Name: Monitorowanie adsorpcji białek za pomocą nanoporów w stanie stałym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Poznaj metodę wytwarzania nanoporów w membranach azotku krzemu i monitorowania adsorpcji białek na poziomie pojedynczych cząsteczek. Technika impulsów rezystancyjnych umożliwia bezetykietową detekcję w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Johnowi Grazulowi (Cornell University), Andre Marzialiemu (The University of British Columbia at Vancouver) oraz Vincentowi Tabard-Cossie (The University of Ottawa) za udzielone porady. Niniejsza praca została sfinansowana częściowo z grantów przyznanych przez amerykańską National Science Foundation (DMR-0706517 i DMR-1006332) oraz National Institutes of Health (R01-GM088403). Wiercenie nanoporów zostało przeprowadzone w Electron Microscopy Facility w Cornell Center for Materials Research (CCMR) przy wsparciu programu National Science Foundation - Materials Research Science and Engineering Centers (MRSEC) (DMR 0520404). Przygotowanie membran z azotku krzemu odbyło się w Cornell NanoScale Facility, członku National Nanotechnology Infrastructure Network, który jest wspierany przez National Science Foundation (Grant ECS-0335765).

1. Wytwarzanie nanoporów w stanie stałym w membranach z azotku krzemu
<ol>
 <li>Ustaw napięcie przyspieszenia mikroskopu FEI Tecnai F20 S/TEM na 200 kV. W przypadku użycia innego S/TEM, napięcie przyspieszenia powinno być większe lub równe 200 kV 9</li>
 <li>Włóż siatkę z oknem z azotku krzemu SPI o grubości 20 nm do uchwytu próbek TEM i oczyść ją plazmą tlenową przez 30 sekund w celu usunięcia zanieczyszczeń z uchwytu.</li>
 <li>Wprowadź próbkę do S/TEM i poczekaj na uzyskanie próżni. Po wytworzeniu próżni w S/TEM zlokalizuj okno azotkowe w trybie TEM w polu jasnym, szukając jasnego kwadratu na ronchigramie. Upewnij się, że TEM jest odpowiednio ustawiony, a następnie przeprowadź wyrównanie i ustawienie ostrości próbki.</li>
 <li>Przełącz S/TEM w tryb STEM. Użyj detektora HAADF (lub równoważnego) do obrazowania próbki i upewnij się, że jest ona prawidłowo wyrównana.</li>
 <li>Ustaw monochromator na niską wartość. Niższa wartość monochromatora pozwala na uzyskanie wyższego natężenia prądu elektronów dostępnych do wiercenia. Jeśli S/TEM nie posiada monochromatora, pomiń ten krok.</li>
 <li>Wybierz odpowiednią wielkość plamki (spot size) do wiercenia nanopora. Odpowiada ona średnicy wiązki elektronowej. Sonda o średnicy 3 nm sprawdza się dobrze przy wierceniu porów o średnicy 5 nm. Większa sonda (5 nm) będzie wiercić szybciej i stworzy większy por. Mniejsza sonda (1 nm) będzie wymagać dłuższego czasu wiercenia i stworzy mniejszy por.</li>
 <li>W razie potrzeby skoryguj ustawienia STEM.</li>
 <li>Ustaw ostrość membrany azotkowej i zwiększ powiększenie do x1.3M. Precyzyjne ustawianie ostrości należy przeprowadzać, monitorując ronchigram.</li>
 <li>Jeśli występuje jakikolwiek ruch próbki, należy odczekać do jej stabilizacji. Może to potrwać do godziny. W czasie oczekiwania zablokuj wiązkę elektronową, aby nie uszkodzić azotku.</li>
 <li>Umieść sondę elektronową na próbce i rozpocznij wiercenie.</li>
 <li>Okresowo sprawdzaj próbkę, skanując ją detektorem HAADF, zarówno aby upewnić się, że nanopor jest wiercony (będzie wyglądał jak ciemna plamka), jak i aby sprawdzić, czy próbka się nie przemieszcza. Jeśli próbka lekko dryfuje, skoryguj pozycję sondy elektronowej tak, aby znajdowała się nad nanoporem.</li>
 <li>Obserwuj ronchigram, aby zidentyfikować moment powstania poru. Gdy obraz jest ostry, błona azotkowa ma mieniący się wygląd. Zniknie on w momencie powstania nanopora. Lekkie rozostrzenie ronchigramu pozwala dostrzec prążki Fresnela związane z nanoporem.</li>
 <li>Wykonaj obraz nanopora za pomocą HAADF.</li>
 <li>Wykonaj profil intensywności obrazu nanopora. Średnicę nanopora można oszacować na podstawie najciemniejszego obszaru profilu.</li>
 <li>Powiększenie nanopora można przeprowadzić, przesuwając sondę elektronową wzdłuż krawędzi poru.</li>
 <li>Gdy nanopor osiągnie pożądaną średnicę, przełącz S/TEM w tryb TEM.</li>
 <li>Przywróć monochromator do standardowego ustawienia i obrazuj nanopor w trybie TEM w polu jasnym, aby potwierdzić jego rozmiar (Rys. 1).</li>
</ol>
2. Zwilżanie nanoporu w stanie stałym
<ol>
 <li>Odgazuj wodę dejonizowaną zawierającą 1 M KCl i 10 mM fosforanu potasu, pH 7,4. Można to zrobić, poddając roztwory próżni i umieszczając je w myjce ultradźwiękowej przez 20 minut.</li>
 <li>Umieść chip z azotku krzemu zawierający nanopor w zlewce Pyrex o pojemności 10 ml. Należy uważać, aby nie uszkodzić okienka z azotku, ponieważ jest ono bardzo delikatne. Postaw zlewkę na płycie grzejnej w dygestorium i ustaw temperaturę na 100°C.</li>
 <li>Wyczyść chip z nanoporem za pomocą roztworu piranha, zachowując szczególną ostrożność. Najpierw za pomocą pipety szklanej dodaj do naczynia 3 ml kwasu siarkowego. Następnie ostrożnie dodaj 1 ml nadtlenku wodoru do kwasu siarkowego, aby przygotować roztwór piranha14. Prosimy o zachowanie wszelkich środków ostrożności.</li>
 <li>Pozostaw chip z nanoporem w roztworze piranha na 10 minut.</li>
 <li>Usuń roztwór piranha ze zlewki za pomocą pipety szklanej. Umieść go w odpowiednim pojemniku do przechowywania.</li>
 <li>Napełnij zlewkę odgazowaną wodą dejonizowaną, używając czystej pipety szklanej. Opróżnij zlewkę z wody i powtórz tę czynność co najmniej 5 razy.</li>
 <li>Wyjmij chip z nanoporem za pomocą czystej pęsety i osusz go delikatnym ssaniem.</li>
 <li>Natychmiast zamknij chip z nanoporem w komorze (Rys. 2a, 2b). Chip można uszczelnić w komorze za pomocą uszczelek O-ring lub uszczelniacza silikonowego.</li>
 <li>Wypełnij komorę roztworem KCl.</li>
 <li>Podłącz elektrody Ag/AgCl do komory (Rys. 2b). Elektrody można wykonać, namaczając srebrny drut w wybielaczu przez noc.</li>
 <li>Przyłoż potencjał transbłonowy między elektrodami i monitoruj odpowiedź prądową, korzystając z wzmacniacza patch-clamp Axon 200B w trybie clamp napięciowego (voltage-clamp).</li>
 <li>Na podstawie pomiarów sporządź krzywą I/V (prądowo-napięciową). Krzywa I/V powinna być silnie liniowa przy zastosowaniu 1 M KCl (Rys. 3). Przewodność nanoporu powinna odpowiadać jego średnicy. Jeśli nanopór nie wykazuje liniowej krzywej I/V, przewodność jest zbyt niska lub prąd otwarty nanoporu nie jest stabilny (Rys. 4a), oznacza to, że nanopór nie został odpowiednio zwilżony i należy powtórzyć mycie roztworem piranha.</li>
</ol>
3. Monitorowanie adsorpcji białek
<ol>
 <li>Kluczowe jest przeprowadzenie eksperymentów kontrolnych z membraną z pojedynczym nanoporem lub równoległą macierzą nanoporów (patrz poniżej), aby monitorować prąd w warunkach buforowych bez próbki białka. Zalecamy podjęcie dwóch następujących kroków: (i) zastosowanie buforu o wysokim stopniu czystości (czystość &gt; 99,9%; stopień chromatograficzny) oraz (ii) zastosowanie buforu, którego oddziaływanie z nanoporem w stanie stałym nie generuje zdarzeń jednokanałowych. Dodatkowo zalecamy uzyskanie wysokiej czystości próbki białka przy użyciu standardowych procedur chemii białek. Czystość próbki białka należy sprawdzić za pomocą analizy żelowej z użyciem dodku sodu i poliakryloamidu (SDS-PAGE) oraz wysokorozdzielczej spektrometrii mas 15.</li>
 <li>Do uziemionej kąpieli w komorze należy dodać oczyszczoną próbkę badanego białka. Należy odczekać czas niezbędny do dyfuzji próbki w całej kąpieli. Typowe stężenia białek, które można mierzyć, mieszczą się w zakresie od kilkunastu nM do μM 7,15-21.</li>
 <li>Należy przyłożyć potencjał napięcia przezbłonowego o polaryzacji przeciwnej do ładunku całkowitego badanego białka. Na przykład BSA posiada efektywny ładunek netto ujemny przy pH 7,4, w związku z czym należy przyłożyć dodatnie napięcie. Przyłożone napięcie tworzy gradient potencjału wewnątrz nanoporu, a białka o przeciwnych ładunkach będą napędzane przez przeciwstawne siły. Tylko polaryzacje napięcia, które wprowadzają białka do nanoporu, będą generować mierzalne sygnały.</li>
 <li>Przyłożony potencjał o wartości 200 mV powinien być wystarczający do zaobserwowania większości analitów białkowych. Zdarzenia będą pojawiać się jako przejściowe odchylenia prądu od linii bazowej (Rys. 4b). Jeśli sygnał nie zostanie zaobserwowany, należy zwiększyć stężenie białka w komorze. Wyższe napięcia poprawiają stosunek sygnału do szumu. Nanopory azotkowe mogą wytrzymać napięcie rzędu kilku woltów.</li>
 <li>Adsorpcja białek będzie objawiać się jako długotrwałe zmiany prądu bazowego nanoporu (Rys. 4c).</li>
</ol>
4. Możliwości funkcjonalizacji nanoporów
Istnieje kilka metod wprowadzania grup funkcyjnych do azotku krzemu 22,23. Większość filmów azotkowych posiada cienką warstwę tlenku na powierzchni, a ekspozycja na ozon może stworzyć dodatkową warstwę tlenku, jeśli jest to konieczne. Można stosować różne organosilany, które ulegają samoorganizacji na takich warstwach. Szczególne zainteresowanie budzi aminosilan, który samoorganizuje się i może być dalej modyfikowany (np. kwasem karboksylowym i aldehydami), co pozwala na badanie szeregu powierzchni organicznych. Po przemyciu nanoporu roztworem piranhy i umocowaniu go w komorze, aminę można dodać bezpośrednio do kąpieli w komorze z elektrolitem wspomagającym 0,5 M TBACl (tetrabutylochlorek amonu), używając bezwodnego MeOH (metanolu) jako rozpuszczalnika. Formowanie monowarstwy można monitorować poprzez przyłożenie napięcia polaryzującego 400 mV i pomiar spadku natężenia prądu 23.
5. Wyznaczanie pozornej stałej szybkości reakcji pierwszego rzędu oraz stałej adsorpcji Langmuira przy użyciu równoległych macierzy nanoporów
5.1 Pozorne stałe szybkości reakcji pierwszego rzędu dla absorpcji i desorpcji
Podkreślamy, że pozytywnym aspektem tej metodologii jest możliwość obserwacji pojedynczych adsorpcji na poziomie pojedynczej cząsteczki. Pomiary adsorpcji białek na powierzchni nieorganicznej w skali pojedynczej cząsteczki można przeskalować poprzez zastosowanie równoległych matryc nanoporów w stanie stałym. Matryca nanoporów jest niezbędna ze względu na konieczność przebadania wielu porów w celu uzyskania wiarygodnych statystyk. W tym celu zastosowanie matrycy nanoporów umożliwiłoby monitorowanie pojedynczych adsorpcji, a także pomiar wielu zdarzeń do dalszej analizy. Matrycę nanoporów w azotku krzemu można utworzyć zgodnie z powyższym protokołem, po prostu wiercąc wiele otworów w próbce. Każdy nanopor powinien mieć podobny rozmiar. Odpowiednie powinny być matryce nanoporów o wymiarach 6x6 lub 7x7. Po dodaniu anality białkowego do komory prąd będzie spadać wykładniczo zgodnie z następującym wzorem: 
 
It = I∞ - (I∞ - I0)exp(-k't)
Tutaj It oznacza prąd w czasie eksperymentalnym t. I0 to pierwotny prąd przepływający przez macierz nanoporów. I∞ oznacza prąd na poziomie nasycenia (tj. w nieskończoności). k' to pozorna stała szybkości reakcji pierwszego rzędu, którą można wyznaczyć z dopasowania krzywej eksperymentalnej. Wyższą wartość k' można interpretować jako szybszą szybkość adsorpcji. Stosunek I∞/I0, nazywany również znormalizowanym prądem nasycenia, jest liczbą bezwymiarową z zakresu od 0 do 1. Parametr ten stanowi miarę stopnia zajęcia przez zaadsorbowane anality białkowe. Zatem każdemu odrębnemu warunkowi eksperymentalnemu powinny być przypisane dwa konkretne parametry wyjściowe: I∞/I0 oraz k'.
Należy zauważyć, że pozorne stałe szybkości adsorpcji pierwszego rzędu oraz znormalizowane natężenia prądu są zależne od efektywnego czasu przebywania białek w nanoporach. Czas ten zależy od stężenia analizowanych białek w objętościowej fazie wodnej 24. W związku z tym konieczne jest wprowadzenie dodatkowej korekty tych wartości w oparciu o efektywny czas przebywania białek wewnątrz nanoporu. Sugerujemy pomiar częstotliwości szybkich zdarzeń (translokacji) i pomnożenie go przez średni czas przebywania podczas takich zdarzeń. Pozwoli to wyznaczyć średni czas przebywania białek wewnątrz nanoporu w jednostce czasu.
Stałą szybkości desorpcji można wyznaczyć również przy użyciu równoległego układu nanoporów. Gdy poziom prądu osiągnie nasycenie (I∞), należy odwrócić polaryzację napięcia, aby zapobiec dalszemu uwięzieniu białek w nanoporach. Desorpcja pojedynczych białek będzie objawiać się zmianą rejestrowanego prądu w kierunku wartości wyższych. Stałą szybkości można będzie następnie wyznaczyć na podstawie wzrostu poziomu prądu.
5.2 Stała adsorpcji Langmuira
Absorpcja analitów białkowych na nieorganicznych powierzchniach nanoporów zależy od stężenia białka w fazie wodnej. Zjawisko to zostało już zaobserwowane na poziomie pojedynczych cząsteczek 13. Jeśli θ reprezentuje znormalizowany prąd nasycenia (I∞ / I0), to typowe równanie izotermy Langmuira jest opisane następującym wyrażeniem:
<img alt="Równanie izotermy Langmuira θ=αC/(1+αC); analiza adsorpcji; wzór w badaniu naukowym." src="/files/ftp_upload/3560/3560fig5_2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 5.2">
gdzie C to stężenie białka w fazie wodnej. α to stała adsorpcji Langmuira. Stała ta rośnie wraz ze wzrostem energii wiązania podczas adsorpcji oraz wraz ze spadkiem temperatury. Zebranie punktów danych θ będzie wymagało przeprowadzenia pomiarów z wykorzystaniem równoległych układów przy różnych stężeniach białka w fazie wodnej. Dane należy analizować w połączeniu z innymi technikami, aby zweryfikować wartość dopasowanej stałej adsorpcji Langmuira. Ponadto do interpretacji uzyskanych danych eksperymentalnych można wykorzystać pełnoatomowe symulacje dynamiki molekularnej 25,26.
6. Reprezentatywne wyniki
Typowe wyniki dla nanoporów w stanie stałym będą następujące. Prąd otwartego poru powinien być wysoce stabilny, co pokazano na Ryc. 4a. Charakterystyki I/V nanoporu powinny być wysoce liniowe w 1 M KCl, 10 fosforanu potasu, pH 7,4, co przedstawiono na Ryc. 2. Nachylenie dopasowania liniowego do krzywej I/V pozwoli wyznaczyć przewodność jednostkową nanoporu. Przewodność jest bezpośrednio powiązana z średnicą nanoporu i powinna odpowiadać równaniu: <img alt="Równanie statycznej równowagi G≈(πd²/4l)σ; wzór na nośność; analiza naprężeń mechanicznych." src="/files/ftp_upload/3560/3560figeqn.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Równanie na rysunku">, gdzie G to przewodność nanoporu, d to jego średnica, l to jego długość, a σ to przewodność roztworu w komorze 14. Wartość ta powinna być zgodna z dokładnością do 30%. Jeśli jest ona zbyt mała, prawdopodobnie por nie został zwilżony. Po dodaniu białka powinny wystąpić szybkie zdarzenia, jak pokazano na Ryc. 4b. Adsorpcja białka objawia się jako długotrwały spadek prądu, co przedstawiono na Ryc. 4c. Niektóre białka są wysoce labilne i ulegają transformacji strukturalnej wewnątrz poru. W takim przypadku długotrwałemu spadkowi napięcia towarzyszyć będą szybkie fluktuacje.
<img alt="Nanocząsteczka na obrazie TEM; skala 10 nm; analiza mikroskopowa; badania nad nauką o materiałach." src="/files/ftp_upload/3560/3560fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Nanopor w stanie stałym wykonany przy użyciu Tecnai F20 S/TEM. Por został wywiercony w trybie STEM do średnicy 20 nm. Obraz wykonano w trybie TEM w polu jasnym. Warstwa azotku miała grubość 30 nm.
<img alt="Schemat układu siatki TEM i o-ringu dla eksperymentu pomiaru roztworu z opisanymi elementami." src="/files/ftp_upload/3560/3560fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Komora służąca do umieszczenia pojedynczego nanoporu w stanie stałym w pomiarach impulsu rezystywnego. A) Komora i chip krzemowy z wolnostojącym oknem azotkowym (siatka TEM). Nanopor jest wiercony w azotku przed załadowaniem. Czerwone o-ringi są używane do zapewnienia szczelnego zamknięcia wokół chipu, który oddziela dwie kąpiele roztworu jonowego. B) Schemat komory przedstawiający rozmieszczenie kąpieli z roztworami i elektrod względem nanoporu.
<img alt="Wykres prądowo-napięciowy; charakterystyka nanomateriału; analiza rezystancji elektrycznej; wykres liniowy." src="/files/ftp_upload/3560/3560fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Typowe przebiegi I/V dla nanoporów w stanie stałym o różnych średnicach. Jednokanałowe przebiegi elektryczne zarejestrowano w 1 M KCl, 20 mM Tris, pH 8.5. Nanopory wykonano w azotku krzemu o grubości 30 nm. Należy zauważyć, że grubość azotku wpływa na przewodność jednostkową nanoporu.
<img alt="Wykresy aktywności kanałów jonowych: prezentacja natężenia prądu (pA) w funkcji czasu (10s) w trzech warunkach eksperymentalnych." src="/files/ftp_upload/3560/3560fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4. Pomiarowe zapisy prądu pojedynczego kanału i detekcja adsorpcji białka. A) Zapis elektryczny pojedynczego kanału przedstawiający prąd otwarcia nanoporu o średnicy 10 nm. B) Odchylenia prądu reprezentują wnikanie albuminy surowicy bydlęcej (BSA) do wnętrza nanoporu. C) Adsorpcja BSA na powierzchni azotku. Wszystkie zapisy pochodzą z tego samego nanoporu w 1 M KCl, 10 mM fosforanie potasu, pH 7.4. Zastosowany potencjał przezbłonowy wynosił +40 mV, a BSA dodano do kąpieli w komorze uziemionej w stężeniu 120 nM.

<ol><li>Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion-beam+sculpting+at+nanometre+length+scales%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ion-beam sculpting at nanometre length scales.</a> Nature. 412, 166-169 (2001).</li>
<li>Li, J., Gershow, M., Stein, D., Brandin, E., Golovchenko, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+molecules+and+configurations+in+a+solid-state+nanopore+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Mater%22%5BJournal%5D)">DNA molecules and configurations in a solid-state nanopore microscope.</a> Nat. Mater. 2, 611-615 (2003).</li>
<li>Dekker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid-state+nanopores%5BTitle%5D)+AND+%22Nature.+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Solid-state nanopores.</a> Nature. Nanotechnology. 2, 209-215 (2007).</li>
<li>Branton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+and+challenges+of+nanopore+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">The potential and challenges of nanopore sequencing.</a> Nat. Biotechnol. 26, 1146-1153 (2008).</li>
<li>Wanunu, M., Morrison, W., Rabin, Y., Grosberg, A. Y., Meller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrostatic+focusing+of+unlabelled+DNA+into+nanoscale+pores+using+a+salt+gradient%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Electrostatic focusing of unlabelled DNA into nanoscale pores using a salt gradient.</a> Nat. Nanotechnol. 5, 160-165 (2010).</li>
<li>Peng, H., Ling, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+DNA+translocation+through+a+solid-state+nanopore+by+magnetic+tweezers%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Reverse DNA translocation through a solid-state nanopore by magnetic tweezers.</a> Nanotechnology. 20, 185101-185101 (2009).</li>
<li>Talaga, D. S., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+protein+unfolding+in+solid+state+nanopores%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Single-molecule protein unfolding in solid state nanopores.</a> J. Am. Chem. Soc. 131, 9287-9297 (2009).</li>
<li>Zhao, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+SNPs+using+a+synthetic+nanopore%5BTitle%5D)+AND+%22Nano.+Lett%22%5BJournal%5D)">Detecting SNPs using a synthetic nanopore.</a> Nano. Lett. 7, 1680-1685 (2007).</li>
<li>Storm, A. J., Chen, J. H., Ling, X. S., Zandbergen, H. W., Dekker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+solid-state+nanopores+with+single-nanometre+precision%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Mater%22%5BJournal%5D)">Fabrication of solid-state nanopores with single-nanometre precision.</a> Nat. Mater. 2, 537-540 (2003).</li>
<li>Sexton, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resistive-pulse+studies+of+proteins+and+protein%2Fantibody+complexes+using+a+conical+nanotube+sensor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Resistive-pulse studies of proteins and protein/antibody complexes using a conical nanotube sensor.</a> J. Am. Chem. Soc. 129, 13144-13152 (2007).</li>
<li>Martin, C. R., Siwy, Z. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemistry.+Learning+nature%27s+way%3A+biosensing+with+synthetic+nanopores%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Chemistry. Learning nature's way: biosensing with synthetic nanopores.</a> Science. 317, 331-332 (2007).</li>
<li>Sexton, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+adsorption-based+model+for+pulse+duration+in+resistive-pulse+protein+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">An adsorption-based model for pulse duration in resistive-pulse protein sensing.</a> J. Am. Chem. Soc. 132, 6755-6763 (2010).</li>
<li>Niedzwiecki, D. J., Grazul, J., Movileanu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+observation+of+protein+adsoption+onto+an+inorganic+surface%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Single-molecule observation of protein adsoption onto an inorganic surface.</a> J. Am. Chem. Soc. 132, 10816-10822 (2010).</li>
<li>Selvin, P. R., Ha, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWanunu%2C+M+%22Single-molecule+techniques%3A+a+laboratory+manual%22">Single-molecule techniques: a laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. 395-420 (2008).</li>
<li>Han, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+detection+of+single+protein+molecules+and+protein-protein+interactions+using+synthetic+nanopores%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Label-free detection of single protein molecules and protein-protein interactions using synthetic nanopores.</a> Anal. Chem. 80, 4651-4658 (2008).</li>
<li>Han, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensing+protein+molecules+using+nanofabricated+pores%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Phys.+Lett%22%5BJournal%5D)">Sensing protein molecules using nanofabricated pores.</a> Appl. Phys. Lett. 88, (2006).</li>
<li>Fologea, D., Ledden, B., McNabb, D. S., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+characterization+of+protein+molecules+by+a+solid-state+nanopore%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Phys.+Lett%22%5BJournal%5D)">Electrical characterization of protein molecules by a solid-state nanopore.</a> Appl. Phys. Lett. 91, (2007).</li>
<li>Firnkes, M., Pedone, D., Knezevic, J., Doblinger, M., Rant, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrically+Facilitated+Translocations+of+Proteins+through+Silicon+Nitride+Nanopores%3A+Conjoint+and+Competitive+Action+of+Diffusion%2C+Electrophoresis%2C+and+Electroosmosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nano.+Lett%22%5BJournal%5D)">Electrically Facilitated Translocations of Proteins through Silicon Nitride Nanopores: Conjoint and Competitive Action of Diffusion, Electrophoresis, and Electroosmosis.</a> Nano. Lett. , (2010).</li>
<li>Pedone, D., Firnkes, M., Rant, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Data+analysis+of+translocation+events+in+nanopore+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Data analysis of translocation events in nanopore experiments.</a> Anal. Chem. 81, 9689-9694 (2009).</li>
<li>Oukhaled, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+Completely+Unfolded+and+Native+Proteins+through+Solid-State+Nanopores+as+a+Function+of+Electric+Driving+Force%5BTitle%5D)+AND+%22ACS.+Nano.%22%5BJournal%5D)">Dynamics of Completely Unfolded and Native Proteins through Solid-State Nanopores as a Function of Electric Driving Force.</a> ACS. Nano.. , (2011).</li>
<li>Yusko, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+protein+translocation+through+nanopores+with+bio-inspired+fluid+walls%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Controlling protein translocation through nanopores with bio-inspired fluid walls.</a> Nat. Nanotechnol. 6, 253-260 (2011).</li>
<li>Arafat, A., Schroen, K., de Smet, L. C., Sudholter, E. J., Zuilhof, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tailor-made+functionalization+of+silicon+nitride+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Tailor-made functionalization of silicon nitride surfaces.</a> J. Am. Chem. Soc. 126, 8600-8601 (2004).</li>
<li>Wanunu, M., Meller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+modified+solid-state+nanopores%5BTitle%5D)+AND+%22Nano.+Lett%22%5BJournal%5D)">Chemically modified solid-state nanopores.</a> Nano. Lett. 7, 1580-1585 (2007).</li>
<li>Movileanu, L., Cheley, S., Bayley, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partitioning+of+individual+flexible+polymers+into+a+nanoscopic+protein+pore%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Partitioning of individual flexible polymers into a nanoscopic protein pore.</a> Biophys. J. 85, 897-910 (2003).</li>
<li>Aksimentiev, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+ionic+current+signatures+of+DNA+transport+through+a+nanopore%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Deciphering ionic current signatures of DNA transport through a nanopore.</a> Nanoscale. 2, 468-483 (2010).</li>
<li>Timp, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanopore+Sequencing%3A+Electrical+Measurements+of+the+Code+of+Life%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans.+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Nanopore Sequencing: Electrical Measurements of the Code of Life.</a> IEEE Trans. Nanotechnol. 9, 281-294 (2010).</li>
<li>Roach, P., Farrar, D., Perry, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+tailoring+for+controlled+protein+adsorption%3A+effect+of+topography+at+the+nanometer+scale+and+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Surface tailoring for controlled protein adsorption: effect of topography at the nanometer scale and chemistry.</a> J. Am. Chem. Soc. 128, 3939-3945 (2006).</li>
<li>Roach, P., Farrar, D., Perry, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interpretation+of+protein+adsorption%3A+surface-induced+conformational+changes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Interpretation of protein adsorption: surface-induced conformational changes.</a> J. Am. Chem. Soc. 127, 8168-8173 (2005).</li>
<li>Brewer, S. H., Glomm, W. R., Johnson, M. C., Knag, M. K., Franzen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+BSA+binding+to+citrate-coated+gold+nanoparticles+and+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Probing BSA binding to citrate-coated gold nanoparticles and surfaces.</a> Langmuir. 21, 9303-9307 (2005).</li>
<li>Schon, P., Gorlich, M., Coenen, M. J., Heus, H. A., Speller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonspecific+protein+adsorption+at+the+single+molecule+level+studied+by+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Nonspecific protein adsorption at the single molecule level studied by atomic force microscopy.</a> Langmuir. 23, 9921-9923 (2007).</li>
<li>Rabe, M., Verdes, D., Zimmermann, J., Seeger, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+organization+and+cooperativity+during+nonspecific+protein+adsorption+events%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem.+B%22%5BJournal%5D)">Surface organization and cooperativity during nonspecific protein adsorption events.</a> J. Phys. Chem. B. 112, 13971-13980 (2008).</li>
<li>Rabe, M., Verdes, D., Rankl, M., Artus, G. R., Seeger, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+study+of+concepts+and+phenomena+of+the+nonspecific+adsorption+of+beta-lactoglobulin%5BTitle%5D)+AND+%22Chemphyschem%22%5BJournal%5D)">A comprehensive study of concepts and phenomena of the nonspecific adsorption of beta-lactoglobulin.</a> Chemphyschem. 8, 862-872 (2007).</li>
<li>Micic, M., Chen, A., Leblanc, R. M., Moy, V. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanning+Electron+Microscopy+Studies+of+Protein-Functionalized+Atomic+Force+Microscopy+Cantilever+Tips%5BTitle%5D)+AND+%22Scanning%22%5BJournal%5D)">Scanning Electron Microscopy Studies of Protein-Functionalized Atomic Force Microscopy Cantilever Tips.</a> Scanning. 21, 394-397 (1999).</li>
<li>Grant, A. W., Hu, Q. H., Kasemo, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission+electron+microscopy+%27windows%27+for+nanofabricated+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Transmission electron microscopy 'windows' for nanofabricated structures.</a> Nanotechnology. 15, 1175-1181 (2004).</li>
<li>Giannoulis, C. S., Desai, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+proteins+and+fibroblasts+on+thin+inorganic+films%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mater.+Sci%3A+Mater.+Med%22%5BJournal%5D)">Characterization of proteins and fibroblasts on thin inorganic films.</a> J. Mater. Sci: Mater. Med. 13, 75-80 (2002).</li>
<li>Gustavsson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+modifications+of+silicon+nitride+for+cellular+biosensors+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mater.+Sci%3A+Mater.+Med%22%5BJournal%5D)">Surface modifications of silicon nitride for cellular biosensors applications.</a> J. Mater. Sci: Mater. Med. 19, 1839-1850 (2008).</li>
<li>Shirshov, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+response+of+planar+polarization+interferometer+to+molecular+layer+formation%3A+fibrinogen+adsorption+on+silicon+nitride+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Analysis of the response of planar polarization interferometer to molecular layer formation: fibrinogen adsorption on silicon nitride surface.</a> Biosens. Bioelectron. 16, 381-390 (2001).</li>
<li>Chen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+layer+deposition+to+fine-tune+the+surface+properties+and+diamters+of+fabricated+nanopores%5BTitle%5D)+AND+%22Nano.+Lett%22%5BJournal%5D)">Atomic layer deposition to fine-tune the surface properties and diamters of fabricated nanopores.</a> Nano. Lett. 4, 1333-1337 (2004).</li>
<li>Siwy, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+biosensors+based+on+biofunctionalized+conical+gold+nanotubes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Protein biosensors based on biofunctionalized conical gold nanotubes.</a> J. Am. Chem. Soc. 127, 5000-5001 (2005).</li>
<li>Ding, S., Gao, C., Gu, L. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+Single+Molecules+of+Immunoglobulin+and+Ricin+with+an+Aptamer-Encoded+Glass+Nanopore%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Capturing Single Molecules of Immunoglobulin and Ricin with an Aptamer-Encoded Glass Nanopore.</a> Anal. Chem. , (2009).</li>
<li>Kim, M. -J., Wanunu, M., Bell, C. D., Meller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Fabrication+of+Uniform+Size+Nanopores+and+Nanopore+Arrays+for+Parallel+DNA+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">Rapid Fabrication of Uniform Size Nanopores and Nanopore Arrays for Parallel DNA Analysis.</a> Adv. Mater. 18, 3149-3153 (2006).</li>
<li>Bezrukov, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+channels+as+molecular+Coulter+counters+to+probe+metabolite+transport%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Membr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Ion channels as molecular Coulter counters to probe metabolite transport.</a> J. Membr. Biol. 174, 1-13 (2000).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

Spontaniczna adsorpcja białek na powierzchniach w stanie stałym 27-29 ma fundamentalne znaczenie w wielu obszarach, takich jak zastosowania biochipów oraz projektowanie nowej klasy funkcjonalnych biomateriałów hybrydowych. Wcześniejsze badania wykazały, że białka zaadsorbowane na powierzchniach w stanie stałym nie wykazują mobilności bocznej ani znaczących szybkości desorpcji, w związku z czym adsorpcję białek uznaje się ogólnie za proces nieodwracalny i nieswoisty 30-32. Przyjmuje się, że adsorpcja...

<table><tbody><tr><td>Tecnai F20 S/TEM</td><td>FEI</td><td></td><td>S/TEM wymaga napięcia przyspieszającego &amp;#8805;200kV i źródła emisji polowej. </td></tr><tr><td>Okienko z membrany azotku krzemu o grubości 20 nm do TEM</td><td>SPI Supplies</td><td>4163SN-BA</td><td></td></tr><tr><td>Wzmacniacz patch-clamp Axon Axopatch 200B</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axon Digidata 1440A</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie pCLAMP 10</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>Oprogramowanie do akwizycji i analizy danych elektrofizjologicznych</td></tr><tr><td>Kwas siarkowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>A300</td><td></td></tr><tr><td>Nadtlenek wodoru</td><td>Fisher Scientific</td><td>H325</td><td></td></tr><tr><td>Silikonowe pierścienie O-ring</td><td>McMaster-Carr</td><td>003 S70</td><td>Alternatywnie można użyć PDMS </td></tr><tr><td>Drut srebrny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>348759</td><td>Do elektrod</td></tr><tr><td>SPC Technology, pin stykowy D-sub</td><td>Newark Inc</td><td>9K4978</td><td>Do elektrod</td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan potasu dwuzasadowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2222</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan potasu jednozasadowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5379</td><td></td></tr><tr><td>PDMS</td><td>Dow Corning</td><td></td><td>Zestaw elastomeru Sylgard 184. Do wykonania komory.</td></tr><tr><td>Uszczelniacz Kwik-Cast</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>KWIK-CAST</td><td>Szybko utwardzalny uszczelniacz silikonowy</td></tr><tr><td>Płyta grzewcza</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Klatka Faradaya</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

monitorowanie adsorpcji białek za pomocą nanoporów w stanie stałym

Monitoring Protein Adsorption with Solid-state Nanopores

Nanopory w stanie stałym są wykorzystywane do pomiarów na poziomie pojedynczych cząsteczek w celu zbadania lokalnej struktury i elastyczności kwasów nukleinowych 1-6, rozwijania białek 7 oraz powinowactwa wiązania różnych ligandów 8. Dzięki połączeniu tych nanoporów z techniką impulsu rezystywnego 9-12, pomiary takie można przeprowadzać w szerokim zakresie warunków i bez konieczności znakowania 3. W technice impulsu rezystywnego po obu stronach nanoporu wprowadza się jonowy roztwór soli. W konsekwencji jony są przenoszone z jednej strony komory na drugą pod wpływem przyłożonego potencjału transmembranowego, co skutkuje powstaniem stałego prądu. Przenikanie analizowanej substancji do nanoporu powoduje wyraźne odchylenie tego prądu, które można analizować w celu uzyskania informacji o pojedynczych cząsteczkach. Z zastosowaniem tej techniki można monitorować adsorpcję pojedynczych białek na ściankach nanoporu w szerokim zakresie warunków 13. Adsorpcja białek zyskuje na znaczeniu, ponieważ wraz z miniaturyzacją urządzeń mikroprzepływowych interakcje tych systemów z pojedynczymi białkami stają się istotnym zagadnieniem. Niniejszy protokół opisuje szybki test wiązania białek do powłok azotkowych, który można łatwo rozszerzyć na inne cienkie warstwy nadające się do drążenia nanoporów lub na funkcjonalizowane powierzchnie azotkowe. Można badać różne białka w szerokim zakresie roztworów i warunków denaturujących. Ponadto protokół ten może być wykorzystany do badania bardziej podstawowych problemów za pomocą spektroskopii nanoporowej.

Opisano metodę wykorzystania nanoporów w stanie stałym do monitorowania niespecyficznej adsorpcji białek na powierzchni nieorganicznej. Metoda ta opiera się na zasadzie impulsu rezystywnego, co pozwala na badanie adsorpcji w czasie rzeczywistym i na poziomie pojedynczych cząsteczek. Ponieważ proces adsorpcji pojedynczych białek zachodzi daleko od stanu równowagi, proponujemy zastosowanie równoległych macierzy syntetycznych nanoporów, co umożliwia ilościowe wyznaczenie pozornej stałej szybkości reakcji adsorpcji białek pierwszego rzędu oraz stałej adsorpcji Langmuira.

Monitorowanie adsorpcji białek za pomocą nanoporów w stanie stałym

Nanopory w stanie stałym zostały wykorzystane do przeprowadzania pomiarów na poziomie pojedynczych cząsteczek w celu zbadania lokalnej struktury i elastyczności kwasów nukleinowych ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest stworzenie nanoporów w membranach sztucznych do wykorzystania w badaniach nad absorpcją białek. Cel ten osiąga się poprzez wiercenie nanoporów w membranie azotkowej przy użyciu stempla. Następnie nanopor zostaje umieszczony w komorze i zwilżony roztworem jonowym.Dzięki temu ciecz tworzy mostek od jednej strony nanoporu do drugiej, przygotowując nanopor do eksperymentów. Przez nanopor przykłada się napięcie, co pozwala na zaobserwowanie przepływu prądu jonowego. Ostatnim krokiem jest dodanie białka do komory nanoporu.Ostatecznie obserwacja długotrwałych blokad prądu jonowego w nanoporze ujawnia adsorpcję białek do ścianek nanoporu. Cześć, nazywam się Dave Wicki. Jestem doktorantem w Katedrze Fizyki na Uniwersytecie Syrakuz.Choć metoda ta może dostarczyć informacji na temat adsorpcji białek na powierzchniach nieorganicznych, można ją również zastosować do innych układów, takich jak oddziaływania białek z kwasami nukleinowymi, spektroskopia pojedynczych cząsteczek oraz badanie cząsteczek w przestrzeniach ograniczonych. Rozpocznij od ustawienia napięcia przyspieszającego dla kolumny.Następnie wprowadź do uchwytu próbek TEM siatkę z okienkiem z azotku krzemu marki SPI. Oczyść siatkę plazmą tlenową przez 30 sekund, aby usunąć zanieczyszczenia. Przed załadowaniem próbki, umieść uchwyt w TEM i poczekaj na odpompowanie próżni.Korzystając z trybu TEM w polu jasnym, zlokalizuj okno azotkowe, które widoczne jest jako jasny kwadrat na surowym programie. Upewnij się, że TEM jest odpowiednio wyrównany. Następnie ustaw wyrównanie i ostrość próbki.Następnie przełącz system w tryb STEM i użyj detektora hot off do obrazowania próbki oraz sprawdzenia jej wyrównania. Ustaw monochromator, jeśli jest obecny, na niską wartość, aby zapewnić wyższy prąd elektronów dostępny do wiercenia. Wybierz odpowiednią wielkość plamki (spot size) do wykonania nanoporu, bazując na średnicy wiązki elektronów.Po ustawieniu trzpienia w linii, należy użyć BROGRAM-u, aby precyzyjnie ustawić ostrość na membranie azotkowej przy wymaganym powiększeniu. W przypadku jakiegokolwiek ruchu próbki należy wyłączyć wiązkę elektronów i odczekać, aż próbka się ustabilizuje.Proces ten może potrwać do godziny. Po stabilizacji umieść sondę elektronową na próbce i rozpocznij wiercenie nanopora. Wiercenie nanopora za pomocą TM wymaga cierpliwości i precyzji.Jest to proces, w którym azotek jest stopniowo usuwany pod wpływem wiązki elektronów. Ważne jest, aby trzymać sondę elektronową bezpośrednio nad miejscem wiercenia i potwierdzić, że nanopor został całkowicie przewiercony. Przed wyjęciem próbki z TEM należy okresowo sprawdzać próbkę, skanując ją detektorem hot off.Jeśli próbka lekko się przesuwa, skoryguj pozycję sondy elektronowej tak, aby znajdowała się nad nanoporem. Po ustawieniu ostrości na gram ROI mieniąca się warstwa azotku zniknie. Gdy nanopor utworzy się przy rozregulowanym gramie roky, widoczna będzie postrzępiona krawędź.Wykonaj obraz nanopora przy wyłączonym podgrzewaniu, a następnie stwórz profil intensywności tego obrazu. Średnicę nanopora można oszacować na podstawie najciemniejszego obszaru profilu. W razie potrzeby do powiększenia nanopora można użyć wiązki elektronów.Gdy osiągnie wymaganą średnicę, przełącz urządzenie w tryb TEM z monochromatorem w ustawieniu standardowym. Użyj TEM w polu jasnym, aby potwierdzić rozmiar porów.Zacznij od przygotowania odgazowanego roztworu soli fizjologicznej. Poddaj roztwór działaniu próżni oraz sonikacji w kąpieli przez 20 minut. Ostrożnie umieść delikatny chip z azotkiem krzemu zawierający nanopory w zlewce Pyrex o pojemności 10 mililitrów. Następnie, w dygestorium, postaw zlewkę na płycie grzewczej.Bardzo dokładnie oczyść chip Nanopore roztworem piranha. Najpierw, za pomocą pipety szklanej, dodaj do pojemnika 3 mL kwasu siarkowego. Następnie ostrożnie dodaj 1 mL stężonego nadtlenku wodoru do kwasu siarkowego.Należy zachować wszelkie środki ostrożności. Pozostawić chip nanoporowy do namoczenia na 10 minut. Następnie, używając pipety szklanej, usunąć roztwór piranha z zlewki i zutylizować go w odpowiedni sposób.Następnie napełnij zlewkę odgazowaną wodą dejonizowaną. Za pomocą czystej pipety szklanej opróżnij zlewkę z wody i powtórz to płukanie co najmniej pięć razy. Czystą pęsetą wyjmij chip nanoporowy i osusz go za pomocą lekkiego ssania.Po wyschnięciu natychmiast zamknij chip nanoporowy w komorze. Chip można zabezpieczyć w komorze za pomocą uszczelek typu O-ring lub uszczelniacza silikonowego. Wypełnij komorę roztworem chlorku potasu.Podłącz elektrody srebrowe i srebrowo-chlorkowe do komory. Elektrody można przygotować, mocząc drut srebrowy w wybielaczu przez noc. Przyłóż potencjał transmembranowy pomiędzy elektrodami i monitoruj odpowiedź prądową przy użyciu wzmacniacza patch-clamp.W trybie clamp napięciowy (voltage clamp) należy na podstawie pomiarów wyznaczyć krzywą zależności prądu od napięcia. Krzywa ta powinna być wysoce liniowa. Przy zastosowaniu jednomolarnego chlorku potasu przewodnictwo nanoporu powinno odpowiadać jego średnicy.Jeśli nanopor nie wykazuje liniowej krzywej IV, oznacza to, że przewodność jest zbyt niska lub prąd otwarty nanoporu jest niestabilny. Wskazuje to na niewłaściwe osadzenie nanoporu, co wymaga ponownego przeprowadzenia płukania piha. Niezbędne jest upewnienie się, że wewnątrz nanoporu znajduje się ciecz.Jeśli ten etap nie zostanie przeprowadzony prawidłowo, prąd jonowy przepływający przez nanopor wykaże bardzo wysoki poziom szumów, a stopień wnikania białek do nanoporu zostanie drastycznie ograniczony. Należy rozpocząć od dodania oczyszczonej próbki badanego białka do uziemionej kąpieli w komorze. Następnie należy odczekać, aż próbka całkowicie dyfunduje.Zastosuj napięcie polaryzacyjne potencjału błonowego o polarności przeciwnej do całkowitego ładunku badanego białka. Przyłożony potencjał rzędu 200 mV powinien być wystarczający do przeprowadzenia obserwacji. Większość zdarzeń związanych z analizowanymi białkami objawi się jako przejściowe odchylenia prądu od linii bazowej.Jeśli nie zaobserwowano sygnału, należy zwiększyć stężenie białka w komorze. Wyższe napięcia poprawiają stosunek sygnału do szumu i przewodność azotku. Nanopory mogą wytrzymać napięcie rzędu kilku woltów.Absorpcja białek będzie objawiać się jako trwałe zmiany prądu bazowego nanoporu. Typowe wyniki dla nanoporów w stanie stałym będą wyglądać następująco. Prąd otwartego pory powinien być wysoce stabilny.Charakterystyki prądowo-napięciowe (IV) nanoporu powinny być wysoce liniowe. W roztworze 1 M chlorku potasu i 10 M fosforanu potasu o pH 7.4, nachylenie dopasowania liniowego do krzywej IV pozwoli wyznaczyć przewodność jednostkową nanoporu. Przewodność jest bezpośrednio powiązana z średnicą nanoporu i powinna być zgodna z równaniem.Wartość ta powinna być zgodna z dokładnością do 30%. Jeśli wartość jest zbyt mała, prawdopodobnie por nie został zablokowany po dodaniu białka. Szybkie zdarzenia powinny nastąpić po absorpcji białka, która objawia się jako długotrwały spadek prądu. Niektóre białka są wysoce labilne i ulegają przekształceniom strukturalnym wewnątrz poru.W tym przypadku długotrwały spadek napięcia będzie temu towarzyszył gwałtownym fluktuacjom. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak wytwarzać nanopory w stanie stałym przy użyciu transmisyjnego mikroskopu elektronowego z rastrowaniem oraz jak wykorzystywać je do adsorpcji białka SA. Pamiętaj, że praca z roztworem piraniny może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas przeprowadzania tej procedury zawsze należy przestrzegać środków ostrożności, takich jak praca w dygestorium z użyciem rękawiczek, fartucha laboratoryjnego oraz fartucha chemicznego.Dziękujemy za obejrzenie materiału i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

monitoring-protein-adsorption-with-solid-state-nanopores

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Monitorowanie adsorpcji białka za pomocą nanoporów w stanie stałym

Ten film opisuje technikę powierzchniowego rezonansu plazmonowego, czyli SPR, do badania interakcji między dwiema cząsteczkami za pomocą chipa czujnika. Zmiana kąta rezonansu i natężenie odbitego światła są wykrywane jako funkcja asocjacji i dysocjacji dwóch cząsteczek, a to dostarcza informacji o oddziaływaniach między dwiema cząsteczkami.

Powierzchniowy rezonans plazmonów do badania oddziaływań biomolekularnych za pomocą chipa czujnika

Przedstawiono metodologię przygotowania nanoporów w stanie stałym w roztworze do eksperymentów z translokacją biomolekularną. Stosując krótkie impulsy o silnym polu elektrycznym, średnica nanoporów może być kontrolowana z subnanometryczną precyzją, a jej charakterystyka szumu elektrycznego znacznie się poprawia. Procedura ta jest wykonywana in situ przy użyciu standardowego sprzętu laboratoryjnego w warunkach eksperymentalnych.

Dostrajanie rozmiaru i minimalizowanie szumów nanoporów w stanie stałym

Powierzchniowy rezonans plazmonowy (SPR) to bezznacznikowa metoda wykrywania interakcji biomolekularnych w czasie rzeczywistym. W niniejszym artykule opisano protokół eksperymentu interakcji białko błona / receptor, omawiając jednocześnie zalety i wady tej techniki.

Pomiary w czasie rzeczywistym interakcji białko-receptor błonowy przy użyciu powierzchniowego rezonansu plazmonowego (SPR)

Prezentowany protokół opisuje analizę transportu za pośrednictwem białka błonowego na poziomie pojedynczego transportera przy użyciu dwuwarstw lipidowych bez rozpuszczalników rozciągających się na pore. Osiągnięto to poprzez stworzenie masowo produkowanych chipów z matrycami nanoporowymi, w połączeniu z wysoce równoległym pozyskiwaniem i analizą danych, co umożliwi w przyszłości tworzenie badań przesiewowych efektorów białek błonowych.

Procesy transportu błonowego analizowane przez wysoce równoległy system chipów nanoporowych w rozdzielczości pojedynczego białka

Tutaj używamy poliuretanowego przestrajalnego nanopora zintegrowanego z techniką rezystancyjnego wykrywania impulsów, aby scharakteryzować chemię powierzchni nanocząstek poprzez pomiar prędkości translokacji cząstek, które mogą być użyte do określenia potencjału zeta poszczególnych nanocząstek.

Oznaczanie potencjału Zeta za pomocą prędkości translokacji nanocząstek przez przestrajalne nanopory: na przykładzie cząstek zmodyfikowanych DNA

Przedstawiono tutaj proces produkcji mikroprocesorów, który wykorzystuje plazmoniczną pęsetę. Mikroczip umożliwia obrazowanie uwięzionej cząstki w celu zmierzenia maksymalnych sił wychwytywania.

Pułapkowanie plazmoniczne i uwalnianie nanocząstek w środowisku monitorowania

Proteazy są ściśle regulowanymi enzymami zaangażowanymi w podstawowe procesy biologiczne, a rozregulowana aktywność proteazy napędza postęp złożonych chorób, takich jak rak. Celem tej metody jest stworzenie nanoczujników, które mierzą aktywność proteazy in vivo, wytwarzając sygnał rozszczepienia, który jest wykrywalny w moczu gospodarza i dyskryminuje chorobę.

Nanoczujniki do wykrywania aktywności proteazy in vivo w diagnostyce nieinwazyjnej

Tutaj prezentujemy protokół do wykrywania dyskretnych klastrów tlenu metali, polioksometalanów (POM), na granicy pojedynczej cząsteczki za pomocą biologicznej platformy elektronicznej opartej na nanoporach. Metoda ta stanowi komplementarne podejście do tradycyjnych narzędzi chemii analitycznej stosowanych w badaniu tych cząsteczek.

Charakterystyka fizyczna pojedynczych nanocząstek metalicznych w wysokiej rozdzielczości

Tutaj prezentujemy protokół wytwarzania bezprzewodowej elektrody nanoporowej typu zamkniętego i późniejszego elektrochemicznego pomiaru zderzeń pojedynczych nanocząstek.

Bezprzewodowa elektroda nanoporowa typu zamkniętego do analizy pojedynczych nanocząstek

Pierwszym krokiem do zrozumienia interakcji biomolekuła z nieorganiczną fazą stałą jest odkrycie podstawowych stałych fizykochemicznych, które mogą być oceniane poprzez ustalenie izoterm adsorpcji. Adsorpcja w fazie ciekłej jest ograniczona przez kinetykę, pojemność powierzchniową, pH i adsorpcję konkurencyjną, które należy ostrożnie rozważyć przed rozpoczęciem eksperymentu adsorpcji.

Badanie adsorpcji krótkich peptydów na zdyspergowanych nanocząstkach nieorganicznych w roztworze metodą zubożenia

Plazmoniczne pęsety wykorzystują zlokalizowany powierzchniowy rezonans plazmonów w nanostrukturach złota, aby uwięzić pojedyncze nanocząsteczki, w tym białka, w polu optycznym o skali nanometrowej. Zmiany w rozproszonym sygnale ujawniają obecność białka i dynamikę konformacyjną, umożliwiając monitorowanie bez modyfikacji fluoroforu lub wiązania powierzchni.

Monitorowanie dynamiki konformacyjnej pojedynczych niemodyfikowanych białek za pomocą plazmonicznej pęsety

Poznaj metodę wytwarzania nanoporów w membranach azotku krzemu i monitorowania adsorpcji białek na poziomie pojedynczych cząsteczek. Technika impulsów rezystancyjnych umożliwia bezetykietową detekcję w czasie rzeczywistym.

Monitorowanie adsorpcji białek za pomocą nanoporów w stanie stałym

Przeglądaj więcej filmów