Wykrywanie i izolacja krążących komórek czerniaka z wykorzystaniem przepływometrii fotoakustycznej

Celem poniższego eksperymentu jest wykrycie nowotworu przed powstaniem przerzutów. Osiąga się to poprzez pobranie i rozdzielenie próbek krwi od pacjentów z czerniakiem w czwartym stadium. W drugim kroku krew wprowadza się do fotoakustycznej komory przepływowej, która umożliwia detekcję i izolację komórek czerniaka.

Następnie wykonuje się obrazowanie wychwyconych komórek, aby potwierdzić obecność wykrytego czerniaka. Wyniki wykazują zdolność systemu do dokładnego i szybkiego wykrywania oraz izolowania komórek czerniaka na podstawie kształtu fal fotoakustycznych i technik obrazowania komórek. Główną zaletą naszej techniki w stosunku do istniejących metod wykrywania krążących komórek czerniaka, takich jak R-T-P-C-R, magnetyczne sortowanie komórek oraz inne metody, jest to, że nasza metoda nie wymaga znakowania i pozwala na wychwycenie krążących komórek czerniaka bez modyfikowania ich powierzchni ani unieruchamiania ich na podłożu.

Aby przygotować próbkę do wykrywania przerzutów nowotworowych, należy rozpocząć od pobrania około 10 ml krwi pełnej od pacjenta z czwartym stadium nowotworu. Dwie probówki typu vacutainer o pojemności 5 ml należy wirować przez 10 minut. Przy 3000 RPM próbka krwi rozdzieli się na trzy różne warstwy. Dolna warstwa składa się z erytrocytów.

Warstwa środkowa, nazywana również warstwą leukocytarną (buffy coat), zawiera leukocyty i komórki czerniaka, natomiast warstwa górna zawiera osocze i płytki krwi. Usuń jak najwięcej osocza, uważając, aby nie naruszyć warstwy leukocytarnej. Dodaj 250 µL OptiPrep 10 77 do probówek typu Eppendorf o pojemności 2 ml.

Za pomocą dziewięciocalowej pipety Pasteura pobrać pozostałą plazmę, całą warstwę leukocytów (buffy coat) oraz górną warstwę erytrocytów, upewniając się, że pobrana objętość nie przekracza 500 µL. Przenieść roztwór do wcześniej przygotowanych probówek typu wind Trobe.

Krew ponownie się rozdzieli, ale tym razem erytrocyty zostaną oddzielone przez hispę, co umożliwi łatwe wyodrębnienie warstwy leukocytarnej (Buffy coat). Używając dziewięciocalowej pipety Pesa, wyizoluj całą warstwę leukocytarną i umieść ją w probówce eend orph o pojemności 2 ml. Następnie zawieś ją w 1,5 ml PBS z 2% objętościowo β2-merkaptoetanolu.

Aby skonstruować komorę przepływową, należy rozpocząć od ośmiomilimetrowego akrylowego cylindra o średnicy zewnętrznej 20 mm i średnicy wewnętrznej 17 mm. Następnie należy wywiercić trzy otwory o średnicy 5 mm w ścianie cylindra, pod kątem 90 stopni względem siebie. Na koniec należy odciąć trzy kawałki rurki polimerowej i umieścić je w wywierconych otworach.

Naciągnij Parafilm na dno pierścienia akrylowego, aby stworzyć wodoszczelną uszczelkę. Parafilm wraz z pierścieniem akrylowym utworzy płytką miseczkę, która będzie zawierać roztwór akrylamidu tworzący komorę przepływową. Przeciągnij drut o średnicy 1,6 millimeter przez elementy rurek znajdujące się naprzeciw siebie, upewniając się, że przez środek pierścienia w stronę trzeciego elementu rurki widoczny jest tylko drut.

Wprowadź drut o średnicy 1,6 milimetra i ustaw rurkę w odległości jednego milimetra od zawieszonego drutu. Druty te zapobiegają przedostawaniu się akrylamidu do rurki. Przygotuj pięć mililitrów akrylamidu.

Następnie szybko wlej mieszaninę do pierścienia akrylowego, wypełniając go aż po brzeg. Po kilku sekundach roztwór zżeluje. Tworząc formę komory przepływowej, ostrożnie wyciągnij druty, dbając o to, aby nie zakłócić żelu akryloamidowego, pozostawiając cylindryczny kanał przepływowy oraz miejsce do umieszczenia światłowodu skupionego na ścieżce przepływu.

Komora przepływowa jest teraz gotowa do użycia z zastosowaniem żelu ultradźwiękowego do sprzęgania akustycznego. Połącz piezoelektryczny przetwornik akustyczny z polifluorku winylidenu z komorą przepływową bezpośrednio nad ścieżką przepływu. Używając złącza bagnetowego lub kabla BNC, podłącz przetwornik do wejścia odbiornika szerokopasmowego.

Podłącz wyjście filtra do oscyloskopu, aby uruchomić wyzwalanie oscyloskopu. Umieść fotodiodę w pobliżu przetwornika i podłącz ją do oscyloskopu za pomocą kabla B NNC. Wysuń niewielką rurkę komory przepływowej, aż utworzy się niewielka kieszonka powietrzna, a następnie połącz ją z przetwornikiem.

Następnie należy włożyć światłowód i wypełnić kieszeń wodą, aby zredukować sygnały z powierzchni styku i zwiększyć ilość światła laserowego dostarczanego do ścieżki przepływu. Ze względu na aperturę numeryczną światłowodu oraz krótki dystans do ścieżki przepływu, laser będzie naświetlał w danym momencie tylko jedną porcję próbki, co zapewni, że próbka znajdująca się bezpośrednio przed laserem jest tą samą próbką, która generuje sygnały fotoakustyczne.

Następnie należy przymocować konektor T do jednego ramienia komory przepływowej oraz dwie pompy strzykawkowe do pozostałych odgałęzień konektora. Jedna strzykawka zawiera powietrze, natomiast druga będzie zawierać wcześniej przygotowaną zawiesinę komórkową. Następnie należy uruchomić obie pompy strzykawkowe.

Gdy dwa dopuszczalne płyny dotrą do połączenia w kształcie litery T, zostaną one podzielone na jednorodne segmenty i przepłyną obok przetwornika. Próbkę w przepływie należy naświetlić nanosekundowym laserem impulsowym, aby wygenerować fale fotoakustyczne w komórkach czerniaka. Ponieważ melanina jest szerokopasmowym absorbentem optycznym, można zastosować dowolną długość fali lasera z zakresu widzialnego.

Sygnał pojawiający się na oscyloskopie, gdy ślimak znajduje się nad przetwornikiem, wskazuje, że ślimak posiada czerniaka. Śledź go w systemie przed przeniesieniem do fiolki zbiorczej. Aby przygotować próbki do immunocytochemii, umieść szkiełka przedmiotowe w lejkach cytologicznych i włóż je do cyto-wirówki w celu odwirowania, co pomoże uwięzionym komórkom przylgnąć do szkiełek.

Do każdego lejka wlej 100 µL 1% BSA w PBS. Następnie wiruj przy 600 RPM przez trzy minuty. Po wirowaniu dodaj próbki komórkowe do lejków CyTOF, a następnie ponownie wiruj przy 600 RPM przez trzy minuty.

Spryskaj preparaty utrwalaczem na bazie etanolu. Następnie przemyj preparaty w PBS dwukrotnie przez 10 minut, aby zablokować nieswoiste wiązanie. Inkubuj każdy preparat w mieszaninie 10 µL surowicy koziej i 90 µL PBS przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej.

Po inkubacji odlać ciecz z preparatów i dodać roztwór przeciwciał pierwszorzędowych. Każdy preparat powinien zawierać 1% serum królika, jedno 1% przeciwciało przeciwko CD 45 mysie oraz 10% serum kozie w PBS; inkubować przez jedną godzinę w wilgotnej komorze w temperaturze pokojowej. Następnie przemyć preparaty w PBS przez 10 minut, powtarzając czynność trzykrotnie.

Następnie inkubować preparaty z odpowiednimi fluorescencyjnymi przeciwciałami wtórnymi w ciemności przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej, po czym odlać ciecz z preparatów. Następnie przemyć je w PBS przez pięć minut, powtarzając czynność trzykrotnie. Aby zabarwić jądra, inkubować komórki z DPI w stężeniu 0,1 µg/mL przez jedną minutę. Następnie odlać ciecz z preparatów i przemyć w PBS.

Na koniec, używając medium montażowego na bazie żywicy, przymocuj szkiełko nakrywkowe nad próbką komórek, uszczelnij nakrywkę bezbarwnym lakierem do paznokci i wykonaj obrazowanie za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Formy fal fotoakustycznych z leukocytów i komórek czerniaka przedstawiono tutaj po lewej stronie. Leukocyty, nie posiadając naturalnej pigmentacji, nie generują fal fotoakustycznych i przejawiają się jako płaska linia szumu elektronicznego po prawej stronie.

Jednakże pigmentowane komórki czerniaka generują silną falę fotoakustyczną. Po immunocytochemicznym barwieniu hodowane komórki czerniaka wykazują punktowe sygnały w kolorze niebieskim; jedna z nich została zaznaczona na zielono na obrazach z nałożonym DPI, a kolejna z CD 45 jako wskaźnikiem leukocytów. Rysunek ten przedstawia komórki czerniaka wśród kilku białych krwinek po ich wyhodowaniu.

Nasza technika utoruje drogę badaczom w dziedzinie wykrywania nowotworów do zgłębiania zjawiska przerzutowania, co pozwoli na usprawnienie diagnostyki raka i ostatecznie na powstrzymanie jego śmiertelnego rozprzestrzeniania się.