Name: Przeszczep komórek macierzystych w symulowanym modelu niedokrwienia/reperfuzji in vitro (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: Poznaj metodę przeszczepu komórek macierzystych w symulowanym modelu niedokrwienia/reperfuzji in vitro. Protokół umożliwia ocenę przeżywalności komórek kardiomiocytów H9C2 po terapii komórkowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była wspierana przez OTKA (Węgierski Fundusz Badań Naukowych) D45933, T049621, TÉT (Węgierska Fundacja Nauki i Techniki) A4/04, Arg-17/2006 oraz stypendia SIN, Bolyai i Öveges, a także TÁMOP 4.2.2-08/1/KMR-2008-0004 i 4.2.1/B 09/1/KMR-2010-0001. OTKA 83803. Chcielibyśmy podziękować Williamowi Gesztesowi za przygotowanie lektora.

1. Przygotowanie komórek kardiomioblastów H9c2
Kardiomioblasty szczura H9c2 otrzymano z ATCC (Wesel, Niemcy) i namnażano w DMEM z wysoką zawartością glukozy (4,5 g/L), zawierającym 10% płodowej surowicy bydlęcej, 4 mM L-glutaminy, 100 U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny. Linia komórkowa mioblastów H9c2 pochodzi z embrionalnego serca szczura i jest wykorzystywana jako model in vitro zarówno dla mięśni szkieletowych, jak i serca 8,9.
Przygotuj płytkę 12-dołkową z komórkami H9c2:
<ol>
	<li>Usunąć pożywkę hodowlaną z szalki Petriego z komórkami H9c2.</li>
	<li>Przemyć komórki dwukrotnie 5 ml PBS i poddać trawieniu przy użyciu 2-3 ml 0,05% trypsyny/EDTA.</li>
	<li>Umieścić szalkę Petriego na 5 minut w inkubatorze w temperaturze 37°C.</li>
	<li>Zahamować działanie trypsyny, dodając 10 ml pożywki hodowlanej DMEM.</li>
	<li>Odwirować komórki przy 1200 RPM przez 8 minut.</li>
	<li>Po usunięciu supernatantu resuspendować komórki w 1 ml pożywki hodowlanej DMEM i policzyć komórki za pomocą hemocytometru, stosując barwienie błękitem trypanu.</li>
	<li>Wysiać 30 000 komórek H9c2 w 2 ml DMEM na każdą studzienkę płytki 12-dołkowej.</li>
	<li>Umieścić płytkę w inkubatorze CO2 w temperaturze 37°C na 24 godziny.</li>
</ol>
2. Symulowane niedokrwienie/reperfuzja
Ischemię/reperfuzję symulowano in vitro poprzez przeprowadzenie deprywacji tlenu i glukozy (OGD) w hodowlach komórek H9c2. Procedurę tę wykonano na stole mikroskopu konfokalnego Zeiss z systemem inkubacji komórek PeCon (Erbach, Niemcy), co umożliwiło obserwację komórek podczas OGD.
<ol>
	<li>Usunąć pożywkę poprzez aspirację z płytki 12-dołkowej z komórkami H9c2.</li>
	<li>Przemyć komórki dwukrotnie PBS.</li>
	<li>Dodać 3 ml pożywki bezglukozowej do każdego dołka.</li>
	<li>Umieścić płytkę w systemie inkubacji komórek.</li>
	<li>Włączyć dopływ azotu w celu usunięcia tlenu z systemu inkubacji.</li>
	<li>Odczekać, aż poziom tlenu spadnie do 0.5%, a następnie uruchomić stoper. Poziom 0.5% tlenu odpowiada ciśnieniu parcjalnemu około 3 mmHg. Poddać komórki 150-minutowej symulowanej ischemii.</li>
	<li>Po zakończeniu symulowanej ischemii usunąć z komórek pożywkę bezglukozową.</li>
	<li>Pipetować 2 ml normalnej pożywki hodowlanej do dołków.</li>
	<li>Umieścić płytkę 12-dołkową na 30 minut w inkubatorze CO2 w temperaturze 37°C; jest to „okres reperfuzji”.</li>
</ol>
3. Przygotowanie mezenchymalnych komórek macierzystych do ratunku
Szpik kostny pochodzenia ludzkiego przeniesiono do kolb T75 i rozcieńczono w pożywce DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) zawierającej 10% płodowej surowicy cielęcej (FCS), 100 U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny, 4 mM L-glutaminy oraz 1 g/l glukozy. Kolby inkubowano w temperaturze 37°C w pełnej wilgotności w atmosferze 5% CO2 przez 3 dni. Po okresie inkubacji BMSCs przylgnęły do powierzchni kolb, a pozostałe składniki szpiku kostnego usunięto poprzez przemycie PBS. W eksperymentach wykorzystano BMSCs w zakresie od 1 do 5 pasażu. Tożsamość komórek potwierdzono za pomocą cytometrii przepływowej poprzez wykazanie obecności markerów powierzchniowych specyficznych dla danej linii komórkowej. Badano markery powierzchniowe specyficzne dla linii hematopoetycznej (CD34, CD45) oraz markery powierzchniowe mezenchymalne (CD73, CD90, CD105 i CD166).
Podczas symulowanego niedokrwienia przygotować ratunkowe mezenchymalne komórki macierzyste do transplantacji.
<ol>
	<li>Rozcieńczyć barwnik fluorescencyjny Vybrant DiD w stosunku 1:200 w pożywce hodowlanej DMEM.</li>
	<li>Odssać pożywkę z komórek rescue i dodać 300 μl DMEM z Vybrant DiD.</li>
	<li>Umieścić szalkę Petriego na 30 minut w inkubatorze CO2 w temperaturze 37°C.</li>
	<li>Usunąć pożywkę hodowlaną z szalki Petriego zawierającej mezenchymalne komórki macierzyste.</li>
	<li>Przemyć komórki dwukrotnie 5 ml PBS i strawić za pomocą 2-3 ml 0,05% trypsyny/EDTA.</li>
	<li>Umieścić szalkę Petriego na 5 minut w inkubatorze w temperaturze 37°C.</li>
	<li>Zahamować działanie trypsyny, dodając 10 ml pożywki hodowlanej DMEM.</li>
	<li>Odwirować komórki przy 1200 RPM przez 8 minut.</li>
	<li>Po usunięciu supernatantu resuspendować komórki w 1 ml pożywki hodowlanej DMEM i policzyć komórki za pomocą hemocytometru z użyciem barwienia błękitem trypanu (Trypan Blue).</li>
	<li>Po 30 minutach, pod koniec reperfuzji, dodać 20 000 mezenchymalnych komórek macierzystych na dołek do poischemicznych mioblastów serca H9c2.</li>
	<li>Umieścić ko-kulturę komórek w inkubatorze CO2 w temperaturze 37°C na 24 godziny.</li>
</ol>
4. Analiza z wykorzystaniem mikroskopii konfokalnej
Po symulowanym urazie niedokrwienno-reperfuzyjnym komórki są inkubowane w zwykłej pożywce hodowlanej przez 24 godziny.
<ol>
	<li>Po 24 godzinach przemyć komórki dwukrotnie PBS.</li>
	<li>Przebarwić komórki w 500 μl roztworu barwnika live/dead przez 30 minut (5 nM kalceiny i 400 nM etydyny-homodimeru-2 w PBS) (5x104 komórek/ml).</li>
</ol>
Ocenę obrazów konfokalnych żywych i martwych komórek wyselekcjonowanych na podstawie morfologii i fluorescencji można przeprowadzić przy użyciu oprogramowania ImageJ (National Institutes of Health, USA). W przypadku kokultur MSC można odróżnić od komórek H9c2 dzięki ich znakowaniu Vybrant DiD. Odsetek martwych komórek można ocenić w 4 niezależnych polach widzenia (obiektyw 10x) dla każdej hodowli w sposób zaślepiony10.
Kardiomioblasty H9c2 hodowane na szklanych szkiełkach obejściowych o średnicy 42 mm można również badać za pomocą wideomikroskopii poklatkowej w trakcie i po urazie niedokrwienno-reperfuzyjnym, wykorzystując system inkubacji komórek mikroskopu konfokalnego. W czasie można badać oddziaływania międzykomórkowe, takie jak fuzja komórek i tworzenie nanorurek międzykomórkowych.
5. Analiza z wykorzystaniem cytometrii przepływowej
Po symulowanym urazie niedokrwienno-reperfuzyjnym komórki są inkubowane w zwykłej pożywce hodowlanej przez 24 godziny.
<ol>
	<li>Po 24 godzinach należy zebrać pożywkę hodowlaną. Bardzo ważne jest zebranie pożywki, ponieważ w ciągu 24-godzinnej inkubacji z powierzchni naczynia hodowlanego mogły oddzielić się martwe komórki.</li>
	<li>Komórki należy przemyć dwukrotnie roztworem PBS i poddać trawieniu 0,05% trypsyną-EDTA.</li>
	<li>Trawienie trypsyną należy zahamować, dodając pożywkę DMEM.</li>
	<li>Komórki oraz zebraną pożywkę hodowlaną należy odwirować przy 1200 RPM (około 150-200g) przez 8 minut.</li>
	<li>Należy odlać nadsącz.</li>
	<li>Komórki należy zawiesić w 500 μL roztworze barwnika live/dead na 30 minut (5 nM kalceiny i 400 nM etydinium-homodimeru-2 w PBS) (5x104 komórek/ml).</li>
	<li>Komórki należy przenieść do probówek do cytometrii przepływowej.</li>
	<li>Należy uruchomić oprogramowanie CellQuest Pro.</li>
	<li>Aby skonfigurować cytometr przepływowy do pomiaru, należy przygotować próbki kontrolne komórek żywych i martwych.
		<ol class="lalpha">
			<li>Komórki H9c2 należy wysiać z gęstością 3x104 w płytkach 12-dołkowych zgodnie z opisem w punkcie 1.</li>
			<li>Kontrole komórek żywych należy przygotować poprzez jednorazową trypsynizację zgodnie z opisem w punkcie 1.</li>
			<li>Kontrole komórek martwych należy przygotować poprzez traktowanie 10 μM H2O2 przez 1 godzinę.</li>
			<li>Po trypsynizacji kontrole komórek żywych i martwych należy resuspender w 500 μl roztworze barwnika live/dead (5 nM kalceiny-AM i 400 nM etydinium-homodimeru-2 w PBS).</li>
		</ol>
	</li>
	<li>Ustawienia instrumentu powinny zostać dostosowane tak, aby komórki żywe były dodatnie dla kalceiny i ujemne dla etydinium homodimeru, natomiast komórki martwe były ujemne dla kalceiny i dodatnie dla etydinium homodimeru.</li>
	<li>Procentowy udział tych populacji można przedstawić w formie słupków na wykresie, a na podstawie tych wartości można przeprowadzić analizę statystyczną.</li>
	<li>Należy zmierzyć poszczególne grupy eksperymentalne.</li>
</ol>
6. Reprezentatywne wyniki:
Nasze wyniki wykazały, że dodane mezenchymalne komórki macierzyste mogą poprawić przeżywalność komórek serca po niedokrwieniu. Obrazy z mikroskopii konfokalnej ujawniły bezpośrednie interakcje międzykomórkowe, takie jak częściowe połączenia błonowe lub nanotubule międzykomórkowe, które prawdopodobnie odgrywają istotną rolę w obserwowanej ochronie10. Nanotubule te rozciągają się na odległość kilku średnic komórkowych, a ich średnice wynosiły od 200 do 500 nm (białe strzałki).
<img src="/files/ftp_upload/3575/3575fig1.jpg" alt="Obraz z mikroskopii fluorescencyjnej; znakowanie komórek markerami zielonymi i czerwonymi, pasek skali 50 µm." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Tworzenie się nanotubul między komórkami. Obserwowano tworzenie się nanotubul (biała strzałka) pomiędzy kardiomioblastami znakowanymi Vybrant DiO a mezenchymalnymi komórkami macierzystymi znakowanymi Vybrant DiD.
Analiza cytometrii przepływowej wykazała populacje przeżywających i nekrotycznych kardiomioblastów oraz mezenchymalnych komórek macierzystych. Co ciekawe, zaobserwowaliśmy również trzecią, „uszkodzoną” populację kardiomioblastów, która zawierała kalceinę, ale zawierała także wskaźnik komórek martwych, etydyny homodimer (Rycina 2). 
<img src="/files/ftp_upload/3575/3575fig2.jpg" alt="Wykres kropkowy z cytometrii przepływowej, analiza żywotności komórek: populacje komórek żywych, uszkodzonych, martwych oraz fragmenty komórkowe." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Reprezentatywny wykres kropkowy różnych populacji komórek po symulowanej ischemii.
Ocena kilku eksperymentów wykazała, że dodanie mezenchymalnych komórek macierzystych do poischemicznych kardiomioblastów H9c2 znacząco zwiększyło odsetek żywych komórek w porównaniu do kardiomioblastów hodowanych samodzielnie po niedokrwieniu (Rysunek 3).
<img src="/files/ftp_upload/3575/3575fig3.jpg" alt="Wykres słupkowy przedstawiający procent żywych komórek w warunkach kontrolnych, modelu I-R oraz I-R+BMSC, analiza." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Wpływ leczenia komórkami macierzystymi na kardiomioblasty po niedokrwieniu. Procent żywych komórek uległ znacznemu zmniejszeniu po symulowanym niedokrwieniu w porównaniu z grupą kontrolną (kontrola vs model I-R: 90,36±2,60 vs 10,52±0,48, *** p&gt;0,001), a następnie wzrósł po dodaniu mezenchymalnych komórek macierzystych (model I-R vs I-R + BMSC: 10,52±0,48 vs 25,21±2,13, *** p&gt;0,001). Dane przedstawiono jako średnia±SEM. Analizę statystyczną danych przeprowadzono za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji z testem post hoc Tukeya dla porównań wielokrotnych.

<ol><li>Dimmeler, S., Burchfield, J., Zeiher, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-Based+Therapy+of+Myocardial+Infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell-Based Therapy of Myocardial Infarction.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 28, (2008).</li>
<li>Kim, S. U., de Vellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell-based+cell+therapy+in+neurological+diseases%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Stem cell-based cell therapy in neurological diseases: A review.</a> Journal of Neuroscience Research. 87, 2183-21 (2009).</li>
<li>Lee, K., Chan, C. K., Patil, N., Goodman, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+therapy+for+bone+regeneration-Bench+to+bedside%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research+Part+B%3A+Applied+Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Cell therapy for bone regeneration-Bench to bedside.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 89, 252-25 (2009).</li>
<li>Gaipa, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GMP-based+CD133%2B+cells+isolation+maintains+progenitor+angiogenic+properties+and+enhances+standardization+in+cardiovascular+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">GMP-based CD133+ cells isolation maintains progenitor angiogenic properties and enhances standardization in cardiovascular cell therapy.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 14, 1619-1619 (2010).</li>
<li>Trounson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+perspectives+in+human+stem+cell+therapeutic+research%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+medicine%22%5BJournal%5D)">New perspectives in human stem cell therapeutic research.</a> BMC medicine. 7, 29-29 (2009).</li>
<li>Mazhari, R., Hare, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+action+of+mesenchymal+stem+cells+in+cardiac+repair%3A+potential+influences+on+the+cardiac+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Clin+Pract+Cardiovasc+Med%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of action of mesenchymal stem cells in cardiac repair: potential influences on the cardiac stem cell niche.</a> Nat Clin Pract Cardiovasc Med. 4, Suppl 1. S21-S21 (2007).</li>
<li>Kimes, B. W., Brandt, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+a+clonal+muscle+cell+line+from+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Properties of a clonal muscle cell line from rat heart.</a> Experimental Cell Research. 98, 367-367 (1976).</li>
<li>Sardao, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vital+imaging+of+H9c2+myoblasts+exposed+to+tert-butylhydroperoxide--characterization+of+morphological+features+of+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Vital imaging of H9c2 myoblasts exposed to tert-butylhydroperoxide--characterization of morphological features of cell death.</a> BMC Cell Biol. 8, 11-11 (2007).</li>
<li>Hescheler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological%2C+biochemical%2C+and+electrophysiological+characterization+of+a+clonal+cell+%28H9c2%29+line+from+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+research%22%5BJournal%5D)">Morphological, biochemical, and electrophysiological characterization of a clonal cell (H9c2) line from rat heart.</a> Circulation research. 69, 1476-1476 (1991).</li>
<li>Cselenyak, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+rescue+cardiomyoblasts+from+cell+death+in+an+in+vitro+ischemia+model+via+direct+cell-to-cell+connections%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells rescue cardiomyoblasts from cell death in an in vitro ischemia model via direct cell-to-cell connections.</a> BMC Cell Biol. 11, 29-29 (2010).</li>
<li>Sauvant, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implementation+of+an+in+vitro+model+system+for+investigation+of+reperfusion+damage+after+renal+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Physiol+Biochem%22%5BJournal%5D)">Implementation of an in vitro model system for investigation of reperfusion damage after renal ischemia.</a> Cell Physiol Biochem. 24, 567-567 (2009).</li>
<li>Namas, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia-Induced+Overexpression+of+BNIP3+is+Not+Dependent+on+Hypoxia-Inducible+Factor+1alpha+in+Mouse+Hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Shock%22%5BJournal%5D)">Hypoxia-Induced Overexpression of BNIP3 is Not Dependent on Hypoxia-Inducible Factor 1alpha in Mouse Hepatocytes.</a> Shock. 36, 196-196 (2011).</li>
<li>Cao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia%2FReoxygenation+Up-Regulated+the+Expression+of+Death+Receptor+5+and+Enhanced+Apoptosis+in+Human+Hepatocyte+Line%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation+Proceedings%22%5BJournal%5D)">Hypoxia/Reoxygenation Up-Regulated the Expression of Death Receptor 5 and Enhanced Apoptosis in Human Hepatocyte Line.</a> Transplantation Proceedings. 38, 2207-2207 (2006).</li>
<li>Meloni, B. P., Meade, A. J., Kitikomolsuk, D., Knuckey, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+neuronal+cell+death+in+acute+and+delayed+in+vitro+ischemia+%28oxygen-glucose+deprivation%29+models%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Characterisation of neuronal cell death in acute and delayed in vitro ischemia (oxygen-glucose deprivation) models.</a> Journal of Neuroscience Methods. 195, 67-67 (2011).</li>
<li>Mimeault, M., Hauke, R., Batra, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells%3A+a+revolution+in+therapeutics--recent+advances+in+stem+cell+biology+and+their+therapeutic+applications+in+regenerative+medicine+and+cancer+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Pharmacology+%26+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Stem cells: a revolution in therapeutics--recent advances in stem cell biology and their therapeutic applications in regenerative medicine and cancer therapies.</a> Clinical Pharmacology & Therapeutics. 82, 252-252 (2007).</li>
<li>Angoulvant, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cell+conditioned+media+attenuates+in+vitro+and+ex+vivo+myocardial+reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Heart+Lung+Transplant%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cell conditioned media attenuates in vitro and ex vivo myocardial reperfusion injury.</a> J Heart Lung Transplant. 30, 95-95 (2010).</li>
<li>Lim, Y. J., Zheng, S., Zuo, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphine+Preconditions+Purkinje+Cells+against+Cell+Death+under+In+Vitro+Simulated+Ischemia%2FReperfusion+Conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">Morphine Preconditions Purkinje Cells against Cell Death under In Vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Conditions.</a> Anesthesiology. 100, 562-562 (2004).</li>
<li>Guo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen-receptor-mediated+protection+of+cerebral+endothelial+cell+viability+and+mitochondrial+function+after+ischemic+insult+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Estrogen-receptor-mediated protection of cerebral endothelial cell viability and mitochondrial function after ischemic insult in vitro.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 30, 545-545 (2010).</li>
</ol>

Nie zgłoszono konfliktów interesów.

Przedstawiony protokół jest podejściem in vitro do znacznie bardziej złożonego problemu terapii komórkami macierzystymi w zawale mięśnia sercowego, ze wszystkimi zaletami i wadami takiego modelu. Oczywiście nie może on odzwierciedlać złożonych (np. immunologicznych) zdarzeń zachodzących podczas i po zawale mięśnia sercowego, ale pozwala skupić się na bezpośrednim wpływie dodanych komórek na komórki po niedokrwieniu. Efekty symulowanego niedokrwienia w kardiomioblastach H9c2 w dużym stopniu zależą od czasu OGD, n...

transplantacja komórek macierzystych w modelu symulowanego niedokrwienia/reperfuzji in vitro

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

Protokoły transplantacji komórek macierzystych są wdrażane do praktyki klinicznej1,2,3. Celem aktualnych badań jest uzyskanie lepszych wyników, zwiększenie powtarzalności protokołów oraz znalezienie nowych źródeł komórek do implantacji4,5. Badanie skuteczności terapii komórkowych nie jest łatwym zadaniem i wymagane są nowe narzędzia do analizy mechanizmów zaangażowanych w proces leczenia6. Opracowaliśmy eksperymentalny protokół niedokrwienia/reperfuzji, aby umożliwić obserwację połączeń komórkowych, a nawet mechanizmów subkomórkowych podczas uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego oraz po transplantacji komórek macierzystych, a także w celu oceny skuteczności terapii komórkowej. Kardiomioblasty H9c2 naniesiono na płytki hodowlane7,8. Niedokrwienie symulowano poprzez 150-minutową inkubację w medium bezglukozowym przy poziomie tlenu poniżej 0,5%. Następnie przywrócono standardowe medium i poziom tlenu, aby zasymulować reperfuzję. Po deprywacji tlenowo-glukozowej uszkodzone komórki poddano terapii poprzez transplantację znakowanych ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z szpiku kostnego, dodając je do hodowli. Mezenchymalne komórki macierzyste są preferowane w badaniach klinicznych, ponieważ są łatwo dostępne przy minimalnie inwazyjnym zabiegu chirurgicznym, łatwo podlegają ekspansji i są autologiczne. Po 24 godzinach kokultywacji komórki barwiono kalceiną i etydyną-homodimerem, aby odróżnić komórki żywe od martwych. Układ ten pozwolił nam zbadać połączenia międzykomórkowe przy użyciu konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej oraz określić wskaźnik przeżywalności komórek poniedokrwiennych za pomocą cytometrii przepływowej. Mikroskopia konfokalna wykazała interakcje między dwiema populacjami komórek, takie jak fuzja komórek i tworzenie nanorurek międzykomórkowych. Analiza cytometrii przepływowej ujawniła 3 klastry uszkodzonych komórek, które można przedstawić na wykresie i poddać analizie statystycznej. Populacje te mogą być badane osobno, a na podstawie uzyskanych danych można wyciągnąć wnioski dotyczące skuteczności symulowanego podejścia terapeutycznego.

Przedstawiamy sposób przygotowania modelu niedokrwienia/reperfuzji in vitro oraz metodę oceny wpływu terapii komórkami macierzystymi na komórki serca po niedokrwieniu.

Transplantacja komórek macierzystych w modelu symulowanego niedokrwienia/reperfuzji in vitro

Protokoły transplantacji komórek macierzystych są wdrażane do praktyki klinicznej1,2,3. W celu uzyskania lepszych wyników, zwiększenia powtarzalności protokołów oraz...

Komórki pochodzenia sercowego są przenoszone na płytki hodowlane w celu symulacji niedokrwienia. Model niedokrwienia z reperfuzją uzyskuje się poprzez inkubację przez 150 minut w medium pozbawionym glukozy, przy poziomie tlenu poniżej 0.5%. Ten okres niedokrwienia prowadzi do obkurczenia i pęcherzykowania większości komórek. Następnie przywraca się standardowe medium oraz poziomy tlenu, aby zasymulować reperfuzję.Mezenchymalne komórki macierzyste są dodawane i hodowane wspólnie z uszkodzonymi komórkami. Po 24 godzinach kokultywacji komórki barwi się wapniem oraz etydium homodimerem w celu rozróżnienia komórek żywych od martwych. Mikroskop konfokalny wyraźnie pokazuje dwie populacje komórek oraz ich oddziaływania, natomiast analiza cytometrii przepływowej ujawnia trzy klastry uszkodzonych komórek, które można przedstawić na wykresie i poddać analizie statystycznej. Protokoły transplantacji komórek macierzystych są wdrażane do praktyki klinicznej. Obecne badania koncentrują się na uzyskiwaniu lepszych wyników, zwiększaniu odporności protokołów oraz poszukiwaniu nowych źródeł komórek do implantacji.Badanie skuteczności terapii komórkowych nie jest łatwym zadaniem i niezbędne są nowe narzędzia do analizy mechanizmów zaangażowanych w proces leczenia. Opracowaliśmy protokół eksperymentalny, który umożliwia obserwację połączeń komórkowych, a nawet mechanizmów podkomórkowych podczas niedokrwienia, uszkodzenia reperfuzyjnego oraz po transplantacji komórek macierzystych. Naszym kryterium projektowym był system w pełni in vitro, w którym obecne są wyłącznie komórki gospodarza i dawcy.Dzięki temu jest ono odizolowane od otaczającej tkanki. Ciągły pomiar żywotności komórek przed, w trakcie i po urazie przez okres do 24 godzin. A także jednoznaczna identyfikacja obu populacji komórek, co umożliwia śledzenie losów przeszczepionych komórek.Aby osiągnąć ten cel, opracowaliśmy protokół deprywacji tlenu i glukozy, powszechnie skracany jako OGD, po którym następował okres reoksygenacji. Jako komórki gospodarza wybrano linię komórkową C2, pochodzącą z kardiomioblastów szczura w dziewiątym dniu życia. Po OGD uszkodzone komórki wspierano poprzez transplantację mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z szpiku kostnego, dodając je do hodowli.Taka konfiguracja pozwoliła nam zbadać połączenia międzykomórkowe przy użyciu mikroskopii konfokalnej oraz określić przeżywalność uszkodzonych komórek za pomocą cytometrii przepływowej. Przejdźmy do pracy i sprawdźmy, jak to zrobić. Usuń pożywkę hodowlaną z komórek H nine C two.Komórki przemyć dwukrotnie PBS i poddać trawieniu 0,05% trypsyną EDTA, pozostawiając szalki Petriego na pięć minut. W inkubatorze w temperaturze 37°C zahamować działanie trypsyny za pomocą pożywki DMEM. Komórki odwirować przy 1200 RPM przez osiem minut.Po usunięciu supernatantu resuspender komórki w 1 mL pożywki DMEM, a następnie policzyć komórki za pomocą cytometru z użyciem barwienia trypanem niebieskim. Wysiać 30 000 komórek H9C2 na dołek w płytce 12-dołkowej, a następnie umieścić płytkę w inkubatorze z CO₂ w temperaturze 37°C na 24 godziny. Usunąć pożywkę poprzez aspirację i przemyć komórki dwukrotnie PBS.Dodać 3 mm pożywki bez glukozy. Umieścić płytkę w systemie inkubacji komórek. Włączyć przepływ azotu w celu usunięcia tlenu z systemu inkubacji.Należy odczekać, aż poziom tlenu osiągnie 0.5%. Następnie należy uruchomić stoper; 0.5% tlenu oznacza w przybliżeniu ciśnienie parcjalne wynoszące trzy milimetry słupa rtęci. Komórki poddaje się 150 minutom symulowanego niedokrwienia. Podczas niedokrwienia komórki odrywają się od powierzchni, a ich błony zaczynają pęcherzyć. Stwierdzono, że każda populacja wymaga nieco innego czasu trwania, aż do osiągnięcia poziomu 60 do 80% obrazu komórek.Dlatego sugerujemy rozpoczęcie od dwóch inkubacji R. Jeśli to nie wystarczy, należy wydłużyć czas OGD. W naszym przypadku komórki C2 w dziewiątym dniu hodowli zazwyczaj wymagają od 150 do 170 minut OGD na koniec symulowanego niedokrwienia.Usunąć pożywkę bezglukozową z komórek i pipetować do dołków zwykłą pożywkę hodowlaną. Umieścić płytkę 12-dołkową na 30 minut w inkubatorze z CO₂ w temperaturze 37 °C. Jest to okres reperfuzji.Podczas symulowanej niedokrwienności przygotować komórki ratunkowe do transplantacji. Rozcieńczyć fluorescencyjny barwnik DiD w stosunku 1:200 w pożywce DMEM. Odessać pożywkę z komórek ratunkowych i dodać 300 µL DMEM z DiD, a następnie inkubować w szalkach Petriego przez 30 minut w inkubatorze z CO₂ w temperaturze 37 °C.Po 30 minutach od zakończenia reperfuzji dodano tysiąc mezenchymalnych komórek macierzystych na dołek do poischemicznych myoblastów kardiologicznych H9C2. Pierwsze kroki są takie same jak przy wysiewaniu H9C2: dwukrotne przemycie PBS, trypsynizacja i policzenie komórek. Kokulturę komórek umieszczono w inkubatorze z CO₂ w temperaturze 37°C na 24 godziny.Po 24 godzinach zebrać pożywkę hodowlaną oraz komórki przylegające z dołków z izacją. Bardzo ważne jest zebranie również pożywki, ponieważ w ciągu 24-godzinnej inkubacji niektóre martwe komórki mogły oddzielić się od powierzchni naczynia hodowlanego.Resuspenduj komórki w 500 µL roztworu live, dead, die, 5 µM calcium i 400 nM Ethereum homodimer w PBS w stężeniu 5 × 10⁴ komórek/ml. W przypadku kokultur komórki macierzyste mezenchymalne odróżnia się od komórek H9C2 za pomocą odpowiedniego fluorescencyjnego znakowania komórek. W ten sposób możliwe jest wykrycie fuzji komórek oraz miejsc kontaktu międzykomórkowego.Odsetek martwych komórek można ocenić w czterech niezależnych polach widzenia, używając obiektywu 10x dla każdej hodowli metodą ślepej próby, co pozwala na uzyskanie powtarzalnego wyniku zliczenia komórek. Przenieś komórki do probówek do cytometrii przepływowej. Uruchom oprogramowanie cell Quest Pro, aby skonfigurować cytometr przepływowy do pomiaru.Przygotuj próbki kontrolne żywych i martwych komórek. Żywe komórki hoduje się w tym samym zagęszczeniu w warunkach normalnych i barwi wapniem. Martwe komórki przygotowuje się poprzez godzinną inkubację z 10 micromole nadtlenkiem wodoru, barwi Ethereum homodimerem i zbiera w ten sam sposób; ustawienia instrumentu należy dostosować tak, aby żywe komórki były dodatnie pod względem wapnia i ujemne pod względem Ethereum homodimeru.Podczas gdy martwe komórki są negatywne pod względem zawartości wapnia i pozytywne pod względem Ethereum homodimer, procentowy udział tych populacji można przedstawić w formie słupków na wykresie, a na podstawie tych wartości można przeprowadzić analizę statystyczną. Stwierdziliśmy, że dodanie zdrowych komórek macierzystych zwiększa stosunek przeżywających komórek w populacji. Co ciekawe, zaobserwowaliśmy również, że komórki, które przetrwały po urazie, mogą zostać wyodrębnione za pomocą bramkowania zarówno z komórek martwych, jak i z tych, które pozostały żywe.Uważamy, że ta populacja zasługuje na dalsze badania. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak w ustandaryzowany sposób przeprowadzać eksperymenty z symulowanym niedokrwieniem z transplantacją komórek macierzystych in vitro. To wszystko.Dziękujemy za obejrzenie materiału i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów. W przypadku jakichkolwiek pytań technicznych prosimy o kontakt. Chętnie pomożemy.

stem-cell-transplantation-an-vitro-simulated-ischemiareperfusion

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Przeszczepianie komórek macierzystych w in vitro symulowanym modelu niedokrwienia/zunaczynienia

Przedstawiono procedurę chirurgicznego wprowadzenia komórek śródbłonka pochodnych z embrionalnych komórek macierzystych do niedokrwionej kończyny dolnej, z zastosowaniem nieinwazyjnego śledzenia za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego.

Komórki śródbłonka pochodzące z embrionalnych komórek macierzystych w leczeniu niedokrwienia kończyny dolnej

Tutaj prezentujemy protokół do generowania przeszczepów naczyń krwionośnych z inżynierii tkankowej, które są funkcjonalne do szczepienia myszom poprzez podwójne wysiewanie częściowo indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (PiPSC) - pochodzących komórek mięśni gładkich i PiPSC - pochodzących komórek śródbłonka na bezkomórkowym bioreaktorze rusztowania naczyń krwionośnych.

Wytwarzanie i przeszczepianie naczyń krwionośnych metodą inżynierii tkankowej w modelu mysim

Mysi model niedokrwienia i reperfuzji mózgu został stworzony w celu zbadania patofizjologii udaru. Podwiązujemy dystalnie prawą środkową tętnicę mózgową i prawą tętnicę szyjną wspólną i przywracamy przepływ krwi po 10 lub 40 minutach niedokrwienia.

Mysi model zamknięcia dwóch naczyń niedokrwienia mózgu-reperfuzji

Tutaj opisujemy przedkliniczny model zwierzęcy do badania patofizjologii uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego w mikrochirurgii rekonstrukcyjnej. Ten model wolnego płata skóry oparty na powierzchownych naczyniach nadbrzusza ogonowego u szczura może również pozwolić na ocenę różnych terapii i związków przeciwdziałających uszkodzeniom związanym z uszkodzeniem niedokrwienno-reperfuzyjnym.

Przedkliniczny model szczurzy do badania uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego w mikrochirurgii rekonstrukcyjnej

Staraliśmy się stworzyć świński model niewydolności serca wywołanej zablokowaniem lewej tętnicy obwodowej i szybką stymulacją, aby przetestować efekt i bezpieczeństwo domięśniowego podawania komórek macierzystych w terapiach komórkowych.

Opracowanie świńskiego modelu niewydolności serca po zawale mięśnia sercowego do leczenia komórkami macierzystymi

Komórki macierzyste są stale badane jako potencjalne metody leczenia osób z uszkodzeniem mięśnia sercowego, jednak ich zmniejszona żywotność i retencja w uszkodzonej tkance może wpłynąć na ich długoterminową skuteczność. W tym manuskrypcie opisujemy alternatywną metodę dostarczania komórek macierzystych w mysim modelu uszkodzenia reperfuzyjnego niedokrwiennego.

Opóźnione dostarczanie komórek macierzystych do mięśnia sercowego po urazie reperfuzyjnym niedokrwiennym w modelu mysim

Dystans przestrzenny jest kluczowym parametrem w ocenie uszkodzenia spowodowanego niedotlenieniem/reoksygenacją w modelu kokulturowym oddzielnych warstw komórek śródbłonka i kardiomiocytów, sugerując po raz pierwszy, że optymalizacja środowiska przestrzennego wspólnej hodowli jest konieczna, aby zapewnić korzystny model in vitro do testowania roli komórek śródbłonka w ochronie kardiomiocytów.

Opracowanie modelu kohodowli komórek w celu naśladowania niedokrwienia/reperfuzji serca in vitro

Ten artykuł opisuje modelowanie niedokrwienno-reperfuzyjne (I/R) w 3-dniowym zarodku pisklęcia za pomocą dostosowanego haka do igły rdzeniowej, aby lepiej zrozumieć rozwój i leczenie I/R. Ten model jest prosty, szybki i niedrogi.

Generowanie modelu niedokrwienia haka i reperfuzji przy użyciu trzydniowego rozwijającego się zarodka pisklęcia

Dostarczanie komórek pod kontrolą ultradźwięków w miejscu zawału mięśnia sercowego u myszy jest bezpiecznym, skutecznym i wygodnym sposobem przeszczepu komórek.

Indukowana ultradźwiękami indukowana pluripotencjalna implantacja kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych u myszy z zawałem mięśnia sercowego

Protokół ma na celu dostarczenie metod dla encefalomiozyangiozy - przeszczepu płata mięśnia skroniowego naczynia krwiotwórczego na powierzchni niedokrwionej tkanki mózgowej - do leczenia ostrego udaru niedokrwiennego bez Moyamoya. Skuteczność tego podejścia w zwiększaniu angiogenezy ocenia się przy użyciu przejściowego modelu niedrożności tętnicy środkowej mózgu u myszy.

Model leczenia encefalomiozyangiozy po udarze wywołanym niedrożnością środkowej tętnicy mózgowej u myszy

Tutaj opisujemy protokół in vitro modelujący niedotlenienie/uszkodzenia reoxygenacji w wysokometabolicznych komórkach nabłonka rurkowo-rurkowego. Model ten został zaprojektowany tak, aby wywołać uszkodzenia wywołane stresem metabolicznym, które można zmierzyć poprzez ekspresję markerów uszkodzenia kanałów bliższych oraz ocenę funkcji oddechowej mitochondriów.

Modelowanie niedotlenienia/uszkodzeń reoxygenacji w bliższych komórkach nabłonka rurkowego

Poznaj metodę przeszczepu komórek macierzystych w symulowanym modelu niedokrwienia/reperfuzji in vitro. Protokół umożliwia ocenę przeżywalności komórek kardiomiocytów H9C2 po terapii komórkowej.

Transplantacja komórek macierzystych w modelu symulowanego niedokrwienia/reperfuzji in vitro

Przeglądaj więcej filmów