Monitorowanie adsorpcji białek za pomocą nanoporów w stanie stałym

Ogólnym celem tej procedury jest stworzenie nanoporów w sztucznych błonach do wykorzystania w badaniach wchłaniania białek. Osiąga się to poprzez wiercenie nanoporów w membranie azotkowej za pomocą trzpienia. Następnie nanopory ładuje się do komory i zwilża roztworem jonowym.

Tak więc płyn tworzy most z jednej strony nanopora na drugą, aby przygotować nanopory do eksperymentów. Przez nią doprowadzane jest napięcie i można zaobserwować, że przepływa przez nią prąd jonów. Ostatnim krokiem jest dodanie białka do komory Nanopore.

Ostatecznie obserwacja długotrwałych blokad w prądzie jonowym przez nanopory ujawnia absorpcję białek na boki nanoporów. Cześć, nazywam się Dave Wicki. Jestem doktorantem na Wydziale Fizyki Uniwersytetu w Syracuse.

Chociaż ta metoda może dostarczyć wglądu w absorpcję białek na powierzchniach nieorganicznych. Może być również stosowany do innych systemów, takich jak białka, interakcje kwasów nukleinowych, pojedyncze cząsteczki do spektroskopii i badanie cząsteczek w ograniczonych przestrzeniach. Zacznij od podniesienia trzpienia do napięcia przyspieszenia.

Następnie załaduj siatkę okienkową z azotku krzemu SPI do uchwytu na próbkę TEM. Wyczyść siatkę plazmą tlenową przez 30 sekund, aby usunąć zanieczyszczenia. Przed załadowaniem próbki należy załadować uchwyt próbki do TEM i pozwolić, aby próżnia opadła.

Korzystając z trybu TEM jasnego pola, znajdź okno azotkowe, jasny kwadrat na surowym rogramie. Upewnij się, że TEM jest prawidłowo wyrównany. Następnie wyrównaj i skoncentruj próbkę.

Teraz przełącz system w tryb STEM i użyj detektora hot off, aby zobrazować próbkę i sprawdzić jej wyrównanie. Ustaw monochromator, jeśli jest obecny, na niską wartość, co pozwala na wyższy prąd elektronów dostępnych do wiercenia. Wybierz odpowiedni rozmiar plamki, aby wywiercić nanopory w oparciu o średnicę sondy elektronowej.

Z wyrównanym trzpieniem. Użyj BROGRAMU, aby idealnie ustawić ostrość na membranie azotkowej w wymaganym powiększeniu. Jeśli próbka jest poruszana, należy wykonać próbę ślepą, wiązkę elektronów i poczekać, aż próbka się ustabilizuje.

Może to potrwać do godziny. Po ustabilizowaniu umieść sondę elektronową na próbce i rozpocznij wiercenie w nanoporach. Wiercenie w nanoporach za pomocą TM wymaga niewierności pacjenta.

Jest to proces, w którym azotek jest stopniowo rozpraszany pod sondą wiązki elektronów. Ważne jest, aby sonda elektronowa znajdowała się bezpośrednio nad miejscem wiercenia i potwierdziła, że nanopory są całkowicie wywiercone. Przed wyjęciem próbki z TEM należy okresowo sprawdzać próbkę, skanując za pomocą detektora hot off.

Jeśli próbka nieznacznie dryfuje, dostosuj położenie sondy elektronowej tak, aby znajdowała się nad nanoporami. Gdy gram ROI jest ostry, połyskująca warstwa azotku zniknie. Kiedy nanopory tworzą się z nieostrym gramem roky, widoczna jest postrzępiona grzywka paznokcia.

Zobrazuj nanopory za pomocą gorącego wyłączenia i utwórz profil intensywności obrazu. Średnicę nanoporów można oszacować na podstawie najciemniejszego obszaru profilu. W razie potrzeby sonda elektronowa może być użyta do powiększenia nanoporów.

Gdy ma wymaganą średnicę. Przełącz na tryb TEM z monochromatorem w ustawieniu standardowym. Użyj TEM w jasnym polu, aby potwierdzić rozmiar porów.

Zacznij od przygotowania degas di soli fizjologicznej. Umieść roztwór w próżni i w kąpieli sonikuj przez 20 minut Delikatnie umieść delikatny nanopor zawierający chip azotku krzemu w 10-mililitrowym dziobie Pyrex. Następnie umieść zlewkę na gorącym talerzu w dygestorium.

Bardzo ostrożnie wyczyść chip Nanopore roztworem piranii. Najpierw dodaj trzy mililitry kwasu siarkowego do pojemnika za pomocą szklanej pipety. Po drugie, ostrożnie dodaj jeden mililitr nadtlenku wodoru do kwasu siarkowego.

Prosimy o podjęcie wszelkich środków ostrożności. Pozwól chipowi nanoporowemu namoczyć się przez 10 minut. Następnie za pomocą szklanej pipety wyjmij roztwór piranii ze zlewki i wyrzuć go w odpowiedni sposób.

Następnie napełnij zlewkę wodą dejonizowaną Degas. Za pomocą czystej szklanej pipety opróżnij zlewkę z wody i powtórz mycie co najmniej pięć razy. Za pomocą czystej pęsety usuń wiór nanoporowy i wysusz go przez lekkie odsysanie.

Po wyschnięciu natychmiast uszczelnij chip nanoporowy w komorze. Chip może być zabezpieczony w komorze za pomocą O-ringów lub uszczelniacza silikonowego. Napełnij komorę roztworem chlorku potasu.

Podłącz srebrne elektrody chlorku srebra do komory. Elektrody można wykonać przez namoczenie srebrnego drutu w wybielaczu przez noc. Zastosuj potencjał transbłonowy na elektrodach i monitoruj odpowiedź prądową za pomocą wzmacniacza z zaciskiem krosowym.

W trybie cęgów napięciowych skonstruuj krzywą napięcia prądu na podstawie pomiarów. Krzywa powinna być wysoce liniowa. W przypadku stosowania jednego molowego chlorku potasu przewodność nanoporów powinna odpowiadać jego średnicy.

Jeśli nanopory nie wykazują liniowej krzywej IV, przewodność jest zbyt niska lub prąd otwarty nanopora nie jest stabilny. Oznacza to, że nanopory nie są prawidłowo połączone i mycie piha należy powtórzyć. Niezbędne jest upewnienie się, że płyn znajduje się w nanoporach.

Jeśli ten krok nie zostanie wykonany prawidłowo, prąd jonowy przepływający przez nanopory będzie wykazywał bardzo duży szum, a podział białek w nanoporach zostanie drastycznie zmniejszony. Rozpocząć od dodania oczyszczonej próbki białka będącego przedmiotem zainteresowania do uziemionej kąpieli w komorze. Poczekaj, aż próbka dokładnie się rozdycha

Zastosuj polaryzację napięcia potencjału transbłonowego o polaryzacji przeciwnej do całkowitego ładunku badanego białka. Zastosowany potencjał 200 miliwoltów powinien być wystarczająco duży do obserwacji. Większość zdarzeń związanych z analitami białkowymi będzie wyglądać jako przejściowe odchylenia prądu od linii bazowej.

Jeśli nie zaobserwuje się żadnego sygnału, zwiększ stężenie białka w komorze. Wyższe napięcia poprawiają stosunek sygnału do szumu i azotku. Nanopory mogą wytrzymać kilka woltów.

Absorpcja białek objawi się długotrwałymi zmianami w prądzie podstawowym nanoporów. Typowe wyniki dla nanoporów w stanie stałym będą następujące. Prąd o otwartych porach powinien być bardzo stabilny.

Charakterystyka dożylna nanoporów powinna być wysoce liniowa. W jednym molowym chlorku potasu, 10 molowym fosforanie potasu o pH 7,4, nachylenie liniowego dopasowania do krzywej IV zapewni jednostkową przewodność nanoporów. Przewodność ma bezpośredni związek ze średnicą nanoporów i powinna pasować do równania.

Ta wartość powinna odpowiadać z dokładnością do 30%Jeśli wartość jest zbyt mała, pory prawdopodobnie nie zostaną połączone z dodatkiem białka. Powinny wystąpić gwałtowne zdarzenia, wchłanianie białka jest długotrwałym spadkiem prądu. Niektóre białka są bardzo labilne i ulegają przemianom strukturalnym we wnętrzu porów.

W takim przypadku długotrwałemu spadkowi napięcia będą towarzyszyć gwałtowne wahania. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wytwarzać nanopory w stanie stałym za pomocą skaningowego transmisyjnego mikroskopu elektronowego i przy użyciu tych zrównoważonych absorpcji białek SA. Nie zapominaj, że praca z roztworem piranii może być niezwykle niebezpieczna, a środki ostrożności, takie jak praca w dygestorium w rękawiczkach, Podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować fartuch laboratoryjny i fartuch chemiczny.

Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.