Name: Podejście oparte na rekombinacji Cre-Lox P do wykrywania fuzji komórek in vivo (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-04T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: Poznaj metodę wykrywania fuzji komórek in vivo opartą na rekombinacji Cre-LoxP z wykorzystaniem luminescencji w myszach. Technika umożliwia śledzenie zdarzeń fuzji komórkowej w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować dr. Peimana Hemmati (Department of Medicine, University of Wisconsin-Madison) za hojne udostępnienie H1 MSCs oraz dr. Tima Hackera, dr. Gouqing Song i panią Jill Koch z University of Wisconsin Cardiovascular Physiology Core Facility za przeprowadzenie operacji u myszy. Praca ta była wspierana przez National Science Foundation w ramach Graduate Research Fellowship dla Briana Freemana oraz przez NIH R21 HL089679.

1. Transfekcja komórek donora
<ol>
	<li>Zebrać mezenchymalne komórki macierzyste (MSC, pochodne z embrionalnych komórek macierzystych H1 uprzejmie udostępnionych przez dr. Peimana Hemattiego; alternatywnie można zastosować dowolny typ komórek dowolnego gatunku, w przypadku których przypuszcza się fuzję in vivo), gdy osiągną 70 - 80% konfluencji, stosując 1X trypsynę (Mediatech, Manassas VA) przez 5 min. Inaktywować trypsynę za pomocą pełnej pożywki α-MEM (bezzantybiotykowa, Invitrogen, Carlsbad CA)18. Centryfugować przy 300 x g przez 5 min.</li>
	<li>Ostrożnie odessać supernatant i resuspender osad w 1 mL 1X PBS, a następnie policzyć komórki za pomocą komory licznikowej (hemacytometru).</li>
	<li>Przenieść 1,5 x 106 komórek do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 mL. Centryfugować przy 300 x g przez 5 min.</li>
	<li>Ostrożnie odessać supernatant. Resuspender osad w 300 μL buforu R (Neon Transfection System, Invitrogen) i 6 μg (2 μg / 5,0 x 105 komórek) p231 pCMVe-betaAc-STOP-luc (Addgene, Cambridge, MA). Wlać 3 mL buforu E (Invitrogen) do portu dokującego elektroporatora zgodnie z protokołem producenta (Neon Transfection System, Invitrogen).</li>
	<li>Przenieść roztwór komórek z plazmidem do końcówki pipety Neon o pojemności 100 μL i przeprowadzić elektroporację z czasem impulsu 20 ms i napięciem 1500 V. Przenieść elektroporowane komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 mL zawierającej 9,7 mL pełnej pożywki α-MEM.</li>
	<li>Powtórzyć krok 1.5 dwukrotnie i połączyć przetransfekowane komórki, aby uzyskać całkowitą objętość 10 mL. Dodać 10 mL zawiesiny komórkowej (1,5 x 106 komórek) do kolby T175 zawierającej 10 mL pełnej pożywki α-MEM. Żywotność komórek po elektroporacji wynosi około 30%, co daje około 4,5 x 105 żywych komórek na kolbę T175.</li>
	<li>Wymienić pełną pożywkę α-MEM 24 godziny po transfekcji.</li>
	<li>Zebrać przetransfekowane komórki przy 70 - 80% konfluencji (~2 - 3 dni po elektroporacji). Wykonać pomiar liczby komórek za pomocą komory licznikowej i resuspender komórki w stężeniu 1,0 x 106 komórek/50 μL pełnej pożywki α-MEM. Zminimalizować czas przebywania komórek w zawiesinie, aby ograniczyć ich obumieranie przed iniekcją.</li>
</ol>
2. Iniekcja domięśniowa w mięsień sercowy
<ol>
	<li>Wprowadzić znieczulenie izofluranem (Phoenix Pharmaceuticals, Inc., St. Joseph, MO) u myszy transgenicznych zaprojektowanych do konstytutywnej ekspresji rekombinazy Cre w każdej komórce (B6.C-Tg(CMV-cre)1Cgn/J, Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME).</li>
	<li>Usunąć sierść z klatki piersiowej za pomocą strzyżarki lub chemicznego depilatora.</li>
	<li>Zaintubować zwierzę cewnikiem 18G (Becton Dickinson &amp; Co, Franklin Lakes NJ) i podłączyć do respiratora dla myszy z częstotliwością 120 - 130 oddechów na minutę i objętością wyrzutową 150 μL.</li>
	<li>Wykonać nacięcie boczne w obrębie czwartej przestrzeni międzyżebrowej, przeprowadzając torakotomię.</li>
	<li>Po odsłonięciu serca wykonać dwa wstrzyknięcia po 25 μL zawiesiny komórek transfekowanych, używając strzykawki 1 mL (Temuro Medical Corporation, Somerset, NJ) i igły 28G (Becton Dickinson &amp; Co, Franklin Lakes NJ). Aby ułatwić wstrzyknięcie domięśniowe i zapobiec nadmiernemu uszkodzeniu narządu, zagiąć końcówkę igły pod kątem ok. 90 stopni.</li>
	<li>Po wstrzyknięciu zamknąć żebra i warstwy mięśniowe za pomocą szwów wchłanialnych (np. vicryl). Skórę zszyć nicią nylonową lub jedwabną 4-0.</li>
	<li>Odczekać do wybudzenia myszy z narkozy i usunąć rurkę intubacyjną.</li>
	<li>Grupy kontrolne powinny obejmować myszy Cre otrzymujące wstrzyknięcia samego medium, myszy Cre otrzymujące tę samą koncentrację komórek nietransfekowanych oraz myszy typu dzikiego otrzymujące komórki transfekowane (alternatywnie myszy Cre otrzymujące komórki transfekowane niepodatne na fuzję). </li>
</ol>
3. Obrazowanie biofotoniczne
<ol>
	<li>Od pięciu do piętnastu minut przed obrazowaniem wstrzyknij dootrzewnowo (IP) 10 μL na gram masy ciała myszy roztworu D-Luciferin o stężeniu 15 mg/mL (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA).</li>
	<li>Zindukuj u myszy znieczulenie izofluranem w stężeniu 4% podczas indukcji oraz 1 - 2% w celu podtrzymania znieczulenia.</li>
	<li>Umieść myszy w pozycji grzbietnej w komorze obrazującej z maską twarzową podającą 1 - 2% izofluranu w celu podtrzymania znieczulenia (Xenogen Biophotonic Imaging System, Hopkinton, MA). Kilka myszy można obrazować jednocześnie. Obrazuj mysz z grupy kontrolnej (sham) razem z myszami eksperymentalnymi, aby ułatwić porównanie sygnału luminescencyjnego.</li>
	<li>Używając oprogramowania Living Image (Xenogen), ustaw odpowiedni czas ekspozycji (zazwyczaj 60 sec, patrz Wyniki). Dostosuj obszar obrazu do wielkości myszy i zachowaj ten sam obszar podczas całego obrazowania, aby zapobiec zmianom czułości. Ustaw wysokość obiektu na 4,5 cm.</li>
	<li>Zarejestruj sygnał intensywności luminescencji odpowiadający myszy lub myszom w polu widzenia i zapisz niezmodyfikowane pliki obrazów. Przetwórz obrazy, aby usunąć sygnał tła odpowiadający myszy kontrolnej lub niepoddanej manipulacjom. Wartości intensywności powyżej tła odpowiadają komórkom zfuzowanym w organizmie zwierzęcia. Analizę intensywności można przeprowadzić za pomocą oprogramowania Living Image (Xenogen) lub otwartoźródłowego oprogramowania do analizy obrazu. Zazwyczaj wybiera się region zainteresowania (ROI), aby porównać dane dotyczące intensywności między zwierzętami i eksperymentami.</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki
Aby określić czułość systemu obrazowania biofotonicznego Xenogen, do mięśnia sercowego myszy C57/Bl6 (Jackson Laboratory) wprowadzono linię komórkową konstytutywnie wykazującą ekspresję lucyferazy (231-LUC-D3H1, Xenogen). Komórki wstrzyknięto w stężeniach 1 x 106, 1 x 103 lub 1 x 101 komórek. Sześć godzin po podaniu komórek myszom wstrzyknięto lucyferynę do jamy otrzewnej, a następnie wykonano obrazowanie przy użyciu systemu Xenogen. Specyficzny sygnał można było wykryć przy 1 000 komórkach (u 2 z 6 obrazowanych myszy, Ryc. 2), jednak detekcja była bardziej wiarygodna przy 10 000 komórkach (u 6 z 6 obrazowanych myszy). Co istotne, badanie to posłużyło również do ustalenia przybliżonej korelacji między liczbą komórek wykazujących ekspresję lucyferazy a intensywnością sygnału.
Aby zademonstrować użyteczność opisanego protokołu w wykrywaniu i śledzeniu fuzji komórek, MSC zostały przetransfekowane plazmidem LoxP-Stop-LoxP-Luciferase (Addgene) i podane do mięśnia sercowego myszy wykazujących ekspresję Cre. Około tydzień po podaniu komórek myszy poddano obrazowaniu z wykorzystaniem systemu Xenogen bez iniekcji D-lucyferyny. Zgodnie z oczekiwaniami, w przypadku braku substratu enzymatycznego nie wykryto sygnału intensywności (Rycina 3). Następnie D-lucyferynę wstrzyknięto dootrzewnowo, a u dwóch z czterech badanych myszy wykryto sygnał odpowiadający intensywności lucyferazy, a tym samym fuzji komórek. Podobny sygnał wykryto tydzień później (Rycina 3), co sugeruje, że produkty fuzji z udziałem MSC mogą być utrzymywać się in vivo. W tym przypadku badanie zakończono, aby umożliwić ocenę serca i tkanek otaczających, jednak można zaplanować analizy długoterminowe i częstsze obrazowanie w celu śledzenia utrzymywania się, proliferacji, a być może migracji produktów fuzji u myszy.
<img alt="Proces edycji genów; system Cre-lox; schemat transfekcji komórek; sprzęt do obrazowania biofotonicznego." src="/files/ftp_upload/3581/3581fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Schemat techniki wykrywania fuzji komórkowej in vivo. Jeśli dojdzie do fuzji między komórkami myszy wykazującymi ekspresję Cre a przeszczepionymi komórkami wykazującymi ekspresję plazmidu lucyferazy z sekwencją flox, lucyferaza zostanie wyeksponowana. Lucyferazę można wykryć poprzez wstrzyknięcie substratu enzymatycznego, D-lucyferyny, do myszy, a następnie obrazowanie zwierzęcia przy użyciu systemu obrazowania biofotonicznego Xenogen (Adaptowano z 19)
<img alt="Obrazowanie bioluminescencyjne myszy w badaniu nad rakiem; sygnał fluorescencyjny wskazujący na aktywność guza." src="/files/ftp_upload/3581/3581fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Czułość wykrywania komórek wykazujących ekspresję lucyferazy w tkance serca za pomocą obrazowania biofotonowego. Linia komórkowa konstytutywnie wykazująca ekspresję lucyferazy (231-LUC-D3H1, Xenogen) została wprowadzona do przestrzeni wewnątrzmięśniowej serca myszy C57/Bl6 w różnych całkowitych liczbach komórek. Przedstawiono reprezentatywne obrazy myszy, które otrzymały 1 x 106, 1 x 103 oraz 1 x 101 komórek (od lewej do prawej); obrazowanie przeprowadzono około 6 godzin po iniekcji.
<img alt="Obrazowanie fluorescencyjne myszy, analiza optyczna; układ eksperymentalny z wykresem wyników luminescencji." src="/files/ftp_upload/3581/3581fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Ilościowe oznaczenie luminescencji In Vivo wskazującej na fuzję komórek. MSCs zostały przetransfekowane plazmidem LoxP-Stop-LoxP-Luciferase i podane do mięśnia sercowego myszy wykazujących ekspresję Cre. Około jednego oraz dwóch tygodni po podaniu komórek, myszy Cre poddano obrazowaniu przy użyciu systemu Xenogen Biophotonic Imaging System w celu zmierzenia intensywności luminescencji wskazującej na fuzję komórek. (A) Nałożenie zdjęcia i intensywności luminescencji grupy sham oraz myszy 1-4 (od lewej do prawej) 17 dni po podaniu komórek. (B) Intensywność luminescencji grupy sham oraz myszy 1-4 (od lewej do prawej) 17 dni po podaniu komórek. Wybrano obszar zainteresowania (żółty) odpowiadający miejscu wstrzyknięcia, a poziomy intensywności określono za pomocą oprogramowania ImageJ (źródło otwarta)20. (C) Intensywność luminescencji została znormalizowana względem tego samego obszaru zainteresowania u myszy z grupy sham dla wszystkich warunków eksperymentalnych. W pierwszym tygodniu myszy 3 i 4 wykazały pozytywny sygnał luminescencji, co sugeruje spontaniczną fuzję komórki mysiej i przeszczepionej MSC. Sygnał utrzymywał się u myszy 3 w drugim tygodniu. Aby określić organospecyficzną lokalizację sygnału odpowiadającego myszy 3, odsłonięto jamę klatki piersiowej, a następnie wycięto i obrazowano główne organy. (D) Nałożenie zdjęcia i intensywności luminescencji myszy 3. Zauważalna lokalizacja sygnału intensywności w jelicie cienkim. (E) Intensywność luminescencji myszy 3. (F) Nałożenie zdjęcia i intensywności luminescencji myszy z grupy sham. (G) Intensywność luminescencji myszy z grupy sham.

<ol><li>Bernirschke, K. K. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBernirschke%2C+KKP+%22Pathology+of+the+Human+Placenta%22">Pathology of the Human Placenta</a>. , Springer. New York. (2000).</li>
<li>Hoshina, M., Boothby, M., Boime, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytological+localization+of+chorionic+gonadotropin+alpha+and+placental+lactogen+mRNAs+during+development+of+the+human+placenta%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cytological localization of chorionic gonadotropin alpha and placental lactogen mRNAs during development of the human placenta.</a> J. Cell. Biol. 93, 190-198 (1982).</li>
<li>Johansen, M., Redman, C. W., Wilkins, T., Sargent, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trophoblast+deportation+in+human+pregnancy--its+relevance+for+pre-eclampsia%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Trophoblast deportation in human pregnancy--its relevance for pre-eclampsia.</a> Placenta. 20, 531-539 (1999).</li>
<li>Redman, C. W., Sargent, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Placental+debris%2C+oxidative+stress+and+pre-eclampsia%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Placental debris, oxidative stress and pre-eclampsia.</a> Placenta. 21, 597-602 (2000).</li>
<li>Ogle, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+fusion+of+cells+between+species+yields+transdifferentiation+and+retroviral+transfer+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB.+J%22%5BJournal%5D)">Spontaneous fusion of cells between species yields transdifferentiation and retroviral transfer in vivo.</a> FASEB. J. 18, 548-550 (2004).</li>
<li>Nygren, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow-derived+hematopoietic+cells+generate+cardiomyocytes+at+a+low+frequency+through+cell+fusion%2C+but+not+transdifferentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Bone marrow-derived hematopoietic cells generate cardiomyocytes at a low frequency through cell fusion, but not transdifferentiation.</a> Nat. Med. 10, 494-501 (2004).</li>
<li>Nygren, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid+and+lymphoid+contribution+to+non-haematopoietic+lineages+through+irradiation-induced+heterotypic+cell+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Myeloid and lymphoid contribution to non-haematopoietic lineages through irradiation-induced heterotypic cell fusion.</a> Nat. Cell. Biol. 10, 584-592 (2008).</li>
<li>Kutschka, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenoviral+human+BCL-2+transgene+expression+attenuates+early+donor+cell+death+after+cardiomyoblast+transplantation+into+ischemic+rat+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Adenoviral human BCL-2 transgene expression attenuates early donor cell death after cardiomyoblast transplantation into ischemic rat hearts.</a> Circulation. 114, I174-I180 (2006).</li>
<li>Min, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+bioluminescence+imaging+of+cord+blood+derived+mesenchymal+stem+cell+transplantation+into+rat+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Nucl.+Med%22%5BJournal%5D)">In vivo bioluminescence imaging of cord blood derived mesenchymal stem cell transplantation into rat myocardium.</a> Ann. Nucl. Med. 20, 165-170 (2006).</li>
<li>Malstrom, S. E., Tornavaca, O., Meseguer, A., Purchio, A. F., West, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+characterization+and+hormonal+regulation+of+kidney+androgen-regulated+protein+%28Kap%29-luciferase+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.+Sci%22%5BJournal%5D)">The characterization and hormonal regulation of kidney androgen-regulated protein (Kap)-luciferase transgenic mice.</a> Toxicol. Sci. 79, 266-277 (2004).</li>
<li>Weir, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophotonic+imaging+in+HO-1.luc+transgenic+mice%3A+real-time+demonstration+of+gender-specific+chloroform+induced+renal+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res%22%5BJournal%5D)">Biophotonic imaging in HO-1.luc transgenic mice: real-time demonstration of gender-specific chloroform induced renal toxicity.</a> Mutat. Res. 574, 67-75 (2005).</li>
<li>Rajashekara, G., Glover, D. A., Banai, M., O'Callaghan, D., Splitter, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuated+bioluminescent+Brucella+melitensis+mutants+GR019+%28virB4%29%2C+GR024+%28galE%29%2C+and+GR026+%28BMEI1090-BMEI1091%29+confer+protection+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Attenuated bioluminescent Brucella melitensis mutants GR019 (virB4), GR024 (galE), and GR026 (BMEI1090-BMEI1091) confer protection in mice.</a> Infect. Immun. 74, 2925-2936 (1090).</li>
<li>Kadurugamuwa, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+biophotonic+imaging+for+monitoring+of+catheter-associated+urinary+tract+infections+and+therapy+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Noninvasive biophotonic imaging for monitoring of catheter-associated urinary tract infections and therapy in mice.</a> Infect. Immun. 73, 3878-3887 (2005).</li>
<li>Ryan, P. L., Youngblood, R. C., Harvill, J., Willard, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photonic+monitoring+in+real+time+of+vascular+endothelial+growth+factor+receptor+2+gene+expression+under+relaxin-induced+conditions+in+a+novel+murine+wound+model%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.Y.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Photonic monitoring in real time of vascular endothelial growth factor receptor 2 gene expression under relaxin-induced conditions in a novel murine wound model.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci. 1041, 398-414 (2005).</li>
<li>Zhu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-invasive+imaging+of+GFAP+expression+after+neuronal+damage+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">Non-invasive imaging of GFAP expression after neuronal damage in mice.</a> Neurosci. Lett. 367, 210-212 (2004).</li>
<li>Noiseux, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+overexpressing+Akt+dramatically+repair+infarcted+myocardium+and+improve+cardiac+function+despite+infrequent+cellular+fusion+or+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells overexpressing Akt dramatically repair infarcted myocardium and improve cardiac function despite infrequent cellular fusion or differentiation.</a> Mol. Ther. 14, 840-850 (2006).</li>
<li>Ajiki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Composite+tissue+transplantation+in+rats%3A+fusion+of+donor+muscle+to+the+recipient+site%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Proc%22%5BJournal%5D)">Composite tissue transplantation in rats: fusion of donor muscle to the recipient site.</a> Transplant Proc. 37, 208-209 (2005).</li>
<li>Trivedi, P., Hematti, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+and+immunological+characterization+of+mesenchymal+stromal+cells+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Hematol%22%5BJournal%5D)">Derivation and immunological characterization of mesenchymal stromal cells from human embryonic stem cells.</a> Exp. Hematol. 36, 350-359 (2008).</li>
<li>Ogle, B. M., Cascalho, M., Platt, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+implications+of+cell+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Biological implications of cell fusion.</a> Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 6, 567-575 (2005).</li>
<li>Collins, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ImageJ+for+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">ImageJ for microscopy.</a> BioTechniques. 43, 25-30 (2007).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Metoda opisana w niniejszym opracowaniu pozwala po raz pierwszy na dyskretną identyfikację i analizę czasową fuzji komórek w organizmach, w tym u małych zwierząt. Podejście to łączy rekombinację Cre-LoxP z późniejszą biofotoniczną analizą obrazu. Metoda ta nadaje się do śledzenia nie tylko fuzji komórka-komórka, ale także fuzji wirus-komórka, co może okazać się użyteczne w monitorowaniu infekcji wirusowych. Analiza obrazu jest szybka, a jednoczesne obrazowanie wielu małych zwierząt jest możliwe. Wykrywanie fuzji ...

<table><tbody><tr><td>System transfekcji Neon</td><td>Invitrogen</td><td>MPK5000</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw Neon 100 &amp;mu;L</td><td>Invitrogen</td><td>MPK10025</td><td>Zawiera bufor R i E</td></tr><tr><td>a-MEM w proszku</td><td>Invitrogen</td><td>12000-022</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Hyclone</td><td>SH30070.03</td><td></td></tr><tr><td>B6.C-Tg(CMV-cre)1Cgn/J</td><td>Jackson Laboratory</td><td>006054</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna 10X</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT-25-054-Cl</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Fisher Scientific</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>D-Lucyferyna</td><td>Caliper Life Sciences</td><td>122796</td><td></td></tr><tr><td>System obrazowania biofotonicznego Xenogen</td><td>Caliper Life Sciences</td><td>IVIS Spectrum</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6014-500G</td><td></td></tr><tr><td>Niezbędne aminokwasy</td><td>Invitrogen</td><td>11140-050</td><td></td></tr></tbody></table>

podejście oparte na rekombinacji cre-lox p do detekcji fuzji komórek in vivo

A Cre-Lox P Recombination Approach for the Detection of Cell Fusion In Vivo

Zdolność dwóch lub więcej komórek tego samego typu do fuzji była wykorzystywana u metazoa w toku ewolucji do tworzenia wielu złożonych organów, w tym mięśni szkieletowych, kości i łożyska. Współczesne badania wykazują, że fuzja komórek tego samego typu zapewnia usprawnienie funkcji. Na przykład, gdy komórki trofoblastyczne łożyska łączą się, tworząc syncytiotrofoblast, syncytiotrofoblast jest w stanie skuteczniej transportować składniki odżywcze i hormony przez barierę matczino-płodową niż niefuzyjne trofoblasty1-4. Nowsze badania wskazują, że fuzja komórek różnych typów może kierować losem komórki. Uważano niegdyś, że „reversja” lub modyfikacja losu komórki poprzez fuzję jest ograniczona do systemów hodowli komórkowych. Jednak rozwój transplantologii komórek macierzystych doprowadził do odkrycia przez nas i innych badaczy, że komórki macierzyste mogą łączyć się z komórkami somatycznymi in vivo i że fuzja ta ułatwia różnicowanie komórek macierzystych5-7. Zatem fuzja komórek jest regulowanym procesem zdolnym do promowania przeżycia i różnicowania komórek, a tym samym może mieć kluczowe znaczenie dla rozwoju, regeneracji tkanek, a nawet patogenezy chorób.
Ograniczeniem w badaniach nad fuzją komórek jest brak odpowiedniej technologii pozwalającej na 1) dokładną identyfikację produktów fuzji oraz 2) śledzenie produktów fuzji w czasie. Przedstawiamy tutaj nowatorskie podejście rozwiązujące oba te ograniczenia poprzez indukcję bioluminescencji podczas fuzji (Rycina 1); bioluminescencję można wykryć z wysoką czułością in vivo8-15. Wykorzystujemy konstrukt kodujący gen lucyferazy świetlika (Photinus pyralis) umieszczony obok kodonu stop flankowanego sekwencjami LoxP. Gdy komórki wykazujące ekspresję tego genu łączą się z komórkami wykazującymi ekspresję białka rekombinazy Cre, miejsca LoxP ulegają przecięciu, a sygnał stop zostaje wycięty, co umożliwia transkrypcję lucyferazy. Ponieważ sygnał jest indukowalny, częstotliwość występowania sygnałów fałszywie dodatnich jest bardzo niska. W przeciwieństwie do istniejących metod wykorzystujących system Cre/LoxP16, 17, wprowadziliśmy „żywy” sygnał detekcyjny, co po raz pierwszy daje możliwość śledzenia kinetyki fuzji komórek in vivo.
Aby zademonstrować tę metodę, myszy wykazujące powszechną ekspresję rekombinazy Cre posłużyły jako biorcy komórek macierzystych przetransfekowanych konstruktem do ekspresji lucyferazy w miejsce sekwencji za kodonem stop z floksowanymi sekwencjami (floxed stop codon). Komórki macierzyste przeszczepiono drogą wstrzyknięcia domięśniowego, a po transplantacji przeprowadzono analizę obrazowania intravitalnego w celu śledzenia obecności produktów fuzji w sercu i tkankach otaczających w czasie. Podejście to można zaadaptować do analizy fuzji komórek w dowolnym typie tkanki na każdym etapie rozwoju, choroby lub regeneracji tkanek u osobników dorosłych.

Opisano metodę śledzenia fuzji komórek w żywych organizmach w czasie. Podejście to wykorzystuje rekombinację Cre-LoxP do indukcji ekspresji lucyferazy po fuzji komórek. Wygenerowany sygnał luminescencyjny może być wykrywany w żywych organizmach przy użyciu systemów obrazowania biofotonicznego z czułością detekcji na poziomie ˜1,000 komórek w tkankach obwodowych.

Podejście oparte na rekombinacji Cre-Lox P do detekcji fuzji komórek in vivo

Zdolność dwóch lub więcej komórek tego samego typu do fuzji była wykorzystywana u metazoa na przestrzeni ewolucji do tworzenia wielu złożonych organów, w tym ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest identyfikacja i śledzenie zdarzeń fuzji komórkowej in vivo. Osiąga się to poprzez najpierw przeprowadzenie transfekcji komórek donora genem lucyferazy z sekwencją STOP (flockowaną). Drugim krokiem procedury jest wprowadzenie przetransfekowanych komórek do tkanek myszy zmodyfikowanej genetycznie w celu konstytutywnej ekspresji rekombinazy Cre.Trzecim krokiem jest obrazowanie luminescencji w tkankach myszy biorców, co odpowiada zdarzeniom fuzji komórkowej. Następnie przeprowadza się analizę intensywności sygnału w zależności od warunków eksperymentalnych. Ostatecznie wyniki mogą wykazać lokalizację i transport produktów fuzji komórkowej u żywych myszy poprzez detekcję indukowalnej luminescencji związanej z fuzją komórek.Metoda ta może pomóc w rozwiązaniu kluczowych kwestii w dziedzinach rozwoju, biologii komórek macierzystych i biologii nowotworów, takich jak to, czy fuzja komórek ułatwia programowanie komórek macierzystych lub czy przerzuty nowotworowe zależą od fuzji komórkowej. Procedurę zademonstrują Anthony Springers, Nicholas Co i Brian Freeman, studenci w naszym laboratorium, oraz Gal Queen Song, naukowiec pomocniczy w departamencie medycyny. Rozpocznij od trypsynizacji komórek do fuzji in vivo, gdy osiągną 70 do 80% konfluencji. W tym przypadku wykorzystano mezenchymalne komórki macierzyste; dezaktywuj trypsynę za pomocą pełnej pożywki alpha-MEM bez antybiotyków, a następnie odwiruj komórki. Ostrożnie odessaj nadsącz i resuspenduj osad komórkowy w 1 mL 1x PBS. Po policzeniu komórek za pomocą cytometru hemocytometrycznego, przenieś 1,5 miliona komórek do probówki wirówkowej i odwiruj je do postaci osadu.Po ostrożnym odessaniu supernatantu, zawiesić osad w 300 µL buforu R zawierającego 6 µg plazmidu, zgodnie z protokołem producenta. Wprowadzić 3 mL EBU do portu dokującego elektroporatora.Następnie przenieś 100 µL roztworu plazmidu komórkowego do końcówki pipety Neon. Umieść końcówkę pipety w urządzeniu do elektroporacji i przeprowadź elektroporację komórek.Następnie przenieś te komórki do 15 mililitrowej probówki stożkowej zawierającej 9,7 mililitra pożywki alpha MEM, medium kompletne. Powtórz proces elektroporacji dwukrotnie, aby uzyskać łącznie 300 mikrolitrów elektroporowanych komórek, wszystkich zebranych w kompletnej pożywce alpha MEM. Następnie dodaj komórki do kolby T 175 zawierającej kolejne 10 mililitrów kompletnej pożywki alpha MEM.Wymień pożywkę po 24 godzinach od transfekcji; przeżywalność komórek po elektroporacji wynosi około 30%, co daje około pół miliona żywych komórek na kolbę. Po dwóch lub trzech dniach komórki osiągną 70 do 80% konfluencji. Następnie przenieś i policz komórki bezpośrednio przed iniekcją. Resus.Zawiesić komórki w pełnej pożywce alpha MEM w stężeniu 1 miliona komórek na 50 µL pożywki i wstrzyknąć je tak szybko, jak to możliwe, aby zminimalizować śmiertelność komórek. W tej procedurze wykorzystuje się myszy zmodyfikowane genetycznie w celu powszechnej ekspresji rekombinazy Cree; przed przystąpieniem do działania mysz należy znieczulić izofluranem. Za pomocą testu bólowego należy upewnić się, że zwierzę znajduje się w chirurgicznej fazie znieczulenia.Następnie usuń owłosienie z klatki piersiowej za pomocą maszynki do strzyżenia lub chemicznego depilatora. Dalej przygotuj mysz do operacji poprzez intubację cewnikiem 18G, umieszczenie zwierzęcia na respiratorze dla myszy oraz na podkładce grzewczej. Wykonaj teraz torakotomię, wykonując nacięcie boczne w obrębie czwartej przestrzeni międzyżebrowej.Zapewnij przejrzysty kąt widzenia serca. Zegnij końcówkę igły o rozmiarze 28 G przymocowanej do strzykawki o pojemności 1 ml pod kątem bliskim 90 stopni. Napełnij strzykawkę 50 µl przygotowanych komórek, wprowadzając dodatkową ilość powietrza, aby umożliwić wypchnięcie całej objętości zawiesiny komórkowej z igły.Następnie wykonaj 2 wstrzyknięcia po 25 µL zawiesiny transfekowanych komórek do przestrzeni przedniej lewej komory mięśnia sercowego. Ważne jest, aby upewnić się, że komórki zostały wstrzyknięte do tkanki. Można to potwierdzić, obserwując rozgałęzianie się tkanki podczas wstrzykiwania. Po wykonaniu iniekcji.Do zamknięcia żeber i warstw mięśniowych należy użyć nici wchłanialnych, takich jak nici Vicryl. Zabieg kończy się zamknięciem skóry za pomocą nici nylonowych lub jedwabnych o rozmiarze 4-0. Podczas przeprowadzania operacji i iniekcji należy działać sprawnie, ponieważ sukces zależy od krótkiego czasu trwania tej procedury.Teraz należy pozwolić myszy wybudzić się z narkozy na płycie grzewczej i przeprowadzić ekstubację, gdy mysz zakaszle lub wykaże aktywność odruchową. W grupach kontrolnych do tkanki tłuszczowej (cream ice) należy wstrzyknąć pożywkę alpha MEM niezawierającą transfekowanych komórek, a myszom typu dzikiego należy wstrzyknąć komórki transfekowane. Myszy przeznaczone do obrazowania należy znieczulić, stosując 4% isofluorine.Przygotuj myszy, wykonując doszpikowe wstrzyknięcie D Lucifer. Umieść każdą znieczuloną mysz z podanym lucyferykiem w pozycji na plecach. W komorze obrazującej można jednocześnie obrazować kilka myszy, w tym mysz kontrolną po wstrzyknięciu pozorowanym.Używając maski gazowej, utrzymuj znieczulenie przy użyciu od 1 do 2% isofluranu. Umieść komorę obrazującą pod mikroskopem i uruchom dostępny w sprzedaży pakiet oprogramowania do obsługi obrazowania. Przygotuj oprogramowanie, ustawiając w pierwszej kolejności odpowiedni czas naświetlania.Następnie określ kształt obszaru obrazowania dla jednej myszy i zastosuj ten sam kształt dla wszystkich pozostałych obrazowanych myszy. Następnie ustaw wysokość obiektu na 4,5 centimeters. zarejestruj sygnał intensywności luminescencji odpowiadający myszy lub myszom znajdującym się w polu widzenia.Następnie zapisz niemodyfikowany plik obrazu. Przetwórz obrazy w celu usunięcia sygnału tła odpowiadającego wartościom intensywności u myszy kontrolnej; wartości powyżej luminescencji tła odpowiadają komórkom zfuzjowanym wewnątrz organizmu. Uznajemy, że oprogramowanie open source ImageJ jest łatwe do dostosowania i niezawodne w zakresie postprocesingu obrazów.Aby przeprowadzić tę analizę, kluczowe jest, aby obrazy uzyskane z oprogramowania Xeno gen zostały wyeksportowane jako pliki T. Analizę intensywności można przeprowadzić przy użyciu dostępnych komercyjnie lub otwartoźródłowych programów do analizy obrazu. Zazwyczaj wybierany jest obszar zainteresowania, aby porównać dane dotyczące intensywności pomiędzy zwierzętami i eksperymentami w celu określenia czułości systemu obrazowania.Linię komórkową konstytutywnie eksponującą lucyferazę wstrzyknięto w różne stężeniach do mięśnia sercowego myszy C 57 black six. Sześć godzin później wykonano obrazowanie sygnału luminescencji u myszy. Sygnał wykryto u dwóch z sześciu myszy, którym wstrzyknięto 1000 komórek, oraz u wszystkich sześciu zwierząt, którym wstrzyknięto 10 000 komórek.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak identyfikować i śledzić produkty fuzji komórek in vivo poprzez detekcję luminescencji indukowalnej.

a-cre-lox-p-recombination-approach-for-detection-cell-fusion

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Podejście do rekombinacji Cre-Lox P do wykrywania fuzji komórek in vivo

W niniejszym filmie prezentujemy efektywną elektrofuzję komórek in vitro za pomocą zmodyfikowanej metody adhezyjnej z wykorzystaniem elektroporacji oraz późniejszą detekcję i wizualizację sfuzowanych komórek przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej.

Wizualizacja elektrofuzyjnej fuzji komórek za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Niniejszy protokół opisuje sposób obrazowania oddziaływań białko-białko z wykorzystaniem testu bliskości opartego na FRET.

Obrazowanie oddziaływań białko-białko in vivo

Opracowaliśmy test fuzji komórek, który pozwala na ilościowe określenie zdarzeń fuzji błon zapośredniczonej przez białka SNARE poprzez aktywowaną ekspresję β-galaktozydazy.

Analiza fuzji błon zapośredniczonej przez białka SNARE z wykorzystaniem enzymatycznego testu fuzji komórek

Interakcje białko-białko są wizualizowane w komórkach z nanometrową rozdzielczością przestrzenną poprzez połączenie dwucząsteczkowej komplementacji fluorescencji (BiFC) z fotoaktywowaną mikroskopią lokalizacyjną (PALM). Opisano tutaj zastosowanie BiFC-PALM do obrazowania oddziaływań Ras-Raf w komórkach U2OS do wizualizacji klastrowania i dyfuzji w nanoskali poszczególnych kompleksów Ras-Raf.

Fotoaktywowana mikroskopia lokalizacyjna z dwucząsteczkową komplementacją fluorescencji (BiFC-PALM)

Autonomiczne funkcje genów w mózgu mogą być badane poprzez wywoływanie utraty lub utraty funkcji w rzadkich populacjach komórek. Tutaj opisujemy elektroporację in utero w celu dostarczenia rekombinazy Cre do rzadkich populacji rozwijających się neuronów korowych z floksowanymi genami, aby spowodować utratę funkcji in vivo.

Indukowanie rekombinacji Cre-lox w korze mózgowej myszy poprzez elektroporację in utero

Opisujemy test oparty na komórkach, który informuje o fuzji HIV-1 poprzez ekspresję białka zielonej fluorescencji wykrywalnego za pomocą cytometrii przepływowej lub mikroskopii fluorescencyjnej. Może być stosowany do testowania inhibitorów wnikania wirusa (szczególnie na etapie fuzji) w systemach infekcji bezkomórkowych i międzykomórkowych.

Wysokoprzepustowy test fuzji błony wirusowej aktywowanej Cre-Lox w celu identyfikacji inhibitorów fuzji błony wirusowej HIV-1

Ten protokół opisuje podejście oparte na spektroskopii fluktuacji fluorescencji, mające na celu badanie interakcji między białkami pośredniczącymi w interakcjach komórka-komórka, tj. białkami zlokalizowanymi w połączeniach komórkowych, bezpośrednio w żywych komórkach. Zapewniamy szczegółowe wytyczne dotyczące kalibracji, akwizycji i analizy przyrządów, w tym korekty możliwych źródeł artefaktów.

Test spektroskopii fluktuacji fluorescencji interakcji białko-białko na styku komórka-komórka

Celem tego protokołu jest połączenie dwóch różnych typów komórek w celu stworzenia komórek hybrydowych. Analiza mikroskopii fluorescencyjnej połączonych komórek służy do śledzenia komórki pochodzenia organelli komórkowych. Test ten można wykorzystać do zbadania, w jaki sposób struktura i funkcja komórkowa reagują na zakłócenia spowodowane fuzją komórek.

Fuzja komórka-komórka linii komórkowych z edytowanym genomem w celu perturbacji struktury i funkcji komórkowej

Ten protokół demonstruje użycie testu ligacji zbliżeniowej do badania interakcji białko-białko in situ w linii zarodkowej C. elegans.

Wykrywanie in situ składania kompleksów rybonukleoproteinowych w linii zarodkowej C. elegans przy użyciu testu ligacji zbliżeniowej

Förster Resonance Energy Transfer (FRET) pomiędzy dwiema cząsteczkami fluoroforu może być wykorzystany do badania interakcji białek w żywej komórce. W tym miejscu przedstawiono protokół pomiaru FRET w żywych komórkach poprzez wykrywanie uczulonej emisji akceptora i wygaszanie cząsteczki donorowej za pomocą konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej.

Ocena interakcji białek w żywych komórkach z emisją uwrażliwioną na FRET

Transfer energii rezonansu fluorescencji (FRET) to technika obrazowania służąca do wykrywania interakcji białek w żywych komórkach. W tym miejscu przedstawiono protokół FRET w celu zbadania związku enzymów modyfikujących histony z czynnikami transkrypcyjnymi, które rekrutują je do docelowych promotorów w celu epigenetycznej regulacji ekspresji genów w tkankach roślinnych.

Badanie interakcji między enzymami modyfikującymi histony a czynnikami transkrypcyjnymi in vivo poprzez transfer energii rezonansu fluorescencyjnego

Poznaj metodę wykrywania fuzji komórek in vivo opartą na rekombinacji Cre-LoxP z wykorzystaniem luminescencji w myszach. Technika umożliwia śledzenie zdarzeń fuzji komórkowej w czasie rzeczywistym.

Podejście oparte na rekombinacji Cre-Lox P do detekcji fuzji komórek in vivo

Przeglądaj więcej filmów