Perfuzyjna fiksacja całego organizmu gryzoni

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zaprezentowanie naszej techniki fiksacji perfuzyjnej, która kładzie nacisk na wykorzystanie ciśnień fizjologicznych w celu prawidłowego utrwalenia tkanki mózgowej szczura do procedur immunohistochemicznych. W pierwszej kolejności zaprezentowano zastosowanie i konfigurację aparatury do perfuzji. Następnie przygotowano narzędzia niezbędne do przeprowadzenia zarówno zabiegu perfuzji, jak i wyjęcia mózgu, a głęboko znieczulone zwierzę umieszczono w płytkiej kuwecie wypełnionej kruszonym lodem.

Pod klatką piersiową wykonuje się boczny nacięcie o długości od pięciu do sześciu centymetrów przez skórę i ścianę brzuszną. Po odsłonięciu serca przeprowadza się perfuzję zwierzęcia. Ostatnim krokiem jest usunięcie mózgu i umieszczenie go w fiolce z utrwalaczem w objętości płynu co najmniej 10-krotnie przekraczającej objętość samego mózgu.

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zaprezentowanie naszej techniki perfuzji utrwalającej, która kładzie nacisk na wykorzystanie ciśnień fizjologicznych w celu prawidłowego zakonserwowania tkanki mózgowej szczura do badań immunohistochemicznych. Rozpoczniemy od przygotowania zestawu do perfuzji. Zajmie to około 10 minut. Używając strzykawki o pojemności 50 ml, wielokrotnie przepłucz i oczyść linię utrwalacza buforem, aż do całkowitego usunięcia pęcherzyków powietrza.

Dla sukcesu perfuzji kluczowe jest, aby w żadnej z linii nie było pęcherzyków powietrza. Osiąga się to poprzez umieszczenie zaworu wylotowego w zlewce wypełnionej buforem. Teraz zamknij zawór wylotowy.

Następnie wyjmij probówkę ze strzykawki, ściskając ją tak, aby na końcu zawisła kropla buforu. Umieść wypełnioną rurkę, wkładając wlot utrwalacza do butelki zawierającej 200 mililitrów utrwalacza na bazie paraldehydu na jedno zwierzę. Należy przy tym uważać, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza.

Dokręć zakrętkę, upewniając się, że uszczelka jest prawidłowo osadzona. Jeśli nie zostanie ona właściwie osadzona, ciśnienie w zamkniętym układzie nie zostanie utrzymane. Umieść butelkę w zestawie do perfuzji.

Ustaw przepływ wyłącznie z linii buforowej, zamykając port wylotowy i obracając zawór buforu do tej samej pozycji co zawór utrwalacza. Otwórz port wylotowy i przepłucz linię buforową w taki sam sposób, jak zrobiono to wcześniej dla linii utrwalacza. Po oczyszczeniu linii umieść rurkę w butelce z buforem.

Następnie należy sprawdzić szczelność układu. Podczas pompowania gumowej gruszki manometru odczuwalny będzie opór. Jako końcowy etap przygotowania.

Napełnij igłę perfuzyjną buforem, aby zapobiec wprowadzeniu pęcherzyków powietrza. System jest teraz gotowy do perfuzji. Po podaniu mieszaniny ketaminy i ksylazyny oraz potwierdzeniu głębokości znieczulenia chirurgicznego za pomocą metody ucisku palca u stopy, umieść całkowicie znieczulonego szczura na płytkiej tacy wypełnionej kruszonym lodem.

Nie kontynuuj procedury, dopóki zwierzę nie zostanie w pełni znieczulone. Operację rozpocznij od wykonania bocznego nacięcia o długości od pięciu do sześciu centymetrów przez powłoki skórne i ścianę brzucha, tuż poniżej klatki piersiowej. Ostrożnie oddziel wątrobę od przepony.

Za pomocą zakrzywionych nożyc tępych wykonaj małe nacięcie w przeponie. Położenie i nacisk palca mogą ułatwić przecięcie przepony. Kontynuuj nacinanie przepony wzdłuż całej długości klatki piersiowej, aby odsłonić jamę opłucnej.

Umieść zakrzywione nożyce tępym końcem wzdłuż jednej strony żeber, ostrożnie odsuwając płuca i wykonaj cięcie przez klatkę piersiową aż do obojczyka. Następnie wykonaj podobne cięcie po stronie przeciwległej. Teraz unieś mostek i ostrożnie odetnij wszelkie tkanki łączące go z sercem.

Zaciśnij końcówkę mostka za pomocą kleszczyków hemostatycznych i odsuń kleszczyki w stronę głowy. Klatka piersiowa powinna się unieść, zapewniając wyraźny widok na główne naczynia krwionośne. Używając nożyczek irydowych, wykonaj małe nacięcie w tylnej części lewej komory.

Przez naciętą komorę wprowadź do aorty wstępującej igłę perfuzyjną o rozmiarze 15 G z tępym lub oliwnym zakończeniem. Końcówka igły powinna być widoczna przez ścianę aorty i nie może sięgać łuku aorty w miejscu rozgałęzienia tętnic ramiennych i szyjnych. Aby unieruchomić igłę i zapobiec wyciekom, zaciśnij serce kleszczykiem hemostatycznym.

Na koniec, za pomocą nożyczek irydowych, wykonaj szeroki otwór w prawym przedsionku. Należy uważać, aby nie uszkodzić aorty zstępującej. W tym momencie zwierzę jest gotowe do perfuzji.

Podłącz igłę perfuzyjną w prawym przedsionku do portu wylotowego, unikając wprowadzenia pęcherzyków powietrza, a następnie otwórz port wylotowy. Następnie szybko i równomiernie napompuj gruszkę manometru do ciśnienia 80 mmHg. Utrzymuj to ciśnienie przez cały okres infuzji buforu.

Teraz należy uruchomić stoper. Dostosować kąt igły tak, aby przepływ był najsilniejszy, a gdy bufor będzie prawie zużyty, przełączyć zawór buforu. Ciecz stanie się przejrzysta, gdy wątroba zostanie upłyniona.

Jest to oznaka prawidłowej perfuzji, a czas oczyszczenia wątroby powinien zostać odnotowany bardzo szybko. Po tym zdarzeniu zaobserwowane zostaną drżenia fiksacyjne. Należy wskazać ten moment jako czas rzeczywistej fiksacji. Aby utrzymać stałą prędkość przepływu, ciśnienie można stopniowo zwiększać do maksymalnie 130 mmHg.

Gdy utrwalacz zostanie niemal całkowicie zużyty, zamknij zawór wylotowy i zanotuj godzinę. Szczur powinien być teraz sztywny. Można teraz przystąpić do pobrania organów szczura. Aby usunąć mózg, rozpocznij sekcję utrwalonego szczura od odcięcia głowy za pomocą gilotyny.

Następnie wykonaj nacięcie w linii pośrodkowej wzdłuż powłok od szyi do nosa i odsłoń czaszkę za pomocą nożyczek chirurgicznych. Odetnij pozostałą tkankę mięśniową szyi, aby odsłonić podstawę czaszki. Wprowadź ostrze nożyczek irydowych do otworu wielkiego (foramen magnum) po jednej stronie, ostrożnie przesuwając nożyczki wzdłuż wewnętrznej powierzchni czaszki.

Następnie wykonaj nacięcie sięgające dystalnej krawędzi tylnej powierzchni czaszki. Wykonaj analogiczne nacięcie po stronie przeciwległej. Następnie za pomocą kleszczyków typu theros usuń fragmenty czaszki wokół móżdżku.

Ostrożnie przesuń końcówkę nożyczek wzdłuż wewnętrznej powierzchni czaszki od grzbietowego dystalnego tylnego rogu do dystalnej krawędzi czołowej. Unikaj uszkodzenia mózgu poprzez podważanie końcówką ostrza. Podczas tego procesu powtórz tę czynność, wykonując cięcie po przeciwnej stronie.

Następnie, używając pęset, oddziel powierzchnię grzbietową czaszki od mózgu. Odetnij również boki czaszki, korzystając z pęset. Teraz, za pomocą szpatułki, przetnij opuszki węchowe i połączenia nerwowe wzdłuż powierzchni brzusznej mózgu, a następnie ostrożnie oddziel mózg od głowy.

Za pomocą nożyczek irydowych przetnij wszelką oponę twardą łączącą mózg z czaszką. Po usunięciu mózgu umieść go w fiolce z utrwalaczem, którego objętość jest co najmniej 10 razy większa od objętości samego mózgu. Przechowuj fiolkę w temperaturze 4 °C przez 24 godziny.

Po 24 godzinach przemyć mózg PBS 3 razy, delikatnie obracając naczyniem. Następnie mózg można przechowywać w PBS lub roztworze Hanksa. Z dodatkiem azotku sodu, w temperaturze 4 °C, mózgi mogą być przechowywane przez trzy miesiące.

Nieprzecięte. Po opanowaniu techniki cała perfuzja mogła zostać zakończona w czasie od pięciu do ośmiu minut.