Monitorowanie adsorpcji białek za pomocą nanoporów w stanie stałym

Ogólnym celem niniejszej procedury jest stworzenie nanoporów w membranach sztucznych do wykorzystania w badaniach nad absorpcją białek. Cel ten osiąga się poprzez wiercenie nanoporów w membranie azotkowej przy użyciu stempla. Następnie nanopor zostaje umieszczony w komorze i zwilżony roztworem jonowym.

Dzięki temu ciecz tworzy mostek od jednej strony nanoporu do drugiej, przygotowując nanopor do eksperymentów. Przez nanopor przykłada się napięcie, co pozwala na zaobserwowanie przepływu prądu jonowego. Ostatnim krokiem jest dodanie białka do komory nanoporu.

Ostatecznie obserwacja długotrwałych blokad prądu jonowego w nanoporze ujawnia adsorpcję białek do ścianek nanoporu. Cześć, nazywam się Dave Wicki. Jestem doktorantem w Katedrze Fizyki na Uniwersytecie Syrakuz.

Choć metoda ta może dostarczyć informacji na temat adsorpcji białek na powierzchniach nieorganicznych, można ją również zastosować do innych układów, takich jak oddziaływania białek z kwasami nukleinowymi, spektroskopia pojedynczych cząsteczek oraz badanie cząsteczek w przestrzeniach ograniczonych. Rozpocznij od ustawienia napięcia przyspieszającego dla kolumny.

Następnie wprowadź do uchwytu próbek TEM siatkę z okienkiem z azotku krzemu marki SPI. Oczyść siatkę plazmą tlenową przez 30 sekund, aby usunąć zanieczyszczenia. Przed załadowaniem próbki, umieść uchwyt w TEM i poczekaj na odpompowanie próżni.

Korzystając z trybu TEM w polu jasnym, zlokalizuj okno azotkowe, które widoczne jest jako jasny kwadrat na surowym programie. Upewnij się, że TEM jest odpowiednio wyrównany. Następnie ustaw wyrównanie i ostrość próbki.

Następnie przełącz system w tryb STEM i użyj detektora hot off do obrazowania próbki oraz sprawdzenia jej wyrównania. Ustaw monochromator, jeśli jest obecny, na niską wartość, aby zapewnić wyższy prąd elektronów dostępny do wiercenia. Wybierz odpowiednią wielkość plamki (spot size) do wykonania nanoporu, bazując na średnicy wiązki elektronów.

Po ustawieniu trzpienia w linii, należy użyć BROGRAM-u, aby precyzyjnie ustawić ostrość na membranie azotkowej przy wymaganym powiększeniu. W przypadku jakiegokolwiek ruchu próbki należy wyłączyć wiązkę elektronów i odczekać, aż próbka się ustabilizuje.

Proces ten może potrwać do godziny. Po stabilizacji umieść sondę elektronową na próbce i rozpocznij wiercenie nanopora. Wiercenie nanopora za pomocą TM wymaga cierpliwości i precyzji.

Jest to proces, w którym azotek jest stopniowo usuwany pod wpływem wiązki elektronów. Ważne jest, aby trzymać sondę elektronową bezpośrednio nad miejscem wiercenia i potwierdzić, że nanopor został całkowicie przewiercony. Przed wyjęciem próbki z TEM należy okresowo sprawdzać próbkę, skanując ją detektorem hot off.

Jeśli próbka lekko się przesuwa, skoryguj pozycję sondy elektronowej tak, aby znajdowała się nad nanoporem. Po ustawieniu ostrości na gram ROI mieniąca się warstwa azotku zniknie. Gdy nanopor utworzy się przy rozregulowanym gramie roky, widoczna będzie postrzępiona krawędź.

Wykonaj obraz nanopora przy wyłączonym podgrzewaniu, a następnie stwórz profil intensywności tego obrazu. Średnicę nanopora można oszacować na podstawie najciemniejszego obszaru profilu. W razie potrzeby do powiększenia nanopora można użyć wiązki elektronów.

Gdy osiągnie wymaganą średnicę, przełącz urządzenie w tryb TEM z monochromatorem w ustawieniu standardowym. Użyj TEM w polu jasnym, aby potwierdzić rozmiar porów.

Zacznij od przygotowania odgazowanego roztworu soli fizjologicznej. Poddaj roztwór działaniu próżni oraz sonikacji w kąpieli przez 20 minut. Ostrożnie umieść delikatny chip z azotkiem krzemu zawierający nanopory w zlewce Pyrex o pojemności 10 mililitrów. Następnie, w dygestorium, postaw zlewkę na płycie grzewczej.

Bardzo dokładnie oczyść chip Nanopore roztworem piranha. Najpierw, za pomocą pipety szklanej, dodaj do pojemnika 3 mL kwasu siarkowego. Następnie ostrożnie dodaj 1 mL stężonego nadtlenku wodoru do kwasu siarkowego.

Należy zachować wszelkie środki ostrożności. Pozostawić chip nanoporowy do namoczenia na 10 minut. Następnie, używając pipety szklanej, usunąć roztwór piranha z zlewki i zutylizować go w odpowiedni sposób.

Następnie napełnij zlewkę odgazowaną wodą dejonizowaną. Za pomocą czystej pipety szklanej opróżnij zlewkę z wody i powtórz to płukanie co najmniej pięć razy. Czystą pęsetą wyjmij chip nanoporowy i osusz go za pomocą lekkiego ssania.

Po wyschnięciu natychmiast zamknij chip nanoporowy w komorze. Chip można zabezpieczyć w komorze za pomocą uszczelek typu O-ring lub uszczelniacza silikonowego. Wypełnij komorę roztworem chlorku potasu.

Podłącz elektrody srebrowe i srebrowo-chlorkowe do komory. Elektrody można przygotować, mocząc drut srebrowy w wybielaczu przez noc. Przyłóż potencjał transmembranowy pomiędzy elektrodami i monitoruj odpowiedź prądową przy użyciu wzmacniacza patch-clamp.

W trybie clamp napięciowy (voltage clamp) należy na podstawie pomiarów wyznaczyć krzywą zależności prądu od napięcia. Krzywa ta powinna być wysoce liniowa. Przy zastosowaniu jednomolarnego chlorku potasu przewodnictwo nanoporu powinno odpowiadać jego średnicy.

Jeśli nanopor nie wykazuje liniowej krzywej IV, oznacza to, że przewodność jest zbyt niska lub prąd otwarty nanoporu jest niestabilny. Wskazuje to na niewłaściwe osadzenie nanoporu, co wymaga ponownego przeprowadzenia płukania piha. Niezbędne jest upewnienie się, że wewnątrz nanoporu znajduje się ciecz.

Jeśli ten etap nie zostanie przeprowadzony prawidłowo, prąd jonowy przepływający przez nanopor wykaże bardzo wysoki poziom szumów, a stopień wnikania białek do nanoporu zostanie drastycznie ograniczony. Należy rozpocząć od dodania oczyszczonej próbki badanego białka do uziemionej kąpieli w komorze. Następnie należy odczekać, aż próbka całkowicie dyfunduje.

Zastosuj napięcie polaryzacyjne potencjału błonowego o polarności przeciwnej do całkowitego ładunku badanego białka. Przyłożony potencjał rzędu 200 mV powinien być wystarczający do przeprowadzenia obserwacji. Większość zdarzeń związanych z analizowanymi białkami objawi się jako przejściowe odchylenia prądu od linii bazowej.

Jeśli nie zaobserwowano sygnału, należy zwiększyć stężenie białka w komorze. Wyższe napięcia poprawiają stosunek sygnału do szumu i przewodność azotku. Nanopory mogą wytrzymać napięcie rzędu kilku woltów.

Absorpcja białek będzie objawiać się jako trwałe zmiany prądu bazowego nanoporu. Typowe wyniki dla nanoporów w stanie stałym będą wyglądać następująco. Prąd otwartego pory powinien być wysoce stabilny.

Charakterystyki prądowo-napięciowe (IV) nanoporu powinny być wysoce liniowe. W roztworze 1 M chlorku potasu i 10 M fosforanu potasu o pH 7.4, nachylenie dopasowania liniowego do krzywej IV pozwoli wyznaczyć przewodność jednostkową nanoporu. Przewodność jest bezpośrednio powiązana z średnicą nanoporu i powinna być zgodna z równaniem.

Wartość ta powinna być zgodna z dokładnością do 30%. Jeśli wartość jest zbyt mała, prawdopodobnie por nie został zablokowany po dodaniu białka. Szybkie zdarzenia powinny nastąpić po absorpcji białka, która objawia się jako długotrwały spadek prądu. Niektóre białka są wysoce labilne i ulegają przekształceniom strukturalnym wewnątrz poru.

W tym przypadku długotrwały spadek napięcia będzie temu towarzyszył gwałtownym fluktuacjom. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak wytwarzać nanopory w stanie stałym przy użyciu transmisyjnego mikroskopu elektronowego z rastrowaniem oraz jak wykorzystywać je do adsorpcji białka SA. Pamiętaj, że praca z roztworem piraniny może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas przeprowadzania tej procedury zawsze należy przestrzegać środków ostrożności, takich jak praca w dygestorium z użyciem rękawiczek, fartucha laboratoryjnego oraz fartucha chemicznego.

Dziękujemy za obejrzenie materiału i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.