Detekcja i izolacja krążących komórek czerniaka z wykorzystaniem fotoakustycznej cytometrii przepływowej

Celem następnego eksperymentu jest wykrycie obecności nowotworu przed powstaniem przerzutów. Osiąga się to poprzez pobranie i rozdzielenie próbek krwi od pacjentów z czwartym stadium czerniaka. W drugim kroku krew wprowadza się do fotoakustycznej komory przepływowej, co umożliwia wykrycie i izolację komórek czerniaka.

Następnie wykonuje się obrazowanie wychwyconych komórek, aby potwierdzić obecność wykrytego czerniaka. Wyniki wykazują zdolność systemu do dokładnego i szybkiego wykrywania oraz izolowania komórek czerniaka w oparciu o formy fal fotoakustycznych i techniki obrazowania komórek. Główną zaletą naszej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami wykrywania krążących komórek czerniaka, takimi jak R-T-P-C-R, biomagnetyczne sortowanie komórek oraz inne metody, jest to, że nasza metoda nie wymaga znakowania i umożliwia wychwyt krążących komórek czerniaka bez modyfikacji ich powierzchni ani przytwierdzania ich do podłoża.

Aby przygotować próbkę do wykrywania przerzutów nowotworowych, należy rozpocząć od pobrania około 10 ml krwi pełnej od pacjenta z nowotworem w czwartym stadium. Próbki w dwóch probówkach typu vacutainer o pojemności 5 ml należy wirować przez 10 minut. Przy prędkości 3000 RPM próbka krwi rozdzieli się na trzy różne warstwy. Dolną warstwę stanowią erytrocyty.

Warstwa środkowa, nazywana również warstwą leukocytarną (buffy coat), zawiera leukocyty i komórki czerniaka, a warstwa górna zawiera osocze i płytki krwi. Usuń jak najwięcej osocza, uważając, aby nie naruszyć warstwy leukocytarnej. Do probówek typu Eppendorf o pojemności 2 ml dodaj 250 µL OptiPrep 1077.

Za pomocą dziewięciocalowej pipety Pasteura pobrać pozostałą plazmę, całą warstwę białkową (Buffy coat) oraz górną warstwę erytrocytów. Należy upewnić się, że pobrana objętość nie przekracza 500 µL. Przenieść roztwór do wcześniej przygotowanych probówek wind Trobe.

Krew ponownie się rozdzieli, ale tym razem erytrocyty zostaną oddzielone przez hispę, co umożliwi łatwe wyekstrahowanie warstwy leukocytarnej (Buffy coat). Użyj dziewięciocalowej pipety Pesa, aby wyizolować całą warstwę leukocytarną i umieść ją w probówce eend orph o pojemności 2 ml. Następnie zawieś ją w 1,5 ml PBS z 2% v/v między 20.

Aby zbudować komorę przepływową, należy rozpocząć od akrylowego cylindra o długości 8 mm, średnicy zewnętrznej 20 mm i średnicy wewnętrznej 17 mm. Następnie należy wywiercić trzy otwory o średnicy 5 mm w bocznej ścianie cylindra, zachowując kąty 90° względem siebie. Na koniec należy odciąć trzy odcinki rurki polimerowej i umieścić je w wywierconych otworach.

Naciągnij parafilm na spód pierścienia akrylowego, aby stworzyć wodoszczelną uszczelkę. Parafilm utworzy wraz z pierścieniem akrylowym płytką miseczkę, która będzie pomieścić roztwór akrylamidu służący do stworzenia komory przepływowej. Przeciągnij drut o średnicy 1,6 millimeter przez kawałki rurek znajdujące się naprzeciw siebie, upewniając się, że przez środek pierścienia w stronę trzeciego kawałka rurki widoczny jest tylko drut.

Wprowadź drut o średnicy 1,6 mm i ustaw rurkę w odległości 1 mm od zawieszonego drutu. Druty te zapobiegają przedostawaniu się akryloamidu do rurki. Przygotuj 5 mL akryloamidu.

Następnie szybko wlej mieszaninę do akrylowego pierścienia, wypełniając go do pełna. Po kilku sekundach roztwór zgeliuje. Aby wykonać formę komory przepływowej, ostrożnie wyciągnij druty, dbając o to, aby nie zakłócić struktury żelu akryloamidowego, pozostawiając cylindryczną drogę przepływu oraz miejsce na umieszczenie światłowodu skupionego na drodze przepływu.

Komora przepływowa jest teraz gotowa do użycia z zastosowaniem żelu ultradźwiękowego w celu zapewnienia sprzężenia akustycznego. Przymocuj piezoelektryczny przetwornik akustyczny z polifluorku winylidenu do komory przepływowej bezpośrednio nad ścieżką przepływu. Za pomocą złącza bagnetowego lub kabla BNC podłącz przetwornik do wejścia odbiornika szerokopasmowego.

Podłącz wyjście filtra do oscyloskopu, aby uruchomić wyzwalanie oscyloskopu. Umieść fotodiodę w pobliżu przetwornika i podłącz ją do oscyloskopu za pomocą kabla BNC. Wysuń cienką rurkę komory przepływowej, aż utworzy się niewielka kieszeń powietrzna, a następnie połącz ją z przetwornikiem.

Następnie należy wprowadzić światłowód i wypełnić komorę wodą, aby zredukować sygnały z powierzchni styku i zwiększyć ilość światła laserowego kierowanego do ścieżki przepływu. Ze względu na aperturę numeryczną światłowodu oraz krótką odległość do ścieżki przepływu, laser będzie naświetlać w danej chwili tylko jeden segment próbki, co gwarantuje, że próbka znajdująca się bezpośrednio przed laserem jest tą samą próbką, która generuje sygnały fotoakustyczne.

Następnie podłącz złączkę T do jednego ramienia komory przepływowej oraz dwie pompy strzykawkowe do pozostałych odgałęzień złączki. Jedna strzykawka zawiera powietrze, natomiast druga przygotowaną wcześniej zawiesinę komórek. Następnie uruchom obie pompy strzykawkowe.

Gdy dwa dopuszczalne płyny dotrą do złącza w kształcie litery T, zostaną one podzielone na jednorodne segmenty i przepłyną obok przetwornika. Naświetl przepływającą próbkę nanosekundowym laserem impulsowym, aby wygenerować fale fotoakustyczne w komórkach czerniaka. Ponieważ melanina jest szerokopasmowym absorbentem optycznym, można zastosować dowolną długość fali lasera z zakresu widzialnego.

Sygnał pojawiający się na oscyloskopie w momencie, gdy ślimak znajduje się nad przetwornikiem, wskazuje, że ślimak jest nosicielem czerniaka. Śledź go w systemie przed wrzuceniem do probówki zbiorczej. Aby przygotować próbki do immunocytochemii, umieść szkiełka przedmiotowe w lejkach cytologicznych i załaduj je do cyto-wirówki, aby odwirowanie pomogło przechwyconym komórkom przywrzeć do szkiełek przedmiotowych.

Do każdego lejka należy nalać 100 µL 1% BSA w PBS. Następnie wiruj z prędkością 600 RPM przez trzy minuty. Po wirowaniu dodaj próbki komórek do lejków CyTOF, a następnie ponownie wiruj z prędkością 600 RPM przez trzy minuty.

Spryskaj preparaty utrwalaczem na bazie etanolu. Następnie przemyj preparaty w PBS dwukrotnie po 10 minut, aby zablokować nieswoiste wiązanie. Inkubuj każdy preparat w mieszaninie 10 µL serum koziego i 90 µL PBS przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej.

Po inkubacji zlać ciecz z szkiełek i dodać roztwór przeciwciała pierwszorzędowego. Każde szkiełko powinno zawierać 1%rabbit mark, jedno 1%mouse CD 45 oraz 10%goat serum w PBS; inkubować przez jedną godzinę w wilgotnej komorze w temperaturze pokojowej. Następnie przemyć szkiełka w PBS trzy razy po 10 minut.

Następnie inkubować preparaty z odpowiednimi fluorescencyjnymi przeciwciałami wtórnymi w ciemności przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej, a następnie odlać nadmiar przeciwciał. Przemyć preparaty w PBS przez pięć minut, powtarzając czynność trzykrotnie. Aby zabarwić jądra komórkowe, inkubować komórki z 0,1 µg/mL DPI przez jedną minutę. Następnie odlać roztwór i przemyć preparaty w PBS.

Na koniec, używając medium montażowego na bazie żywicy, przymocuj szkiełko nakrywkowe nad próbką komórek, uszczelnij szkiełko bezbarwnym lakierem do paznokci i wykonaj obrazowanie za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Formy fal fotoakustycznych z leukocytów i komórek czerniaka przedstawiono tutaj po lewej stronie. Leukocyty, nie posiadając naturalnej pigmentacji, nie generują fal fotoakustycznych i objawiają się jako płaska linia szumu elektronicznego po prawej stronie.

Jednakże pigmentowane komórki czerniaka generują silną falę fotoakustyczną. Po immunocytochemicznym barwieniu hodowane komórki czerniaka wykazują plamiste sygnały w kolorze niebieskim; jedna z zaznaczonych komórek została wyróżniona zielonym nałożeniem na obrazach dla DPI oraz jedna z komórek z CD 45 jako wskaźnikiem leukocytów. Rysunek ten przedstawia komórki czerniaka wśród kilku białych krwinek po ich rozwoju.

Nasza technika utoruje drogę badaczom z dziedziny diagnostyki nowotworów do zgłębiania zjawiska przerzutowania, co pozwoli na usprawnienie wykrywania raka i ostatecznie na powstrzymanie jego śmiertelnego rozprzestrzeniania się.