmentów z dwiema lub więcej warstwami niebieskich komórek bliżej centrum oraz regiony o słabszym barwieniu na obu końcach, gdzie widoczna jest sieć pojedynczych, sparowanych lub małych grup niebieskich komórek3 (Rycina 2B). Przekrój poprzeczny ciemnoniebieskiego regionu kanalików nasiennych powinien ukazać dobrze rozwiniętą i zorganizowaną spermatogenezę z niebieskimi komórkami zarodkowymi na różnych etapach różnicowania (Rycina 2C).
2. Ksenoprzeszczep tkanki jądra
Żywotność tkanki jądr po transplantacji jest odwrotnie skorelowana ze stopniem rozwoju dawcy; najlepsze wyniki uzyskuje się przy zastosowaniu tkanki pochodzącej od noworodków płci męskiej, podczas gdy tkanka dorosłych wykazuje wysoką tendencję do degeneracji i obumierania17-21. Generalnie sukces ksenoprzeszczepu maleje w miarę, jak tkanka dawcy przechodzi mejozę w pierwszej fali spermatogenezy. Czas do pełnego rozwoju niedojrzałej tkanki dawcy i całkowitej spermatogenezy jest specyficzny dla gatunku i często nieco krótszy w porównaniu z jądrami in situ. Liczba kanalików nasiennych z pełną spermatogenezą jest zmienna w zależności od gatunku. O ile u owiec, kóz i świń liczba ta przekracza 50%, o tyle u bydła i kotów jest ona mniejsza niż 15% 14(Rysunek 3).
<img alt="Anatomia rozrodcza gryzoni; zdjęcia z sekcji; budowa przewodów odprowadzających; identyfikacja Ts, Ep." src="/files/ftp_upload/3545/3545fig1.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Procedura transplantacji komórek linii zarodkowej. Po podaniu znieczulenia ułożyć biorców w pozycji na plecach i wykonać nacięcie w linii środkowej brzucha o długości ok. 0,4 cala (A). Odsłonić jądro, odsuwając tkankę tłuszczową przytwierdzoną do najądrza i jądra, a pod tkankę tłuszczową/jądro wsunąć cienką jałową serwetkę, aby ułatwić identyfikację wizualną (B). Upozycjonować jądro i najądrze tak, aby widoczne były zatopione w tkance tłuszczowej przewody odprowadzające (C, D, E). Zidentyfikować przewody odprowadzające i delikatnie usunąć tkankę tłuszczową wokół nich. Pod przewody można wsunąć kawałek kolorowego papieru lub plastiku w celu lepszej wizualizacji (G). Uciąć lub rozgnieść końcówkę pipety, dopasowując ją do rozmiaru przewodów, a następnie pobrać zawiesinę komórek do pipety (H). Ostrożnie wprowadzić pipetę do jednego z przewodów w pęczku przewodów odprowadzających, delikatnie przesuwając ją o kilka mm w kierunku jądra (strzałka na rysunku H wskazuje kierunek wstrzykiwania i wprowadzania pipety). Przedstawiono jądro po udanym wstrzyknięciu do kanalików nasiennych (I). Ts: jądro; Ep: najądrze.
<img alt="Obrazy mikroskopowe wzrostu grzybów, symbiozy korzeni roślin, oddziaływania komórkowych; wyniki eksperymentu." src="/files/ftp_upload/3545/3545fig2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Reprezentatywne wyniki transplantacji komórek linii zarodkowej A) Wstrzyknięty jądro barwione X-gal. Niebieskie segmenty kanalików nasiennych reprezentują utrwalone kolonie pochodzące od transgenicznych dawców SSC (transgen LacZ). B) Większe powiększenie kolonii SSC w 3 miesiącu po transplantacji. Ciemnoniebieski obszar w centrum reprezentuje pełną spermatogenezę, a jasnoniebieskie obszary na końcach reprezentują rozrastające się rozszerzenie kolonii. C) Przekrój histologiczny ciemnoniebieskiego kanalika nasiennego (3 miesiące po transplantacji) wykazuje dobrze zorganizowaną spermatogenezę. Paski skali na rycinach B i C wynoszą odpowiednio 200 μm i 30 μm. (Ryciny zaadaptowano z Annu Rev Cell Dev Biol. 2008;24:263-86 oraz Biol Reprod. 1999 Jun;60(6):1429-36).
<img alt="Schemat procesu reprodukcyjnego myszy; histologia, komórki plemników, stadia rozwoju zarodka." src="/files/ftp_upload/3545/3545fig3.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Ektopowe ksenoprzeszczepy niedojrzałej tkanki jąder dużych zwierząt do myszy z niedoborem odporności. Fragmenty niedojrzałego jądra dawcy (~1 mm3) przeszczepione pod skórę grzbietową myszy z niedoborem odporności (A) są w stanie przetrwać i reagować na gonadotropiny mysie. W rezultacie tkanka jądra przechodzi pełny rozwój, w tym formowanie plemników zdolnych do zapłodnienia (B). Po zebraniu ksenoprzeszczepów jądra (C) mogą one zostać wykorzystane do analizy lub w celu pozyskania plemników (D) do ICSI (E) i produkcji zarodków (F). Paski odpowiadają 50 μm (B, E i F) lub 10 μm (D). (Zmodyfikowano na podstawie Rodriguez-Sosa i Dobrinksi 200914).

<ol><li>Brinster, R. L., Avarbock, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+transmission+of+donor+haplotype+following+spermatogonial+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Germline transmission of donor haplotype following spermatogonial transplantation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (24), 11303-11303 (1994).</li>
<li>Brinster, R. L., Zimmermann, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spermatogenesis+following+male+germ-cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Spermatogenesis following male germ-cell transplantation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (24), 11298-11298 (1994).</li>
<li>Nagano, M., Avarbock, M. R., Brinster, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+and+kinetics+of+mouse+donor+spermatogonial+stem+cell+colonization+in+recipient+testes%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Pattern and kinetics of mouse donor spermatogonial stem cell colonization in recipient testes.</a> Biology of Reproduction. 60 (6), 1429-1429 (1999).</li>
<li>Nagano, M., Brinster, C. J., Orwig, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+mice+produced+by+retroviral+transduction+of+male+germ-line+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Transgenic mice produced by retroviral transduction of male germ-line stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (23), 13090-13090 (2001).</li>
<li>Ryu, B. Y., Orwig, K. E., Oatley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+transgenic+rats+through+the+male+germline+using+lentiviral+transduction+and+transplantation+of+spermatogonial+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Andrology%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of transgenic rats through the male germline using lentiviral transduction and transplantation of spermatogonial stem cells.</a> Journal of Andrology. 28 (2), 353-353 (2007).</li>
<li>Hess, R. A., Cooke, P. S., Hofmann, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+insights+into+the+regulation+of+the+spermatogonial+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Mechanistic insights into the regulation of the spermatogonial stem cell niche.</a> Cell Cycle. 5 (11), 1164-1164 (2006).</li>
<li>Oatley, M. J., Racicot, K. E., Oatley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sertoli+cells+dictate+spermatogonial+stem+cell+niches+in+the+mouse+testis%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Sertoli cells dictate spermatogonial stem cell niches in the mouse testis.</a> Biology of Reproduction. 84 (4), 639-639 (2011).</li>
<li>Nagano, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homing+efficiency+and+proliferation+kinetics+of+male+germ+line+stem+cells+following+transplantation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Homing efficiency and proliferation kinetics of male germ line stem cells following transplantation in mice.</a> Biology of Reproduction. 69 (2), 701-701 (2003).</li>
<li>Kubota, H., Avarbock, M. R., Brinster, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+factors+essential+for+self-renewal+and+expansion+of+mouse+spermatogonial+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Growth factors essential for self-renewal and expansion of mouse spermatogonial stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (47), 16489-16489 (2004).</li>
<li>Oatley, J. M., Avarbock, M. R., Telaranta, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+genes+important+for+spermatogonial+stem+cell+self-renewal+and+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Identifying genes important for spermatogonial stem cell self-renewal and survival.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (25), 9524-9524 (2006).</li>
<li>Dobrinski, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germ+cell+transplantation+and+testis+tissue+xenografting+in+domestic+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Animal+Reproduction+Science%22%5BJournal%5D)">Germ cell transplantation and testis tissue xenografting in domestic animals.</a> Animal Reproduction Science. 89 (1-4), 137-137 (2005).</li>
<li>Dobrinski, I., Avarbock, M. R., Brinster, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+germ+cells+from+rabbits+and+dogs+into+mouse+testes%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Transplantation of germ cells from rabbits and dogs into mouse testes.</a> Biology of Reproduction. 61 (5), 1331-1331 (1999).</li>
<li>Honaramooz, A., Snedaker, A., Boiani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sperm+from+neonatal+mammalian+testes+grafted+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Sperm from neonatal mammalian testes grafted in mice.</a> Nature. 418 (6899), 778-778 (2002).</li>
<li>Rodriguez-Sosa, J. R., Dobrinski, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+developments+in+testis+tissue+xenografting%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Recent developments in testis tissue xenografting.</a> Reproduction. 138 (2), 187-187 (2009).</li>
<li>Dobrinski, I., Rathi, R. Ectopic grafting of mammalian testis tissue into mouse hosts. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDobrinski%2C+I+%22Methods+in+Molecular+Biology%22">Methods in Molecular Biology</a>. 139, Clifton, N.J. 450-450 (2008).</li>
<li>Rodriguez-Sosa, J. R., Schlatt, S., Dobrinski, I. Testicular tissue transplantation for fertility preservation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRodriguez-Sosa%2C+JR+%22Fertility+Preservation%3A+Emerging+Technologies+and+Clinical+Applications%22">Fertility Preservation: Emerging Technologies and Clinical Applications</a>. Seli, E., Agarwal, A. , Springer. New York, NY. 331-331 (2011).</li>
<li>Rathi, R., Honaramooz, A., Zeng, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germ+cell+fate+and+seminiferous+tubule+development+in+bovine+testis+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Germ cell fate and seminiferous tubule development in bovine testis xenografts.</a> Reproduction. 130 (6), 923-923 (2005).</li>
<li>Rathi, R., Honaramooz, A., Zeng, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germ+cell+development+in+equine+testis+tissue+xenografted+into+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Germ cell development in equine testis tissue xenografted into mice.</a> Reproduction. 131 (6), 1091-1091 (2006).</li>
<li>Kim, Y., Selvaraj, V., Pukazhenthi, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+donor+age+on+success+of+spermatogenesis+in+feline+testis+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%2C+Fertility%2C+and+Development%22%5BJournal%5D)">Effect of donor age on success of spermatogenesis in feline testis xenografts.</a> Reproduction, Fertility, and Development. 19 (7), 869-869 (2007).</li>
<li>Arregui, L., Rathi, R., Zeng, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenografting+of+adult+mammalian+testis+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Animal+Reproduction+Science%22%5BJournal%5D)">Xenografting of adult mammalian testis tissue.</a> Animal Reproduction Science. 106 (1-2), 65-65 (2008).</li>
<li>Schlatt, S., Honaramooz, A., Ehmcke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limited+survival+of+adult+human+testicular+tissue+as+ectopic+xenograft%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Limited survival of adult human testicular tissue as ectopic xenograft.</a> Human Reproduction. 21 (2), 384-384 (2006).</li>
<li>Shinohara, T., Avarbock, M. R., Brinster, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((beta1-+and+alpha6-integrin+are+surface+markers+on+mouse+spermatogonial+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">beta1- and alpha6-integrin are surface markers on mouse spermatogonial stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (10), 5504-5504 (1999).</li>
<li>Kanatsu-Shinohara, M., Toyokuni, S., Shinohara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD9+is+a+surface+marker+on+mouse+and+rat+male+germline+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">CD9 is a surface marker on mouse and rat male germline stem cells.</a> Biology of Reproduction. 70 (1), 70-70 (2004).</li>
<li>Ryu, B. Y., Orwig, K. E., Oatley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+aging+and+niche+microenvironment+on+spermatogonial+stem+cell+self-renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Effects of aging and niche microenvironment on spermatogonial stem cell self-renewal.</a> Stem Cells. 24 (6), 1505-1505 (2006).</li>
<li>Costoya, J. A., Hobbs, R. M., Barna, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+role+of+Plzf+in+maintenance+of+spermatogonial+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Essential role of Plzf in maintenance of spermatogonial stem cells.</a> Nature Genetics. 36 (6), 653-653 (2004).</li>
<li>Morrow, C. M., Hostetler, C. E., Griswold, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ETV5+is+required+for+continuous+spermatogenesis+in+adult+mice+and+may+mediate+blood+testes+barrier+function+and+testicular+immune+privilege%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">ETV5 is required for continuous spermatogenesis in adult mice and may mediate blood testes barrier function and testicular immune privilege.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1120, 144-144 (2007).</li>
<li>Zeng, W., Snedaker, A. K., Megee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preservation+and+transplantation+of+porcine+testis+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%2C+Fertility+and+Development%22%5BJournal%5D)">Preservation and transplantation of porcine testis tissue.</a> Reproduction, Fertility and Development. 21 (3), 489-489 (2009).</li>
<li>Jahnukainen, K., Ehmcke, J., Hergenrother, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+cold+storage+and+cryopreservation+of+immature+non-human+primate+testicular+tissue+on+spermatogonial+stem+cell+potential+in+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Effect of cold storage and cryopreservation of immature non-human primate testicular tissue on spermatogonial stem cell potential in xenografts.</a> Human Reproduction. 22 (4), 1060-1060 (2007).</li>
<li>Rathi, R., Zeng, W., Megee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maturation+of+testicular+tissue+from+infant+monkeys+after+xenografting+into+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Maturation of testicular tissue from infant monkeys after xenografting into mice.</a> Endocrinology. 149 (10), 5288-5288 (2008).</li>
<li>Honaramooz, A., Li, M. W., Penedo, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+maturation+of+primate+testis+by+xenografting+into+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Accelerated maturation of primate testis by xenografting into mice.</a> Biology of Reproduction. 70 (5), 1500-1500 (2004).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano konfliktów interesów.

1. Transplantacja komórek linii zarodkowej
Transplantacja komórek linii płciowej stanowi jedyny funkcjonalny test umożliwiający jednoznaczne potwierdzenie obecności komórek macierzystych spermatogonialnych (SSCs) w danej populacji komórek. Tylko SSCs mogą migrować do niszy SSC znajdującej się w błonie podstawnej, kolonizować ją i inicjować spermatogenezę pochodzącą od dawcy. Transplantacja komórek linii płciowej umożliwiła badanie i manipulowanie SSCs w sposób bezprecedensowy. Technika ta była s...

<table><tbody><tr><td>Kolagenaza (typ IV)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5138</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>DNaseI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>31053-028</td><td></td></tr><tr><td>Barwnik trypan blue</td><td>Invitrogen</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Nylonowe sitko do odfiltrowywania komórek</td><td>BD Biosciences</td><td>352340 (40&amp;#181;m) 352350 (70&amp;#181;m)</td><td></td></tr><tr><td>Busulfan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B2635</td><td></td></tr><tr><td>Cienkościenne kapilary szklane</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>TW 100-3</td><td></td></tr><tr><td>Polietylenowe rurki BD intramedic (PE100)</td><td>BD Biosciences</td><td>CA-63018-725</td><td></td></tr><tr><td>Jedwabna nić chirurgiczna Ethicon 6-0</td><td>Ethicon Inc.</td><td>706G</td><td></td></tr><tr><td>Klamry do ran</td><td>BD Biosciences</td><td>427631</td><td></td></tr><tr><td>Sigmacote</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SL2</td><td></td></tr><tr><td>X-gal</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4252</td><td></td></tr><tr><td>Ferrocyjanek potasu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9387</td><td></td></tr><tr><td>Ferrycyjanek potasu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3667</td><td></td></tr><tr><td>chlorek magnezu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>208337</td><td></td></tr><tr><td>deoksycholan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6750</td><td></td></tr><tr><td>N,N-Dimetyloformamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4551</td><td></td></tr><tr><td>Igepal CA-630</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>18896</td><td></td></tr></tbody></table>

transplantacja komórek linii zarodkowej i ksenoprzeszczepy tkanki jądra u myszy

Germ Cell Transplantation and Testis Tissue Xenografting in Mice

Przeszczepianie komórek linii zarodkowej zostało opracowane przez dr. Ralpha Brinstera i współpracowników z University of Pennsylvania w 1994 roku1,2. Te przełomowe badania wykazały, że mikroiniekcja komórek linii zarodkowej od płodnych myszy donora do kanalików nasiennych bezpłodnych myszy biorcy prowadzi do spermatogenezy pochodzącej od donora i produkcji plemników przez zwierzę biorcę2. Wykorzystanie samców donora niosących bakteryjny gen β-galaktozydazy pozwoliło na identyfikację spermatogenezy pochodzącej od donora oraz przekazanie haplotypu donora potomstwu zwierząt biorców1. Co zaskakujące, po przeszczepieniu do światła kanalików nasiennych, przeszczepione komórki linii zarodkowej były w stanie przemieścić się z przedziału światła do błony podstawnej, w której znajdują się spermatogonia3. Powszechnie przyjmuje się, że tylko SSC są w stanie skolonizować niszę i przywrócić spermatogenezę w jądrze biorcy. Zatem przeszczepianie komórek linii zarodkowej stanowi funkcjonalne podejście do badania niszy komórek macierzystych w jądrze oraz charakterystyki domniemanych komórek macierzystych spermatogonialnych. Do dziś przeszczepianie komórek linii zarodkowej jest wykorzystywane do wyjaśniania podstawowej biologii komórek macierzystych, wytwarzania zwierząt transgenicznych poprzez manipulacje genetyczne komórek linii zarodkowej przed przeszczepieniem4,5, badania interakcji między komórkami Sertolego a komórkami linii zarodkowej6,7, homingu i kolonizacji SSC3,8, a także samoodnowy i różnicowania SSC9,10.
Przeszczepy komórek linii zarodkowej są możliwe również u dużych gatunków11. W ich przypadku głównymi zastosowaniami są zachowanie płodności, rozpowszechnianie elitycznej genetyki w populacjach zwierząt oraz generowanie zwierząt transgenicznych, ponieważ badanie spermatogenezy i biologii SSC za pomocą tej techniki jest logistycznie trudniejsze i bardziej kosztowne niż u gryzoni. Przeszczepienie komórek linii zarodkowej dużych gatunków do kanalików nasiennych myszy prowadzi do kolonizacji komórek dawcy i ekspansji spermatogonialnej, ale nie do ich pełnego różnicowania, co prawdopodobnie wynika z niekompatybilności somatycznego komponentu komórkowego biorcy z komórkami linii zarodkowej gatunków odległych filogenetycznie12. Alternatywnym podejściem jest przeszczepienie komórek linii zarodkowej dużych gatunków wraz z otaczającym je komponentem somatycznym. W 2002 roku po raz pierwszy zgłosiliśmy, że małe fragmenty tkanki jądra niedojrzałych samców przeszczepione pod skórę grzbietową myszy z niedoborem odporności są w stanie przetrwać i przejść pełny rozwój z produkcją plemników zdolnych do zapłodnienia13. Od tego czasu wykazano, że ksenoprzeszczepy tkanki jądra odnoszą sukces u wielu gatunków i stały się cenną alternatywą do badania rozwoju jąder oraz spermatogenezy dużych zwierząt u myszy14.

Opisano protokoły transplantacji komórek linii płciowej oraz ksenoprzeszczepów tkanki jądra. Transplantacja komórek linii płciowej prowadzi do spermatogenezy pochodzącej od dawcy w jądrach biorcy i stanowi funkcjonalny test rekonstytucji służący do identyfikacji komórek macierzystych spermatogoniów (SSCs). Ksenoprzeszczepy tkanki jądra odtwarzają rozwój jądra oraz spermatogenezę różnych gatunków dawców u myszy biorców.

Transplantacja komórek linii zarodkowej i ksenoprzeszczepy tkanki jądra u myszy

Transplantacja komórek linii zarodkowej została opracowana przez dr. Ralpha Brinstera i współpracowników z University of Pennsylvania w 1994 roku1,2. Te przełomowe badania ...

W tym filmie zaprezentowano dwie powiązane ze sobą techniki. Pierwszą z nich jest transplantacja komórek macierzystych spermatogoniów, czyli transplantacja SSC, a drugą jest ksenoprzeszczep tych tkanek. Transplantacja SSC jest wykorzystywana do indukowania spermatogenezy z komórek SSC dawcy w jądrach biorcy.Osiąga się to poprzez przygotowanie zawiesiny komórkowej z jąder dawcy lub hodowlanych komórek zawierających SSC z dawcy z identyfikowalnym markerem transgenicznym, takim jak GFP lub LAC Z. Następnie jądra samca biorcy zostają wyewagowane. Biorca został poddany zabiegowi, w wyniku którego w jego jądrach nastąpił ubytek komórek zarodkowych. Następnie izoluje się przewody nasienne samca biorcy i wstrzykuje w nie komórki dawcy wymieszane z taan.Niebieski barwnik. Ostatecznie kolonizacja nabłonka kanalików nasiennych biorcy. Obecność komórek linii zarodkowej pochodzących od dawcy w kanalikach nasiennych jest widoczna dwa do trzech miesięcy po transplantacji, co w tym przykładzie wykazano za pomocą barwienia tkanek jąder biorcy, demonstrującego kolonizację przez komórki dawcy wykazujące ekspresję lack Z.Drugą techniką zaprezentowaną w tym filmie jest ksenoprzeszczep tkanki jawodra. Metoda raftingu tkanki jawodra jest wykorzystywana do wprowadzenia rozwoju jąder i spermatogenezy gatunku dawcy poprzez transplantację fragmentów jąder niedojrzałych dawców do mysich gospodarzy z niedoborem tych funkcji. Osiąga się to poprzez uprzednie przygotowanie odpowiednich fragmentów tkanki do transplantacji z jąder dużego gatunku dawcy, takiego jak świnia, co pokazano w niniejszym przykładzie.Kolejnym krokiem jest kastracja dorosłej myszy biorcy z niedoborem odporności, a następnie przeszczepienie fragmentów jąder dawcy pod skórę grzbietową myszy biorcy. Myszy biorcy pełnią funkcję inkubatorów in vivo, umożliwiając pełny rozwój ksenoprzeszczepów jąder w ciągu od sześciu do siedmiu miesięcy, w zależności od gatunku dawcy. Przeszczepianie komórek macierzystych linii zarodkowej zostało opracowane po raz pierwszy przez Ralpha Bristera i jego współpracowników z University of Pennsylvania i po raz pierwszy opisane w 1994 roku.Od tego czasu metoda ta znalazła szerokie zastosowanie i obecnie stanowi złoty standard bioanalizy w dziedzinie biologii macierzystych komórek linii zarodkowej, pomagając w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w tej dyscyplinie, takie jak wyjaśnienie szlaków sygnałowych sterujących samoodnawianiem się komórek macierzystych. Pomysł na ksenotransplantację pojawił się u nas po zauważeniu, że transplantacja wyizolowanych macierzystych komórek spermatogoni od dawców niebędących gryzoniami, np. świń, naczelnych lub ludzi, do jądra myszy nie prowadziła do pełnej spermatogenezy pochodzącej od dawcy. Ustaliliśmy, że zachowanie mikrośrodowiska jądra poprzez transplantację małych fragmentów tkanki jądra zamiast wyizolowanych komórek zarodkowych pozwala przełamać to ograniczenie i prowadzi do pełnej spermatogenezy pochodzącej od dawcy z gatunku odległego filogenetycznie w organizmie myszy jako biorcy.Zostało to po raz pierwszy przez nas opisane w 2002 roku. Protokół transplantacji komórek zarodkowych wymaga przygotowania zawiesiny komórkowej do wstrzyknięcia. Szczegóły przygotowania znajdują się w tekście manuskryptu.Procedurę transplantacji należy rozpocząć od znieczulenia myszy biorcy i upewnienia się, że głębokość znieczulenia jest wystarczająca, poprzez sprawdzenie braku odruchu bólowego. Następnie zwierzę należy ułożyć na grzbiecie i chirurgicznie przygotować obszar brzuszny. Wykonaj nacięcie w linii środkowej o długości około jednego centymetra, aby odsłonić ścianę brzuszną.Za pomocą pęsety unieś ścianę w miejscu białej linii, aby uniknąć przypadkowego uszkodzenia narządów jamy brzusznej. Następnie, posiłkując się cienką pęsetą, wykonaj nacięcie o długości pół centymetra, aby odsłonić jamę otrzewną. Wypreparuj jądro, pociągając za przylegający do niego i do najądrza podkład tłuszczowy, a następnie umieść te struktury na sterylnej karcie indeksowej.Teraz należy dodać barwnik trypan blue do zawiesiny komórkowej. Następnie wprowadź zawiesinę komórkową do rurki polietylenowej połączonej z jednofazową strzykawką o objętości 1 ml i przymocuj do rurki dociągniętą pipetę. Powoli wprowadź zawiesinę komórkową do pipety, wywierając nacisk na tłok strzykawki.Przechodzimy teraz do najważniejszego etapu transplantacji SCC, którym jest identyfikacja i kaniulacja przewodów wywodowych (ENT). Przy użyciu mikroskopu rozcinającego zidentyfikujuj przewodów wywodowych pomiędzy jądrami a nadjądrzami (EPI), a następnie delikatnie usuń tkankę tłuszczową otaczającą przewody. Pracuj ostrożnie, ponieważ przewody oraz otaczająca je błona są półprzezroczyste.Ustabilizować przewody, obejmując je sterylnym, trójkątnym kawałkiem plastiku. Następnie ostrożnie wprowadzić pipetę do iniekcji do jednego z przewodów w pęczku przewodów deferens. Delikatnie przesunąć pipetę o kilka milimetrów w kierunku jądra.Utrzymując pipetę iniekcyjną w bezruchu, powoli wstrzykuj komórki w momencie, gdy jądro i kanaliki przymilczkowe zaczynają się wypełniać; zachowaj stały przepływ, aż do czasu wypełnienia prawie wszystkich kanalików widocznych na powierzchni. Nie przepełniaj jądra, aby nie doprowadzić do jego niedokrwienia. Następnie wprowadź jądro z powrotem do jamy brzusznej i powtórz procedurę na jądrze przeciwległym.Po zakończeniu zamknij ścianę brzusną za pomocą szwu jedwabnego 6-0 i zamknij skórę za pomocą metalnych klamer chirurgicznych. Po operacji monitoruj mysz na podgrzewanej podkładce, aż do momentu wystarczającego wybudzenia z narkozy, aby można było ją przenieść z powrotem do klatki macierzystej. Druga procedura, która zostanie zaprezentowana – ksenotransplantacja tkanki jądra – zakłada wykorzystanie biopsji jądra lub całych jąder od dawców.W przypadku biopsji fragmenty jądra należy przemyć dwa lub trzy razy w lodowatej pożywce hodowlanej z dodatkiem antybiotyków. Po każdym przemyciu zawiesinę należy odwirować i usunąć nadosad. Następnie tkankę po przemyciu należy przenieść do czystej szalki i pociąć biopsje na mniejsze fragmenty przeznaczone do transplantacji.Używając zakrzywionej pęsety i ostrza skalpela, należy przeprowadzić bardziej szczegółowe przygotowanie całych jąder. Rozpocznij od dwu- lub trzykrotnego przemycia każdego jądra lodowatym PBS zawierającym antybiotyki. Następnie przenieś oczyszczone jądra do czystej szalki z PBS.Następnie usuń błonę pochwy, wykonując nacięcie wzdłuż jej powierzchni, i wydobądź jądra. Usuń wszystkie struktury przyległe, takie jak osłonka, sznur nasienny, najednacz i tkankę łączną. Przemyj wyjęte jądra raz w zimnym PBS, a następnie przenieś je do naczynia hodowlanego z PBS.Następnie ostrożnie usuń tunica albuginea, używając ostrza skalpela i nożyczek. Jeśli jądro jest bardzo małe, tunica może zostać usunięta poprzez wyciśnięcie tkanki jądra z tunicy przez małe nacięcie w małej szalce hodowlanej wypełnionej lodem. W zimnym medium stopniowo posiekaj jądro na małe kawałki, zgodnie z wcześniejszym opisem.Na koniec należy wybrać fragmenty tkanki przeznaczone do ksenoprzeszczepienia i odizolować je w naczyniach hodowlanych z lodowatym medium hodowlanym do momentu ich wykorzystania. Znieczulić mysz zgodnie z wcześniej opisaną procedurą. Następnie umieścić mysz na podkładce grzewczej.Przygotuj sterylne pole operacyjne, wygolając sierść na brzuchu i grzbiecie. Przetrzyj brzuch 70% etanolem oraz roztworem Betadine. Aby przeprowadzić kastrację, wykonaj nacięcie skóry w linii środkowej brzucha o długości od 0,5 do 1 cm, aby odsłonić ścianę brzuszną.Następnie nacinamy ścianę brzuszną, aby odsłonić jamę brzuszną. Ostrożnie odsłaniamy jądro, tętnicę jądrową oraz najedenkę, zgodnie z wcześniejszym opisem. Następnie oddzielamy ogon najedenki od gubernaculum za pomocą tępej dyssekcji.Następnie należy podwiązać tętnicę jamnika w przewodzie nasiennym wraz z naczyniem krwionośnym, używając jedwabnych szwów. Po tym czasie należy przeciąć podwiązane struktury, wykonując cięcie pomiędzy jądrami a podwiązaniem. Po powtórzeniu procedury dla drugiego jądra, należy zaszyć ścianę brzusną jednym lub dwoma szwami chirurgicznymi, a nacięcie skóry zamknąć za pomocą jednego lub dwóch klipsów micc w celu implantacji egzogennych ksenoprzeszczepów.Umyj i ułóż kastrowaną, zanieczuloną mysz w pozycji brzusznej i przygotuj sterylne pole operacyjne na grzbiecie zwierzęcia. W miejscu każdego planowanego przeszczepu wykonaj nacięcie skóry o długości pół centymetra po każdej stronie linii środkowej, używając pęsety do przytrzymania brzegu nacięcia. Za pomocą nożyczek utwórz w tkance podskórnej jamę o głębokości od 5 do 10 milimetrów.Rozdziel tkankę łączną, aby stworzyć przestrzeń wystarczająco głęboką dla przeszczepu, tak aby nie został on uchwycony przez klips zamykający. Używając precyzyjnej pęsety, umieść fragment tkanki jądra głęboko w jamie podskórnej, przytrzymując brzeg nacięcia skóry pęsetą irydową.Każde nacięcie skóry zamknij za pomocą jednego klipsa Mic Clip. Następnie pozwól myszy dojść do siebie po anestezji na podgrzewanym podłożu. Po wybudzeniu przenieś mysz do jej klatki macierzystej i monitoruj jej stan aż do pełnego powrotu do formy.Stwierdzono, że przeszczepione komórki macierzyste spermatogonia dawcy wykazujące ekspresję transgenu lae zasiedliły jądra biorcy dwa do trzech miesięcy po transplantacji iCal. Barwienie ujawniło charakterystyczne niebieskie segmenty kanalików rozwijnących biorcy. Dobrze rozwinięta kolonia tworzy długi, ciemnoniebieski odcinek całkowicie wypełnionych segmentów, z dwiema lub więcej warstwami niebieskich komórek bliżej centrum na obu końcach kolonii.Widoczna jest również sieć pojedynczych par lub małych grup komórek. Przekrój poprzeczny ciemnoniebieskiego obszaru kanalików nasiennych ujawnił dobrze ukształtowaną i dobrze zorganizowaną agenezję Perato z niebieskimi komórkami zarodkowymi na różnych etapach różnicowania. W przypadku tkanek jąder, fragmenty ksenoprzeszczepu niedojrzałych jąder dawcy zostały przeszczepione pod skórę grzbietową myszy z niedoborem odporności, gdzie były w stanie przetrwać i reagować na gonadotropiny mysie.W rezultacie tkanka jądra uległa pełnemu rozwojowi, w tym do powstania zdolnych do zapłodnienia plemników. Po pobraniu ksenoprzeszczepów jąder wykorzystano je do pozyskania plemników w celu przeprowadzenia exy oraz produkcji embrionów. Transplantacja macierzystych komórek plemnikowych rozwija dziedzinę biologii komórek macierzystych poprzez badanie interakcji nisz komórek macierzystych w jądrach oraz opracowanie warunków hodowlanych umożliwiających ekspansję macierzystych komórek plemnikowych in vitro po wytworzeniu ksenoprzeszczepu tkanki jądra.Technika ta utorowała drogę badaczom z dziedziny biologii rozrodczej samców do studiowania aspektów spermatogenezy, toksykologii rozrodczej oraz konserwacji materiału genetycznego niedojrzałych samców u różnych gatunków dawców, od myszy po ludzi.

germ-cell-transplantation-and-testis-tissue-xenografting-in-mice

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Przeszczepianie komórek zarodkowych i przeszczepianie tkanki jąder u myszy

Opisano metodę niezawodnego przeszczepiania ludzkich komórek złośliwego guza pochewki nerwów obwodowych znakowanych lucyferazą do nerwu kulszowego myszy z niedoborem odporności. Omówiono również wykorzystanie obrazowania bioluminescencyjnego do wykazania prawidłowego przyjęcia przeszczepów nowotworowych oraz kryteria losowego przydziału zwierząt do grup badawczych.

Ortotopowe ksenoprzeszczepy ludzkich komórek złośliwego guza osłonki nerwów obwodowych znakowanych lucyferazą do testowania potencjalnych środków terapeutycznych in vivo

Prosta metoda pozyskiwania i utrzymywania linii komórek macierzystych i progenitorowych spermatogoniów od dorosłych myszy jest przedstawiona tutaj.  Metoda wykorzystuje komórki zasilające pochodzące z przedziału komórki somatycznej jądra dorosłej myszy. Ta technika ma zastosowanie do popularnych szczepów myszy, w tym myszy transgenicznych, nokautujących i knock-in.

Seryjne wzbogacanie spermatogonialnych komórek macierzystych i progenitorowych (SSC) w hodowli w celu uzyskania długoterminowych linii SSC dorosłych myszy

Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) pochodzące z miogennych komórek macierzystych są obiecującymi kandydatami na strategie terapii komórkowej w leczeniu dystrofii mięśniowych. Protokół ten opisuje przeszczep i pomiary funkcjonalne wymagane do oceny wszczepienia i różnicowania mezoangioblastów pochodzących z iPSC (rodzaj komórek progenitorowych mięśni) w mysich modelach ostrej i przewlekłej regeneracji mięśni.

Przeszczep indukowanych pluripotencjalnych progenitorów miogennych podobnych do mezoangioblastów pochodzących z mezoangioblastów w mysich modelach regeneracji mięśni

Ksenografty ludzkich nowotworów u myszy z niedoborem odporności są cennymi narzędziami do badania biologii raka.  Opisano specyficzne protokoły generowania ksenoprzeszczepów podskórnych i wewnątrzwątrobowych z ludzkich komórek raka wątrobowokomórkowego lub fragmentów guza.  Regeneracja wątroby wywołana częściową hepatektomią u myszy biorców jest przedstawiana jako strategia ułatwiająca wszczepienie wewnątrzwątrobowe.

Wytwarzanie podskórnych i wewnątrzwątrobowych ksenoprzeszczepów ludzkiego raka wątrobowokomórkowego u myszy z niedoborem odporności

Sprawdzona technika szczepienia pierwotnych inwazyjnych ksenoprzeszczepów raka ortotopowego pęcherza moczowego wymaga laparotomii i mobilizacji pęcherza. Procedura ta powoduje znaczną zachorowalność u myszy, jest technicznie trudna i czasochłonna. W związku z tym opracowaliśmy wysoce precyzyjne, przezskórne podejście wykorzystujące kontrolę ultrasonograficzną.

Małoinwazyjne założenie mysich ortotopowych ksenoprzeszczepów pęcherza moczowego

Ten manuskrypt szczegółowo opisuje metodę używaną do generowania ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów z rakiem prostaty (PDX) z krążących komórek nowotworowych (CTC). Generowanie modeli PDX z CTC zapewnia alternatywny model eksperymentalny do badania raka prostaty; Najczęściej diagnozowany nowotwór i częsta przyczyna zgonów z powodu raka u mężczyzn.

Generowanie modeli ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów z rakiem prostaty z krążących komórek nowotworowych

Tutaj prezentujemy protokół do wywoływania i oceniania choroby w modelu xenoGVHD (xenoGVHD) ksenogenicznej choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi. xenoGVHD dostarcza model in vivo do badania immunosupresji ludzkich limfocytów T. Dodatkowo opisujemy, jak wykrywać ludzkie limfocyty T w tkankach za pomocą cyfrowego PCR jako narzędzia do ilościowego określania immunosupresji.

Indukcja i ocena choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi w ksenogenicznym mysim modelu i kwantyfikacja ludzkich limfocytów T w tkankach myszy przy użyciu cyfrowego PCR

Skomplikowane choroby ludzkie mogą być trudne do modelowania w tradycyjnych systemach modeli laboratoryjnych. W tym miejscu opisujemy chirurgiczne podejście do modelowania choroby mięśni ludzkich poprzez przeszczepienie biopsji ludzkich mięśni szkieletowych myszom z niedoborem odporności.

Wykonywanie ksenoprzeszczepów mięśni szkieletowych u myszy z niedoborem odporności

Tutaj opisane są cztery metody generowania organoidów jąder z pierwotnych komórek jąder myszy noworodków, tj. macierz zewnątrzkomórkowa (ECM) oraz środowiska hodowli 2D i 3D wolne od ECM. Techniki te mają wiele zastosowań badawczych i są szczególnie przydatne do badania rozwoju jąder i fizjologii in vitro.

Pozakomórkowe i pozakomórkowe wolne od macierzy komórkowej wytwarzanie mysich organoidów jąder

Obecny protokół opisuje, jak przeszczepić ludzką skórę nieotyłym myszom z cukrzycą (NOD)-scid z receptorem łańcucha gamma interleukiny-2 (NSG). W raporcie zawarto szczegółowy opis przygotowania skóry ludzkiej do przeszczepu, przygotowania myszy do przeszczepu, przeszczepu skóry ludzkiej o podzielonej grubości oraz procedury rekonwalescencji po przeszczepie.

Model skóry ksenoprzeszczepu do manipulowania ludzkimi odpowiedziami immunologicznymi in vivo

Tutaj wprowadzamy metodę wykonywania okrągłych wstrzyknięć spermatyd (ROSI) u myszy, technikę o obiecujących zastosowaniach klinicznych i użyteczność do badania mechanizmów leżących u podstaw rozwoju embrionalnego.

Wstrzyknięcie okrągłego plemnika myszy

Poznaj techniki przeszczepu komórek SSC i ksenoprzeszczepu tkanki jądra u myszy. Metody te umożliwiają odtworzenie spermatogenezy od dawcy w jądrach biorcy oraz badanie biologii rozrodu.

Transplantacja komórek linii zarodkowej i ksenoprzeszczepy tkanki jądra u myszy

Przeglądaj więcej filmów