Name: Wykrywanie i izolacja krążących komórek czerniaka za pomocą przepływometrii fotoakustycznej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: Poznaj metodę wykrywania i izolacji krążących komórek czerniaka za pomocą przepływometrii fotoakustycznej. Technika ta umożliwia szybką, bezcetykietową detekcję komórek nowotworowych z krwi pacjentów z czerniakiem w stadium IV.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wyrażamy wdzięczność za wsparcie Departamentu Inżynierii Biologicznej oraz Christopher S. Bond Life Sciences Center na University of Missouri. Dziękujemy za wsparcie finansowe w ramach grantów Missouri Life Sciences Research Board 09-1034 oraz NIH R21CA139186-0. Dziękujemy również Life Sciences Undergraduate Research Opportunity Program na University of Missouri, University of Missouri Molecular Cytology Core oraz University of Missouri College of Engineering za wsparcie finansowe.

1. Przygotowanie próbki krwi
<ol>
	<li>Pobrać około 10 mL krwi pełnej od pacjenta z rakiem w IV stadium do dwóch probówek vacutainer o pojemności 5 mL.</li>
	<li>Wirować probówki przez dziesięć minut przy 3,000 obrotów na minutę (rpm).</li>
	<li>Próbka krwi rozwarstwi się na trzy różne warstwy: warstwa dolna składa się z erytrocytów, warstwa środkowa, nazywana również warstwą buffy coat, zawiera leukocyty i komórki czerniaka, a warstwa górna zawiera osocze i płytki krwi. Usunąć jak najwięcej osocza, nie naruszając warstwy buffy coat.</li>
	<li>Wlać 250 μL Histopaque 1077 do dwóch probówek Wintrobe o pojemności 1 mL.</li>
	<li>Za pomocą 9″ pipety Pasteura pobrać pozostałe osocze, całą warstwę buffy coat oraz górną warstwę erytrocytów, dbając o to, aby zebrać &lt; 500 μL.</li>
	<li>Nanieść tak przygotowany roztwór na warstwę Histopaque i wirować probówki Wintrobe umieszczone w 15 mL probówkach stożkowych przez 10 minut przy 3000 rpm.</li>
	<li>Krew ponownie się rozwarstwi, ale tym razem erytrocyty zostaną oddzielone przez Histopaque, co umożliwi łatwe pobranie warstwy buffy coat. Za pomocą 9″ pipety Pasteura pobrać całą warstwę buffy coat i przenieść ją do probówki eppendorf o pojemności 2 mL.</li>
	<li>Resuspendować warstwę buffy coat w 1,5 mL PBS z dodatkiem 2% v/v Tween 20.</li>
</ol>
2. Konstrukcja komory przepływowej
<ol>
	<li>Należy przygotować cylinder akrylowy o średnicy zewnętrznej 20 mm, średnicy wewnętrznej 17 mm i wysokości 8 mm. W bocznej ściance cylindra należy wywiercić trzy otwory o średnicy 5 mm, rozmieszczone co 90 stopni względem siebie. Następnie należy odciąć trzy odcinki rurki polimerowej (średnica wewnętrzna 1,6 mm, średnica zewnętrzna 5 mm) i umieścić je w wywierconych otworach.</li>
	<li>Dno pierścienia akrylowego należy naciągnąć Parafilmem, aby zapewnić szczelność wodną. Parafilm wraz z pierścieniem akrylowym tworzy płytką miseczkę, która będzie pomieścić roztwór akryloamidu służący do uformowania komory przepływowej.</li>
	<li>Przez odcinki rurek znajdujące się naprzeciw siebie należy przełożyć drut o średnicy 1,6 mm, upewniając się, że w środkowej części pierścienia widoczny jest tylko drut. Trzeci odcinek rurki należy wypełnić drutem o średnicy 1,6 mm i ustawić rurkę w odległości 1 mm od drutu zawieszonego. Druty te zapobiegają przedostawaniu się akryloamidu do wnętrza rurek. Po zestaleniu akryloamidu druty zostaną usunięte, pozostawiając cylindryczny kanał przepływowy oraz miejsce na umieszczenie włókna optycznego ogniskującego wiązkę na ścieżce przepływu.</li>
	<li>Do małego zlewki należy dodać 5 mL przygotowanego akryloamidu [20 g akryloamidu (Sigma Aldrich), 0,7 g bisakryloamidu (Sigma Aldrich), 100 mL wody destylowanej]. Należy odważyć 0,02 g persiarczanu amonu (Sigma) i dodać go do zlewki. Mieszaninę należy mieszać magnetycznym mieszadłem przez 3 minuty. Do zlewki należy dodać 20 μL tetrametyloetylenodiaminy (Fisher Scientific). Mieszaninę należy szybko wlać do pierścienia akrylowego, wypełniając go po brzegi. Po kilku sekundach roztwór ulegnie żelowaniu, tworząc formę komory przepływowej. Należy ostrożnie wyciągnąć druty, dbając o to, aby nie naruszyć żelu akryloamidowego. Komora przepływowa jest teraz gotowa do użycia.</li>
</ol>
3. Układ fotoakustycznej flowmetrii
<ol>
	<li>Połącz akustycznie piezoelektryczny przetwornik akustyczny z polifluorku winylidenu (Panametrics) z komorą przepływową, stosując żel ultradźwiękowy bezpośrednio nad ścieżką przepływu.</li>
	<li>Za pomocą kabla Bayonet Neill-Concelman (BNC) podłącz przetwornik do wejścia szerokopasmowego odbiornika RITEC Broadband Receiver-640A (filtr dolnoprzepustowy: wyłączony, filtr górnoprzepustowy: 1 MHz, impedancja wejściowa: 50 Ohms, wzmocnienie: 35 dB). Wyjście filtra podłącz do oscyloskopu (Tektronix TDS 2024B). W celu wyzwolenia oscyloskopu, w pobliżu przetwornika umieszczono fotodiodę (Thorlabs), która jest podłączona do oscyloskopu za pomocą kabla BNC.</li>
	<li>Do jednego ramienia komory przepływowej przymocowano łącznik T (Small Parts). Do pozostałych odgałęzień łącznika podłączono dwie pompy strzykawkowe (Braintree Scientific). Jedna strzykawka zawiera powietrze, a druga zawiesinę komórkową przygotowaną w części 1. Ustaw prędkość przepływu na 100 μL/minute.</li>
	<li>Wysuń cienką rurkę komory przepływowej, aż utworzy się mała szczelina powietrzna, a następnie w tym miejscu umieść rdzeniowe włókno optyczne o średnicy 1 mm i aperturze numerycznej 0,37. Wypełnij szczelinę wodą, aby zredukować sygnały z powierzchni styku i zwiększyć ilość światła laserowego kierowanego na ścieżkę przepływu. Ze względu na aperturę numeryczną włókna optycznego i krótką odległość do ścieżki przepływu, laser będzie naświetlać w danym czasie tylko jedną porcję próbki, co zapewni, że próbka znajdująca się bezpośrednio przed laserem jest tą samą próbką, która generuje sygnały fotoakustyczne. Energia lasera powinna wynosić około 28 mJ/cm2 przy rozmiarze plamki 7 mm2.</li>
	<li>Włącz obie pompy strzykawkowe. Gdy dwie niemieszalne ciecze dotrą do złącza T, zostaną one podzielone na jednorodne porcje i przepłyną obok przetwornika.</li>
	<li>Naświetlaj przepływającą próbkę nanosekundowym laserem impulsowym, aby wygenerować fale fotoakustyczne w komórkach czerniaka. Ponieważ melanina jest szerokopasmowym absorbentem optycznym, można zastosować dowolną długość fali lasera z zakresu widzialnego.</li>
	<li>Jeśli na oscyloskopie pojawi się sygnał w momencie, gdy porcja znajduje się nad przetwornikiem, oznacza to, że porcja zawiera komórki czerniaka i powinna być śledzona w systemie aż do wpłynięcia do probówki zbiorczej.</li>
</ol>
4. Immunocytochemia
<ol>
	<li>Przenieś przechwycone próbki do wirówki Cytospin 4 (Thermo Scientific) w celu ich utrwalenia na szkiełkach przedmiotowych. Umieść szkiełka przedmiotowe w lejkach do cytospinacji (Shandon EZ Single Cytofunnel z brązowym filtrem Thermo Scientific) i wprowadź je do wirówki Cytospin 4. Do każdego lejka wlej 100 μL 1% albuminy surowicy bydlęcej (Sigma) w PBS, a następnie wiruj przy 600 rpm przez 3 minuty, aby wspomóc przyleganie przechwyconych komórek do szkiełek.</li>
	<li>Po wirowaniu dodaj próbki komórkowe do lejków i ponownie wiruj przy 600 rpm przez 3 minuty. Następnie spryskaj szkiełka utrwalaczem na bazie etanolu.</li>
	<li>Przemyj szkiełka w PBS dwukrotnie przez 10 minut.</li>
	<li>Aby zablokować nieswoiste wiązanie, inkubuj każde szkiełko z mieszaniną 10 μL surowicy koziej (Sigma) i 90 μL PBS przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Po inkubacji zlej roztwór ze szkiełek i inkubuj je z roztworem przeciwciał pierwszorzędowych przez 1 godzinę w wilgotnej komorze w temperaturze pokojowej. Każde szkiełko powinno zawierać 1% przeciwciała MART-1 pochodzenia króliczego, 1% przeciwciała CD-45 pochodzenia mysiego, 10% surowicy koziej i 89% PBS.</li>
	<li>Po inkubacji przemyj szkiełka w PBS trzykrotnie przez 10 minut.</li>
	<li>Następnie szkiełka inkubuje się w roztworze przeciwciał wtórnych, które są sprzężone z fluorophorem. Mieszanina zawiera 0,05% kozich przeciwciał anty-króliczych, 0,05% kozich przeciwciał anty-mysich, 0,1% surowicy koziej i 99% PBS. Szkiełka inkubuje się w ciemności przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Po inkubacji zlej roztwór i przemyj szkiełka w PBS trzykrotnie przez 5 minut.</li>
	<li>W celu barwienia jąder komórkowych inkubuj komórki z 0,1 μg/mL DAPI (Invitrogen) przez 1 minutę. Następnie zlej roztwór i przemyj szkiełka w PBS.</li>
	<li>Nałóż szkiełko zakrywkowe na próbkę komórkową, używając 20 μL żywicznego medium montażowego na szkiełko. Uszczelnij zakrywkę bezbarwnym lakierem do paznokci, aby zabezpieczyć preparat. Teraz szkiełka są gotowe do obrazowania za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.</li>
</ol>
5. Reprezentatywne wyniki:
<img src="/files/ftp_upload/3559/3559fig1.jpg" alt="Obrazowanie komórek i wykresy sygnałów elektrycznych; leukocyty, komórki czerniaka; mikroskopia, woltomierz." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> Rycina 1. 
Przedstawiono tutaj przebiegi fal fotoakustycznych dla leukocytów i komórek czerniaka. Leukocyty, nieposiadając wrodzonej pigmentacji, nie generują fal fotoakustycznych i objawiają się jako płaska linia szumu elektronicznego (po lewej). Pigmentowane komórki czerniaka generują wyraźną falę fotoakustyczną (po prawej).
<img src="/files/ftp_upload/3559/3559fig2.jpg" alt="Obraz z mikroskopii fluorescencyjnej barwionych komórek; analiza niebieskich jąder i zielonej cytoplazmy." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> Rysunek 2. 
Po barwieniu immunocytochemicznym w hodowlanych komórkach czerniaka widoczne są niebieskie sygnały DAPI, natomiast MART1 jest zaznaczone na zielono.
<img src="/files/ftp_upload/3559/3559fig3.jpg" alt="Obraz z mikroskopii fluorescencyjnej; barwienie komórek; lokalizacja białek; badanie odpowiedzi immunologicznej; analiza laboratoryjna." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> Rysunek 3. 
Nałożone obrazy dla DAPI i MART1, analogicznie jak na Rysunku 2, z CD45 jako wskaźnikiem leukocytów; rysunek przedstawia komórki czerniaka wśród kilku białych krwinek.

<ol><li>Pantel, K., Brakenhoff, R., Brandt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+clinical+relevance+and+specific+biological+properties+of+disseminating+tumour+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Detection clinical relevance and specific biological properties of disseminating tumour cells.</a> Nature Reviews Cancer. 8, 329-340 (2008).</li>
<li>Pantel, K., Brakenhoff, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+the+metastatic+cascade%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Dissecting the metastatic cascade.</a> Nature Reviews Cancer. 4, 448-456 (2004).</li>
<li>Yu, M., Stott, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cells%3A+approaches+to+isolation+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cells: approaches to isolation and characterization.</a> The Journal of Cell Biology. 192, 373-373 (2011).</li>
<li>Detection of circulating melanoma cells in human blood using photoacoustic flowmetry. Weight, R. M., Dale, P. S., Viator, J. Annual International Conference of the IEEE, 2009, , IEEE. 106-109 (1985).</li>
<li>Weight, R. M., Dale, P. S., Lisle, A., Caldwell, C., Viator, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoacoustic+detection+of+metastatic+melanoma+cells+in+the+human+circulatory+system%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Photoacoustic detection of metastatic melanoma cells in the human circulatory system.</a> Opt. Lett. 31, 2998-3000 (2006).</li>
<li>Gupta, A., Kumar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+geometry+on+droplet+formation+in+the+squeezing+regime+in+a+microfluidic+T-junction%5BTitle%5D)+AND+%22Microfluidics+and+Nanofluidics%22%5BJournal%5D)">Effect of geometry on droplet formation in the squeezing regime in a microfluidic T-junction.</a> Microfluidics and Nanofluidics. 8, 799-812 (2010).</li>
<li>Mocellin, S., Hoon, D., Ambrosi, A., Nitti, D., Rossi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prognostic+value+of+circulating+tumor+cells+in+patients+with+melanoma%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">The prognostic value of circulating tumor cells in patients with melanoma: a systematic review and meta-analysis.</a> Clinical Cancer Research. 12, 4605-4605 (2006).</li>
<li>Cristofanilli, M., Budd, G., Ellis, M., Stopeck, A., Matera, J., Miller, M., Reuben, J., Doyle, G., Allard, W., Terstappen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cells%2C+disease+progression%2C+and+survival+in+metastatic+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cells, disease progression, and survival in metastatic breast cancer.</a> New England Journal of Medicine. 351, 781-781 (2004).</li>
<li>Cristofanilli, M., Hayes, D., Budd, G., Ellis, M., Stopeck, A., Reuben, J., Doyle, G., Matera, J., Allard, W., Miller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cells%3A+a+novel+prognostic+factor+for+newly+diagnosed+metastatic+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cells: a novel prognostic factor for newly diagnosed metastatic breast cancer.</a> Journal of Clinical Oncology. 23, 1420-1420 (2005).</li>
<li>Ghossein, R., Scher, H., Gerald, W., Kelly, W., Curley, T., Amsterdam, A., Zhang, Z., Rosai, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+circulating+tumor+cells+in+patients+with+localized+and+metastatic+prostatic+carcinoma%3A+clinical+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Detection of circulating tumor cells in patients with localized and metastatic prostatic carcinoma: clinical implications.</a> Journal of Clinical Oncology. 13, 1195-1195 (1995).</li>
<li>Loberg, R., Fridman, Y., Pienta, B., Keller, E., McCauley, L., Taichman, R., Pienta, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+isolation+of+circulating+tumor+cells+in+urologic+cancers%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Detection and isolation of circulating tumor cells in urologic cancers: a review.</a> Neoplasia. 6, 302-302 (2004).</li>
<li>Viator, J. A., Gupta, S. K., Goldschmidt, B. S., Bhattacharyya, K., Raghuraman, R., Shukla, R., Dale, P. S., Boote, E., Katti, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+gold+nanoparticle+enhanced+prostate+cancer+cells+using+photoacoustic+flowmetry+with+optical+reflectance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Nanotech%22%5BJournal%5D)">Detection of gold nanoparticle enhanced prostate cancer cells using photoacoustic flowmetry with optical reflectance.</a> J. Biomed. Nanotech. 6, 187-191 (2010).</li>
</ol>

John A. Viator jest założycielem i prezesem Viator Technologies Inc, firmy powstałej w celu komercjalizacji technologii fotoakustycznych służących poprawie zdrowia ludzi.

Wykrywanie CTC jest nadal dziedziną wymagającą intensywnych badań, z bardzo niewielką liczbą zastosowań klinicznych ze względu na trudny problem izolacji rzadkich komórek nowotworowych. Oceniane są wiele innych technik wykrywania CTC, w tym RT-PCR, mikroprzepływowe wychwytywanie komórek, wychwytywanie immunomagnetyczne oraz inne metody8-12. Jednak fotoakustyczna detekcja CMC wydaje się obiecująca, ponieważ jest bezmarkerowa i zapewnia szybki oraz dokładny sposób wychwytywania małych cząsteczek absorbujących światło.
Opisany protokół izolacji białych krwinek jest wysoce wydajny, niemniej w próbce występuje niewielka liczba czerwonych krwinek. Te zanieczyszczające komórki również absorbują światło laserowe, lecz w znacznie mniejszym stopniu. Aby upewnić się, że erytrocyty nie zakłócają działania naszego systemu detekcji czerniaka, do systemu wprowadzono próbki od pięciu zdrowych pacjentów; żadna z nich nie wygenerowała sygnału, co wskazuje, że czerwone krwinki występują w stężeniach na tyle niskich, że można je pominąć. 
Przeprowadzono serię badań stężeń z wykorzystaniem hodowlanych komórek czerniaka, a fotoakustyczny system przepływowy okazał się czuły do poziomu 1 cell/μL (dane niepublikowane). Badania te są w toku i wkrótce obejmą próby z wykorzystaniem próbek pobranych od pacjentów onkologicznych.
Ta technika fotoakustyczna jest również oceniana pod kątem zastosowania w niepigmentowanych CTC, takich jak w raku piersi i prostaty, poprzez przyłączanie egzogennych chromoforów. Przeprowadziliśmy wstępne badania z wykorzystaniem nanocząsteczek złota na komórkach nowotworowych13. Testy te wykazały, że nanocząsteczki mogą zapewnić niezbędną absorpcję optyczną do generowania fal fotoakustycznych. Pozostałym wyzwaniem technicznym jest selektywne przyłączanie takich cząsteczek do komórek nowotworowych.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>ABCD1234</td><td></td></tr></tbody></table>

detekcja i izolacja krążących komórek czerniaka z wykorzystaniem fotoakustycznej cytometrii przepływowej

Detection and Isolation of Circulating Melanoma Cells using Photoacoustic Flowmetry

Krążące komórki nowotworowe (CTC) to komórki, które oddzieliły się od guza makroskopowego i rozprzestrzeniły poprzez układ krwionośny i limfatyczny, aby tworzyć przerzuty.1,2,3CTCs są wskaźnikami choroby przerzutowej, a ich wykrywanie w próbkach krwi może być wykorzystywane do diagnostyki nowotworów oraz monitorowania stanu pacjenta&prime;odpowiedź na terapię. Ponieważ CTC są rzadkie i stanowią około jednej komórki nowotworowej wśród miliardów prawidłowych komórek krwi u pacjentów z zaawansowanym rakiem, ich detekcja i zliczanie są trudnym zadaniem. Wykorzystujemy obecność pigmentu w większości komórek czerniaka do generowania fal fotoakustycznych, czyli indukowanych laserem fal ultradźwiękowych, w specjalnie zaprojektowanym cytometrze przepływowym do detekcji krążących komórek czerniaka (CMC).4,5Proces ten polega na rozdzieleniu próbki krwi pełnej za pomocą wirowania w celu uzyskania warstwy białych krwinek. Jeśli CMC znajdują się we krwi pełnej, zostaną one oddzielone wraz z białymi krwinkami ze względu na podobną gęstość. Komórki te są resuspendowane w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) i wprowadzane do przepływomierza. Zamiast ciągłego przepływu zawiesiny komórek krwi, zastosowano przepływ dwufazowy, aby przechwycić te komórki do dalszych badań. W przepływie dwufazowym dwie niemieszalne ciecze w układzie mikrofluidycznym spotykają się w węźle i tworzą naprzemienne segmenty cieczy.6,7Leukocyty zawieszone w PBS oraz powietrze tworzą mikrolitrowe segmenty (slugi), które są sekwencyjnie naświetlane światłem laserowym. Dodatek surfaktantu do fazy ciekłej umożliwia jednorodne formowanie się segmentów, a użytkownik może tworzyć segmenty o różnych rozmiarach poprzez zmianę szybkości przepływu obu faz. Segmenty powietrza oraz segmenty PBS z leukocytami nie zawierają absorbentów światła, a zatem nie generują fal fotoakustycznych. Natomiast segmenty leukocytów zawierające choćby pojedyncze CMCs absorbują światło laserowe i generują wysokoczęstotliwościowe fale akustyczne. Segmenty te, generujące fale fotoakustyczne, są wyodrębniane i zbierane do barwienia cytochemicznego w celu weryfikacji obecności CMCs.

Opracowaliśmy cytometr przepływowy wykorzystujący ultradźwięki indukowane laserem do wykrywania krążących komórek czerniaka jako wczesnego wskaźnika choroby przerzutowej.

Detekcja i izolacja krążących komórek czerniaka z wykorzystaniem fotoakustycznej cytometrii przepływowej

Krążące komórki nowotworowe (CTC) to komórki, które oddzieliły się od guza makroskopowego i rozprzestrzeniły poprzez układ krwionośny i limfatyczny, aby zasiedlić...

Celem następnego eksperymentu jest wykrycie nowotworu przed powstaniem przerzutów. Osiąga się to poprzez pobranie i rozdzielenie próbek krwi od pacjentów z czerniakiem w czwartym stadium. W drugim kroku krew wprowadza się do fotoakustycznej komory przepływowej, która umożliwia detekcję i izolację komórek czerniaka.Następnie wykonuje się obrazowanie wychwyconych komórek, aby potwierdzić obecność wykrytego czerniaka. Wyniki wykazują zdolność systemu do dokładnego i szybkiego wykrywania oraz izolowania komórek czerniaka w oparciu o formy fal fotoakustycznych i techniki obrazowania komórek. Główną zaletą naszej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami wykrywania krążących komórek czerniaka, takimi jak R-T-P-C-R, biomagnetyczne sortowanie komórek oraz inne metody, jest to, że nasza metoda nie wymaga znakowania i pozwala na wychwytywanie krążących komórek czerniaka bez modyfikowania ich powierzchni ani przytwierdzania ich do podłoża.Aby przygotować próbkę do wykrywania przerzutów nowotworowych, należy rozpocząć od pobrania około 10 ml krwi pełnej od pacjenta z czwartym stadium raka. Próbki w dwóch probówkach typu vacutainer o pojemności 5 ml należy wirować przez 10 minut. Przy prędkości 3000 RPM próbka krwi rozdzieli się na trzy różne warstwy. Warstwę dolną stanowią erytrocyty.Warstwa środkowa, nazywana również warstwą leukocytarną (buffy coat), zawiera leukocyty i komórki czerniaka, a warstwa górna zawiera osocze i płytki krwi. Usuń jak najwięcej osocza, nie naruszając warstwy leukocytarnej. Dodaj 250 µL OptiPrep 1077 do probówek typu Eppendorf o pojemności 2 mL.Za pomocą dziewięciocalowej pipety Pasteura pobierz pozostałą plazmę, całą warstwę białkową (buffy coat) oraz górną warstwę erytrocytów. Należy upewnić się, że pobrana objętość wynosi mniej niż 500 µL. Przenieś roztwór do wcześniej przygotowanych probówek wind Trobe.Krew ponownie się rozdzieli, lecz tym razem erytrocyty zostaną oddzielone przez hispę, co umożliwi łatwe wyodrębnienie warstwy leukocytarnej (Buffy coat). Za pomocą dziewięciocalowej pipety Pesa należy wyizolować całą warstwę leukocytarną i przenieść ją do probówki eend orph o pojemności 2 ml. Następnie należy zawiesić ją w 1,5 ml PBS z 2% v/v między 20.Aby zbudować komorę przepływową, należy zacząć od akrylowego cylindra o długości 8 mm, średnicy zewnętrznej 20 mm i średnicy wewnętrznej 17 mm. Następnie należy wywiercić w bocznej ściance cylindra trzy otwory o średnicy 5 mm, rozmieszczone pod kątem 90 stopni względem siebie. Na koniec należy odciąć trzy kawałki rurki polimerowej i umieścić je w wywierconych otworach.Naciągnij parafilm na dno pierścienia akrylowego, aby stworzyć wodoszczelną uszczelkę. Parafilm wraz z pierścieniem akrylowym utworzy płytką miseczkę, która pomieści roztwór akrylamidu służący do stworzenia komory przepływowej. Przeciągnij drut o średnicy 1,6 millimeter przez kawałki rurek znajdujące się naprzeciw siebie, upewniając się, że przez środek pierścienia, w stronę trzeciego kawałka rurki, widoczny jest tylko drut.Wprowadź drut o średnicy 1,6 mm i ustaw rurkę w odległości 1 mm od zawieszonego drutu. Druty te zapobiegają przedostawaniu się akryloamidu do rurki. Przygotuj 5 mL akryloamidu.Następnie szybko wlej mieszaninę do akrylowego pierścienia, wypełniając go do pełna. Po kilku sekundach roztwór ulegnie żelowaniu. Aby utworzyć formę komory przepływowej, ostrożnie wyciągnij druty, dbając o to, by nie zakłócić struktury żelu akryloamidowego, pozostawiając cylindryczną drogę przepływu oraz miejsce na rozmieszczenie światłowodu skupionego na tej drodze.Komora przepływowa jest teraz gotowa do użycia z zastosowaniem żelu ultradźwiękowego dla zapewnienia sprzężenia akustycznego. Połącz piezoelektryczny przetwornik akustyczny z polifluorku winylidenu z komorą przepływową bezpośrednio nad ścieżką przepływu. Za pomocą złącza bagnetowego lub kabla BNC podłącz przetwornik do wejścia odbiornika szerokopasmowego.Podłącz wyjście filtra do oscyloskopu, aby uruchomić wyzwalanie oscyloskopu. Umieść fotodiodę w pobliżu przetwornika i podłącz ją do oscyloskopu za pomocą kabla B NNC. Wysuń cienką rurkę komory przepływowej, aż utworzy się niewielka kieszeń powietrzna, a następnie połącz ją z przetwornikiem.Następnie należy włożyć światłowód i wypełnić komorę wodą, aby zredukować sygnały z interfejsu i zwiększyć ilość światła laserowego kierowanego na ścieżkę przepływu. Ze względu na aperturę numeryczną światłowodu i krótką odległość do ścieżki przepływu, laser będzie naświetlał w danym momencie tylko jedną porcję próbki, co gwarantuje, że próbka znajdująca się bezpośrednio przed laserem jest tą samą próbką, która generuje sygnały fotoakustyczne.Następnie podłącz złączkę T do jednego ramienia komory przepływowej oraz dwie pompy strzykawkowe do pozostałych odgałęzień złączki. Jedna strzykawka powinna zawierać powietrze, a druga wcześniej przygotowaną zawiesinę komórek. Następnie uruchom obie pompy strzykawkowe.Gdy dwa dopuszczalne płyny dotrą do złącza T, zostaną one podzielone na jednorodne segmenty i przepłyną obok przetwornika. Naświetl płynącą próbkę nanosekundowym laserem impulsowym, aby wywołać fale fotoakustyczne w komórkach czerniaka. Ponieważ melanina jest szerokopasmowym absorberem optycznym, można zastosować dowolną długość fali lasera z zakresu widzialnego.Sygnał pojawiający się na oscyloskopie, gdy śluzowiec znajduje się nad przetwornikiem, wskazuje, że zawiera on czerniaka. Należy go śledzić w systemie przed zrzuceniem do fiolki zbierającej. Aby przygotować próbki do immunocytochemii, należy umieścić szkiełka przedmiotowe w lejkach do cytocentryfugi, a następnie załadować je do cytocentryfugi i wirować, aby pomóc przechwyconym komórkom przytwierdzić się do szkiełek przedmiotowych.Do każdego lejka wlej 100 µL 1%BSA w PBS. Następnie wiruj z prędkością 600 RPM przez trzy minuty. Po wirowaniu dodaj próbki komórek do lejków CyTOF, a następnie ponownie wiruj z prędkością 600 RPM przez trzy minuty.Spryskaj preparaty fiksatywem na bazie etanolu. Następnie przemyj preparaty w PBS dwukrotnie przez 10 minut, aby zablokować niespecyficzne wiązania. Inkubuj każdy preparat w mieszaninie 10 µL surowicy koziej i 90 µL PBS przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej.Po inkubacji odlać ciecz z szkiełek i dodać roztwór przeciwciała pierwszorzędowego. Każde szkiełko powinno zawierać 1%rabbit mark, jedno 1%mouse CD 45 oraz 10%goat serum w PBS; inkubować przez jedną godzinę w wilgotnej komorze w temperaturze pokojowej. Następnie przemyć szkiełka w PBS przez 10 minut, powtarzając czynność trzy razy.Następnie inkubować preparaty z odpowiednimi fluorescencyjnymi przeciwciałami wtórnymi w ciemności przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej, a następnie zlać roztwór z szkiełek. Potem przemyć je w PBS przez pięć minut, powtarzając czynność trzykrotnie; aby zabarwić jądra, inkubować komórki z 0,1 µg/mL DPI przez jedną minutę. Następnie zlać roztwór z szkiełek i przemyć w PBS.Na koniec, używając medium montażowego na bazie żywicy, przymocuj szkiełko nakrywkowe nad próbką komórek, uszczelnij szkiełko bezbarwnym lakierem do paznokci i wykonaj obrazowanie za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Formy fal fotoakustycznych z leukocytów i komórek czerniaka przedstawiono tutaj po lewej stronie. Leukocyty, nie posiadając naturalnej pigmentacji, nie generują fal fotoakustycznych i przejawiają się jako płaska linia szumu elektronicznego po prawej stronie.Jednakże pigmentowane komórki czerniaka generują silną falę fotoakustyczną. Po immunocytochemicznym barwieniu chemicznym hodowane komórki czerniaka wykazują plamiste sygnały w kolorze niebieskim; jedna z zaznaczonych komórek została wyróżniona zieloną nakładką na obrazach DPI, a jedna z nich została oznaczona CD 45 jako wskaźnik leukocytów. Rysunek ten przedstawia komórki czerniaka pośród kilku białych krwinek po zakończeniu procesu rozwoju.Nasza technika utoruje drogę badaczom w dziedzinie wykrywania nowotworów do zgłębiania zjawiska przerzutowania, aby zarówno usprawnić diagnostykę raka, jak i ostatecznie powstrzymać jego śmiertelne rozprzestrzenianie się.

detection-isolation-circulating-melanoma-cells-using-photoacoustic

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Wykrywanie i izolacja krążących komórek czerniaka z wykorzystaniem fotoakustycznej flowmetrii

Ten film opisuje technikę izolowania komórek macierzystych czerniaka CD133 ujemnych i dodatnich z pierwotnej linii komórkowej czerniaka za pomocą sortowania komórek aktywowanego magnetycznie. CD133-dodatnie CSC czerniaka są dalej badane w celu zrozumienia mechanizmów nowotworzenia czerniaka.

Izolacja komórek macierzystych czerniaka: metoda uzyskiwania dodatnich i ujemnych komórek czerniaka CD133 za pomocą sortowania komórek aktywowanych magnetycznie

W tym filmie prezentujemy fotoakustyczną cytometryczną detekcję komórek raka jajnika zawierających nanocząstki w komorze przepływowej in vitro. Ta nieinwazyjna technika z powodzeniem identyfikuje krążące komórki nowotworowe w systemie przepływowym z wykorzystaniem środka kontrastowego.

Fotoakustyczna cytometria przepływowa in vitro: nieinwazyjna technika fotoakustyczna do wykrywania krążących komórek raka jajnika zawierających nanocząstki

Źródło: Kalva, S. K.,  i wsp., Pulsacyjna tomografia fotoakustyczna oparta na diodach laserowych do monitorowania wymywania i wypłukiwania barwnika w unaczynieniu kory mózgowej szczura. J. Vis. Exp. (2019)Ten film przedstawia procedurę wykorzystania obrazowania fotoakustycznego do obserwacji zmian w naczyniach korowych znieczulonego szczura. Proces obejmuje obrazowanie bazowe, wstrzykiwanie barwnika oraz analizę wchłaniania i klirensu barwnika podczas wymywania i wymowywania.

Fotoakustyczne monitorowanie ruchu barwnika w korowych naczyniach krwionośnych

Ten artykuł opisuje przygotowanie świeżo uzyskanej tkanki czerniaka do pierwotnych hodowli komórkowych oraz sposób usuwania zanieczyszczeń erytrocytów i fibroblastów z komórek nowotworowych. Na koniec opisujemy, w jaki sposób domniemane komórki macierzyste czerniaka CD133 + są sortowane od masy CD133 za pomocą sortowania komórek aktywowanych magnetycznie (MACS).

Hodowla komórkowa pochodząca od pacjenta i izolacja domniemanych komórek macierzystych raka CD133+ z czerniaka

Opisujemy dwie uzupełniające się metody wykorzystujące wskaźnik cyklu komórkowego ubikwitynacji fluorescencji (FUCCI) oraz analizę obrazu lub cytometrię przepływową do identyfikacji i izolacji komórek w wewnętrznych obszarach zatrzymanych G1 i zewnętrznych proliferujących sferoidach 3D.

Oparta na obrazowaniu i cytometrii przepływowej analiza położenia komórki i cyklu komórkowego w sferoidach czerniaka 3D

Tutaj prezentujemy protokół do szacowania właściwości optycznych materiału i powierzchni za pomocą efektu fotoakustycznego połączonego z całkowitym wewnętrznym odbiciem. Technika ta, która eliminuje fotoakustykę opartą na polu, może być wykorzystana do stworzenia fotoakustycznego systemu metrologicznego do szacowania grubości materiałów, współczynników załamania światła objętościowych i cienkowarstwowych oraz badania ich właściwości optycznych.

Fotoakustyka oparta na polu ulotnym: ocena właściwości optycznych na powierzchniach

Tutaj prezentujemy protokół wykrywania mutacji somatycznych nowotworu w krążącym DNA obecnym w płynach biologicznych pacjenta (biofluidach). Nasza metoda oparta na kropelkowej cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy (dPCR) umożliwia ilościowe określenie częstości alleli mutacji nowotworowych (MAF), ułatwiając minimalnie inwazyjne uzupełnienie diagnozy i czasowego monitorowania odpowiedzi guza.

Wykrywanie i monitorowanie krążącego DNA związanego z nowotworem w płynach biologicznych pacjenta

Przedstawiono protokół wykrywania krążących komórek nowotworowych jajnika za pomocą specjalnie zaprojektowanego systemu przepływu fotoakustycznego i ukierunkowanych nanocząsteczek siarczku miedzi z kwasem foliowym.

Wykrywanie raka jajnika za pomocą fotoakustycznej cytometrii przepływowej

Ten artykuł opisuje przebieg techniki wykorzystywane do testowania nowych kandydatów na mediatory przerzutów czerniaka i ich mechanizm(y) działania.

Solidna platforma odkrywcza do identyfikacji nowych mediatorów przerzutów czerniaka

Protokół ten zawiera przewodnik krok po kroku dotyczący projektowania multipleksowego panelu przeciwciał immunofluorescencyjnych do obrazowania mysich tkanek czerniaka FFPE na podstawie kodów kreskowych. Opisujemy również proces analizy obrazu przy użyciu narzędzi typu open source do generowania przestrzennych wglądów proteomicznych w mikrośrodowisku immunologicznym mysiego czerniaka.

Multipleksowe obrazowanie immunofluorescencyjne oparte na kodach kreskowych DNA do analizy próbek FFPE z genetycznie przeprogramowanego mysiego czerniaka

Poznaj metodę wykrywania i izolacji krążących komórek czerniaka za pomocą przepływometrii fotoakustycznej. Technika ta umożliwia szybką, bezcetykietową detekcję komórek nowotworowych z krwi pacjentów z czerniakiem w stadium IV.

Detekcja i izolacja krążących komórek czerniaka z wykorzystaniem fotoakustycznej cytometrii przepływowej

Przeglądaj więcej filmów