Transplantacja komórek macierzystych w modelu symulowanego niedokrwienia/reperfuzji in vitro

Komórki pochodzenia sercowego są przenoszone na płytki hodowlane w celu symulacji niedokrwienia. Model niedokrwienia z reperfuzją uzyskuje się poprzez inkubację przez 150 minut w medium pozbawionym glukozy, przy poziomie tlenu poniżej 0.5%. Ten okres niedokrwienia prowadzi do obkurczenia i pęcherzykowania większości komórek. Następnie przywraca się standardowe medium oraz poziomy tlenu, aby zasymulować reperfuzję.

Mezenchymalne komórki macierzyste są dodawane i hodowane wspólnie z uszkodzonymi komórkami. Po 24 godzinach kokultywacji komórki barwi się wapniem oraz etydium homodimerem w celu rozróżnienia komórek żywych od martwych. Mikroskop konfokalny wyraźnie pokazuje dwie populacje komórek oraz ich oddziaływania, natomiast analiza cytometrii przepływowej ujawnia trzy klastry uszkodzonych komórek, które można przedstawić na wykresie i poddać analizie statystycznej. Protokoły transplantacji komórek macierzystych są wdrażane do praktyki klinicznej. Obecne badania koncentrują się na uzyskiwaniu lepszych wyników, zwiększaniu odporności protokołów oraz poszukiwaniu nowych źródeł komórek do implantacji.

Badanie skuteczności terapii komórkowych nie jest łatwym zadaniem i niezbędne są nowe narzędzia do analizy mechanizmów zaangażowanych w proces leczenia. Opracowaliśmy protokół eksperymentalny, który umożliwia obserwację połączeń komórkowych, a nawet mechanizmów podkomórkowych podczas niedokrwienia, uszkodzenia reperfuzyjnego oraz po transplantacji komórek macierzystych. Naszym kryterium projektowym był system w pełni in vitro, w którym obecne są wyłącznie komórki gospodarza i dawcy.

Dzięki temu jest ono odizolowane od otaczającej tkanki. Ciągły pomiar żywotności komórek przed, w trakcie i po urazie przez okres do 24 godzin. A także jednoznaczna identyfikacja obu populacji komórek, co umożliwia śledzenie losów przeszczepionych komórek.

Aby osiągnąć ten cel, opracowaliśmy protokół deprywacji tlenu i glukozy, powszechnie skracany jako OGD, po którym następował okres reoksygenacji. Jako komórki gospodarza wybrano linię komórkową C2, pochodzącą z kardiomioblastów szczura w dziewiątym dniu życia. Po OGD uszkodzone komórki wspierano poprzez transplantację mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z szpiku kostnego, dodając je do hodowli.

Taka konfiguracja pozwoliła nam zbadać połączenia międzykomórkowe przy użyciu mikroskopii konfokalnej oraz określić przeżywalność uszkodzonych komórek za pomocą cytometrii przepływowej. Przejdźmy do pracy i sprawdźmy, jak to zrobić. Usuń pożywkę hodowlaną z komórek H nine C two.

Komórki przemyć dwukrotnie PBS i poddać trawieniu 0,05% trypsyną EDTA, pozostawiając szalki Petriego na pięć minut. W inkubatorze w temperaturze 37°C zahamować działanie trypsyny za pomocą pożywki DMEM. Komórki odwirować przy 1200 RPM przez osiem minut.

Po usunięciu supernatantu resuspender komórki w 1 mL pożywki DMEM, a następnie policzyć komórki za pomocą cytometru z użyciem barwienia trypanem niebieskim. Wysiać 30 000 komórek H9C2 na dołek w płytce 12-dołkowej, a następnie umieścić płytkę w inkubatorze z CO₂ w temperaturze 37°C na 24 godziny. Usunąć pożywkę poprzez aspirację i przemyć komórki dwukrotnie PBS.

Dodać 3 mm pożywki bez glukozy. Umieścić płytkę w systemie inkubacji komórek. Włączyć przepływ azotu w celu usunięcia tlenu z systemu inkubacji.

Należy odczekać, aż poziom tlenu osiągnie 0.5%. Następnie należy uruchomić stoper; 0.5% tlenu oznacza w przybliżeniu ciśnienie parcjalne wynoszące trzy milimetry słupa rtęci. Komórki poddaje się 150 minutom symulowanego niedokrwienia. Podczas niedokrwienia komórki odrywają się od powierzchni, a ich błony zaczynają pęcherzyć. Stwierdzono, że każda populacja wymaga nieco innego czasu trwania, aż do osiągnięcia poziomu 60 do 80% obrazu komórek.

Dlatego sugerujemy rozpoczęcie od dwóch inkubacji R. Jeśli to nie wystarczy, należy wydłużyć czas OGD. W naszym przypadku komórki C2 w dziewiątym dniu hodowli zazwyczaj wymagają od 150 do 170 minut OGD na koniec symulowanego niedokrwienia.

Usunąć pożywkę bezglukozową z komórek i pipetować do dołków zwykłą pożywkę hodowlaną. Umieścić płytkę 12-dołkową na 30 minut w inkubatorze z CO₂ w temperaturze 37 °C. Jest to okres reperfuzji.

Podczas symulowanej niedokrwienności przygotować komórki ratunkowe do transplantacji. Rozcieńczyć fluorescencyjny barwnik DiD w stosunku 1:200 w pożywce DMEM. Odessać pożywkę z komórek ratunkowych i dodać 300 µL DMEM z DiD, a następnie inkubować w szalkach Petriego przez 30 minut w inkubatorze z CO₂ w temperaturze 37 °C.

Po 30 minutach od zakończenia reperfuzji dodano tysiąc mezenchymalnych komórek macierzystych na dołek do poischemicznych myoblastów kardiologicznych H9C2. Pierwsze kroki są takie same jak przy wysiewaniu H9C2: dwukrotne przemycie PBS, trypsynizacja i policzenie komórek. Kokulturę komórek umieszczono w inkubatorze z CO₂ w temperaturze 37°C na 24 godziny.

Po 24 godzinach zebrać pożywkę hodowlaną oraz komórki przylegające z dołków z izacją. Bardzo ważne jest zebranie również pożywki, ponieważ w ciągu 24-godzinnej inkubacji niektóre martwe komórki mogły oddzielić się od powierzchni naczynia hodowlanego.

Resuspenduj komórki w 500 µL roztworu live, dead, die, 5 µM calcium i 400 nM Ethereum homodimer w PBS w stężeniu 5 × 10⁴ komórek/ml. W przypadku kokultur komórki macierzyste mezenchymalne odróżnia się od komórek H9C2 za pomocą odpowiedniego fluorescencyjnego znakowania komórek. W ten sposób możliwe jest wykrycie fuzji komórek oraz miejsc kontaktu międzykomórkowego.

Odsetek martwych komórek można ocenić w czterech niezależnych polach widzenia, używając obiektywu 10x dla każdej hodowli metodą ślepej próby, co pozwala na uzyskanie powtarzalnego wyniku zliczenia komórek. Przenieś komórki do probówek do cytometrii przepływowej. Uruchom oprogramowanie cell Quest Pro, aby skonfigurować cytometr przepływowy do pomiaru.

Przygotuj próbki kontrolne żywych i martwych komórek. Żywe komórki hoduje się w tym samym zagęszczeniu w warunkach normalnych i barwi wapniem. Martwe komórki przygotowuje się poprzez godzinną inkubację z 10 micromole nadtlenkiem wodoru, barwi Ethereum homodimerem i zbiera w ten sam sposób; ustawienia instrumentu należy dostosować tak, aby żywe komórki były dodatnie pod względem wapnia i ujemne pod względem Ethereum homodimeru.

Podczas gdy martwe komórki są negatywne pod względem zawartości wapnia i pozytywne pod względem Ethereum homodimer, procentowy udział tych populacji można przedstawić w formie słupków na wykresie, a na podstawie tych wartości można przeprowadzić analizę statystyczną. Stwierdziliśmy, że dodanie zdrowych komórek macierzystych zwiększa stosunek przeżywających komórek w populacji. Co ciekawe, zaobserwowaliśmy również, że komórki, które przetrwały po urazie, mogą zostać wyodrębnione za pomocą bramkowania zarówno z komórek martwych, jak i z tych, które pozostały żywe.

Uważamy, że ta populacja zasługuje na dalsze badania. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak w ustandaryzowany sposób przeprowadzać eksperymenty z symulowanym niedokrwieniem z transplantacją komórek macierzystych in vitro. To wszystko.

Dziękujemy za obejrzenie materiału i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów. W przypadku jakichkolwiek pytań technicznych prosimy o kontakt. Chętnie pomożemy.