Name: Utrwalanie perfuzji całego zwierzęcia u gryzoni (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-30T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Poznaj technikę utrwalania perfuzji całego zwierzęcia u szczurów z zachowaniem ciśnień fizjologicznych dla optymalnej prezervacji tkanki mózgowej. Metoda ta umożliwia przygotowanie próbek do immunohistochemii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Niniejsza praca została sfinansowana przez Center for Neural Communication Technology (CNCT), centrum zasobów P41 finansowane przez National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering (NIBIB, P41 EB002030) oraz wspierane przez National Institutes of Health (NIH).

1. Przygotowanie utrwalacza
(Patrz tabela Fiksatywy i bufory.)
2. Przygotowanie buforów perfuzyjnych
(Patrz tabela Utrwalacz i bufory.)
3. Przygotowanie aparatury i znieczulenia
<ol>
 <li>Używając kąpieli wodnej, podgrzej bufor perfuzyjny do 37 °C. Umieść zawór wylotowy w zlewce wypełnionej buforem. Napełnij strzykawkę 50 ml buforem i podłącz ją do drenu utrwalacza. Przepłucz dren wielokrotnie, wtłaczając i wycofując bufor.</li>
 <li>Oczyść linię buforem, aż do całkowitego usunięcia pęcherzyków powietrza z drenu. Dla sukcesu perfuzji kluczowe jest, aby w żadnej z linii nie było pęcherzyków powietrza.</li>
 <li>Zdejmij strzykawkę i podłącz pojemnik z 4% paraformaldehydem (w temperaturze pokojowej). Aby uniknąć powstania pęcherzyków powietrza na końcu drenu, uciśnij go podczas wprowadzania do pojemnika w taki sposób, aby kropla buforu wystawała z końca i stykała się z powierzchnią cieczy w pojemniku.</li>
 <li>Zamknij port wylotowy (koniec z igłą). Przekręć zawór buforu (niebieski) do tej samej pozycji co zawór utrwalacza (biały). Pozwoli to na przepływ wyłącznie z linii buforu.</li>
 <li>Otwórz port wylotowy i powtórz kroki od A1 do A3 w celu napełnienia linii buforu. Po usunięciu wszystkich pęcherzyków powietrza zamknij port wylotowy, zdejmij strzykawkę i podłącz pojemnik z buforem, dbając o to, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza do drenu.</li>
 <li>Przetestuj szczelność systemu i zdolność do utrzymania ciśnienia, pompując gumową gruszkę manometru. Normalnie występuje pewien opór wynikający ze sprężenia powietrza w systemie.</li>
 <li>Przygotuj narzędzia chirurgiczne w sposób umożliwiający łatwy dostęp. Napełnij igłę perfuzyjną buforem, aby wyeliminować możliwość wystąpienia pęcherzyków powietrza.</li>
 <li>Przed zabiegiem podaje się mieszaninę ketaminy i ksylazyny (do 80 mg/kg masy ciała ketaminy oraz 10 mg/kg masy ciała ksylazyny) drogą domięśniową (igła 27G i strzykawka 1 cc). W razie potrzeby w trakcie operacji podawane będą dodatkowe dawki środka znieczulającego, aby utrzymać chirurgiczną płaszczyznę znieczulenia.</li>
</ol>
4. Operacja perfuzji
<ol>
 <li>Gdy zwierzę osiągnie chirurgiczny poziom znieczulenia, umieść je na płytkiej tacy wypełnionej kruszonym lodem. (Do określenia głębokości znieczulenia zastosuj metodę reakcji na uciśnięcie palca u nogi. Zwierzę musi nie reagować przed kontynuacją procedury).</li>
 <li>Wykonaj boczne cięcie o długości 5-6 cm przez skórę i ścianę brzucha tuż poniżej klatki piersiowej. Ostrożnie oddziel wątrobę od przepony.</li>
 <li>Za pomocą zakrzywionych nożyczek tępych wykonaj niewielkie nacięcie w przeponie. Położenie i nacisk palca mogą ułatwić przecięcie przepony.</li>
 <li>Kontynuuj nacięcie przepony wzdłuż całej długości klatki piersiowej, aby odsłonić jamę opłucnową.</li>
 <li>Umieść zakrzywione nożyczki tępe wzdłuż jednej strony żeber, ostrożnie odsuwając płuca, i wykonaj cięcie przez klatkę piersiową aż do obojczyka. Wykonaj analogiczne cięcie po stronie przeciwległej.</li>
 <li>Podnosząc mostek, ostrożnie odetnij wszelkie tkanki łączące go z sercem. Zaciśnij końcówkę mostka za pomocą hemostatu i odsuń hemostat w stronę głowy. Przy prawidłowym wykonaniu grasica unosi się wraz z mostkiem, odsłaniając głównymi naczynia krwionośne.</li>
 <li>Za pomocą nożyczek irydowych wykonaj niewielkie nacięcie w tylnej części lewej komory.</li>
</ol>
<img alt="Proces sekcji szczura przedstawiający etapy dostępu do serca, schemat laboratoryjny, metoda badawcza." src="/files/ftp_upload/3564/3564step7.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3564/3564step7large.jpg" target="_blank"> Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy rysunek</a>.
<ol start="8">
 <li>Przećpijt przez naciętą komorę do aorty wstępującej tępo zakończoną lub oliwkową igłę perfuzyjną o rozmiarze 15G. Końcówka powinna być widoczna przez ścianę aorty i nie może sięgać łuku aorty, w miejscu rozgałęzienia tętnic ramiennych i szyjnych.</li>
 <li>Użyj kleszczyków hemostatycznych do zaciśnięcia serca, co unieruchomi igłę i zapobiegnie wyciekom. W razie potrzeby można użyć zmodyfikowanych kleszczyków hemostatycznych do zaciśnięcia aorty wokół końcówki igły (kleszczyki te pozostają na miejscu aż do rozpoczęcia sekcji, lecz dla przejrzystości zostaną pominięte na dalszych ilustracjach).</li>
 <li>Na koniec, za pomocą nożyczek irydowych, wykonaj nacięcie prawego przedsionka zwierzęcia, tworząc jak największy otwór wyjścia, tak aby nie uszkodzić aorty zstępującej. W tym momencie zwierzę jest gotowe do perfuzji.</li>
</ol>
5. Perfuzja
<ol>
 <li>Otwórz i podłącz port wylotowy do podstawy igły, dbając o to, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza.</li>
 <li>Szybko i równomiernie napompuj gruszkę manometru do ciśnienia 80 mm Hg. Utrzymuj to ciśnienie przez cały okres infuzji buforu. Uruchom stoper.</li>
 <li>Wyreguluj kąt nachylenia igły. Kąt igły ma kluczowe znaczenie dla osiągnięcia maksymalnego szybkości przepływu (zwróć uwagę na zmianę przepływu podczas regulacji kąta).</li>
 <li>Przełącz zawór buforu (niebieski), gdy bufor będzie prawie zużyty (200 ml). Płyn powinien być przejrzysty. Przejrzystość wątroby jest wskaźnikiem prawidłowej perfuzji. Na tym etapie wątroba powinna być przejrzysta. Odnotuj czas w dokumentacji.</li>
 <li>Drżenia związane z utrwalaniem powinny pojawić się w ciągu kilku sekund; należy to uznać za rzeczywisty czas utrwalenia. Odnotuj czas w dokumentacji.</li>
 <li>Ciśnienie można stopniowo zwiększać do maksymalnie 130 mm Hg 2, aby utrzymać stałą szybkość przepływu.</li>
 <li>Zamknij zawór wylotowy, gdy utrwalacz będzie prawie zużyty. Odnotuj czas zakończenia w dokumentacji.</li>
 <li>Na tym etapie szczur powinien być sztywny.</li>
 <li>Zużyta paraformaldehyd musi zostać zebrana i przechowywana do utylizacji zgodnie z przepisami Twojej instytucji.</li>
</ol>
6. Disekcja 4,11
<ol>
 <li>Odetnij głowę za pomocą nożyczek.</li>
 <li>Wykonaj cięcie w linii środkowej wzdłuż powłok od szyi do nosa i odsłoń czaszkę.</li>
 <li>Odetnij pozostałe mięśnie szyi, aby odsłonić podstawę czaszki; usuń wszelkie resztki mięśni za pomocą nożyczek lub kleszczy kostnych.</li>
 <li>Wprowadź ostrze nożyczek do tęczówek do foramen magnum po jednej stronie, ostrożnie przesuwając nożyczki wzdłuż wewnętrznej powierzchni czaszki.</li>
 <li>Następnie wykonaj cięcie sięgające do dystalnej krawędzi tylnej powierzchni czaszki. Wykonaj analogiczne cięcie po stronie przeciwległej. Użyj kleszczy kostnych, aby usunąć fragmenty czaszki wokół móżdżku.</li>
 <li>Ostrożnie przesuwaj nożyczki wzdłuż wewnętrznej powierzchni czaszki, prowadząc końcówkę od grzbietowego dystalnego tylnego rogu do dystalnej krawędzi czołowej czaszki, lekko unosząc ostrze podczas cięcia, aby zapobiec uszkodzeniu mózgu. Powtórz czynność po drugiej stronie.</li>
 <li>Za pomocą kleszczy kostnych oddziel powierzchnię grzbietową czaszki od mózgu. Przytnij również boki czaszki, używając kleszczy kostnych.</li>
 <li>Za pomocą szpatułki przetnij cebulki węchowe i połączenia nerwowe wzdłuż brzusznej powierzchni mózgu.</li>
 <li>Delikatnie oddziel mózg od głowy, odcinając za pomocą nożyczek do tęczówek wszelkie fragmenty opony twardej, które nadal łączą mózg z czaszką.</li>
 <li>Wyjmij mózg i umieść go w fiolce z utrwalaczem zawierającym ciecz o objętości co najmniej 10x większej niż objętość samego mózgu. Od czasu do czasu delikatnie potrząśnij fiolką.</li>
</ol>
7. Postutrwalanie i przechowywanie
<ol>
 <li>Pozostawić mózg w utrwalaczu na 24 godziny w temperaturze 4 °C, okazjonalnie delikatnie mieszając w sposób wirowy.</li>
 <li>Po 24 godzinach wypłukać mózg w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym, wymieniając medium 3 razy i za każdym razem delikatnie mieszając w sposób wirowy.</li>
 <li>Mózgi można następnie przechowywać w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym lub w HBHS z azotkiem sodu w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
8. Reprezentatywne wyniki
Wstępnym wskaźnikiem powodzenia perfuzji jest przejaśnienie kończyn, takich jak nos, uszy i łapy, oraz organów wewnętrznych, takich jak grasica i wątroba (IHC World). Makroskopowa ocena mózgu wykazuje naczynia krwionośne pozbawione krwi (wygląd od białego do bladożółtego). Będzie to widoczne również w przekrojach tkankowych przeznaczonych do barwienia i immunohistochemii. Ostatecznym wskaźnikiem wyniku perfuzji jest stan ultrastruktury w tkance.1,6,7,8
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Przygotowanie utrwalacza:</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Przygotowanie roztworu stokowego 8% paraformaldehydu</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>
 <ol>
 <li>Dodać 40 g Paraformaldehydu do 500 ml dH2O. Podgrzewać roztwór do 60- 65 °C przy ciągłym mieszaniu (nie przekraczać 65 °C, ponieważ może to negatywnie wpłynąć na powodzenie procedury immunohistochemicznej).</li>
 <li>Aby przejrzyć roztwór, zmniejszyć temperaturę i za pomocą zakraplacza dodać 2-3 ml 1,0 M NaOH.</li>
 <li>Przefiltrować i przechowywać w temperaturze 4 °C przez maksymalnie 1 miesiąc.</li>
 </ol>
 </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Przygotowanie 0,2 M buforu fosforanowego sodu, pH 7,4</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>
 <ol start="4">
 <li>W celu przygotowania roztworu stokowego jednowodorofosforanu sodu, dodać 27,8 g NaH2PO4* H2O do 1 L dH2O.</li>
 <li>W celu przygotowania roztworu stokowego dwuwodorofosforanu sodu, dodać 28,4 g Na2HPO4 do 1 L dH2O.</li>
 <li>Dodać 810 ml roztworu jednowodorofosforanu do 190 ml roztworu dwuwodorofosforanu.</li>
 </ol>
 </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Przygotowanie 4% utrwalacza na bazie paraformaldehydu</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>
 <ol start="7">
 <li>Zmieszać w równych częściach 8% roztwór stokowy paraformaldehydu oraz 0,2 M bufor fosforanowy sodu.</li>
 <li>Uwaga: utrwalacz ten najlepiej przygotować bezpośrednio przed użyciem, nie wcześniej niż 72 godziny przed procedurą.</li>
 </ol>
 </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Przygotowanie buforów do perfuzji i przechowywania:</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Przygotowanie soli fizjologicznej buforowanej fosforanowo (PBS), pH 7,4</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>
 <ol start="9">
 <li>1 L dH2O</li>
 <li>9 g NaCl</li>
 <li>144 mg KH2PO4</li>
 <li>795 mg Na2HPO4</li>
 <li>Sprawdzić pH</li>
 </ol>
 </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Roztwór Hanksa buforowany HEPES (HBHS) z azotkiem sodu, pH 7,4</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>
 <ol start="14">
 <li>990 ml dH2O</li>
 <li>7,5 g NaCl,</li>
 <li>0,3 g KCl</li>
 <li>0,06 g K H2PO4</li>
 <li>0,13 g Na2HPO4</li>
 <li>2 g Dekstrozy/Glukozy</li>
 <li>2,4 g 10 mm Hepes</li>
 <li>0,1 g MgCl2 6 cząsteczek dH2O</li>
 <li>0,05 g MgSO4 7 cząsteczek dH2O</li>
 <li>0,165 g CaCl2 2 cząsteczek dH2O</li>
 <li>90 mg NaN3</li>
 <li>Sprawdzić pH</li>
 </ol>
 </td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
Tabela 1. Przygotowanie utrwalacza i buforów.
<img alt="Schemat systemu perfuzji z manometrem, utrwalaczem i buforem dla procesu konserwacji tkanek." src="/files/ftp_upload/3564/3564fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Aparatura do perfuzji z opisanymi elementami.
<img alt="Schemat aparatu do perfuzji, przedstawiający przepływ utrwalacza i buforu, stosowanego do konserwacji tkanek." src="/files/ftp_upload/3564/3564fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Przygotowanie aparatu do perfuzji I. Należy zacząć od linii z utrwalaczem. Usunąć pęcherzyki powietrza z drenów i wypełnić je buforem, gwałtownie wtłaczając i odsysając bufor do strzykawki i przez linię. Zamknąć zawór przy igle. Umieścić linię z utrwalaczem w butelce z utrwalaczem, uważając, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza.
<img alt="Schemat systemu perfuzji cieczy, ustawienie buforu utrwalającego do przygotowania próbek biologicznych." src="/files/ftp_upload/3564/3564fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Przygotowanie aparatu do perfuzji II. 1. Otwórz zawór przy igle. 2. Przekręć zawór buforu (niebieski) do pozycji umożliwiającej przepływ. 3. Usunij pęcherzyki powietrza z drenu i wypełnij go buforem, szybko wypychając i zasysając bufor za pomocą strzykawki. 4. Zamknij zawór przy igle. Umieść dren w butelce z buforem. Sprawdź szczelność systemu, pompując gruszkę manometru i obserwując wskaźnik. Aparat jest teraz gotowy do procedury perfuzji.
<img alt="Schemat systemu utrwalania tkanek z utrwalaczem, butelkami z buforem i połączonymi rurkami do konfiguracji eksperymentalnej." src="/files/ftp_upload/3564/3564fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Aparatura do perfuzji w pozycji do podawania buforu.
<img alt="Schemat sekcji gryzonia przedstawiający kroki chirurgiczne w celu uzyskania dostępu do jamy klatki piersiowej i serca." src="/files/ftp_upload/3564/3564fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5. Operacja perfuzji I. a) Wykonaj nacięcie boczne przez powłoki skórne i ścianę brzucha. b) Wykonaj nacięcie przepony i przetnij ją w poprzek, odsłaniając serce. Wykonaj równoległe nacięcia po obu stronach żeber aż do obojczyka. c) Zaciśnij końcówkę mostka kleszczykami hemostatycznymi i odciągnij kleszczyki w stronę głowy.
<img alt="Technika chirurgiczna ekstrakcji serca gryzonia; schemat ilustrujący metodę sekcji." src="/files/ftp_upload/3564/3564fig6.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6. Operacja perfuzyjna II. a) Przełożyć igłę perfuzyjną przez przeciętą komorę do aorty wstępującej. b) Zabezpieczyć igłę perfuzyjną, używając jednego zestawu kleszczyków hemostatycznych do zaklemowania serca. Drugi zestaw zmodyfikowanych kleszczyków hemostatycznych można wykorzystać do zaklemowania aorty wokół końcówki igły, aby zapobiec wyciekowi. Za pomocą nożyczek irydowych wykonać niewielkie nacięcie w tylnej części lewej komory.
<img alt="Schemat metody perfuzji, konfiguracja utrwalacza i buforu dla eksperymentu przygotowania tkanek gryzoni." src="/files/ftp_upload/3564/3564fig7.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 7"> 
Rycina 7. Perfuzja buforem. Należy ścisnąć gruszkę manometru, aby wytworzyć ciśnienie w przewodzie. Otwórz zawór (1) i podłącz go do nasady igły. Kluczowe jest upewnienie się, że do układu nie dostały się pęcherzyki powietrza. Należy napompować gruszkę manometru do ciśnienia 80 mm Hg i utrzymywać tę wartość przez cały czas infuzji buforu.
<img alt="Schemat układu do perfuzji szczura; przepływ utrwalacza i buforu; eksperyment neurobiologiczny." src="/files/ftp_upload/3564/3564fig8.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 8"> 
Rycina 8. Perfuzja utrwalaczem. Gdy bufor jest prawie na wyczerpaniu (200 ml), należy przełączyć zawór buforu (1), aby umożliwić przepływ utrwalacza. Ciśnienie można stopniowo zwiększać do maksymalnie 130 mm Hg.
<img alt="Schemat sekcji szczura przedstawiający cięcia chirurgiczne." src="/files/ftp_upload/3564/3564fig9.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 9"> 
Rysunek 9. Sekcja I. a) usunięcie głowy za pomocą nożyczek. b) wykonanie nacięcia skóry wzdłuż linii środkowej od szyi do nosa i odsłonięcie czaszki. c) odcięcie pozostałych mięśni szyi w celu odsłonięcia podstawy czaszki. Należy trzymać głowę tak, aby otwór wielki w powierzchni czaszki (foramen magnum) był dostępny. Ostrym końcem nożyczek irydologicznych należy ostrożnie wprowadzić narzędzie do otworu wielkiego i wykonać cięcie. Tę samą czynność należy powtórzyć po stronie przeciwległej. Za pomocą kuretażu kostnego (rongeurs) należy usunąć fragmenty czaszki wokół móżdżku.
<img alt="Schemat embrionalnego rozwoju kraniofacjalnego przedstawiający zmiany morfologiczne w trzech etapach." src="/files/ftp_upload/3564/3564fig10.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 10"> 
Rysunek 10. Sekcja II. a) ostrożnie przesuń nożyczki wzdłuż wewnętrznej powierzchni czaszki. Podczas cięcia lekko unieś końcówkę nożyczek, aby zapobiec uszkodzeniu mózgu. Powtórz tę czynność po przeciwnej stronie. Użyj kleszczy kostnych, aby oddzielić czaszkę od mózgu. b) ilustracja z usuniętą czaszką i odsłoniętym mózgiem. c) za pomocą szpatułki przetnij cebulki węchowe i połączenia nerwowe w najbardziej przedniej części mózgu. Ostrożnie prowadź końcówkę szpatułki wzdłuż dolnej powierzchni mózgu, aby przeciąć połączenia i ułatwić jego usunięcie. Wyjmij mózg i umieść go w fiolce z utrwalaczem.

<ol><li>Cinar, O., Semiz, O., Can, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microscopic+survey+on+the+efficiency+of+well-known+routine+chemical+fixatives+on+cryosections%5BTitle%5D)+AND+%22Acta.+Histochem%22%5BJournal%5D)">A microscopic survey on the efficiency of well-known routine chemical fixatives on cryosections.</a> Acta. Histochem. 108, 487-496 (2006).</li>
<li>Fritz, M., Rinaldi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+pressure+measurement+with+the+tail-cuff+method+in+Wistar+and+spontaneously+hypertensive+rats%3A+Influence+of+adrenergic-+and+nitric+oxide-mediated+vasomotion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Toxicol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Blood pressure measurement with the tail-cuff method in Wistar and spontaneously hypertensive rats: Influence of adrenergic- and nitric oxide-mediated vasomotion.</a> J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 58, 215-221 (2008).</li>
<li>Ikeda, K., Nara, Y., Yamorii, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Indirect+systolic+and+mean+blood+pressure+determination+by+anew+tail+cuff+method+in+spontaneously+hypertensive+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Animals%22%5BJournal%5D)">Indirect systolic and mean blood pressure determination by anew tail cuff method in spontaneously hypertensive rats.</a> Laboratory Animals. 25, 26-29 (1991).</li>
<li>Jacobowitz, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removal+of+discrete+fresh+regions+of+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Removal of discrete fresh regions of rat brain.</a> Brain Res. 80, 111-115 (1974).</li>
<li>Jonkers, B. W., Sterk, J. C., Wouterlood, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcardial+perfusion+fixation+of+the+CNS+by+means+of+a+compressed-air-driven+device%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurosci.+Meth%22%5BJournal%5D)">Transcardial perfusion fixation of the CNS by means of a compressed-air-driven device.</a> Journal of Neurosci. Meth. 12, 141-149 (1984).</li>
<li>Jung-Hwa, T. ao-C. heng, Gallant, J., Brightman, P. E., Dosemeci, M. W., A,, Reese, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+changes+at+the+synapse+after+delayed+perfusion+fixation+in+different+regions+of+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Structural changes at the synapse after delayed perfusion fixation in different regions of the mouse brain.</a> J. Comp. Neurol. 501, 731-740 (2007).</li>
<li>Kasukurthi, R., Brenner, M. J., Morre, A. M., Moradzadeh, A., Wilson, Z. R., Santosa, K. B., Mackinnon, S. E., Hunter, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcardial+perfusion+versus+immersion+fixation+for+assessment+of+peripheral+nerve+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Meth%22%5BJournal%5D)">Transcardial perfusion versus immersion fixation for assessment of peripheral nerve regeneration.</a> J. Neurosci. Meth. 184, 303-309 (2009).</li>
<li>Lamberts, R., Goldsmith, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fixation%2C+fine+structure%2C+and+immunostaining+for+neuropeptides%3A+perfusion+versus+immersion+of+the+neuroendocrine+hypothalamus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Fixation, fine structure, and immunostaining for neuropeptides: perfusion versus immersion of the neuroendocrine hypothalamus.</a> J. Histochem. Cytochem. 34, 389-398 (1986).</li>
<li>Ramos-Vara, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technical+Aspects+of+Immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Vet.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Technical Aspects of Immunohistochemistry.</a> Vet. Pathol. 42, 405-426 (2005).</li>
<li>Shi, Z. R., Itzkowitz, S. H., Kim, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+three+immunoperoxidase+techniques+for+antigen+detection+in+colorectal+carcinoma+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">A comparison of three immunoperoxidase techniques for antigen detection in colorectal carcinoma tissues.</a> J. Histochem. Cytochem. 36, 317-322 (1988).</li>
<li>Walker, W. F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWalker%2C+WF+%22Vertebrate+dissection%22">Vertebrate dissection</a>. , Sixth Ed, W.B. Saunders Comp. Philadelphia. (1980).</li>
<li>Zwienenberg, M., Gong, Q., Lee, L. L., Berman, R. F., Lyeth, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((J.+Neurotrauma%5BTitle%5D)+AND+%22Monitoring+in+the+Rat%3A+Comparison+of+Monitoring+in+the+Ventricle%2C+Brain+Parenchyma%2C+and+Cisterna+Magna%22%5BJournal%5D)">J. Neurotrauma.</a> Monitoring in the Rat: Comparison of Monitoring in the Ventricle, Brain Parenchyma, and Cisterna Magna. 16, 1095-1102 (1999).</li>
</ol>

Autorzy nie zgłaszają żadnych konfliktów interesów.

Dodatkowe uwagi dla powodzenia zabiegu chirurgicznego: 
<ol>
<li>Po przebiciu przepony należy działać szybko, ponieważ hipoksja i hiperkapnia zainicjują nieodwracalne zmiany fizjologiczne, które mogą zakłócić późniejszą analizę.</li>
<li>Po wprowadzeniu i zaciśnięciu igły w miejscu wkłucia, ciśnienie resztkowe wypchnie krew do podstawy igły (tzw. flashback). W przypadku większych zwierząt może dojść do gwałtownego wyrzutu krwi. Kluczowe jest, aby krew dotarła przynajmniej do podstawy igły, aby uniknąć wprowadzenia pęcherzyków powietrza, które stanowiłyby przeszkodę w pełnej perfuzji. Jeśli u podstawy igły nie pojawi się krew, należy ją wyjąć i ponownie napełnić buforem, podłączając ją do portu wyjściowego zestawu do perfuzji. Po przepłukaniu końcówki buforem igłę można ponownie wprowadzić do serca.</li>
<li>Prawidłowe umieszczenie igły w aorcie jest krytyczne; nie powinna ona sięgać aż do łuku aorty.</li>
<li>W przypadku przeprowadzania wielu perfuzji nie ma potrzeby każdorazowego ustawiania wszystkiego od początku. Użytkownik musi zapewnić odpowiednią objętość buforu i utrwalacza w każdej butelce (200 ml na zwierzę/roztwór). Butelki można w razie potrzeby uzupełnić. Najważniejszym aspektem jest przepłukanie linii perfuzyjnej biegnącej od zestawu do zwierzęcia (zawór wyjściowy). Po zakończeniu perfuzji w linii tej znajduje się 4% paraformaldehyd. Należy wyjąć rurkę z butelki z buforem i użyć strzykawki 50 ml wypełnionej wodą, aby wypłukać utrwalacz. Należy upewnić się, że zawór wyjściowy znajduje się w zlewce na odpady w celu prawidłowej utylizacji paraformaldehydu. Czynność tę należy powtórzyć trzykrotnie. Następnie należy ponownie napełnić linię buforem, stosując metodę opisaną w punkcie 2.3.</li>
<li>Ta metoda utrwalania jest wysoce adaptowalna, z możliwością zmiany zarówno buforu, jak i utrwalacza na inne substancje utrwalające (np. te stosowane w EM) zgodnie z wymaganiami eksperymentu.</li>
<li>System jest również często wykorzystywany do pobierania żywej tkanki. W tym procesie stosuje się podawanie wyłącznie buforu (butelka z buforem, wciąż podłączona do całego systemu, zostaje umieszczona w pojemniku z lodem, a butelka z utrwalaczem pozostaje pusta, ale zamknięta). Zapewnia to perfuzję zimnym buforem przy optymalnym ciśnieniu. System ten można zaadaptować do infuzji barwników utrwalających, dodając barwnik bezpośrednio do buforu (jeśli ilość nie stanowi problemu) lub używając strzykawki z minimalną ilością roztworu bufor/barwnik pomiędzy etapem buforowania a utrwalania.</li>
<li>W przypadku odlewania naczyń krwionośnych etap monitorowania ciśnienia buforem jest kluczowy, jednak ze względu na lepkość i krzepnącą naturę roztworu odlewowego należy użyć strzykawki 50 ml do bezpośredniego podania lub jednorazowego dodatkowego elementu do aparatury (rurki, zawór i pojemnik utrzymujący) przystosowanego do współpracy z obecnym systemem. Odlewanie naczyń w naszym laboratorium poprzedzało zaprojektowanie i wykonanie aparatury do perfuzji. W związku z tym nie możemy stwierdzić, że pomiary ciśnienia będą dokładnym odzwierciedleniem wartości w miejscu podania. Wartości mogą wymagać korekty, aby uzyskać pomyślne podanie lepkich płynów.</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;silny&gt;Środek znieczulający:&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Mieszanina ketaminy i ksylazyny (środek znieczulający może się różnić w zależności od laboratorium/instytucji)</td><td>Ketaset</td><td>NDC 0856-2013-01</td><td>fiolka 10 ml</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;silny&gt;Chirurgia:&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Końcówka igły, 27 GA x 1,25&quot;</td><td>Usługi Materiałowe</td><td>25251</td><td></td></tr><tr><td>Duże nożyczki tępe/tępozakrzywione (~14,5 cm)</td><td>Fine Science Tools</td><td>14519-14</td><td></td></tr><tr><td>Proste nożyczki irydologiczne</td><td>Fine Science Tools</td><td>14058-11</td><td></td></tr><tr><td>Standardowe pęsety</td><td>Fine Science Tools</td><td>11027-12</td><td></td></tr><tr><td>Para pęsety precyzyjnej (Graefe)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11050-10</td><td></td></tr><tr><td>1 duże kleszczyki hemostatyczne – zakrzywione lub proste (~19 cm)</td><td>surgicaltools.com</td><td>17.21.51</td><td></td></tr><tr><td>2 standardowe kleszczyki hemostatyczne – proste, ząbkowane (14 cm)</td><td>Fine Science Tools</td><td>13013-14</td><td></td></tr><tr><td>1 zmodyfikowany zacisk hemostatyczny (z otworem o rozmiarze 15G wykonanym w końcówce)</td><td>Fine Science Tools</td><td>13013-14</td><td></td></tr><tr><td>igła tępa lub z oliwnym zakończeniem o rozmiarze 15G (igła do perfuzji)</td><td>Fisnar</td><td>5601137</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;silny&gt;Perfuzja&lt;/strong&gt;:</td></tr><tr><td>System HyPerFusion lub odpowiednik</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sroztwór soli fosforowej (PBS), pH 7,4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4% paraformaldehyd w 0,1 M buforze fosforanowym, pH 7,4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Płytka tacka szklana lub plastikowa, ok. 10&quot; x 10&quot;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kruszony lód</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kąpiel wodna (37 &amp;deg;C)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Timer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>strzykawka 50 ml</td><td>Medline Industries</td><td>NPMJD50LZ</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;silny&gt;Sekcja&lt;/strong&gt;:</td></tr><tr><td>Para standardowych prostych nożyczek ostrych/tępych (~12 cm)</td><td>Fine Science Tools</td><td>14054-13</td><td></td></tr><tr><td>Średnie kleszczyki kostne (rongeury) zakrzywione lub proste (14-16 cm) lub kleszczyki do usuwania kości czaszki</td><td>Fine Science Tools</td><td>16020-14</td><td></td></tr><tr><td>Proste nożyczki irydologiczne (~9 cm)</td><td>Fine Science Tools</td><td>14058-11</td><td></td></tr><tr><td>Mikroszpatułka (podwójna 2&quot; końce płaskie, jeden zaokrąglony, jeden zwężający się do 1/8&quot;)</td><td>Fine Science Tools</td><td>10091-12</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;silny&gt;Po utrwalaniu &amp;Przechowywanie:&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>fiolka szklana 50 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>40 ml roztworu Hanksa buforowanego HEPES-em (HBHS) z azotkiem sodu (90 mg/l)</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

perfuzyjna fiksacja całego organizmu gryzoni

Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents

Celem fiksacji jest szybkie i jednorodne utrwalenie tkanki w stanie zbliżonym do żywego organizmu. Choć bezpośrednie umieszczenie tkanki w utrwalaczu sprawdza się w przypadku małych fragmentów, większe preparaty, takie jak nienaruszony mózg, stanowią problem w przypadku fiksacji przez imersję, ponieważ utrwalacz nie dociera do wszystkich obszarów tkanki z tą samą prędkością 5,7. Często zmiany w odpowiedzi na hipoksję zaczynają się, zanim tkanka zostanie utrwalona 12. Przewagą bezpośredniej perfuzji utrwalacza przez układ krwionośny jest fakt, że substancja chemiczna może szybko dotrzeć do każdego zakątka organizmu, wykorzystując naturalną sieć naczyniową. Aby najskuteczniej wykorzystać układ krwionośny, należy zadbać o dostosowanie ciśnienia do wartości fizjologicznych 3. Należy zauważyć, że ciśnienia fizjologiczne zależą od wykorzystanego gatunku. Techniki fiksacji perfuzyjnej różnią się w zależności od utrwalanej tkanki oraz sposobu jej przetwarzania po fiksacji. W niniejszym filmie opisujemy niskokosztową, szybką, kontrolowaną i jednorodną procedurę fiksacji z użyciem 4% paraformaldehydu perfundowanego przez układ naczyniowy: przez serce szczura, aby uzyskać jak najlepsze utrwalenie mózgu do immunohistochemii. Główną zaletą tej techniki (w porównaniu z systemami grawitacyjnymi) jest najskuteczniejsze wykorzystanie układu krwionośnego.

W niniejszej pracy opisujemy tanią, szybką, kontrolowaną i jednorodną procedurę fiksacji z użyciem 4% paraformaldehydu podawanego przez perfuzję układu naczyniowego: poprzez serce szczura, aby uzyskać jak najlepszą konserwację mózgu.

Perfuzyjna fiksacja całego organizmu gryzoni

Celem utrwalania jest szybkie i jednorodne zachowanie tkanki w stanie zbliżonym do naturalnego. Chociaż bezpośrednie umieszczenie tkanki w utrwalaczu sprawdza się w przypadku małych...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zaprezentowanie naszej techniki fiksacji perfuzyjnej, która kładzie nacisk na wykorzystanie ciśnień fizjologicznych w celu prawidłowego utrwalenia tkanki mózgowej szczura do procedur immunohistochemicznych. W pierwszej kolejności zaprezentowano zastosowanie i konfigurację aparatury do perfuzji. Następnie przygotowano narzędzia niezbędne do przeprowadzenia zarówno zabiegu perfuzji, jak i wyjęcia mózgu, a głęboko znieczulone zwierzę umieszczono w płytkiej kuwecie wypełnionej kruszonym lodem.Pod klatką piersiową wykonuje się boczny nacięcie o długości od pięciu do sześciu centymetrów przez skórę i ścianę brzuszną. Po odsłonięciu serca przeprowadza się perfuzję zwierzęcia. Ostatnim krokiem jest usunięcie mózgu i umieszczenie go w fiolce z utrwalaczem w objętości płynu co najmniej 10-krotnie przekraczającej objętość samego mózgu.Ogólnym celem niniejszej procedury jest zaprezentowanie naszej techniki perfuzji utrwalającej, która kładzie nacisk na wykorzystanie ciśnień fizjologicznych w celu prawidłowego zakonserwowania tkanki mózgowej szczura do badań immunohistochemicznych. Rozpoczniemy od przygotowania zestawu do perfuzji. Zajmie to około 10 minut. Używając strzykawki o pojemności 50 ml, wielokrotnie przepłucz i oczyść linię utrwalacza buforem, aż do całkowitego usunięcia pęcherzyków powietrza.Dla sukcesu perfuzji kluczowe jest, aby w żadnej z linii nie było pęcherzyków powietrza. Osiąga się to poprzez umieszczenie zaworu wylotowego w zlewce wypełnionej buforem. Teraz zamknij zawór wylotowy.Następnie wyjmij probówkę ze strzykawki, ściskając ją tak, aby na końcu zawisła kropla buforu. Umieść wypełnioną rurkę, wkładając wlot utrwalacza do butelki zawierającej 200 mililitrów utrwalacza na bazie paraldehydu na jedno zwierzę. Należy przy tym uważać, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza.Dokręć zakrętkę, upewniając się, że uszczelka jest prawidłowo osadzona. Jeśli nie zostanie ona właściwie osadzona, ciśnienie w zamkniętym układzie nie zostanie utrzymane. Umieść butelkę w zestawie do perfuzji.Ustaw przepływ wyłącznie z linii buforowej, zamykając port wylotowy i obracając zawór buforu do tej samej pozycji co zawór utrwalacza. Otwórz port wylotowy i przepłucz linię buforową w taki sam sposób, jak zrobiono to wcześniej dla linii utrwalacza. Po oczyszczeniu linii umieść rurkę w butelce z buforem.Następnie należy sprawdzić szczelność układu. Podczas pompowania gumowej gruszki manometru odczuwalny będzie opór. Jako końcowy etap przygotowania.Napełnij igłę perfuzyjną buforem, aby zapobiec wprowadzeniu pęcherzyków powietrza. System jest teraz gotowy do perfuzji. Po podaniu mieszaniny ketaminy i ksylazyny oraz potwierdzeniu głębokości znieczulenia chirurgicznego za pomocą metody ucisku palca u stopy, umieść całkowicie znieczulonego szczura na płytkiej tacy wypełnionej kruszonym lodem.Nie kontynuuj procedury, dopóki zwierzę nie zostanie w pełni znieczulone. Operację rozpocznij od wykonania bocznego nacięcia o długości od pięciu do sześciu centymetrów przez powłoki skórne i ścianę brzucha, tuż poniżej klatki piersiowej. Ostrożnie oddziel wątrobę od przepony.Za pomocą zakrzywionych nożyc tępych wykonaj małe nacięcie w przeponie. Położenie i nacisk palca mogą ułatwić przecięcie przepony. Kontynuuj nacinanie przepony wzdłuż całej długości klatki piersiowej, aby odsłonić jamę opłucnej.Umieść zakrzywione nożyce tępym końcem wzdłuż jednej strony żeber, ostrożnie odsuwając płuca i wykonaj cięcie przez klatkę piersiową aż do obojczyka. Następnie wykonaj podobne cięcie po stronie przeciwległej. Teraz unieś mostek i ostrożnie odetnij wszelkie tkanki łączące go z sercem.Zaciśnij końcówkę mostka za pomocą kleszczyków hemostatycznych i odsuń kleszczyki w stronę głowy. Klatka piersiowa powinna się unieść, zapewniając wyraźny widok na główne naczynia krwionośne. Używając nożyczek irydowych, wykonaj małe nacięcie w tylnej części lewej komory.Przez naciętą komorę wprowadź do aorty wstępującej igłę perfuzyjną o rozmiarze 15 G z tępym lub oliwnym zakończeniem. Końcówka igły powinna być widoczna przez ścianę aorty i nie może sięgać łuku aorty w miejscu rozgałęzienia tętnic ramiennych i szyjnych. Aby unieruchomić igłę i zapobiec wyciekom, zaciśnij serce kleszczykiem hemostatycznym.Na koniec, za pomocą nożyczek irydowych, wykonaj szeroki otwór w prawym przedsionku. Należy uważać, aby nie uszkodzić aorty zstępującej. W tym momencie zwierzę jest gotowe do perfuzji.Podłącz igłę perfuzyjną w prawym przedsionku do portu wylotowego, unikając wprowadzenia pęcherzyków powietrza, a następnie otwórz port wylotowy. Następnie szybko i równomiernie napompuj gruszkę manometru do ciśnienia 80 mmHg. Utrzymuj to ciśnienie przez cały okres infuzji buforu.Teraz należy uruchomić stoper. Dostosować kąt igły tak, aby przepływ był najsilniejszy, a gdy bufor będzie prawie zużyty, przełączyć zawór buforu. Ciecz stanie się przejrzysta, gdy wątroba zostanie upłyniona.Jest to oznaka prawidłowej perfuzji, a czas oczyszczenia wątroby powinien zostać odnotowany bardzo szybko. Po tym zdarzeniu zaobserwowane zostaną drżenia fiksacyjne. Należy wskazać ten moment jako czas rzeczywistej fiksacji. Aby utrzymać stałą prędkość przepływu, ciśnienie można stopniowo zwiększać do maksymalnie 130 mmHg.Gdy utrwalacz zostanie niemal całkowicie zużyty, zamknij zawór wylotowy i zanotuj godzinę. Szczur powinien być teraz sztywny. Można teraz przystąpić do pobrania organów szczura. Aby usunąć mózg, rozpocznij sekcję utrwalonego szczura od odcięcia głowy za pomocą gilotyny.Następnie wykonaj nacięcie w linii pośrodkowej wzdłuż powłok od szyi do nosa i odsłoń czaszkę za pomocą nożyczek chirurgicznych. Odetnij pozostałą tkankę mięśniową szyi, aby odsłonić podstawę czaszki. Wprowadź ostrze nożyczek irydowych do otworu wielkiego (foramen magnum) po jednej stronie, ostrożnie przesuwając nożyczki wzdłuż wewnętrznej powierzchni czaszki.Następnie wykonaj nacięcie sięgające dystalnej krawędzi tylnej powierzchni czaszki. Wykonaj analogiczne nacięcie po stronie przeciwległej. Następnie za pomocą kleszczyków typu theros usuń fragmenty czaszki wokół móżdżku.Ostrożnie przesuń końcówkę nożyczek wzdłuż wewnętrznej powierzchni czaszki od grzbietowego dystalnego tylnego rogu do dystalnej krawędzi czołowej. Unikaj uszkodzenia mózgu poprzez podważanie końcówką ostrza. Podczas tego procesu powtórz tę czynność, wykonując cięcie po przeciwnej stronie.Następnie, używając pęset, oddziel powierzchnię grzbietową czaszki od mózgu. Odetnij również boki czaszki, korzystając z pęset. Teraz, za pomocą szpatułki, przetnij opuszki węchowe i połączenia nerwowe wzdłuż powierzchni brzusznej mózgu, a następnie ostrożnie oddziel mózg od głowy.Za pomocą nożyczek irydowych przetnij wszelką oponę twardą łączącą mózg z czaszką. Po usunięciu mózgu umieść go w fiolce z utrwalaczem, którego objętość jest co najmniej 10 razy większa od objętości samego mózgu. Przechowuj fiolkę w temperaturze 4 °C przez 24 godziny.Po 24 godzinach przemyć mózg PBS 3 razy, delikatnie obracając naczyniem. Następnie mózg można przechowywać w PBS lub roztworze Hanksa. Z dodatkiem azotku sodu, w temperaturze 4 °C, mózgi mogą być przechowywane przez trzy miesiące.Nieprzecięte. Po opanowaniu techniki cała perfuzja mogła zostać zakończona w czasie od pięciu do ośmiu minut.

whole-animal-perfusion-fixation-for-rodents

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Całkowita Perfuzyjna Fiksacja Zwierząt dla Gryzoni

Ten film opisuje procedurę perfuzji wątroby myszy przez żyłę wrotną za pomocą roztworu kolagenazy przed izolacją komórek wątroby.

Perfuzja wątroby myszy in vivo: metoda podawania roztworu do wątroby gryzoni przez żyłę wrotną

Tutaj prezentujemy histologiczną metodę przechwytywania, znakowania, optycznego oczyszczania i obrazowania nienaruszonego interfejsu tkanki mózgowej wokół przewlekle wszczepionych mikrourządzeń w tkance mózgowej gryzoni.  Wyniki technik obejmujących tę metodę są przydatne do zrozumienia wpływu różnych penetrujących implantów mózgowych na otaczające je tkanki.

Nienaruszona charakterystyka histologiczna mikrourządzeń z implantami do mózgu i otaczających tkanek

Tutaj prezentujemy test przepuszczalności naczyń krwionośnych mózgu myszy za pomocą dootrzewnowego wstrzykiwania znaczników fluorescencyjnych, a następnie perfuzji, który ma zastosowanie do zwierzęcych modeli dysfunkcji bariery krew-mózg. Jedna półmózg służy do ilościowej oceny przepuszczalności, a druga do wizualizacji znacznika/barwienia immunologicznego. Zabieg trwa 5 - 6 godzin dla 10 myszy.

Test przepuszczalności bariery krew-mózg in vivo u myszy przy użyciu znaczników znakowanych fluorescencyjnie

Tutaj prezentujemy dwie nowatorskie metodologie, psPACT i mPACT, do osiągnięcia maksymalnej przezroczystości optycznej i późniejszej mikroskopowej analizy unaczynienia tkanek w nienaruszonym całym OUN gryzonia.

Nowatorskie metody pasywnego oczyszczania do szybkiego wytwarzania przezroczystości optycznej w całej tkance OUN

Ten artykuł opisuje prostą metodę przygotowania mózgów małych zwierząt do obrazowania mikro-CT, w którym zmiany chorobowe mogą być określane ilościowo, a elektrody lokalizowane z dużą precyzją w kontekście całego mózgu.

Metoda oparta na mikrotomografii komputerowej do charakteryzowania zmian chorobowych i lokalizacji elektrod w mózgach małych zwierząt

Protokół jest opisany dla perfuzji in situ dolnej części ciała myszy, w tym pęcherza, prostaty, narządów płciowych, kości, mięśni i skóry stóp.

Ustalanie in situ perfuzji w obiegu zamkniętym dolnych narządów jamy brzusznej i kończyn tylnych u myszy

Ten protokół opisuje nowatorski test przejściowy oparty na rAAV z funkcją wzmacniania i opisywania. Ten test może być wykorzystany do wywołania ekspresji in vivo w mózgu myszy.

Wdrożenie AAV konstruktów ekspresyjnych opartych na wzmacniaczu in vivo w mózgu myszy

Ten protokół opisuje skuteczne i powtarzalne podejście do badań histologicznych mózgu myszy, w tym perfuzję, sekcję mózgu, swobodne barwienie immunologiczne, montowanie tkanek i obrazowanie.

Swobodne barwienie immunologiczne mózgów myszy

Prezentowana jest wygodna metoda perfuzji grawitacyjnej do analizy histologicznej ośrodkowego układu nerwowego myszy. Immunofluorescencyjne wykrywanie fosforylowanej α-synukleiny wykazano w mysim modelu choroby Parkinsona. Praca ta kompleksowo opisuje również etapy perfuzji przezsercowej, rozwarstwienia, zamrażania/osadzania tkanek i zamrażania sekcji.

Grawitacyjna metoda perfuzji przezsercowej do analizy histologicznej ośrodkowego układu nerwowego myszy

Kolce dendrytyczne są postsynaptycznymi przedziałami większości synaps pobudzających. Zmiany w morfologii kolców dendrytycznych występują podczas rozwoju neurologicznego, starzenia się, uczenia się oraz wielu zaburzeń neurologicznych i psychiatrycznych, co podkreśla znaczenie wiarygodnej analizy kręgosłupa dendrytycznego. Protokół ten opisuje ilościowe określanie morfologii kolców dendrytycznych w sposób dokładny i powtarzalny przy użyciu oprogramowania do automatycznej trójwymiarowej...

Kwantyfikacja dendrytycznego kręgosłupa za pomocą automatycznego oprogramowania do trójwymiarowej rekonstrukcji neuronów

Poznaj technikę utrwalania perfuzji całego zwierzęcia u szczurów z zachowaniem ciśnień fizjologicznych dla optymalnej prezervacji tkanki mózgowej. Metoda ta umożliwia przygotowanie próbek do immunohistochemii.

Perfuzyjna fiksacja całego organizmu gryzoni

Przeglądaj więcej filmów